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CN107699557A - 一种高纯度d‑阿洛酮糖的制备方法 - Google Patents

一种高纯度d‑阿洛酮糖的制备方法 Download PDF

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CN107699557A
CN107699557A CN201711106927.3A CN201711106927A CN107699557A CN 107699557 A CN107699557 A CN 107699557A CN 201711106927 A CN201711106927 A CN 201711106927A CN 107699557 A CN107699557 A CN 107699557A
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mass
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CN201711106927.3A
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李方华
窦光朋
邵先豹
刘杰
刘双双
杜倩
张明站
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Shandong Bailong Park Biological Polytron Technologies Inc
Original Assignee
Shandong Bailong Park Biological Polytron Technologies Inc
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Abstract

本发明涉及一种高纯度D‑阿洛酮糖的制备方法，包括如下步骤：(a)制备D‑阿洛酮糖差向异构酶粗酶制剂；(b)步骤(a)中粗酶制剂与葡萄糖异构酶进行固定化；(c)制备含有D‑阿洛酮糖、果糖、葡萄糖的混合液；(d)将步骤(c)制得的混合液经脱色、过滤、离交得到D‑阿洛酮糖溶液和果糖、葡萄糖的混合液；(e)步骤(d)制得的D‑阿洛酮糖溶液经过色谱分离、浓缩、结晶或干燥，制得D‑阿洛酮糖。

Description

一种高纯度D-阿洛酮糖的制备方法
技术领域
本发明涉及一种高纯度D-阿洛酮糖的制备方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
D-阿洛酮糖是一种重要的稀有糖，在自然界中极少量地存在于甘蔗糖蜜、水果干、糖制品、小麦和鼠刺属植物中。作为甜味剂，D-阿洛酮糖甜度相当于果糖的70％，能量只有蔗糖的0.3％，食用后几乎不产生热量，是真正意义上的糖尿病人可以食用的甜味剂。新的研究发现，食用D-阿洛酮糖后不仅血糖不会升高，而且还能有效地调控血糖，减少能量的摄入，减少腹部脂肪的积累等作用，其独特的功能和潜在的医疗价值吸引了众多研究学者的关注，并越来越受到消费者的欢迎。2011年FDA认可甜味剂D－阿洛酮糖可以作为食品添加剂使用。
中国专利文献CN105602879A(申请号201610051547.3)公开了一株高效分泌D-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因工程菌株及其构建方法。该发明通过利用由瘤胃菌Ruminococcus sp.5_1_39B_FAA来源的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因rdpe构建重组表达质粒pMA5-RDPE，然后转化枯草芽孢杆菌，实现了RDPE在枯草芽孢杆菌中组成型分泌表达。通过比较三个糖诱导型启动子，得到最优诱导型启动子PxylA，并明显提高了RDPE的分泌水平。通过敲除木糖利用基因xylAB(xylA和xylB)，阻断了枯草芽孢杆菌的木糖代谢途径，进一步提高了RDPE的分泌量，并使诱导剂木糖的最优诱导浓度由4.0％降低为0.5％。最终，采用分批补料方式，在7.5L发酵罐中对工程菌株1A751SD-XR进行评价，RDPE的分泌水平最高可以达到95U/mL和2.6g/L。但该酶的酶活仍然较低，无法满足实际生产的需要。
中国专利文献CN102869783A(申请号201080044027.0)公开了一种通过使用来源于根癌农杆菌且以食品安全形式表达的阿洛酮糖-差向异构酶而连续地由D-果糖或D-葡萄糖制备D-阿洛酮糖的方法。
当前D-阿洛酮糖的价格较高，其关键原因是制造成本高居不下，大大限制了其在下游食品、保健品领域的应用，产品本身特性难以有效发挥。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种高纯度D-阿洛酮糖的制备方法。
本发明技术方案如下：
一种高纯度D-阿洛酮糖的制备方法，包括如下步骤：
(a)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCY-005经发酵培养基发酵培养，制得发酵液，发酵液经离心分离，洗涤菌体，二次离心，保留沉淀物，制得D-阿洛酮糖差向异构酶粗酶制剂；
所述发酵培养基，组分如下，均为质量百分比：
玉米浆粉3～8％，葡萄糖0.8～1.5％，萘乙酸0.08～0.12％，七水硫酸镁0.015～0.025％，磷酸氢二铵0.01～0.02％，硫酸锰0.015～0.02％，硫酸铜0.015～0.018％，氯化铁0.08～0.12％，余量水，pH6.8～7.2；
(b)步骤(a)中粗酶制剂与葡萄糖异构酶以1:(1～5)(质量比)的比例混合均匀，然后按质量比20％～60％的比例加入到质量浓度为1％～3％的海藻酸钠溶液中，混合均匀，然后滴加到质量浓度为1％～3％的氯化钙溶液中，4℃固定12～36小时；
(c)配制质量浓度为20％～80％的葡萄糖溶液，按质量百分比0.0001％～0.0005％的比例添加氯化钴，混合均匀，缓慢通过添加固定化酶的柱子，得到含有D-阿洛酮糖、果糖、葡萄糖的混合液；
(d)收集步骤(c)制得的混合液，经脱色、过滤、离交得到D-阿洛酮糖溶液和果糖、葡萄糖的混合液；
(e)步骤(d)制得的D-阿洛酮糖溶液经过色谱分离、浓缩、结晶或干燥，制得D-阿洛酮糖。
根据本发明优选的，所述步骤(a)中，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCY-005来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.13152，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
根据本发明优选的，所述步骤(a)中，发酵培养基组分如下，均为重量百分比：
玉米浆粉5％，葡萄糖1％，萘乙酸0.1％，七水硫酸镁0.02％，磷酸氢二铵0.015％，硫酸锰0.018％，硫酸铜0.016％，氯化铁0.1％，余量水，pH6.8～7.2。
根据本发明优选的，所述步骤(a)中，发酵培养步骤如下：
按照体积百分比1～2％的接种量将种子接种于发酵培养基中，在温度35～37℃、pH6.8～7.2，罐压0.04～0.06Mpa，通风比1.8～2.2vvm，转速250～400rpm，溶氧30％～40％的条件下，发酵培养34～38h，制得发酵液。
根据本发明优选的，所述步骤(a)中，洗涤菌体采用pH 8.0、浓度50mmol/L的Tris-HCl缓冲液，然后经离心分离，保留沉淀，制得粗酶制剂。
根据本发明优选的，所述步骤(a)中的离心分离均为在4℃、10000r/min条件下，离心10min。
根据本发明优选的，所述步骤(b)中，葡萄糖异构酶购自诺维信(中国)生物技术有限公司。
根据本发明优选的，所述步骤(d)中，脱色步骤如下：
将步骤(d)制得的混合溶液，按质量百分比0.5～1％的比例加入活性炭，80～85℃搅拌30～40min。
根据本发明优选的，所述步骤(d)中，过滤采用板框过滤，过滤压力0.2～0.4Mpa，水流量5.0～6.0t/h。
根据本发明优选的，所述步骤(d)中，离交步骤如下：
将脱色过滤后的混合溶液以3倍树脂体积/小时的流速，在35～55℃通过连续离子交换系统，进行离交脱盐，离交后料液透光率≥98％。处理后的料液清澈透明，无异味。
根据本发明优选的，所述步骤(d)还包括将制得的果糖、葡萄糖的混合液与步骤(c)的葡萄糖溶液混合，继续进行后续反应。
根据本发明优选的，所述步骤(e)中，色谱分离步骤如下：
色谱运行压力0.20～0.30MPa，温度60～70℃，水耗比1:(1.3～1.6)，每小时进料1.5～2.0m3，分别收集D-阿洛酮糖和果糖、葡萄糖的混合液。
根据本发明优选的，所述步骤(e)中，浓缩采用四效降膜蒸发器，真空度为0.06-0.09Mpa，料液温度50～85℃，浓缩至原体积的60～75％。
根据本发明优选的，所述步骤(e)中，干燥为喷雾干燥，步骤如下：
浓缩后的糖液进入到干燥塔中，进风温度130～150℃，启动雾化器，液体经喷雾干燥为粉末状固体。
根据本发明优选的，所述步骤(e)中，结晶反应条件为：
糖液质量浓度70～85％，温度50～70℃，添加溶质质量10～30％的晶种，搅拌均匀，于50～70℃静置8～16小时，随后按照3～6h降1℃的速率缓慢降温，同时缓慢搅拌，直至溶液中形成大量均匀、规则的晶粒，分离，制得D-阿洛酮糖。
有益效果
1、本发明首次通过采用特殊发酵培养基培养获得的D-阿洛酮糖差向异构酶与葡萄糖异构酶通过混合制作固定化酶的方式，以葡萄糖浆为原料，制备D-阿洛酮糖，葡萄糖被葡萄糖异构酶转化成果糖后立即被同时固定好的D-阿洛酮糖差向异构酶转化成D-阿洛酮糖，较其他方式制备D-阿洛酮糖差向异构酶在相同条件下进行转化时，转化效率大幅提高，同时极大降低了生产成本。
2、本发明中氯化钴同时作为混合柱中葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖差向异构酶的激活剂，较传统方式大大降低了氯化钴的添加量，减少后续处理的费用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
生物材料来源
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCY-005来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号CGMCC No.13152；
实施例中所述葡萄糖异构酶购自诺维信(中国)生物技术有限公司；
D-阿洛酮糖酶活检测方法：
取400ul的100g/L D-果糖作为底物，加入100ul发酵液，恒温水浴55℃下反应5min，于沸水中煮沸10min终止反应。用10000r/min的转速进行离心，离心后取上清液稀释2倍后，用高效液相色谱仪检测D-阿洛酮糖含量，以每毫升发酵液每分钟内产生1μmol的D-阿洛酮糖定义为一个酶活单位。
D-阿洛酮糖转化率定义：D-阿洛酮糖质量/底物(D-果糖)质量。
转化率测定方法如下：用pH8.0，50mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液配制，30％(w/w)的D-果糖溶液作底物，加入适量的酶制剂，55℃水浴振荡反应3h后，立即于100℃沸水浴中15min，用高效液相色谱法测定D-阿洛酮糖含量。
实施例中所述脱色、过滤、离交、色谱分离、浓缩、结晶或干燥均为本领域的常规技术手段。
实施例1
一种高纯度D-阿洛酮糖的制备方法，包括如下步骤：
(1)取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCY-005，接种于种子培养基中，在温度35℃、220rpm的条件下进行种子培养8h，制得种子液；
所述种子培养基组分如下，均为重量百分比：
蛋白胨1.0％，玉米浆粉：0.5％，甘油：1.0％，余量水，pH7.0；
(2)取步骤(1)制得的种子液，按照体积百分比2％的接种量接种于发酵培养基中，在温度35℃、pH7.0，罐压0.05Mpa，通风比2.0vvm，转速300rpm，溶氧35％的条件下，发酵培养36h，制得发酵液；
所述发酵培养基，组分如下，均为质量百分比：
玉米浆粉5％，葡萄糖1％，萘乙酸0.1％，七水硫酸镁0.02％，磷酸氢二铵0.015％，硫酸锰0.018％，硫酸铜0.016％，氯化铁0.1％，余量水，pH7.0；
(3)取步骤(2)制得的发酵液，经4℃、10000r/min条件下离心分离10min、采用pH8.0、浓度50mmol/L的Tris-HCl缓冲液洗涤菌体，4℃、10000r/min条件下二次离心10min，保留沉淀物，制得D-阿洛酮糖差向异构酶的粗酶制剂；
(4)步骤(3)中粗酶制剂与葡萄糖异构酶以1:5(质量比)的比例混合均匀，然后按质量比20％的比例加入到质量浓度为1％～3％的海藻酸钠溶液中，混合均匀，然后滴加到质量浓度为1％～3％的氯化钙溶液中，4℃固定12～36小时；
(5)配制质量浓度为20％～80％的葡萄糖溶液，按质量百分比0.0001％～0.0005％的比例添加氯化钴，混合均匀，缓慢通过添加固定化酶的柱子，得到含有D-阿洛酮糖、果糖、葡萄糖的混合液；
(6)收集步骤(5)制得的混合液，按质量百分比0.5％的比例加入活性炭，85℃搅拌30min脱色，然后在过滤压力0.4Mpa、水流量5.0t/h的条件下采用板框过滤，再经离交得到D-阿洛酮糖溶液和果糖、葡萄糖的混合液，制得的果糖、葡萄糖的混合液与步骤(c)的葡萄糖溶液混合，继续进行后续反应；
所述离交步骤如下：
将脱色过滤后的混合溶液以3倍树脂体积/小时的流速，在55℃通过连续离子交换系统，进行离交脱盐，离交后料液透光率≥98％；处理后的料液清澈透明，无异味。
(7)步骤(6)制得的D-阿洛酮糖溶液经过色谱分离后，在真空度为0.06Mpa、料液温度85℃的条件下采用四效降膜蒸发器浓缩至原体积的60％，结晶或干燥，制得D-阿洛酮糖；
所述色谱分离步骤如下：
色谱运行压力0.30MPa，温度60℃，水耗比1:1.6，每小时进料1.5m3，分别收集D-阿洛酮糖和果糖、葡萄糖的混合液；
所述干燥为喷雾干燥，步骤如下：
浓缩后的糖液进入到干燥塔中，进风温度150℃，启动雾化器，液体经喷雾干燥为粉末状固体；
所述结晶步骤如下：
糖液质量浓度70％，温度70℃，添加溶质质量10％的晶种，搅拌均匀，于70℃静置8小时，随后按照6h降1℃的速率缓慢降温，同时缓慢搅拌，直至溶液中形成大量均匀、规则的晶粒，分离，制得D-阿洛酮糖。
经检测，D-阿洛酮糖酶活为2960，转化率为35.32％。
实施例2
一种高纯度D-阿洛酮糖的制备方法，包括如下步骤：
(1)取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCY-005，接种于种子培养基中，在温度35℃、220rpm的条件下进行种子培养8h，制得种子液；
所述种子培养基组分如下，均为重量百分比：
蛋白胨1.0％，玉米浆粉：0.5％，甘油：1.0％，余量水，pH7.0；
(2)取步骤(1)制得的种子液，按照体积百分比2％的接种量接种于发酵培养基中，在温度35℃、pH7.0，罐压0.05Mpa，通风比2.0vvm，转速300rpm，溶氧35％的条件下，发酵培养36h，制得发酵液；
所述发酵培养基，组分如下，均为质量百分比：
玉米浆粉5％，葡萄糖1％，萘乙酸0.1％，七水硫酸镁0.02％，磷酸氢二铵0.015％，硫酸锰0.018％，硫酸铜0.016％，氯化铁0.1％，余量水，pH7.0；
(3)取步骤(2)制得的发酵液，经4℃、10000r/min条件下离心分离10min、采用pH8.0、浓度50mmol/L的Tris-HCl缓冲液洗涤菌体，4℃、10000r/min条件下二次离心10min，保留沉淀物，制得D-阿洛酮糖差向异构酶的粗酶制剂；
(4)步骤(3)中粗酶制剂与葡萄糖异构酶以1:1(质量比)的比例混合均匀，然后按质量比40％的比例加入到质量浓度为1％～3％的海藻酸钠溶液中，混合均匀，然后滴加到质量浓度为1％～3％的氯化钙溶液中，4℃固定12～36小时；
(5)配制质量浓度为20％～80％的葡萄糖溶液，按质量百分比0.0001％～0.0005％的比例添加氯化钴，混合均匀，缓慢通过添加固定化酶的柱子，得到含有d-阿洛酮糖、果糖、葡萄糖的混合液；
(6)收集步骤(5)制得的混合液，按质量百分比1％的比例加入活性炭，80℃搅拌40min脱色，然后在过滤压力0.2Mpa、水流量6.0t/h的条件下采用板框过滤，再经离交得到D-阿洛酮糖溶液和果糖、葡萄糖的混合液，制得的果糖、葡萄糖的混合液与步骤(c)的葡萄糖溶液混合，继续进行后续反应；
所述离交步骤如下：
将脱色过滤后的混合溶液以3倍树脂体积/小时的流速，在35℃通过连续离子交换系统，进行离交脱盐，离交后料液透光率≥98％；处理后的料液清澈透明，无异味。
(7)步骤(6)制得的D-阿洛酮糖溶液经过色谱分离后，在真空度为0.09Mpa、料液温度50℃的条件下采用四效降膜蒸发器浓缩至原体积的75％，结晶或干燥，制得D-阿洛酮糖；
所述色谱分离步骤如下：
色谱运行压力0.20MPa，温度70℃，水耗比1:1.3，每小时进料2.0m3，分别收集D-阿洛酮糖和果糖、葡萄糖的混合液；
所述干燥为喷雾干燥，步骤如下：
浓缩后的糖液进入到干燥塔中，进风温度130℃，启动雾化器，液体经喷雾干燥为粉末状固体；
所述结晶步骤如下：
糖液质量浓度85％，温度50℃，添加溶质质量30％的晶种，搅拌均匀，于50℃静置16小时，随后按照3h降1℃的速率缓慢降温，同时缓慢搅拌，直至溶液中形成大量均匀、规则的晶粒，分离，制得D-阿洛酮糖。
经检测，D-阿洛酮糖的酶活为3000，转化率为35.56％。
实施例3
一种高纯度D-阿洛酮糖的制备方法，包括如下步骤：
(1)取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCY-005，接种于种子培养基中，在温度35℃、220rpm的条件下进行种子培养8h，制得种子液；
所述种子培养基组分如下，均为重量百分比：
蛋白胨1.0％，玉米浆粉：0.5％，甘油：1.0％，余量水，pH7.0；
(2)取步骤(1)制得的种子液，按照体积百分比2％的接种量接种于发酵培养基中，在温度35℃、pH7.0，罐压0.05Mpa，通风比2.0vvm，转速300rpm，溶氧35％的条件下，发酵培养36h，制得发酵液；
所述发酵培养基，组分如下，均为质量百分比：
玉米浆粉5％，葡萄糖1％，萘乙酸0.1％，七水硫酸镁0.02％，磷酸氢二铵0.015％，硫酸锰0.018％，硫酸铜0.016％，氯化铁0.1％，余量水，pH7.0；
(3)取步骤(2)制得的发酵液，经4℃、10000r/min条件下离心分离10min、采用pH8.0、浓度50mmol/L的Tris-HCl缓冲液洗涤菌体，4℃、10000r/min条件下二次离心10min，保留沉淀物，制得D-阿洛酮糖差向异构酶的粗酶制剂；
(4)步骤(3)中粗酶制剂与葡萄糖异构酶以1:3(质量比)的比例混合均匀，然后按质量比60％的比例加入到质量浓度为1％～3％的海藻酸钠溶液中，混合均匀，然后滴加到质量浓度为1％～3％的氯化钙溶液中，4℃固定12～36小时；
(5)配制质量浓度为20％～80％的葡萄糖溶液，按质量百分比0.0001％～0.0005％的比例添加氯化钴，混合均匀，缓慢通过添加固定化酶的柱子，得到含有D-阿洛酮糖、果糖、葡萄糖的混合液；
(6)收集步骤(5)制得的混合液，按质量百分比0.8％的比例加入活性炭，82℃搅拌35min脱色，然后在过滤压力0.3Mpa、水流量5.5t/h的条件下采用板框过滤，再经离交得到D-阿洛酮糖溶液和果糖、葡萄糖的混合液，制得的果糖、葡萄糖的混合液与步骤(c)的葡萄糖溶液混合，继续进行后续反应；
所述离交步骤如下：
将脱色过滤后的混合溶液以3倍树脂体积/小时的流速，在45℃通过连续离子交换系统，进行离交脱盐，离交后料液透光率≥98％；处理后的料液清澈透明，无异味。
(7)步骤(6)制得的D-阿洛酮糖溶液经过色谱分离后，在真空度为0.075Mpa、料液温度65℃的条件下采用四效降膜蒸发器浓缩至原体积的70％，结晶或干燥，制得D-阿洛酮糖；
所述色谱分离步骤如下：
色谱运行压力0.25MPa，温度65℃，水耗比1:1.4，每小时进料1.8m3，分别收集D-阿洛酮糖和果糖、葡萄糖的混合液；
所述干燥为喷雾干燥，步骤如下：
浓缩后的糖液进入到干燥塔中，进风温度140℃，启动雾化器，液体经喷雾干燥为粉末状固体；
所述结晶步骤如下：
糖液质量浓度75％，温度60℃，添加溶质质量20％的晶种，搅拌均匀，于60℃静置12小时，随后按照4h降1℃的速率缓慢降温，同时缓慢搅拌，直至溶液中形成大量均匀、规则的晶粒，分离，制得D-阿洛酮糖。
经检测，D-阿洛酮糖的酶活为2960，转化率为35.38％。
对比例1
如实施例1所述的一种高纯度D-阿洛酮糖的制备方法，不同之处在于，所述发酵培养基，组分如下，均为质量百分比：
玉米浆粉5％，葡萄糖1％，乙烯利0.1％，七水硫酸镁0.02％，磷酸氢二铵0.015％，硫酸锰0.018％，硫酸铜0.016％，氯化铁0.1％，余量水，pH7.0。
经检测，D-阿洛酮糖的酶活为2220，转化率为31.17％。
对比例2
如实施例1所述的一种高纯度D-阿洛酮糖的制备方法，不同之处在于，葡萄糖异构酶与所制得的D-阿洛酮糖差向异构酶的粗酶制剂不采用混合固定化的方式，葡萄糖与葡萄糖异构酶反应，所得反应溶液然后和所制得的D-阿洛酮糖差向异构酶的粗酶制剂反应。
经检测，D-阿洛酮糖的酶活为3020，转化率为23.28％。
结果分析
通过实施例和对比例1的数据可以看出，实施例通过添加萘乙酸，D-阿洛酮糖的转化率较对比例提高4％左右，较大程度的降低了D-阿洛酮糖制造成本，通过实施和对比例2的数据可以看出，采用混合固定化酶的方式与不采用相比，D-阿洛酮糖的酶活基本上没有损失，而转化率提高12％左右，所以本发明所制得的D-阿洛酮糖差向异构酶较现有已知的D-阿洛酮糖差向异构酶更适合作为混合固定化酶使用，这对于简化工艺，提高转化率，减少成本都具有非常显著的优势。

Claims (10)

1.一种高纯度D-阿洛酮糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCY-005经发酵培养基发酵培养，制得发酵液，发酵液经离心分离，洗涤菌体，二次离心，保留沉淀物，制得D-阿洛酮糖差向异构酶粗酶制剂；
所述发酵培养基，组分如下，均为质量百分比：
玉米浆粉3～8％，葡萄糖0.8～1.5％，萘乙酸0.08～0.12％，七水硫酸镁0.015～0.025％，磷酸氢二铵0.01～0.02％，硫酸锰0.015～0.02％，硫酸铜0.015～0.018％，氯化铁0.08～0.12％，余量水，pH6.8～7.2；
(b)步骤(a)中粗酶制剂与葡萄糖异构酶以1:(1～5)(质量比)的比例混合均匀，然后按质量比20％～60％的比例加入到质量浓度为1％～3％的海藻酸钠溶液中，混合均匀，然后滴加到质量浓度为1％～3％的氯化钙溶液中，4℃固定12～36小时；
(c)配制质量浓度为20％～80％的葡萄糖溶液，按质量百分比0.0001％～0.0005％的比例添加氯化钴，混合均匀，缓慢通过添加固定化酶的柱子，得到含有D-阿洛酮糖、果糖、葡萄糖的混合液；
(d)收集步骤(c)制得的混合液，经脱色、过滤、离交得到D-阿洛酮糖溶液和果糖、葡萄糖的混合液；
(e)步骤(d)制得的D-阿洛酮糖溶液经过色谱分离、浓缩、结晶或干燥，制得D-阿洛酮糖。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)中，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCY-005的保藏编号为CGMCC No.13152。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)中，发酵培养基组分如下，均为重量百分比：
玉米浆粉5％，葡萄糖1％，萘乙酸0.1％，七水硫酸镁0.02％，磷酸氢二铵0.015％，硫酸锰0.018％，硫酸铜0.016％，氯化铁0.1％，余量水，pH6.8～7.2。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)中，发酵培养步骤如下：
按照体积百分比1～2％的接种量将种子接种于发酵培养基中，在温度35～37℃、pH6.8～7.2，罐压0.04～0.06Mpa，通风比1.8～2.2vvm，转速250～400rpm，溶氧30％～40％的条件下，发酵培养34～38h，制得发酵液。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)中，洗涤菌体采用pH 8.0、浓度50mmol/L的Tris-HCl缓冲液，然后经离心分离，保留沉淀，制得粗酶制剂。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)中的离心分离均为在4℃、10000r/min条件下，离心10min。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(d)中，脱色步骤如下：
将步骤(d)制得的混合溶液，按质量百分比0.5～1％的比例加入活性炭，80～85℃搅拌30～40min。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(d)中，过滤采用板框过滤，过滤压力0.2～0.4Mpa，水流量5.0～6.0t/h；
优选的，所述步骤(d)中，离交步骤如下：
将脱色过滤后的混合溶液以3倍树脂体积/小时的流速，在35～55℃通过连续离子交换系统，进行离交脱盐，离交后料液透光率≥98％；
优选的，所述步骤(d)还包括将制得的果糖、葡萄糖的混合液与步骤(c)的葡萄糖溶液混合，继续进行后续反应。
9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(e)中，浓缩采用四效降膜蒸发器，真空度为0.06～0.09Mpa，料液温度50～85℃，浓缩至原体积的60～75％；
优选的，所述步骤(e)中，色谱分离步骤如下：
色谱运行压力0.20～0.30MPa，温度60～70℃，水耗比1:(1.3～1.6)，每小时进料1.5～2.0m3，分别收集D-阿洛酮糖和果糖、葡萄糖的混合液。
10.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(e)中，干燥为喷雾干燥，步骤如下：
浓缩后的糖液进入到干燥塔中，进风温度130～150℃，启动雾化器，液体经喷雾干燥为粉末状固体；
优选的，所述步骤(e)中，结晶反应条件为：
糖液质量浓度70～85％，温度50～70℃，添加溶质质量10～30％的晶种，搅拌均匀，于50～70℃静置8～16小时，随后按照3～6h降1℃的速率缓慢降温，同时缓慢搅拌，直至溶液中形成大量均匀、规则的晶粒，分离，制得D-阿洛酮糖。
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Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108866247A (zh) * 2018-09-18 2018-11-23 上海立足生物科技有限公司 连续大规模分离制备d-阿洛酮糖的方法和设备
CN109022521A (zh) * 2018-09-18 2018-12-18 上海立足生物科技有限公司 一种由淀粉制备d-阿洛酮糖的方法
CN109022625A (zh) * 2018-09-18 2018-12-18 上海立足生物科技有限公司 一种生产浓缩的d-阿洛酮糖的方法
CN109913438A (zh) * 2018-12-27 2019-06-21 吉林中粮生化有限公司 一种制备固定化的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的方法
WO2020057560A1 (zh) * 2018-09-18 2020-03-26 上海立足生物科技有限公司 一种阿洛酮糖的生产工艺
CN111455003A (zh) * 2020-04-30 2020-07-28 中国科学院广州能源研究所 一种微藻制备d-阿洛酮糖的方法
CN113080357A (zh) * 2021-05-17 2021-07-09 江苏赛威分离科技有限公司 一种低热量复配甜味剂及其生产工艺
WO2021239813A1 (en) 2020-05-27 2021-12-02 Pfeifer & Langen GmbH & Co. KG Crystallization of allulose under reduced pressure
WO2022049307A1 (en) 2020-09-07 2022-03-10 Savanna Ingredients Gmbh Extrusion process for the preparation of a solid allulose composition
CN114231578A (zh) * 2021-12-30 2022-03-25 保龄宝生物股份有限公司 一种双酶法制备阿洛酮糖的方法
US11746392B2 (en) 2020-11-23 2023-09-05 Savanna Ingredients Gmbh Drying of allulose crystals
WO2024047121A1 (en) 2022-09-01 2024-03-07 Savanna Ingredients Gmbh Process for the preparation of a particulate allulose composition

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102304479A (zh) * 2011-08-31 2012-01-04 中国海洋大学 添加植物激素的培养基及其在裂殖壶菌发酵中的应用
CN102869783A (zh) * 2009-09-30 2013-01-09 Cj第一制糖株式会社 阿洛酮糖-差向异构酶的固定化以及使用所述阿洛酮糖-差向异构酶制备d-阿洛酮糖的方法
CN103789378A (zh) * 2013-12-24 2014-05-14 山西天骄食业有限公司 一种应用于红枣浓缩汁生产阿洛酮糖的双酶偶联与固定化技术
CN106434494A (zh) * 2016-12-02 2017-02-22 山东百龙创园生物科技股份有限公司 一株枯草芽孢杆菌及其培养方法与应用
CN106520746A (zh) * 2016-12-02 2017-03-22 山东百龙创园生物科技股份有限公司 一种高纯度d‑阿洛酮糖的制备方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102869783A (zh) * 2009-09-30 2013-01-09 Cj第一制糖株式会社 阿洛酮糖-差向异构酶的固定化以及使用所述阿洛酮糖-差向异构酶制备d-阿洛酮糖的方法
CN102304479A (zh) * 2011-08-31 2012-01-04 中国海洋大学 添加植物激素的培养基及其在裂殖壶菌发酵中的应用
CN103789378A (zh) * 2013-12-24 2014-05-14 山西天骄食业有限公司 一种应用于红枣浓缩汁生产阿洛酮糖的双酶偶联与固定化技术
CN106434494A (zh) * 2016-12-02 2017-02-22 山东百龙创园生物科技股份有限公司 一株枯草芽孢杆菌及其培养方法与应用
CN106520746A (zh) * 2016-12-02 2017-03-22 山东百龙创园生物科技股份有限公司 一种高纯度d‑阿洛酮糖的制备方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. REPAR ET AL.: ""Stress resistance of Escherichia coli and Bacillus subtilis is modulated by auxins"", 《CANADIAN JOURNAL OF MICROBIOLOGY》 *
曾青兰等: "《生物制药工艺》", 28 February 2015, 华中科技大学出版社 *
马爱霞: "《药品GMP车间实训教程（上册）》", 30 June 2016, 中国医药科技出版社 *

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108866247A (zh) * 2018-09-18 2018-11-23 上海立足生物科技有限公司 连续大规模分离制备d-阿洛酮糖的方法和设备
CN109022521A (zh) * 2018-09-18 2018-12-18 上海立足生物科技有限公司 一种由淀粉制备d-阿洛酮糖的方法
CN109022625A (zh) * 2018-09-18 2018-12-18 上海立足生物科技有限公司 一种生产浓缩的d-阿洛酮糖的方法
WO2020057561A1 (zh) * 2018-09-18 2020-03-26 上海立足生物科技有限公司 一种由淀粉制备d-阿洛酮糖的方法
WO2020057560A1 (zh) * 2018-09-18 2020-03-26 上海立足生物科技有限公司 一种阿洛酮糖的生产工艺
CN109913438A (zh) * 2018-12-27 2019-06-21 吉林中粮生化有限公司 一种制备固定化的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的方法
CN111455003A (zh) * 2020-04-30 2020-07-28 中国科学院广州能源研究所 一种微藻制备d-阿洛酮糖的方法
WO2021239813A1 (en) 2020-05-27 2021-12-02 Pfeifer & Langen GmbH & Co. KG Crystallization of allulose under reduced pressure
WO2022049307A1 (en) 2020-09-07 2022-03-10 Savanna Ingredients Gmbh Extrusion process for the preparation of a solid allulose composition
US11746392B2 (en) 2020-11-23 2023-09-05 Savanna Ingredients Gmbh Drying of allulose crystals
CN113080357A (zh) * 2021-05-17 2021-07-09 江苏赛威分离科技有限公司 一种低热量复配甜味剂及其生产工艺
CN114231578A (zh) * 2021-12-30 2022-03-25 保龄宝生物股份有限公司 一种双酶法制备阿洛酮糖的方法
WO2024047121A1 (en) 2022-09-01 2024-03-07 Savanna Ingredients Gmbh Process for the preparation of a particulate allulose composition
WO2024047122A1 (en) 2022-09-01 2024-03-07 Savanna Ingredients Gmbh Process for the preparation of a particulate allulose composition

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