CN109837316A - 一种利用木质纤维素玉米芯残渣高效生产l-乳酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用木质纤维素玉米芯残渣高效生产L‑乳酸的方法，涉及L‑乳酸的发酵生产领域，以凝结芽孢杆菌为发酵菌株，利用单一的碳源、氮源，同步糖化发酵生产L‑乳酸，其中碳源为玉米芯残渣。本发明实现了廉价碳源和氮源的利用，低成本、高生产效率、高得率地生产L‑乳酸，为木质纤维素在L‑乳酸生产的应用提供一种有效的替代方法。
Description
技术领域
本发明涉及L-乳酸的发酵生产领域，尤其涉及一种利用木质纤维素玉米芯残渣高效生产L-乳酸的方法。
背景技术
近年来，塑料制品被广泛应用于人们的生产生活中，造成了一定的环境污染。随着环保意识的增强，人们对生物可降解塑料的需求逐渐提升。聚乳酸(PLA)是一种优质的生物可降解材料，由乳酸聚合产生。近年来对PLA的需求大幅增加了乳酸的生产兴趣。然而，聚乳酸的高生产成本严重影响了其应用，这主要是由于单体乳酸占据了聚乳酸生产的大部分成本，而常用碳源淀粉(葡萄糖)占据了乳酸生产的大部分成本。因此，寻找乳酸生产的替代性廉价碳源已经成为一种迫切的需求。
木质纤维素由纤维素、半纤维素和木质素组成，是一种广泛易得、可再生的生物质资源，主要来自农业和林业废物。具有代替淀粉(葡萄糖)的潜力，木质纤维素糖被广泛用来生产大宗化学品，尤其是在乳酸生产过程中被认为是一种经济、有吸引力的原料。玉米芯是我国最丰富、广泛易得的农业废弃物之一。通过半纤维素去除和稀酸水解后，玉米芯残渣(CCR)的纤维素含量达到56～60％。由于前一步骤——木糖醇和糠醛的生产已经分摊了部分成本，因此，在大宗化学品如：乳酸生产中，CCR被认为是一种极具代表性且价格低廉的木质纤维素材料。
凝结芽孢杆菌可以将木质纤维素生物资源有效转化为乳酸，具有产出L-乳酸光学纯度高、耐高温、营养贫瘠、碳效率高、副产物形成少的优点。凝结芽孢杆菌的最佳生长温度为50℃，与纤维素酶水解的最佳温度接近，这有利于菌株进行同步糖化发酵 (SSF)生产乳酸。
目前，利用木质纤维素生产乳酸，仍有诸多问题待解决，如木质纤维素利用困难，酶水解成本高，生产效率和得率较低等。
因此，本领域的技术人员致力于开发一种利用木质纤维素玉米芯残渣高效生产L-乳酸的方法，以实现廉价碳源和氮源的利用，低成本、高生产效率、高得率地生产L- 乳酸，为木质纤维素在L-乳酸生产的应用提供一种有效的替代方法。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何低成本、高生产效率和高得率地生产L-乳酸的问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种利用木质纤维素玉米芯残渣高效生产L-乳酸的方法，以凝结芽孢杆菌为发酵菌株，利用单一的碳源、氮源，同步糖化发酵生产L- 乳酸，其中碳源为玉米芯残渣。
进一步地，发酵菌株为凝结芽孢杆菌H-1（Bacillus coagulans H-1），保藏于中国典型培养物保藏中心(湖北省武汉市珞珈山武汉大学，中国)，其保藏编号为CCTCC No.M2013105，保藏日期是2013年3月26日。
进一步地，玉米芯残渣为玉米芯经过半纤维素去除及稀酸水解后的产物。可选地，购自山东龙力生物科技股份有限公司，根据NREL方法通过两步酸解测得玉米芯残渣中纤维素含量为59.51％，半纤维素含量为5.97％，木质素含量为24.10％。
进一步地，氮源为花生粕。
进一步地，该方法包括以下步骤：
步骤1、活化培养：将菌株接种到固体斜面培养基，50℃培养12～24小时；
步骤2、种子培养：将步骤1中活化后的菌株，在无菌环境中转接到液体培养基，封住瓶口，以菌株消耗氧气创造无菌环境，在50℃、200rpm条件下培养12～16小时，获得种子液；
步骤3、发酵罐培养：将步骤2中种子液按照5～25％的接种量转接到发酵罐培养基中，同时添加纤维素酶0～20U/g纤维素，β-葡萄糖苷酶0～20U/g纤维素和中性蛋白酶0.3g/L，控制发酵罐温度在50℃，搅拌转速为150rpm，培养 30～84小时；
步骤4、检测：发酵结束后取样，检测L-乳酸、纤维二糖及葡萄糖浓度。
进一步地，步骤1中的固体斜面培养基为GSY固体斜面培养基，其配方为：100g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，5g/L胰蛋白胨，50g/L CaCO3，和2％琼脂糖；步骤2中的液体培养基为GSY液体培养基，其配方为：100g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，5g/L胰蛋白胨，50g/L CaCO3。
进一步地，步骤3中的发酵罐培养基配方为：60～140g/L玉米芯残渣，9～21g/L 花生粕，18～42g/LCaCO3。
进一步地，步骤4还包含以下步骤：
步骤4.1、样品处理：将样品置于沸水浴中处理10分钟，取2mL样品加入2mL 2M的H2SO4酸解10分钟，使乳酸钙转化为乳酸，加蒸馏水使L- 乳酸、葡萄糖、纤维二糖浓度稀释至1～5g/L，6000～10000rpm离心10分钟，取上清液，用0.22μm的水相滤膜过滤于液相小瓶中；
步骤4.2、样品检测：用HPLC检测，检测条件为：液相色谱柱为Bio-Rad AminexHPX-87H，流动相为5mM的H2SO4，流速为0.5mL/min，柱温为 55℃，进样量为10μL，使用示差折光检测器(RID)检测。
在本发明的一个较佳实施方式中，以凝结芽孢杆菌H-1作为发酵菌株，以玉米芯经过半纤维素去除及稀酸水解后的玉米芯残渣作为唯一碳源，以花生粕作为唯一氮源，采用GSY固体斜面培养基、GSY液体培养基和发酵罐培养基(配方为100g/L玉米芯残渣，15g/L花生粕，30g/L CaCO3)，按步骤分别活化菌株、培养种子液、进行发酵罐培养同步糖化发酵，生产出L-乳酸，并取发酵产物进行检测。
在本发明的另一较佳实施方式中，同样是以凝结芽孢杆菌H-1作为发酵菌株，以玉米芯经过半纤维素去除及稀酸水解后的玉米芯残渣作为唯一碳源，以花生粕作为唯一氮源，在发酵罐培养的过程中，还增加了补料的步骤，该方法包括以下步骤：
步骤1、活化培养：将凝结芽孢杆菌H-1接种到GSY固体斜面培养基，50℃培养12～24小时；
步骤2、种子培养：步骤1中活化后的菌株，在无菌环境中转接到GSY液体培养基，用封口膜和塑料薄膜封住瓶口，以菌株消耗氧气创造无菌环境，在 50℃、200rpm条件下培养12～16小时，获得种子液；
步骤3、发酵罐培养：将步骤2中种子液按照5～25％的接种量转接到发酵罐培养基中，同时添加纤维素酶0～20U/g纤维素，β-葡萄糖苷酶0～20U/g纤维素和中性蛋白酶0.3g/L，控制发酵罐温度在50℃，搅拌转速为150rpm，发酵 72～140小时；
步骤4、补料：在对数生长期4～7小时时，补料30～70g/L玉米芯残渣， 9～21g/LCaCO3，2～20U/g纤维素的纤维素酶，0～20U/g纤维素的β-葡萄糖苷酶；
步骤5、检测：发酵结束后取样，检测L-乳酸、纤维二糖及葡萄糖浓度。
进一步地，步骤1中的GSY固体斜面培养基的配方为：100g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，5g/L胰蛋白胨，50g/L CaCO3，和2％琼脂糖；步骤2中的GSY液体培养基的配方为：100g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，5g/L胰蛋白胨，50g/L CaCO3；步骤3中的发酵罐培养基的配方为：60～140g/L玉米芯残渣，13.5～31.5g/L花生粕，18～42g/L CaCO3。
本发明提出的一种利用木质纤维素玉米芯残渣生产制备L-乳酸的方法与现有技术相比，具有如下的有益效果：
(1)实现了廉价碳源——木质纤维素的开发利用。利用廉价的木质纤维素玉米芯残渣作为唯一碳源，通过外加纤维素酶将纤维素降解为葡萄糖，用作生产高附加值产品L-乳酸，有利于降低成本，同时解决由于木质纤维素废弃带来的环境污染问题。
(2)实现了廉价氮源——花生粕的开发利用。利用花生粕作为唯一氮源生产高值化合物L-乳酸，有利于降低成本，进行工业化发酵生产，具有应用价值。
(3)实现了L-乳酸的高生产效率生产。利用凝结芽孢杆菌作为生产菌株，凝结芽孢杆菌H-1具有L-乳酸光学纯度高、耐高温、营养贫瘠、碳效率高、副产物形成少的优势，可利用玉米芯残渣同步糖化发酵生产L-乳酸，能实现木质纤维素糖到L-乳酸的高效率转化，耗时短，节省能源。
(4)实现了L-乳酸的高得率生产。凝结芽孢杆菌H-1利用玉米芯残渣发酵生产L-乳酸，纤维素转化L-乳酸的转化率达76％～85％，与其他生产者相比，L-乳酸的得率相对较高，为木质纤维素在L-乳酸生产的应用提供了一种有效的替代方法。
以下将结合附图对本发明的构思、具体方法及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1：本发明的一个实施例中纤维素酶浓度对酶解条件的影响；
图2：本发明的一个实施例中β-葡萄糖苷酶浓度对酶解条件的影响；
图3：本发明的一个实施例中纤维素浓度对微晶纤维素同步糖化发酵的影响；
图4：本发明的一个实施例中纤维素酶浓度对微晶纤维素同步糖化发酵的影响；
图5：本发明的一个实施例中β-葡萄糖苷酶浓度对微晶纤维素同步糖化发酵的影响；
图6：本发明的一个实施例中氮源种类对微晶纤维素同步糖化发酵的影响；
图7：本发明的一个实施例中花生粕浓度对微晶纤维素同步糖化发酵的影响；
图8：本发明的一个实施例中底物浓度对玉米芯残渣同步糖化发酵的影响；
图9：本发明的一个实施例中纤维素酶浓度对玉米芯残渣同步糖化发酵的影响；
图10：本发明的一个实施例中β-葡萄糖苷酶浓度对玉米芯残渣同步糖化发酵的影响；
图11：本发明的一个实施例中凝结芽孢杆菌H-1利用玉米芯残渣为原料分批同步糖化发酵历程；
图12：本发明的一个实施例中凝结芽孢杆菌H-1利用玉米芯残渣为原料补料分批同步糖化发酵历程。
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明的目的是为木质纤维素在L-乳酸生产中的应用提供一种有效的替代方法。以凝结芽孢杆菌H-1为发酵菌株，利用玉米芯残渣同步糖化发酵生产L-乳酸，具有产率高、得率高、成本低的优势，具有一定的现实意义和工业应用价值。
具体地，首先以微晶纤维素作为模型，进行酶解条件及同步糖化发酵条件的优化，并评估了廉价碳氮源组合；之后以玉米芯残渣为底物，进行发酵条件优化，并通过分批同步糖化发酵和补料分批同步糖化发酵两种方法，获得L-乳酸。
玉米芯残渣，优选为玉米芯经过半纤维素去除及稀酸水解后的产物。本发明中使用的玉米芯残渣购自山东龙力生物科技股份有限公司，根据NREL方法通过两步酸解测得玉米芯残渣中纤维素含量为59.51％，半纤维素含量为5.97％，木质素含量为 24.10％。
材料与设备：
发酵菌株为凝结芽孢杆菌H-1，保藏于中国典型培养物保藏中心(湖北省武汉市珞珈山武汉大学，中国)，其保藏编号为CCTCC No.M 2013105；玉米芯残渣购自山东龙力生物科技股份有限公司；花生粕、豆粕、玉米浆干粉购自北京康明威培养基技术有限责任公司；大豆蛋白胨购自北京奥博星生物技术有限责任公司；硫酸铵购自国药集团化学试剂有限公司；酵母粉购自法国Oxoid；胰蛋白胨购自英国Oxoid；纤维素酶购自上海麦克林生化试剂有限公司；β-葡萄糖苷酶购自上海源叶生物科技有限公司；中性蛋白酶购自上海瑞永生物科技有限公司；发酵罐(5L)购自上海百伦生物科技有限公司。
实施例一：
微晶纤维素酶解条件的优化：
1.纤维素酶浓度对微晶纤维素酶解条件的影响
(1)在底物微晶纤维素浓度为60g/L的三角摇瓶中，添加纤维素酶5～25U/g纤维素、β-葡萄糖苷酶20U/g纤维素，使用pH 6的柠檬酸钠-柠檬酸的缓冲液补足至50mL，置于50℃、200rpm的摇床中，酶解40～75小时；
(2)酶解结束后取样分析，通过HPLC测定纤维二糖、葡萄糖浓度；
酶解72小时结果如图1所示，葡萄糖得率和纤维素转化率随纤维素酶的增加而增加，当纤维素酶浓度为15U/g纤维素时，葡萄糖得率和纤维素转化率增幅最高。因此确定微晶纤维素酶解最佳纤维素酶浓度为15U/g纤维素。
2.β-葡萄糖苷酶浓度对微晶纤维素酶解条件的影响
(1)在底物微晶纤维素浓度为60g/L的三角摇瓶中，添加纤维素酶15U/g纤维素，β-葡萄糖苷酶0～30U/g纤维素，使用pH 6的柠檬酸钠-柠檬酸的缓冲液补足至50mL，置于50℃、200rpm的摇床中，酶解40～75小时；
(2)酶解结束后取样分析，通过HPLC测定纤维二糖、葡萄糖浓度；
酶解72小时结果如图2所示，葡萄糖得率和纤维素转化率随β-葡萄糖苷酶的增加而增加，当β-葡萄糖苷酶浓度为7.5U/g纤维素时，葡萄糖得率和纤维素转化率增幅最高。因此确定微晶纤维素酶解最佳β-葡萄糖苷酶浓度为7.5U/g纤维素。
本实施例中取样分析时样品处理的具体方法是：将样品置于沸水浴中处理10分钟，加蒸馏水使葡萄糖、纤维二糖浓度稀释至1～5g/L之间，6000～10000rpm离心10 分钟，取上清液，用0.22μm的水相滤膜过滤于液相小瓶中。
HPLC检测条件是：液相色谱柱为Bio-Rad Aminex HPX-87H，流动相为5mM的H2SO4，流速为0.5mL/min，柱温为55℃，进样量为10μL，使用示差折光检测器(RID) 检测。
实施例二：
微晶纤维素同步糖化发酵条件的优化：
1.底物浓度对微晶纤维素同步糖化发酵的影响
(1)用GSY固体斜面培养基、50℃条件下活化凝结芽孢杆菌H-1菌株；
(2)接种活化后的凝结芽孢杆菌H-1菌株于GSY液体培养基中，用封口膜和塑料薄膜封住瓶口，以菌株消耗氧气创造无菌环境，在50℃、200rpm条件下培养12～16 小时，获得种子液；
(3)按20％的接种量将种子液转接到发酵培养基中，同时添加纤维素酶15U/g 纤维素，β-葡萄糖苷酶7.5U/g纤维素，用封口膜和塑料薄膜封住瓶口，以菌株消耗氧气创造无菌环境，在50℃、200rpm条件下培养；
(4)发酵30～72小时后取样分析，通过HPLC检测L-乳酸、纤维二糖及葡萄糖浓度；
发酵48小时结果如图3所示，L-乳酸浓度随底物纤维素浓度的增加而增加，当纤维素浓度为80g/L时，L-乳酸浓度明显增加。因此确定80g/L微晶纤维素为同步糖化发酵最佳底物浓度。
上述步骤(3)所述的发酵培养基配方是：50～90g/L微晶纤维素，10g/L酵母粉，5g/L胰蛋白胨和25～45g/L CaCO3。
2.纤维素酶浓度对微晶纤维素同步糖化发酵的影响
(1)用GSY固体斜面培养基、50℃条件下活化凝结芽孢杆菌H-1菌株；
(2)接种活化后的凝结芽孢杆菌H-1菌株于GSY液体培养基中，用封口膜和塑料薄膜封住瓶口，以菌株消耗氧气创造无菌环境，在50℃、200rpm条件下培养12–16 小时，获得种子液；
(3)按20％的接种量将种子液转接到发酵培养基中，同时添加纤维素酶10～30U/g纤维素，纤维素酶和β-葡萄糖苷酶比例为2:1，用封口膜和塑料薄膜封住瓶口，以菌株消耗氧气创造无菌环境，在50℃、200rpm条件下培养；
(4)发酵30～72小时后取样分析，通过HPLC检测L-乳酸、纤维二糖及葡萄糖浓度；
发酵48小时结果如图4所示，L-乳酸浓度随纤维素酶浓度的增加而增加，当纤维素酶浓度为15U/g纤维素时，L-乳酸浓度明显增加。因此确定微晶纤维素同步糖化发酵最佳纤维素酶浓度为15U/g纤维素。
上述步骤(3)所述的发酵培养基配方是：80g/L微晶纤维素，10g/L酵母粉，5g/L 胰蛋白胨和40g/L CaCO3。
3.β-葡萄糖苷酶浓度对微晶纤维素同步糖化发酵的影响
(1)用GSY固体斜面培养基、50℃条件下活化凝结芽孢杆菌H-1菌株；
(2)接种活化后的凝结芽孢杆菌H-1菌株于GSY液体培养基中，用封口膜和塑料薄膜封住瓶口，以菌株消耗氧气创造无菌环境，在50℃、200rpm条件下培养12～16 小时，获得种子液；
(3)按20％的接种量将种子液转接到发酵培养基中，同时添加纤维素酶15U/g 纤维素，β-葡萄糖苷酶0～30U/g纤维素，用封口膜和塑料薄膜封住瓶口，以菌株消耗氧气创造无菌环境，在50℃、200rpm条件下培养；
(4)发酵30～72小时后取样分析，通过HPLC检测L-乳酸、纤维二糖及葡萄糖浓度；
发酵48小时结果如图5所示，L-乳酸浓度随β-葡萄糖苷酶浓度的增加而增加，当β-葡萄糖苷酶浓度为7.5U/g纤维素时，L-乳酸浓度增加明显。但此时，L-乳酸浓度相对较低。因此从酶成本和乳酸产量角度考虑，确定微晶纤维素同步糖化发酵最佳β-葡萄糖苷酶浓度为15U/g纤维素。
上述步骤(3)所述的发酵培养基配方是：80g/L微晶纤维素，10g/L酵母粉，5g/L 胰蛋白胨和40g/L CaCO3。
本实施例中所述的GSY固体斜面培养基配方是：100g/L葡萄糖，10g/L酵母粉， 5g/L胰蛋白胨和50g/L CaCO3，添加2％琼脂糖。
菌株为凝结芽孢杆菌H-1，保藏于中国典型培养物保藏中心(湖北省武汉市珞珈山武汉大学，中国)，其保藏编号为CCTCC No.M 2013105。
GSY液体培养基配方是：100g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，5g/L胰蛋白胨和50g/LCaCO3。
取样分析时样品处理的具体方法是：将样品置于沸水浴中处理10分钟，取2mL 样品加入2mL 2M的H2SO4酸解10分钟，使乳酸钙转化为乳酸，加蒸馏水使L-乳酸、葡萄糖、纤维二糖浓度稀释至1～5g/L，6000～10000rpm离心10分钟，取上清液，用 0.22μm的水相滤膜过滤于液相小瓶中。
HPLC检测条件是：液相色谱柱为Bio-Rad Aminex HPX-87H，流动相为5mM的 H2SO4，流速为0.5mL/min，柱温为55℃，进样量为10μL，使用示差折光检测器(RID) 检测。
实施例三：
微晶纤维素同步糖化发酵的氮源优化：
1.氮源种类对微晶纤维素同步糖化发酵的影响
(1)用GSY固体斜面培养基、50℃条件下活化凝结芽孢杆菌H-1菌株；
(2)接种活化后的凝结芽孢杆菌H-1菌株于GSY液体培养基中，用封口膜和塑料薄膜封住瓶口，以菌株消耗氧气创造无菌环境，在50℃、200rpm条件下培养12～16 小时，获得种子液；
(3)按20％的接种量将种子液转接到发酵培养基中，同时添加纤维素酶15U/g 纤维素，β-葡萄糖苷酶15U/g纤维素，用封口膜和塑料薄膜封住瓶口，以菌株消耗氧气创造无菌环境，在50℃、200rpm条件下培养；
(4)发酵30～72小时后取样分析，通过HPLC检测L-乳酸、纤维二糖及葡萄糖浓度；
发酵48小时结果如图6所示，以花生粕为氮源时，L-乳酸产量最高，且花生粕廉价，广泛易得。因此，确认花生粕为微晶纤维素同步糖化发酵最佳氮源。
上述步骤(3)所述的发酵培养基配方是：80g/L微晶纤维素，40g/L CaCO3，氮浓度为3.4g/L，氮源种类及浓度如表1；其中，氮源花生粕、豆粕中需添加0.3g/L中性蛋白酶。
表1是不同氮源种类中总氮浓度和氮源浓度
2.花生粕浓度对微晶纤维素同步糖化发酵的影响
(1)用GSY固体斜面培养基、50℃条件下活化凝结芽孢杆菌H-1菌株；
(2)接种活化后的凝结芽孢杆菌H-1菌株于GSY液体培养基中，用封口膜和塑料薄膜封住瓶口，以菌株消耗氧气创造无菌环境，在50℃、200rpm条件下培养12～16 小时，获得种子液；
(3)按20％的接种量将种子液转接到发酵培养基中，同时添加纤维素酶15U/g 纤维素，β-葡萄糖苷酶15U/g纤维素，中性蛋白酶0.3g/L，用封口膜和塑料薄膜封住瓶口，以菌株消耗氧气创造无菌环境，在50℃、200rpm条件下培养；
(4)发酵30～72小时后取样分析，通过HPLC检测L-乳酸、纤维二糖及葡萄糖浓度；
发酵48小时结果如图7所示，L-乳酸浓度随花生粕浓度的增加而增加，当花生粕浓度大于20g/L时，L-乳酸浓度趋于平稳。因此确定微晶纤维素同步糖化发酵最佳花生粕浓度为20g/L。
上述步骤(3)所述的发酵培养基配方是：80g/L微晶纤维素，0～30g/L花生粕，40g/L CaCO3。
本实施例中所述的GSY固体斜面培养基配方是：100g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，5g/L胰蛋白胨和50g/L CaCO3，添加2％琼脂糖。
菌株为凝结芽孢杆菌H-1，保藏于中国典型培养物保藏中心(湖北省武汉市珞珈山武汉大学，中国)，其保藏编号为CCTCC No.M 2013105。
GSY液体培养基配方是：100g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，5g/L胰蛋白胨和50g/LCaCO3。
取样分析时样品处理的具体方法是：将样品置于沸水浴中处理10分钟，取2mL 样品加入2mL 2M的H2SO4酸解10分钟，使乳酸钙转化为乳酸，加蒸馏水使L-乳酸、葡萄糖、纤维二糖浓度稀释至1～5g/L，6000～10000rpm离心10分钟，取上清液，用 0.22μm的水相滤膜过滤于液相小瓶中。
HPLC检测条件是：液相色谱柱为Bio-Rad Aminex HPX-87H，流动相为5mM的 H2SO4，流速为0.5mL/min，柱温为55℃，进样量为10μL，使用示差折光检测器(RID) 检测。
实施例四：
玉米芯残渣同步糖化发酵条件的优化：
1.底物浓度对玉米芯残渣同步糖化发酵的影响
(1)用GSY固体斜面培养基、50℃条件下活化凝结芽孢杆菌H-1菌株；
(2)接种活化后的凝结芽孢杆菌H-1菌株于GSY液体培养基中，用封口膜和塑料薄膜封住瓶口，以菌株消耗氧气创造无菌环境，在50℃、200rpm条件下培养12～16 小时，获得种子液；
(3)按20％的接种量将种子液转接到发酵培养基中，同时添加纤维素酶15U/g 纤维素，β-葡萄糖苷酶15U/g纤维素，中性蛋白酶0.3g/L，用封口膜和塑料薄膜封住瓶口，以菌株消耗氧气创造无菌环境，在50℃、200rpm条件下培养；
(4)发酵30～72小时后取样分析，通过HPLC检测L-乳酸、纤维二糖及葡萄糖浓度；
发酵48小时结果如图8所示，当玉米芯残渣浓度为120g/L时，L-乳酸产量最高，然而此时L-乳酸浓度的增加相对较少。一方面，过高的底物浓度不利于酶与底物接触，降低了酶解效率，另一方面，过高的底物浓度使传质传热困难，抑制了菌株的生长代谢。因此，从酶解效率和乳酸产量角度综合考虑，确定100g/L玉米芯残渣为同步糖化发酵最佳底物浓度。
上述步骤(3)所述的发酵培养基配方是：60～140g/L玉米芯残渣，纤维素与花生粕浓度比例为4:1，纤维素与CaCO3浓度比例为2:1。
2.纤维素酶浓度对玉米芯残渣同步糖化发酵的影响
(1)用GSY固体斜面培养基、50℃条件下活化凝结芽孢杆菌H-1菌株；
(2)接种活化后的凝结芽孢杆菌H-1菌株于GSY液体培养基中，用封口膜和塑料薄膜封住瓶口，以菌株消耗氧气创造无菌环境，在50℃、200rpm条件下培养12～16 小时，获得种子液；
(3)按20％的接种量将种子液转接到发酵培养基中，同时添加纤维素酶2～20U/g纤维素，β-葡萄糖苷酶15U/g纤维素，中性蛋白酶0.3g/L，用封口膜和塑料薄膜封住瓶口，以菌株消耗氧气创造无菌环境，在50℃、200rpm条件下培养；
(4)发酵30～72小时后取样分析，通过HPLC检测L-乳酸、纤维二糖及葡萄糖浓度；
发酵48小时结果如图9所示，当纤维素酶浓度大于10U/g纤维素时，L-乳酸浓度趋于平稳。因此确定玉米芯残渣同步糖化发酵最佳纤维素酶浓度为10U/g纤维素。
上述步骤(3)所述的发酵培养基配方是：100g/L玉米芯残渣，15g/L花生粕浓度，30g/L CaCO3。
3.β-葡萄糖苷酶浓度对玉米芯残渣同步糖化发酵的影响
(1)用GSY固体斜面培养基、50℃条件下活化凝结芽孢杆菌H-1菌株；
(2)接种活化后的凝结芽孢杆菌H-1菌株于GSY液体培养基中，用封口膜和塑料薄膜封住瓶口，以菌株消耗氧气创造无菌环境，在50℃、200rpm条件下培养12～16 小时，获得种子液；
(3)按20％的接种量将种子液转接到发酵培养基中，同时添加纤维素酶10U/g 纤维素，β-葡萄糖苷酶0～20U/g纤维素，中性蛋白酶0.3g/L，用封口膜和塑料薄膜封住瓶口，以菌株消耗氧气创造无菌环境，在50℃、200rpm条件下培养；
(4)发酵30～72小时后取样分析，通过HPLC检测L-乳酸、纤维二糖及葡萄糖浓度；
发酵48小时结果如图10所示，当β-葡萄糖苷酶浓度为15U/g纤维素时，L-乳酸浓度最高，因此确定玉米芯残渣同步糖化发酵最佳β-葡萄糖苷酶浓度为15U/g纤维素。
上述步骤(3)所述的发酵培养基配方是：100g/L玉米芯残渣，15g/L花生粕，30g/LCaCO3。
本实施例中所述的GSY固体斜面培养基配方是：100g/L葡萄糖，10g/L酵母粉， 5g/L胰蛋白胨和50g/L CaCO3，添加2％琼脂糖。
菌株为凝结芽孢杆菌H-1，保藏于中国典型培养物保藏中心(湖北省武汉市珞珈山武汉大学，中国)，其保藏编号为CCTCC No.M 2013105。
GSY液体培养基配方是：100g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，5g/L胰蛋白胨和50g/LCaCO3。
发酵培养基配方中的玉米芯残渣为玉米芯经过半纤维素去除及稀酸水解后的产物，购自山东龙力生物科技股份有限公司，根据NREL方法通过两步酸解测得玉米芯残渣中纤维素含量为59.51％，半纤维素含量为5.97％，木质素含量为24.10％。
取样分析时样品处理的具体方法是：将样品置于沸水浴中处理10分钟，取2mL 样品加入2mL 2M的H2SO4酸解10分钟，使乳酸钙转化为乳酸，加蒸馏水使L-乳酸、葡萄糖、纤维二糖浓度稀释至1～5g/L，6000～10000rpm离心10分钟，取上清液，用 0.22μm的水相滤膜过滤于液相小瓶中。
HPLC检测条件是：液相色谱柱为Bio-Rad Aminex HPX-87H，流动相为5mM的 H2SO4，流速为0.5mL/min，柱温为55℃，进样量为10μL，使用示差折光检测器(RID) 检测。
实施例五：
一种利用木质纤维素玉米芯残渣分批同步糖化发酵生产L-乳酸的方法，其步骤为：
(1)用GSY固体斜面培养基、50℃条件下活化凝结芽孢杆菌H-1菌株；
(2)接种活化后的凝结芽孢杆菌H-1菌株于GSY液体培养基中，用封口膜和塑料薄膜封住瓶口，以菌株消耗氧气创造无菌环境，在50℃、200rpm条件下培养12～16 小时，获得种子液；
(3)按20％的接种量将种子液转接到发酵罐培养基中，同时添加纤维素酶10U/g纤维素，β-葡萄糖苷酶15U/g纤维素，中性蛋白酶0.3g/L，控制发酵罐温度在50℃，搅拌转速为150rpm，发酵30～60小时；
(4)发酵期间每12小时取样，用HPLC检测L-乳酸、纤维二糖及葡萄糖浓度；
发酵36小时的乳酸产量为68g/L，得率为0.85g/g纤维素；其发酵曲线如图11所示。
本实施例中所述的GSY固体斜面培养基配方是：100g/L葡萄糖，10g/L酵母粉， 5g/L胰蛋白胨和50g/L CaCO3，添加2％琼脂糖。
菌株为凝结芽孢杆菌H-1，保藏于中国典型培养物保藏中心(湖北省武汉市珞珈山武汉大学，中国)，其保藏编号为CCTCC No.M 2013105。
GSY液体培养基配方是：100g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，5g/L胰蛋白胨和50g/LCaCO3。
发酵罐培养基配方是：100g/L玉米芯残渣，15g/L花生粕，30g/L CaCO3。
玉米芯残渣为玉米芯经过半纤维素去除及稀酸水解后的产物，购自山东龙力生物科技股份有限公司，根据NREL方法通过两步酸解测得玉米芯残渣中纤维素含量为59.51％，半纤维素含量为5.97％，木质素含量为24.10％。
取样分析时样品处理的具体方法是：将样品置于沸水浴中处理10分钟，取2mL 样品加入2mL 2M的H2SO4酸解10分钟，使乳酸钙转化为乳酸，加蒸馏水使L-乳酸、葡萄糖、纤维二糖浓度稀释至1～5g/L，6000～10000rpm离心10分钟，取上清液，用 0.22μm的水相滤膜过滤于液相小瓶中。
HPLC检测条件是：液相色谱柱为Bio-Rad Aminex HPX-87H，流动相为5mM的 H2SO4，流速为0.5mL/min，柱温为55℃，进样量为10μL，使用示差折光检测器(RID) 检测。
实施例六：
一种利用木质纤维素玉米芯残渣补料分批同步糖化发酵生产L-乳酸的方法，其步骤为：
(1)活化培养：将凝结芽孢杆菌H-1接种到GSY固体斜面培养基，50℃培养 12～24小时活化；
(2)种子培养：将接种活化后的凝结芽孢杆菌H-1菌株，在无菌环境中转接到所述GSY液体培养基，用封口膜和塑料薄膜封住瓶口，以菌株消耗氧气创造无菌环境，在50℃、200rpm条件下培养12～16小时，获得种子液；
(3)将种子液按照20％的接种量转接到发酵罐培养基中，同时添加纤维素酶 10U/g纤维素，β-葡萄糖苷酶15U/g纤维素和中性蛋白酶0.3g/L，控制发酵罐温度在 50℃，搅拌转速为150rpm，发酵72～140小时；
(4)在对数生长期5小时时，补料50g/L玉米芯残渣，15g/L CaCO3，10U/g纤维素的纤维素酶，15U/g纤维素的β-葡萄糖苷酶；
(5)发酵期间每12小时取样，用HPLC检测L-乳酸、纤维二糖及葡萄糖浓度；
发酵84小时的乳酸产量为79.1g/L，得率为0.76g/g纤维素；其发酵曲线如图12 所示。
本实施例中所述的GSY固体斜面培养基配方是：100g/L葡萄糖，10g/L酵母粉， 5g/L胰蛋白胨和50g/L CaCO3，添加2％琼脂糖。
菌株为凝结芽孢杆菌H-1，保藏于中国典型培养物保藏中心(湖北省武汉市珞珈山武汉大学，中国)，其保藏编号为CCTCC No.M 2013105。
GSY液体培养基配方是：100g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，5g/L胰蛋白胨和50g/LCaCO3。
发酵罐培养基配方是：100g/L玉米芯残渣，22.5g/L花生粕，30g/L CaCO3。
玉米芯残渣为玉米芯经过半纤维素去除及稀酸水解后的产物，购自山东龙力生物科技股份有限公司，根据NREL方法通过两步酸解测得玉米芯残渣中纤维素含量为59.51％，半纤维素含量为5.97％，木质素含量为24.10％。
取样分析时样品处理的具体方法是：将样品置于沸水浴中处理10分钟，取2mL 样品加入2mL 2M的H2SO4酸解10分钟，使乳酸钙转化为乳酸，加蒸馏水使L-乳酸、葡萄糖、纤维二糖浓度稀释至1～5g/L，6000～10000rpm离心10分钟，取上清液，用 0.22μm的水相滤膜过滤于液相小瓶中。
HPLC检测条件是：液相色谱柱为Bio-Rad Aminex HPX-87H，流动相为5mM的 H2SO4，流速为0.5mL/min，柱温为55℃，进样量为10μL，使用示差折光检测器(RID) 检测。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种利用木质纤维素玉米芯残渣高效生产L-乳酸的方法，其特征在于，以凝结芽孢杆菌为发酵菌株，利用单一的碳源、氮源，同步糖化发酵生产L-乳酸，其中所述碳源为玉米芯残渣。
2.如权利要求1所述的利用木质纤维素玉米芯残渣高效生产L-乳酸的方法，其特征在于，所述发酵菌株为凝结芽孢杆菌H-1，保藏于中国典型培养物保藏中心(湖北省武汉市珞珈山武汉大学，中国)，其保藏编号为CCTCC No.M 2013105。
3.如权利要求1所述的利用木质纤维素玉米芯残渣高效生产L-乳酸的方法，其特征在于，所述玉米芯残渣为玉米芯经过半纤维素去除及稀酸水解后的产物。
4.如权利要求1所述的利用木质纤维素玉米芯残渣高效生产L-乳酸的方法，其特征在于，所述氮源为花生粕。
5.如权利要求1所述的利用木质纤维素玉米芯残渣高效生产L-乳酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1、活化培养：将所述发酵菌株接种到固体斜面培养基，50℃培养12～24小时；
步骤2、种子培养：将步骤1中活化后的所述发酵菌株，在无菌环境中转接到液体培养基，封住瓶口，以所述发酵菌株消耗氧气创造无菌环境，在50℃、200rpm条件下培养12～16小时，获得种子液；
步骤3、发酵罐培养：将步骤2中所述种子液按照5～25％的接种量转接到发酵罐培养基中，同时添加纤维素酶0～20U/g纤维素，β-葡萄糖苷酶0～20U/g纤维素和中性蛋白酶0.3g/L，控制发酵罐温度在50℃，搅拌转速为150rpm，培养30～84小时；
步骤4、检测：发酵结束后取样，检测L-乳酸、纤维二糖及葡萄糖浓度。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤1中的所述固体斜面培养基为GSY固体斜面培养基，其配方为：100g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，5g/L胰蛋白胨，50g/L CaCO3，和2％琼脂糖；所述步骤2中的所述液体培养基为GSY液体培养基，其配方为：100g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，5g/L胰蛋白胨，50g/L CaCO3。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤3中的所述发酵罐培养基配方为：60～140g/L玉米芯残渣，9～21g/L花生粕，18～42g/L CaCO3。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤4还包含以下步骤：
步骤4.1、样品处理：将样品置于沸水浴中处理10分钟，取2mL所述样品加入2mL 2M的H2SO4酸解10分钟，使乳酸钙转化为乳酸，加蒸馏水使L-乳酸、葡萄糖、纤维二糖浓度稀释至1～5g/L，6000～10000rpm离心10分钟，取上清液，用0.22μm的水相滤膜过滤于液相小瓶中；
步骤4.2、样品检测：用HPLC检测，检测条件为：液相色谱柱为Bio-RadAminex HPX-87H，流动相为5mM的H2SO4，流速为0.5mL/min，柱温为55℃，进样量为10μL，使用示差折光检测器(RID)检测。
9.如权利要求2所述的利用木质纤维素玉米芯残渣高效生产L-乳酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1、活化培养：将所述凝结芽孢杆菌H-1接种到GSY固体斜面培养基，50℃培养12～24小时；
步骤2、种子培养：步骤1中活化后的所述凝结芽孢杆菌H-1，在无菌环境中转接到GSY液体培养基，用封口膜和塑料薄膜封住瓶口，以所述凝结芽孢杆菌H-1消耗氧气创造无菌环境，在50℃、200rpm条件下培养12～16小时，获得种子液；
步骤3、发酵罐培养：将步骤2中所述种子液按照5～25％的接种量转接到发酵罐培养基中，同时添加纤维素酶0～20U/g纤维素，β-葡萄糖苷酶0～20U/g纤维素和中性蛋白酶0.3g/L，控制发酵罐温度在50℃，搅拌转速为150rpm，发酵72～140小时；
步骤4、补料：在对数生长期4～7小时时，补料30～70g/L所述玉米芯残渣，9～21g/LCaCO3，2～20U/g纤维素的纤维素酶，0～20U/g纤维素的β-葡萄糖苷酶；
步骤5、检测：发酵结束后取样，检测L-乳酸、纤维二糖及葡萄糖浓度。
10.如权利要求9所述的利用木质纤维素玉米芯残渣高效生产L-乳酸的方法，其特征在于，所述步骤1中的所述GSY固体斜面培养基的配方为：100g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，5g/L胰蛋白胨，50g/L CaCO3，和2％琼脂糖；所述步骤2中的所述GSY液体培养基的配方为：100g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，5g/L胰蛋白胨，50g/L CaCO3；所述步骤3中的所述发酵罐培养基的配方为：60～140g/L玉米芯残渣，13.5～31.5g/L花生粕，18～42g/L CaCO3。
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