CN101294171B - 一种由木质纤维质原料制备微生物油脂的方法 - Google Patents
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Abstract
一种由木质纤维质原料制备微生物油脂的方法，属于生物化工技术领域。工艺包括：由木质纤维质原料通过两步水解法制备水解液，以及水解液经两次补料发酵工艺制备微生物油脂的方法。采用该工艺，可利用木质纤维质原料制备较高含量及产量的微生物油脂。发酵底物和流加底物均可采用木质纤维质原料水解液，充分利用了木质纤维质资源，降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，特别涉及一种由木质纤维质原料制备微生物油脂的方法。
背景技术
生物柴油是近年来基于环境恶化和能源危机发展起来的一种可替代化石燃料的可再生新能源，生物柴油就是一种具有很大发展潜力的可再生清洁能源。目前国内外对于生物柴油制备的研究主要集中于植物油或餐饮废弃油脂方面，但利用植物油为原料成本高，其成本占到总生产成本的70％～85％，以餐饮废弃油为原料，也存在原料难以收集和运输的困难，这些都严重地制约了生物柴油的产业化进程，因此寻找一种廉价的原料成为了生物柴油产业化的关键。
微生物油脂(microbial oil)又称单细胞油脂(single cell oil)，是由酵母、霉菌、细菌和藻类等微生物在一定的条件下，利用碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂作为碳源，在菌体内产生的大量油脂。生物柴油由各种动、植物油脂经酯化或转酯化工艺而得，而大部分微生物油的脂肪酸组成和一般植物油相近，因此微生物油脂可替代植物油脂生产生物柴油[李小松，余扬帆.微生物油脂.食品科技，1997，(5)：8-9.Das UN.Essential fatty acid metabolism in patients withessential hypertension，diabetes mellitus and coronary heart disease.Prostaglandins，Leukotrienes & Essential Fatty Acids，1995，52(6)：387-391.]
木质纤维素是地球上最丰富、最廉价的再生资源。有资料表明，全世界每年的植物体生成量高达1.55×1011吨干物质。木质生物资源的主要成分是纤维素、半纤维素和木质素。其中，纤维素、半纤维素是可发酵糖的来源，含量占66％-79％(纤维质原料的绝对干重量)。我国是一个农业大国，若能把大量的农业纤维原料及工业纤维废料中的纤维素经济地、有效地水解成糖化液，并加以利用，这将有利于改善目前资源日益紧张，环境日益恶劣的状况，具有重要的经济和社会意义。
目前，微生物油脂的研究主要以葡萄糖为原料采用批式发酵5-7天，油脂含量可达细胞干重的20-50％。因此，仍需要开发新的工艺，提高油脂含量、生物量，并采用廉价原料为底物，从而降低生产成本。
发明内容
本发明的目的在于提供一种一种由木质纤维质原料制备微生物油脂的方法，提高油脂含量、生物量，并采用廉价原料为底物，从而降低生产成本。
本发明是由木质纤维质原料通过两步水解法制备水解液，以及水解液经两次补料发酵工艺制备微生物油脂的方法。其具体的工艺步骤如下：
1、用粉碎机对甘蔗渣、玉米芯等木质纤维质原料进行粉碎，然后用1-2％的NaOH按液固比15-25∶1在振荡器上将原料处理15-20小时，再用去离子水将原料洗净后烘干，将烘干后的原料用1-2％硫酸110-130℃水解，水解体系中液固质量比：8-10∶1(均为质量百分数)，水解2-4h后得到水解液。
2、所得水解液减压蒸馏去除糠醛，并将水解液浓缩至总糖浓度在30-50g/L，用KOH调节水解液pH为6-7，
3、离心取上清液，按照C/N＝40-50(质量比)加入硫酸铵或硝酸钾以及微量元素溶液，完全溶解后，121℃灭菌15min。
4、将粘红酵母，斯达凯依酵母，被孢霉，拉曼被孢霉等可产生微生物油脂的酵母或霉菌接入种子培养基培养24-30h，以5％-10％的(体积百分数)接种量接入发酵培养基。摇瓶培养温度25-35℃，摇床转速150-250r/min。发酵罐培养pH＝6.0-7.0，通气量0.5-1.1vvm，搅拌转速300-600r/min。
5、发酵培养至菌体对数生长期24-48h以及发酵后期60-96h进行补料，向培养基中补加10g/L-20g/L葡萄糖和木糖的混合溶液(木糖∶葡萄糖＝2～2.5∶1)或木质纤维质水解液等碳源，并以C/N＝40同时进行硫酸氨或硝酸钾等氮源的补加。
6、发酵72-144h结束，4℃，4000-5000r/min离心菌体，提取微生物油脂进行测定。
本发明的有益效果
采用两步水解法制备木质纤维质原料水解液可有效除去乙酸和糠醛对菌体生长的毒害，木质纤维质原料水解液经两次补料发酵工艺可制备较高含量及产量的微生物油脂。发酵底物和流加底物均可采用木质纤维质原料水解液，充分利用了木质纤维质资源，降低了生产成本。
具体实施方式
本发明提供一种由木质纤维质原料制备微生物油脂的方法，工艺包括：由木质纤维质原料通过两步水解法制备水解液，以及水解液经两次补料发酵工艺制备微生物油脂的方法。
下面再举具体实施例对本发明予以进一步说明。
实例一：
1.蔗渣预处理
取一定重量20～40目烘干恒重的甘蔗渣于锥形瓶中，先用1％(质量分数)的NaOH按液固比25∶1在振荡器上将甘蔗渣处理20小时，温度固定为30℃，振荡器转速为140r/min。预处理结束后，用去离子水洗涤并抽滤，将洗涤至中性的甘蔗渣在鼓风干燥箱中105℃烘4h，干燥器中冷却至室温，置于样品袋中保存备用。将烘干后的甘蔗渣进行稀酸水解。硫酸浓度＝1.24％，时间＝2.64h，温度＝123℃，液固比固定在10∶1。所得水解液减压蒸馏去除糠醛，并将水解液浓缩至总糖浓度在30g/L左右，用KOH调节水解液pH为6，3000r/min离心。
2.发酵
(1)菌种：黏红酵母(Rhodotorula gutini As2.107)，购自中国科学研究院微生物研究所。
(2)培养基：
①固体斜面培养基
酵母粉：10g/L；蛋白胨：20g/L；葡萄糖：20g/L；琼脂：20g/L；pH＝5。
②种子培养基
葡萄糖：15g/L；(NH4)2SO4：2g/L；酵母粉：1g/L；KH2PO4：7g/L；Na2HPO4：2g/L；MgSO4：1.5g/L；pH＝5.5。
③发酵培养基：步骤1中离心所得上清液中加入KNO3：3.8g/L；酵母粉：4g/L；KH2PO4：6g/L；Na2HPO4：2g/L；MgSO4：2g/L；pH＝6，115℃灭菌20min。
(3)发酵方式：将固体斜面培养的菌种接至种子培养基中培养24h，然后按5％的接种量转接至发酵培养基，对菌体进行发酵培养。500ml摇瓶装量100ml，培养温度30℃，摇床转速150r/min。发酵24h和60h分别补料两次，加入10g/l木糖和葡萄糖混合溶液(2.5∶1)，同时以C/N＝40补加硝酸钾。
(4)发酵结果，
72h发酵完后，其生物量达到15.1g/L，油脂含量达到32.5％。
实施例二
1.蔗渣预处理
取一定重量20～40目烘干恒重的甘蔗渣于锥形瓶中，先用1％(质量分数)的NaOH按液固比25∶1在振荡器上将甘蔗渣处理20小时，温度固定为30℃，振荡器转速为140r/min。预处理结束后，用去离子水洗涤并抽滤，将洗涤至中性的甘蔗渣在鼓风干燥箱中105℃烘4h，干燥器中冷却至室温，置于样品袋中保存备用。将烘干后的甘蔗渣进行稀酸水解。硫酸浓度＝1.24％，时间＝2.64h，温度＝123℃，液固比固定在10∶1。所得水解液减压蒸馏去除糠醛，并将水解液浓缩至总糖浓度在50g/L左右，用KOH调节水解液pH为6，3000r/min离心。
3.发酵
(5)菌种：黏红酵母(Rhodotorula gutini As2.107)，购自中国科学研究院微生物研究所。
(6)培养基：
①固体斜面培养基
酵母粉：10g/L；蛋白胨：20g/L；葡萄糖：20g/L；琼脂：20g/L；pH＝5。
②种子培养基
葡萄糖：15g/L；(NH4)2SO4：2g/L；酵母粉：1g/L；KH2PO4：7g/L；Na2HPO4：2g/L；MgSO4：1.5g/L；pH＝5.5。
③发酵培养基：步骤1中离心所得上清液中加入KNO3：3.8g/L；酵母粉：4g/L；KH2PO4：6g/L；Na2HPO4：2g/L；MgSO4：2g/L；pH＝6，115℃灭菌20min。
(7)发酵方式：将固体斜面培养的菌种接至种子培养基中培养24h，然后按5％的接种量转接至发酵培养基，对菌体进行发酵培养。1L发酵罐装量750ml，培养温度30℃，摇床转速550r/min。通气量1.0vvm。发酵36h和96h分别补料两次，加入总糖浓度为15g/l蔗渣水解液，同时以C/N＝40补加硝酸钾。
(8)发酵结果，
132h发酵完后，其生物量达到17.5g/L，油脂含量达到52.1％。
实施例三
1.玉米芯预处理
取一定重量20～40目烘干恒重的玉米芯原料于锥形瓶中，先用1％(质量分数)的NaOH按液固比25∶1在振荡器上将甘蔗渣处理20小时，温度固定为30℃，振荡器转速为140r/min。预处理结束后，用去离子水洗涤并抽滤，将洗涤至中性的玉米芯原料在鼓风干燥箱中105℃烘4h，干燥器中冷却至室温，置于样品袋中保存备用。将烘干后的甘蔗渣进行稀酸水解。硫酸浓度＝1.15％，时间＝1h，温度＝115℃，液固比固定在10∶1。所得水解液减压蒸馏去除糠醛，并将水解液浓缩至总糖浓度在50g/L左右，用KOH调节水解液pH为6，3000r/min离心。
2.发酵
(1)菌种：黏红酵母(Rhodotorula gutiniAs2.107)，购自中国科学研究院微生物研究所。
(2)培养基：
①固体斜面培养基
同实施例1
②种子培养基
同实施例1
③发酵培养基：步骤1中离心所得上清液中加入KNO3：3.8g/L；酵母粉：4g/L；KH2PO4：6g/L；Na2HPO4：2g/L；MgSO4：2g/L；pH＝6，115℃灭菌20min。
3.发酵方式：将固体斜面培养的菌种接至种子培养基中培养24h，然后按5％的接种量转接至发酵培养基，对菌体进行发酵培养。1L发酵罐装量750ml，培养温度30℃，摇床转速550r/min。通气量1.0vvm。发酵36h和96h分别补料两次，加入总糖浓度为15g/l玉米芯水解液，同时以C/N＝40补加硝酸钾。
4.发酵结果，
132h发酵完后，其生物量达到14.5g/L，油脂含量达到42.5％。
Claims (1)
1.一种由木质纤维质原料制备微生物油脂的方法，其特征在于，工艺包括：由木质纤维质原料通过两步水解法制备水解液，以及水解液经两次补料发酵工艺制备微生物油脂；
所述由木质纤维质原料通过两步水解法制备水解液的工艺步骤包括：
(1)水解前用粉碎机对甘蔗渣或玉米芯进行粉碎，然后用质量分数为1-2％的NaOH按液固比15-25∶1在振荡器上将木质纤维质原料处理15-20小时，再用去离子水将原料洗净后烘干，将烘干后的原料用1-2％硫酸110-130℃水解，水解体系中液固质量比：8-10∶1，水解2-4h后得到水解液；
(2)所得水解液减压蒸馏去除糠醛，并将水解液浓缩至总糖浓度在30-50g/L，用KOH调节水解液pH为6-7；
所述木质纤维质原料水解液经两次补料发酵工艺制备微生物油脂的工艺步骤为：
(1)将黏红酵母接入种子培养基培养24-30h，以5％-10％的体积百分数接种量接入发酵培养基；摇瓶培养温度25-35℃，摇床转速150-250r/min；发酵罐培养pH＝6.0-7.0，通气量0.5-1.1vvm，搅拌转速300-600r/min；所述的种子培养基为：葡萄糖：15g/L；(NH4)2SO4：2g/L；酵母粉：1g/L；KH2PO4：7g/L；Na2HPO4：2g/L；MgSO4：1.5g/L；pH＝5.5；所述的发酵培养基为木质纤维质原料水解液离心所得上清液中加入KNO3：3.8g/L；酵母粉：4g/L；KH2PO4：6g/L；Na2HPO4：2g/L；MgSO4：2g/L；pH＝6；
(2)发酵培养至菌体对数生长后期24-48h以及发酵后期60-96h进行补料，向培养基中补加10g/L-20g/L葡萄糖和木糖的混合溶液或木质纤维质原料水解液碳源，并以C/N＝40-50质量比同时进行硫酸铵或硝酸钾氮源的补加；
(3)发酵72-144h结束，4℃，4000-5000r/min离心菌体，提取微生物油脂进行测定；
所述的木糖与葡萄糖比为2-2.5∶1。
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