CN102304479A - 添加植物激素的培养基及其在裂殖壶菌发酵中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了添加植物激素的培养基及其在裂殖壶菌发酵中的应用。所述培养基包括以下组分：以葡萄糖为碳源，浓度为10-100g/L；以酵母提取物为氮源，浓度为10-80g/L；海水占培养基总体积的20%-80%；分别添加6-苄基腺嘌呤、糠基氨基嘌呤、赤霉素、吲哚丁酸、萘乙酸和吲哚乙酸中的一种。本发明在裂殖壶菌发酵培养基中加入适宜浓度的植物激素，细胞分裂素6-苄基腺嘌呤、糠基氨基嘌呤、赤霉素、植物生长素吲哚丁酸、萘乙酸和吲哚乙酸均能显著提高裂殖壶菌生长速度和增加DHA含量；而且，采用本发明所述技术方案，可以显著降低裂殖壶菌的发酵成本，提高发酵效率，从而促进产业发展。
Description
技术领域
本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及一种添加有植物激素的培养基及其在裂殖壶菌发酵中的应用。
背景技术
研究表明，以二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，DHA，C22：6，n-3)为代表的n-3多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFAs)是必须脂肪酸，因为具有有益于人类健康的多种生理功能受到广泛的重视。DHA是大脑皮层和视网膜的关键组份，对婴幼儿视觉和神经系统的正常发育，维持视觉和神经系统的功能至关重要。另外，还具有预防心血管疾病、抗癌、抗炎等生理功能。
裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)是一种海洋真菌，这种真菌最显著的特点是细胞内积累大量的油脂，90％以上的油脂以人体易吸收的中性油脂-甘油三脂的形式存在。总脂肪酸中不饱和脂肪酸含量很高，主要为DHA。裂殖壶菌生长速度快，易于进行发酵生产。该物种使用安全，没有任何毒副作用，是一种生产DHA的理想的生物资源。本世纪以来，用裂殖壶菌发酵生产DHA取得了长足的进展，成为我国DHA的主要来源。
植物激素(plant hormone)是在植物体内合成，并从产生之处运送到别处，虽然浓度很低，但是对植物的生理过程及生长发育产生显著作用的生物活性物质。目前已发现的植物激素有细胞分裂素、生长素、赤霉素、乙烯和落叶酸5类，前三者为促进生长发育的激素，而后两者是负向激素，能够抑制生长发育。研究表明，有的真菌(如根瘤菌)能够直接合成或者诱导植物合成植物激素。植物激素对真菌的生长和代谢有也有一定的影响，杨中宝等(2005)研究了激素对丛枝菌根(Arbuscular mycorrhizae)侵染和产孢的影响；于建新等(2009)研究了菌根真菌生长及其与植物共生过程中可直接合成或诱导植物产生多种激素类物质，如生长素等，菌根真菌对植物激素种类、形态和含量的影响等。但还未见关于植物激素对裂殖壶菌的影响的报道。
发明内容
针对现有技术中还未有关于植物激素对裂殖壶菌影响的报道，本发明提供了添加植物激素的培养基及其在裂殖壶菌发酵中的应用，本发明通过在海洋真菌裂殖壶菌发酵生产时添加适当浓度的植物激素，达到了促进裂殖壶菌生长及提高DHA含量的目的。
为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：
添加植物激素的培养基，它包括以下组分：
以葡萄糖为碳源， 浓度为10-100g/L；
以酵母提取物为氮源，浓度为10-80g/L；
海水 占培养基总体积的20％-80％；
分别添加6-苄基腺嘌呤、糠基氨基嘌呤、赤霉素、吲哚丁酸、萘乙酸和吲哚乙酸中的一种。
对上述技术方案的进一步改进：所述6-苄基腺嘌呤浓度为1-10mg/L；糠基氨基嘌呤浓度为1-20mg/L；赤霉素浓度为1-10mg/L；所述吲哚丁酸浓度为1-10mg/L；α-萘乙酸浓度为1-10mg/L；吲哚乙酸浓度为1-10mg/L。
对上述技术方案的进一步改进：所述葡萄糖的优化浓度为40-80g/L。
对上述技术方案的进一步改进：所述酵母提取物的优化浓度为20-60g/L。
对上述技术方案的进一步改进：所述海水占培养基的优化比例为30％-70％。
本发明还提供了添加植物激素的培养基在裂殖壶菌发酵中应用。
对上述技术方案的进一步改进：所述裂殖壶菌为裂殖壶菌OUC88，菌种保藏号：CGMCC NO.1240，保藏日期：2004.10.27。
对上述技术方案的进一步改进：所述裂殖壶菌以1-10％的接种量接入所述培养基中。
对上述技术方案的进一步改进：所述裂殖壶菌的发酵培养温度为18-30℃，pH值为4-8，转速为100-250rpm，振荡培养3-7天。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明通过在裂殖壶菌发酵培养基中添加适宜浓度的植物激素，以检测植物激素对裂殖壶菌产生的影响，所述植物激素分别为细胞分裂素6-苄基腺嘌呤、糠基氨基嘌呤、赤霉素、植物生长素吲哚丁酸、萘乙酸和吲哚乙酸，它们单独添加均能显著提高裂殖壶菌生长速度和增加DHA含量；而且，采用本发明所述技术方案，可以显著降低裂殖壶菌的发酵成本，提高发酵效率，从而促进产业发展。
结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。
附图说明
图1表明本发明中6-BA对裂殖壶菌生长和DHA含量的影响。
图2表明本发明中KT对裂殖壶菌生长和DHA含量的影响。
图3表明本发明中GA对裂殖壶菌生长和DHA含量的影响。
图4表明本发明中IBA对裂殖壶菌生长和DHA含量的影响。
图5表明本发明中NAA对裂殖壶菌生长和DHA含量的影响。
图6表明本发明中IAA对裂殖壶菌生长和DHA含量的影响。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
在研究植物激素对裂殖壶菌的作用模式的时候，主要考查裂殖壶菌的生物量及细胞中DHA的含量，因为两者是判断生产效率提高的两个关键因素。
为了提高裂殖壶菌的生产效益，本发明通过在裂殖壶菌的发酵培养基中分别添加6种不同植物激素验证这些植物激素对裂殖壶菌的影响，并通过进一步的实验确定出各种植物激素的优化添加量，本发明所述6种植物激素包括：细胞分裂素6-苄基腺嘌呤(BA)、糠基氨基嘌呤(KT)、赤霉素(GA)、植物生长素吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)和吲哚乙酸(IAA)，以不添加植物激素的培养基作为对照，比较不同组别裂殖壶菌的生物量和DHA含量，本发明的实验主要包括两类：
1.比较不同的植物激素对裂殖壶菌的生物量和DHA积累的作用；
2.比较同一种植物激素在不同剂量条件下对裂殖壶菌生长和DHA积累的作用。
实施例1：6-BA对裂殖壶菌的生物量与DHA含量的影响
裂殖壶菌培养基以葡萄糖为碳源，浓度为60g/L；以酵母提取物为氮源，浓度为20g/L；培养基中海水的比例为50％。
然后在裂殖壶菌培养基中加入6-BA，添加浓度分别为0.5mg/L、1mg/L、3mg/L、6mg/L和10mg/。
将裂殖壶菌以10％的接种量接入所述培养基中。
发酵培养温度为23±1℃，pH值为6，转速为200rpm，振荡培养4天。
如图1所示，结果表明：6-BA添加浓度为0.5mg/L时对裂殖壶菌的生物量与DHA含量的影响作用不明显，浓度为11mg/L和3mg/L条件下，6-BA对裂殖壶菌生长和DHA含量起促进作用，3mg/L时裂殖壶菌生物量达到最大值，生物量比对照组的7.30g/L·d提高到9.28g/L·d，提高了27.1％；DHA含量从13.0％提高到16.9％，提高了30.0％。但浓度为6mg/L和10mg/L时，6-BA对裂殖壶菌生长和DHA含量产生抑制作用。
实施例2：KT对裂殖壶菌的生物量与DHA含量的影响
裂殖壶菌培养基组成及培养方法如实施例1所述。
如图2所示，结果表明：KT在低浓度时(≤10mg/L)能够提高裂殖壶菌的生物量和DHA含量，在KT添加量为10mg/L时，裂殖壶菌生物量达到9.55g/L·d，比对照组高2.25g/L·d；DHA含量14.9％，比对照组高1.9％。当KT添加量为15mg/L或更高(20mg/L)的情况下，对裂殖壶菌的生长和DHA积累产生明显的抑制作用。
实施例3：GA对裂殖壶菌的生物量与DHA含量的影响
裂殖壶菌培养基组成及培养方法如实施例1所述。
在培养基中加入GA，添加浓度分别为0.5mg/L，1.0mg/L，3mg/L，6mg/L和10mg/L。
如图3所示，结果表明：当GA添加量为1mg/L时，裂殖壶菌生物量和DHA含量均达到最大值，分别是8.62g/L·d和17.2％，分别比对照组高1.32g/L·d和4.2％。
实施例4：IBA对裂殖壶菌的生物量与DHA含量的影响
裂殖壶菌培养基组成及培养方法如实施例1所述。
在裂殖壶菌培养基中加入浓度为0.5mg/L、1mg/L、3mg/L、6mg/L、10mg/L的IBA。
如图4所示，结果表明：IBA对裂殖壶菌生长和DHA含量的影响较小，随着IBA添加量的增大，裂殖壶菌生物量和DHA含量都缓慢上升。在IBA添加量在3mg/L时，裂殖壶菌生长和DHA含量达到最大值，分别比空白高1.36g/L·d和3.1％，在添加量超过3mg/L起抑制作用。
实施例5：α-萘乙酸(NAA)对裂殖壶菌的生物量与DHA含量的影响
裂殖壶菌培养基组成及培养方法如实施例1所述。
在裂殖壶菌培养基中分别加入0.5mg/L、1mg/L、3mg/L、6mg/L、10mg/L的NAA。
如图5所示，结果表明：当NAA添加量从0.5mg/L到6mg/L时，随着NAA添加量的增加，裂殖壶菌生物量和DHA含量逐渐增加，但增幅较小，在NAA添加量为6mg/L时达到最大8.40g/L·d，15.8％，分别比对照组高1.10g/L·d和2.8％；添加量为10mg/L，有明显的抑制作用。
实施例6：吲哚乙酸(IAA)对裂殖壶菌的生物量与DHA含量的影响
裂殖壶菌培养基组成及培养方法如实施例1所述。
在裂殖壶菌培养基中加入IAA，浓度为0.5mg/L、1mg/L、3mg/L、6mg/L和10mg/L。
如图6所示，结果表明：低浓度(0.5mg/L、1mg/L和3mg/L)的IAA对裂殖壶菌生长和DHA含量有一定的促进作用，添加量为3mg/L时生物量和DHA含量均达到最大值，分别是8.29g/L·d和16.0％，分别比对照组高0.99g/L·d和3.0％。
实施例7：3种植物激素对裂殖壶菌生长与DHA含量影响
为了试验多种植物激素对裂殖壶菌的生长和DHA含量的影响，本发明选择了有明显促进作用的3种激素(6-BA、KT及GA)在有效浓度范围内进行三因子三水平正交试验(6-BA：0mg/L，1.5mg/L，3.0mg/L；KT：0mg/L，5.0mg/L，10.0mg/L；GA：0mg/L，0.5mg/L，1.0mg/L)。
正交实验的裂殖壶菌培养基组成及培养条件与实施例1-6相同。
正交实验结果如表1所示，生物量最高的是第6组(6-BA 1.5mg/L，KT10mg/L)，达到8.88g/L.d，比对照组提高28.9％；DHA含量最高的是第4组(6-BA1.5mg/L，GA0.5mg/L)，为14.2％，提高了13.6％。与实施例1、实施例2和实施例3比较，3种植物激素复合使用对DHA积累的促进作用明显低于单独使用的6-BA、KT和GA，说明在某些组合中甚至出现了拮抗效应，DHA含量有所降低。因此建议在裂殖壶菌发酵生产中单独添加适量的植物激素。
表1：3种植物激素对裂殖壶菌生长与DHA含量影响的正交实验
实施例8、在100L发酵罐中6-BA对裂殖壶菌生长与DHA含量的影响
因此采取在裂殖壶菌发酵培养基中单独添加植物激素的方式，本实施例选取所述6种植物激素中对裂殖壶菌影响最大的6-BA进行扩大培养实验，培养基配方具体如下。
100L发酵罐培养基：
葡萄糖70g/L；
酵母提取物40g/L；
海水50％；
植物激素实验组，6-BA 3mg/L；
植物激素对照组，6-BA 0mg/L；
其他条件：
初始pH值，7.0
发酵温度，25℃
接种量，10％
通气量，1∶1
发酵时间，72h。
发酵完成后，离心收集菌体，冷冻干燥后，测菌体细胞干重和测定菌体中DHA的含量。
表2：6-BA对裂殖壶菌生长与DHA含量的影响(100L发酵罐)
| 生物量(g/l d) | DHA含量(％) | |
| 实验组 | 13.8 | 17.3 |
| 对照组 | 12.0 | 14.8 |
从表2看出，在100L反应罐发酵时，添加6-BA的浓度为3mg/L，裂殖壶菌的生物量从12.0g/l d到13.8g/l d，提高了15.0％，DHA含量从14.8％到17.3％，提高了16.9％，证明6-BA对裂殖壶菌的生长和DHA积累都有显著地促进作用。
本发明的裂殖壶菌培养基以葡萄糖为碳源，浓度为60g/L；以酵母提取物为氮源，浓度为20g/L；培养基中海水的比例为50％。通过本领域技术人员的上述常规实验操作可以配制葡萄糖浓度为10-100g/L，酵母提取物浓度为10-80g/L，海水占培养基总体积的20％-80％的裂殖壶菌培养基；并将裂殖壶菌接种于所述配制的培养基中，检测到的植物激素产生的影响与实施例1-6的实验结果相同。并通过同样的实验操作得出葡萄糖优化浓度为40-80g/L，酵母提取物优化浓度为20-60g/L，海水占培养基的优化比例为30％-70％，在优化浓度配方的培养基下，裂殖壶菌生长情况最好。
本发明试验了细胞分裂素6-苄基腺嘌呤(BA)、糠基氨基嘌呤(KT)、赤霉素(GA)、植物生长素吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)和吲哚乙酸(IAA)对裂殖壶菌生长率和DHA的影响。本发明经实验证明，在裂殖壶菌培养基中添加微量植物激素，能够显著提高裂殖壶菌的生长速度和细胞中DHA含量。而且，本发明简便易行，投入产出比高，对于提高裂殖壶菌发酵生产效率，降低成本，促进产业发展，有积极意义。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (9)
1.添加植物激素的培养基，其特征在于它包括以下组分：
以葡萄糖为碳源， 浓度为10-100g/L；
以酵母提取物为氮源，浓度为10-80g/L；
海水 占培养基总体积的20%-80%；
分别添加6-苄基腺嘌呤、糠基氨基嘌呤、赤霉素、吲哚丁酸、萘乙酸和吲哚乙酸中的一种。
2.根据权利要求1所述的添加植物激素的培养基，其特征在于：所述6-苄基腺嘌呤浓度为1-10mg/L；糠基氨基嘌呤浓度为1-20mg/L；赤霉素浓度为1-10mg/L；所述吲哚丁酸浓度为1-10mg/L；α-萘乙酸浓度为1-10mg/L；吲哚乙酸浓度为1-10mg/L。
3.根据权利要求2所述的添加植物激素的培养基，其特征在于：所述葡萄糖的优化浓度为40-80g/L。
4.根据权利要求2所述的添加植物激素的培养基，其特征在于：所述酵母提取物的优化浓度为20-60g/L。
5.根据权利要求2所述的添加植物激素的培养基，其特征在于：所述海水占培养基的优化比例为30%-70%。
6.添加植物激素的培养基在裂殖壶菌发酵中的应用。
7.根据权利要求6所述的添加植物激素的培养基在裂殖壶菌发酵中的应用，其特征在于：所述裂殖壶菌为裂殖壶菌OUC88，菌种保藏号：CGMCC NO.1240，保藏日期：2004.10.27。
8.根据权利要求6所述的添加植物激素的培养基在裂殖壶菌发酵中的应用，其特征在于：所述裂殖壶菌以1-10%的接种量接入所述培养基中。
9.根据权利要求6所述的添加植物激素的培养基在裂殖壶菌发酵中的应用，其特征在于：所述裂殖壶菌的发酵培养温度为18-30℃，pH值为4-8，转速为100-250rpm，振荡培养3-7天。
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