CN110452937B

CN110452937B - 一种提高微藻油脂产量的方法

Info

Publication number: CN110452937B
Application number: CN201910845622.7A
Authority: CN
Inventors: 高锋; 李晨; 杨红丽; 陆苗苗
Original assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Current assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Priority date: 2019-09-02
Filing date: 2019-09-02
Publication date: 2023-05-05
Anticipated expiration: 2039-09-02
Also published as: CN110452937A

Abstract

本发明提供一种提高微藻油脂产量的方法，属于生物工程和生物能源领域，微藻的培养为光能异养培养，其中，微藻为小球藻，异养培养基所用培养基中新橙皮苷的初始浓度为0.75‑1.1g/L。该方法对微藻生长无明显毒副作用，在保证微藻较高生物量的同时，能够促进ME编码基因me g4297和me g6562的表达，增加细胞内电子能量的供给，为脂肪合成提供更多的NADPH；促进DGAT编码基因dgat g3280和dgat g7566的表达，提高TAG的合成量，提高油脂含量，提高油脂产量。

Description

一种提高微藻油脂产量的方法

技术领域

本发明属于生物工程和生物能源领域，具体涉及一种提高微藻油脂产量的方法。

背景技术

最早在20世纪70年代，微藻就曾在一次石油危机期间被当做是化石燃料的替代燃料，然而，因为成本过高，当时并没能进行深入的研究。后来因能源短缺等问题，微藻再次作为产油原料被广泛关注。美国是最早正式开始藻类研究，并成功完成了远海大规模培养的国家。随后，对于产油微藻的研究在世界范围内掀起热潮。英国，日本，中国等国家也先后开展相关研究，从各方面着手探究微藻生物柴油产业化的方式。应用于生产生物柴油的微藻主要受关注的指标是微藻细胞的含油量。微藻种类繁多，因藻种差异和培养方式不同，微藻含油量一般在5％-75％之间，已知的含油量高的微藻有小球藻(Chlorella sp.)、杜氏盐藻(Dunaliella sp.)、微绿球藻 (Nannochloropsis sp.)等真核藻类。微藻的异养化培养技术起步较晚，1953年，Lewin等首次发现了可异养微藻，由此拉开了微藻异养培养研究的序幕。在20世纪90年代，有学者研究改良得到了几种异养培养基配方，为之后的研究打下了基础。相比于自养培养，异养培养过程需要额外提供有机物作为碳源，无需人为增加光照，利用工业发酵方法，可以节省空间，提高生长速度和单位体积产率，通过自动化控制方便管理，降低采收等技术的成本，克服了自养体系的诸多缺点。

现有技术如授权公告号为CN 103757064 B的中国发明专利，该发明公开了一种pH调控微藻油脂快速积累的方法，步骤为：(1)微藻生物量预培养：在反应器中培养微藻，直至所述微藻的生长进入稳定期；(2)CO2培养：向反应器中通入含CO2废气，对步骤(1)得到的微藻进行培养，直至所述微藻进入稳定期后，继续培养2～3天；(3)微藻油脂快速积累：停止向反应器中通入CO2气体，改通入空气，直至培养液pH值高于10。所述方法克服了高浓度CO2 条件下微藻油脂含量不高的问题，实现了在氮源充足条件下油脂的快速积累；具有生物量密度高、油脂积累迅速、操作成本低、方便快捷、能量消耗小等优势。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高微藻油脂产量的方法，该方法对微藻生长无明显毒副作用，在保证微藻较高生物量的同时，能够促进ME编码基因me g4297和me g6562的表达，增加细胞内电子能量的供给，为脂肪合成提供更多的NADPH；促进DGAT编码基因dgatg3280 和dgat g7566的表达，提高TAG的合成量，提高油脂含量，提高油脂产量。

发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

一种提高微藻油脂产量的方法，微藻培养为异养培养，其中，微藻为小球藻，异养培养所用培养基中新橙皮苷的初始浓度为0.75-1.1g/L。微藻油脂的主要成分为甘油三酯(TAG)，其生物合成以脂肪酸作为前体，过程分为脂肪酸的合成、TAG的生物合成及油体的形成三个阶段。中心碳代谢中与油脂合成相关的酶，即苹果酸酶(ME)，催化苹果酸转化为丙酮酸，生成的丙酮酸可以进入脂肪酸合成通路，同时将一分子的NADP⁺还原为NADPH。微藻代谢途径中脂肪酸合成酶几乎只能利用由苹果酸酶产生NADPH。新橙皮苷对微藻生长无明显毒副作用，通过添加新橙皮苷，促进ME编码基因me g4297和me g6562的表达，增加细胞内电子能量的供给，为脂肪合成提供更多的NADPH，有利于提高TAG合成途径上相关酶的活性，从而促进了胞内油脂的合成和积累，得到较高的油脂产量。

在一些实施方式中，上述异养培养基中的氮源为硝态氮。硝态氮作为氮源时，最终的生物量和油脂含量均较高。

在一些实施方式中，上述异养培养基的碳氮比为4.5-5.5:1。当C/N比小于4.5时，小球藻生物量随着C/N増加而增加；当C/N比大于4.5时，小球藻生物量反而降低。当C/N比小于 5.5时，油脂含量随着C/N比的增加而增加；当C/N比大于5.5时，油脂含量随着C/N比的増加反而减小。在C/N比为4.5-5.5:1时，生物量和油脂含量均较高。

在一些实施方式中，上述异养培养初期加入Fe³⁺至浓度为1.5-2.5mg/L，在异养培养指数生长末期加入Fe³⁺至浓度为5-7mg/L。在培养初期加入适宜浓度的Fe³⁺得到的微藻的生物量较高，在指数末期添加高浓度的Fe³⁺离子得到的单位油脂积累量较高，从而得到较高的油脂产量。

在一些实施方式中，上述异养培养指数生长末期向培养基中加入茶多酚至浓度为1.2-1.6g/L。生物活性分子茶多酚对微藻生长无明显毒副作用，在指数生长末期添加茶多酚，能够改变微藻的脂肪酸组成。

在一些实施方式中，上述微藻脂肪酸中多不饱和脂肪酸的含量为14-22％。用于生产生物柴油的油脂需要含有大量的含饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸高的微藻是制备生物柴油的理想原料，不饱和脂肪酸的氧化速率与其双键的数目和位置紧密相关，当多不饱和脂肪酸的含量较高时，氧化稳定性较低。

在一些实施方式中，上述异养培养指数生长末期向培养基中加入丹酚酸b至浓度为 1.2-1.6g/L。二酰甘油酰基转移酶(DGAT)是催化三酰甘油(TAG)生物合成的最后一步关键酶，也是依赖乙酰辅酶A合成TAG途径中的限速酶，在油脂合成途径中扮演关键角色。丹酚酸b对微藻生长无明显毒副作用，添加丹酚酸b能够促进二酰甘油酰基转移酶(DGAT)编码基因dgat g3280和dgat g7566的表达，提高TAG的合成量，也能刺激脂肪酸的生物合成，有助于代谢流流向TAG合成方向，提高油脂含量，提高油脂产量。

在一些实施方式中，上述微藻的油脂产量≧1.13g/L。通过对微藻进行基因调控，促进TAG 的合成和积累，从而提高胞内油脂含量，提高油脂产量，在优选条件下微藻的油脂产量最高可达1.13g/L。

在一些实施方式中，上述异养培养为光能异养培养，培养条件为：光照强度 60-85μmol/(m²·s)，温度25-30℃，光暗周期12-14h/d。采用光能异养生长方式的培养不受光照限制，具有较大的生长密度，底物转化率也较高，有利于实现微藻的自动化培养。

在一些实施方式中，上述微藻的采收方法为絮凝沉淀法，其中，絮凝沉淀法所用絮凝剂为壳聚糖。以壳聚糖采收微藻，具有絮凝效果好，絮凝物体积大、絮凝速率快、无二次污染的优点。

本发明的有益效果为：

1)本发明通过对小球藻进行光能异养培养，并对培养基的氮源、碳氮比、Fe³⁺浓度进行优化，得到较高的生物量和油脂含量，具有较高的油脂产量；

2)本发明通过在小球藻异养培养的指数生长末期添加新橙皮苷和丹酚酸b，促进ME编码基因me g6562的表达，增加细胞内电子能量的供给，为脂肪合成提供更多的NADPH，促进二酰甘油酰基转移酶(DGAT)编码基因dgat g7566的表达，促进TAG的合成，提高油脂含量，提高油脂产量，在优选条件下微藻的油脂产量≧1.13g/L；

3)本发明通过在小球藻异养培养的指数生长末期添加茶多酚，改变微藻的脂肪酸组成，使得微藻脂肪酸中多不饱和脂肪酸的含量为14-22％，提高氧化稳定性，提高生物柴油的质量。

附图说明

图1为本发明的小球藻生长曲线；

图2为本发明的小球藻ME同工酶基因me g4297，me g6562的表达丰度图；

图3为本发明的小球藻DGAT同工酶基因dgat g3280，dgat g7566的表达丰度图；

图4为本发明的藻密度-OD₆₈₀标准曲线及线性回归方程；

图5为本发明的油脂含量-OD₅₃₀的标准曲线及线性回归方程；

图6为本发明的小球藻生物量、油脂产量、油脂含量图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述：

实施例1：

一种提高微藻油脂产量的方法：

所用微藻为实验室经采样筛选所得小球藻。

配制异养培养基，调节pH至7-7.8，异养培养基的配方见表1。

表1异养培养基配方

将无菌藻种接种到装有20ml异养培养基的大试管中培养一周，将培养一周的藻液转接到装有200ml培养液的培养瓶中置于120rpm摇床培养，光照条件为80μmol/(m²·s)，培养温度为 26℃，光周期为12h/d，培养周期18d，每隔1d利用分光光度计在680nm条件下测定其吸光度，制得小球藻的生长曲线，见图1。由图1可以看出小球藻在培养13天时到达稳定期。

将已经培养至10d(对数生长期)的藻液，以10％(v/v)接种量接种于异养培养基，光照条件为80μmol m^-2s^-1，培养温度为26℃，光周期为12h/d，置于在培养架上培养，每天定时摇晃培养液3-5次，防止藻液因贴壁而受光不均，待培养至指数生长末期时，继续添加FeCl₃·6H₂O至Fe³⁺浓度为6mg/L，添加茶多酚至浓度为1.4g/L，添加丹酚酸b至浓度为1.2g/L，培养周期14d。

取出藻液，利用醋酸调节藻液的pH至6，后每升藻液中加入10mg壳聚糖，用机械搅拌器以300r/min搅拌3min，静置10min，过滤分离，得到沉淀藻体。

对比例1：

异养培养基的成分中不含有新橙皮苷，其余部分和实施例1完全一致。

对比例2：

指数生长末期未补加丹酚酸b，其余部分和实施例1完全一致。

对比例3：

异养培养基的成分中不含有新橙皮苷，指数生长末期未补加丹酚酸b，其余部分和实施例 1完全一致。

试验例1：

小球藻苹果酸酶(ME)同工酶基因me g4297，me g6562和二酰甘油酰基转移酶(DGAT) 同工酶基因dgat g3280，dgat g7566表达水平的检测：

参照Promega公司的SV Total RNA Isolation Kit操作手册，提取采收的小球藻的总RNA，向0.2mL无RNA酶的PCR管中加入10μL溶解的RNA，在PCR仪进行反转录的第一步，65℃ 5min，4℃冷却待用。以随机引物作为反转录引物，反转录反应体系见表2。反应条件为：37℃ 15min，95℃5min，反应结束，置于-20℃保存备用。

表2反转录反应体系

试剂	体积(μL)
		无RNA酶水	18
混合引物	2
		5×Buffer	8
RT-E Mix	2
		RNA	10

取上述步骤得到的反转录产物作为RT-PCR的模板，PCR扩增引物包括：

me g4297基因的引物：

F：GGACACAAGTGAGCGCAACCG

R：GGATGGGTCGTTGGGCAGAA

me g6562基因的引物：

F：CGTCGTGGTTCGCATCTTTG

R：GTGTGGAACTGCTACTTAAGG

dgat g3280基因的引物：

F：GGCTCATAGAATTCGACGT

R：ACATTCAAGAGGTCGGTG

dgat g7566基因的引物：

F：GGGGTTCCACACCCTAGAT

R：AGCATCACAGTCGGCTGTGG

荧光定量PCR的反应体系见表3。反应条件为：95℃预变性4min，95℃变性15s，60-63℃ 退火15s，72℃延伸30s，共40个循环。各拷贝基因的退火温度如下：me g4297为60.4℃； me g6562与dgat g7566为62.3℃；dgat g3280为61.6℃。溶解曲线分析：65℃10s，0.5℃/s，至95℃结束。

荧光定量PCR获得的Ct值采用2^-△△Ct法分析。ME同工酶基因me g4297，me g6562的表达丰度见图2，DGAT同工酶基因dgat g3280，dgat g7566的表达丰度见图3。

表3荧光定量PCR反应体系

试剂	体积(μL)
		cDNA	0.2
10μmol/L上游引物	0.5
		10μmol/L下游引物	0.5
2×Taq PCR Master Mix	10
		<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	8.8

由图3可以看出，实施例1和对比例2中me g4297，me g6562基因的表达丰度均要明显高于对比例1，对比例3，这说明，异养培养基中加入新橙皮苷能够促进小球藻ME编码基因 me g4297和me g6562的表达。

由图4可以看出，实施例1和对比例1中dgat g3280，dgat g7566基因的表达丰度均显著高于对比例2，对比例3，这说明，在指数生长末期补加丹酚酸b能够促进DGAT编码基因dgat g3280，dgat g7566的表达。

试验例2：

小球藻生长量的测定：

将小球藻原液稀释2，4，8，16倍，将原液及稀释后的藻液于680nm处测定吸光值，再取适量藻液称重，离心后于120℃下烘干至恒重，再次称重，计算得到各稀释倍数下藻液的浓度，分别测定680nm处的吸光值，绘制藻密度-OD₆₈₀的标准曲线，藻密度-OD₆₈₀标准曲线及线性回归方程见图4。

小球藻油脂含量的测定：

采用磷酸香草醛显色法。配制磷酸香草醛溶液，样品测定：取100μL藻液，加入2ml浓硫酸，100℃水浴10min，后冰水浴冷却5min，加入5ml磷酸香草醛溶液，37℃水浴15min，冷却至室温后摇匀，以蒸馏水为空白对照，测定530nm处吸光度。标准曲线：采用油茶籽油溶于氯仿做样品测定油脂含量，绘制油脂含量-OD₅₃₀的标准曲线，油脂含量-OD₅₃₀的标准曲线及线性回归方程见图5。计算小球藻生物量、油脂产量，油脂含量，结果见图6。

由图6可以看出，实施例1、对比例1、对比例2、对比例3的生物量无明显差别，这说明，异养培养基中加入新橙皮苷，指数生长末期补加丹酚酸b均对小球藻无明显毒害作用；实施例1的油脂含量(60.4％)和油脂产量(1.13g/L)均明显高于对比例1(42.9％,0.79g/L)、对比例2(36.7％,0.68g/L)，对比例1、对比例2的油脂含量和油脂产量明显高于对比例3(30.1％, 0.57g/L)，结合试验例1可以验证：异养培养基中加入新橙皮苷能够促进小球藻ME编码基因 me g4297和me g6562的表达，为脂肪合成提供更多的NADPH，促进胞内油脂的合成，提高油脂产量；在指数生长末期补加丹酚酸b能够促进DGAT编码基因dgat g3280，dgat g7566的表达，提高TAG的合成量，刺激脂肪酸的生物合成，帮助代谢流流向TAG合成方向，提高油脂含量，提高油脂产量。

上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。

以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims

1.一种提高微藻油脂产量的方法，其特征在于：所述微藻培养为异养培养，其中，所述微藻为小球藻，异养培养所用培养基中新橙皮苷的初始浓度为0.75-1.1g/L；所述异养培养初期加入Fe³⁺至浓度为1.5-2.5mg/L，指数生长末期加入Fe³⁺至浓度为5-7mg/L；所述异养培养指数生长末期向培养基中加入茶多酚至浓度为1.2-1.6g/L，所述异养培养指数生长末期向培养基中加入丹酚酸b至浓度为1.2-1.6g/L；所述异养培养为光能异养培养，培养条件为：光照强度60-85μmol/(m²•s)，温度25-30℃，光暗周期12-14h/d。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述异养培养基中的氮源为硝态氮。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述异养培养基的碳氮比为4.5-5.5:1。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述微藻的脂肪酸中多不饱和脂肪酸的含量为14-22%。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述微藻的油脂产量≧1.13g/L。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述微藻的采收方法为絮凝沉淀法，其中，所述絮凝沉淀法所用絮凝剂为壳聚糖。