CN111718968B - 一种提高卷枝毛霉wj11中链脂肪酸产量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种促进卷枝毛霉WJ11生产中链脂肪酸的方法，属于微生物油脂领域。本发明利用在发酵培养基中添加氯化钴溶液，改变了卷枝毛霉的油脂组成，使其中链脂肪酸的占比增加，发酵条件为：添加氯化钴的终浓度为2 mmol/L，添加时间为接种后的24 h，接入种子液的接种量为10%，发酵罐转速为700 rpm，pH为6.2，空气流速为1 vvm，发酵温度为28℃，发酵时间为120 h，最终中链脂肪酸的含量从1.31%提高到了15.29%，其产量为1109.74 mg/L。
Description
技术领域
本发明属于微生物油脂领域。该发酵方法能促进卷枝毛霉WJ11产出中链脂肪酸，并且产量可观。
背景技术
丝状真菌在自然界中广泛存在，卷枝毛霉（
Mucor circinelloides）就是其中一种常见的高产油脂的菌种，它能够产生大量的亚油酸、γ-亚麻酸并在细胞内积累。本发明所用的菌种为卷枝毛霉WJ11，它可以产生高达占细胞干重（CDW）36%的脂质，但这些油脂都是C14以上的长链脂肪酸，比如γ-亚麻酸(顺式-6,9,12-十八碳三烯酸)等。
中链脂肪酸 (MCFA) 是一定链长脂肪酸的统称，一般是指辛酸、癸酸等六碳链到十二碳链的脂肪酸。中链脂肪酸是食品、医疗和化工产品的重要前体。摄入的中链脂肪酸通过门静脉直接运输到肝脏参与氧化，从而快速提供能量，不会引起肥胖，非常有利于极限运动员和减肥人群。自然界中的中链脂肪酸主要存在于椰子油、棕榈仁油中，但含量不高（低于总油脂含量的15%）。在工业生产中，中链脂肪酸的来源主要是人工化学合成或者基因工程改造，通过产油微生物来生产中链脂肪酸的方法也较少。
发明内容
本发明展开了一种方便有效的提高中链脂肪酸产量的方法，即向发酵培养基中添加氯化钴溶液。这相对于人工化学合成和基因工程操作省时省力，收益可观。
技术方案：
在之前的实验中，我们选取了Al3+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+等多种金属离子分别添加到卷枝毛霉WJ11的培养基中，测定卷枝毛霉WJ11产生的油脂含量以后发现Co2+的加入使卷枝毛霉WJ11产出了中链脂肪酸C10和C12。对此现象我们又进行了深入的研究，通过控制Co2+的浓度和Co2+的添加时间不同从而确定了最优的发酵条件。
本发明的收益效果：
Co2+的加入能促进卷枝毛霉WJ11中链脂肪酸的合成，使其比例升高，实验选出了最优的发酵条件即在24 h时加入2 mmol/L Co2+，在此发酵条件下Co2+促进卷枝毛霉中链脂肪酸合成的效果最好，能使卷枝毛霉产生占总油脂含量15.3%的中链脂肪酸，其含量达到1109.7 mg/L。
具体实施方式
菌种：
卷枝毛霉WJ11（
Mucor circinelloides WJ11, CCTCC No. M 2014424; ChinaCenter for Type Culture Collection）
最佳Co2+浓度的确定：
本发明设计了6组不同的Co2+浓度梯度，将它们在配制培养基时分别加入6个完全相同的挡板三角瓶中，每个三角瓶中都装有200 mL发酵培养基，配方为葡萄糖 80 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，酒石酸铵2.0 g/L，KH2PO4 7 g/L，Na2HPO4 2 g/L，酵母抽提物 1.5g/L，CaCl2·2H2O 0.1 g/L，FeCl3·6H2O 8 mg/L，Co(NO3)2·6H2O 0.1 mg/L，ZnSO4·7H2O 1mg/L，CuSO4·5H2O 0.1 mg/L， MnSO4·5H2O 0.1 mg/L，接种量为10%，放入恒温摇床中培养，转速150 rpm，温度28 ℃，培养时间为96 h。
表1 不同Co2+的添加量
| 编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| <![CDATA[Co<sup>2+</sup>浓度（mmol/L）]]> | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| <![CDATA[CoCl<sub>2</sub>溶液（μL）]]> | 0 | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 |
表2 不同Co2+的添加量下中链脂肪酸的产量
| <![CDATA[Co<sup>2+</sup>浓度( mmol/L )]]> | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 |
| 中链脂肪酸含量 ( % ) | 1.385 | 4.358 | 9.022 | 7.702 | 7.175 |
实验结果表明，C10和C12总和即中链脂肪酸的含量受到Co2+的影响，Co2+浓度为6mmol/L时卷枝毛霉不生长，在Co2+的添加量为2 mmol/L时有最大值，此时中链脂肪酸所含比例最高，达到占总油脂含量的9.022%。
最佳的Co2+添加时间：
本实验组包含四个完全相同的挡板三角瓶，每个三角瓶中都装有200 mL发酵培养基，最佳Co2+浓度为2 mmol/L，分别在溶液配制时（0h）、一天后（24h）、两天后（48h）、三天后（72h）加入。接种量为10%，放入恒温摇床中培养，转速150 rpm，温度28 ℃，培养时间为96h。
表3 不同Co2+添加时间下中链脂肪酸的产量
| <![CDATA[Co<sup>2+</sup>添加时间( d)]]> | 0 | 1 | 2 | 3 |
| 中链脂肪酸含量 ( % ) | 9.917 | 14.543 | 5.316 | 4.202 |
实验结果表明，当在发酵一天后加入Co2+使得卷枝毛霉中链脂肪酸的含量达到最高，其中的中链脂肪酸占总油脂含量的14.543%。在发酵两天及以后再加入Co2+对其中链脂肪酸产生的促进作用降低，低于在配制培养基时加入Co2+。因此在发酵一天后加入Co2+是最优选择。
发酵罐发酵
种子培养：将储存在-80 ℃ 甘油中的卷枝毛霉WJ11接入种子培养基中，放入恒温摇床中培养，转速150 rpm，温度28 ℃，培养时间为24 h，获得种子液。
本实验采用四个发酵罐同时发酵，编号依次为F1、F2、F3、F4，设置的发酵条件如表2所示，设置发酵罐的转速为700 rpm，pH为6.2，温度为28℃，空气流速为1 vvm，发酵时间为120h。
表4 发酵罐中的发酵条件
| 编号 | F1 | F2 | F3 | F4 |
| 种子液（mL） | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 产脂培养基（mL） | 900 | 900 | 900 | 900 |
| <![CDATA[Co<sup>2+</sup>浓度（mmol/L）]]> | 0 | 2 | 2 | 1 |
| <![CDATA[Co<sup>2+</sup>添加时间（h）]]> | 0 | 0 | 24 | 24 |
表5 发酵罐120 h脂肪酸组成（%）
| F1 | F2 | F3 | F4 | |
| C10:0 | 0.34±0.05 | 4.27±0.37 | 4.67±0.36 | 4.23±0.37 |
| C12:0 | 0.97±0.11 | 9.28±0.91 | 10.62±0.56 | 9.04±0.89 |
| C14:0 | 2.05±0.95 | 7.20±0.85 | 7.09±0.74 | 6.15±0.62 |
| C16:0 | 33.29±1.2 | 20.02±1.17 | 21.61±1.58 | 21.55±1.57 |
| C18:0 | 6.23±0.85 | 34.56±1.45 | 34.97±1.76 | 31.96±1.38 |
| C18:1 | 31.56±1.87 | 8.51±0.95 | 7.96±0.82 | 9.81±1.01 |
| C18:2 | 12.35±1.21 | 10.28±1.05 | 8.76±0.88 | 10.53±1.07 |
| C18:3 | 13.21±1.35 | 5.88±0.36 | 4.33±0.45 | 6.74±0.72 |
表6 发酵罐中链脂肪酸的含量（%）
| F1 | F2 | F3 | F4 | |
| 24h | 0.191 | 1.35 | 0.236 | 0.973 |
| 48h | 0.714 | 7.573 | 0.809 | 6.949 |
| 72h | 1.132 | 10.683 | 9.275 | 8.73 |
| 96h | 1.205 | 12.734 | 13.859 | 11.295 |
| 120h | 1.31 | 13.553 | 15.29 | 13.267 |
表7 发酵罐中链脂肪酸的产量（mg/L）
| F1 | F2 | F3 | F4 | |
| 24h | 0.700 | 1.545 | 1.054 | 1.228 |
| 48h | 29.700 | 89.615 | 36.052 | 186.447 |
| 72h | 68.762 | 375.340 | 505.000 | 421.404 |
| 96h | 94.201 | 596.570 | 969.578 | 757.936 |
| 120h | 108.071 | 680.118 | 1109.737 | 902.018 |
从实验结果中可以看出，往培养基中加入Co2+会影响卷枝毛霉中的脂肪酸组成，C10:0、C12:0、C14:0、C18:0的含量相对于对照组有明显的提高，当在1d时加入2 mmol/LCo2+时，卷枝毛霉油脂中的中链脂肪酸含量最高。发酵结束时，1d时加入2 mmol/LCo2+条件下卷枝毛霉产出中链脂肪酸的产量为1109.7 mg/L。
Claims (2)
1.一种提高卷枝毛霉WJ11中链脂肪酸产量的方法，其特征在于向培养基中加入氯化钴溶液，包括以下步骤：
（1）种子培养：将储存在-80 ℃ 甘油中的卷枝毛霉WJ11接入种子培养基中，放入恒温摇床中培养，转速150 rpm，温度28 ℃，培养时间为24 h；
（2）发酵培养：采用发酵罐发酵，将培养好的种子液接入发酵培养基，接种量为10%，添加氯化钴的终浓度为2mmol/L，添加时间为接种后的24h，发酵罐搅拌桨转速为700 rpm， pH为6 .2，空气流速为1vvm，发酵温度为28 ℃，发酵时间为120h。
2.根据权利要求1所述的提高卷枝毛霉WJ11中链脂肪酸产量的方法，其特征在于，
种子培养基的特征为：葡萄糖 30 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，酒石酸铵3.3g/L，KH2PO47 g/L，Na2HPO4 2 g/L，酵母抽提物 1 .5 g/L，CaCl2·2H2O 0 .1 g/L，FeCl3·6H2O 8 mg/L，Co(NO3)2·6H2O 0 .1 mg/L，ZnSO4·7H2O 1 mg/L，CuSO4·5H2O 0 .1 mg/L，MnSO4·5H2O0 .1 mg/L；
发酵培养基的特征为：葡萄糖 80 g/L，MgSO4·7H2O 1 .5 g/L，酒石酸铵2 .0 g/L，KH2PO4 7 g/L，Na2HPO4 2 g/L，酵母抽提物 1 .5 g/L，CaCl2·2H2O 0 .1 g/L，FeCl3·6H2O8 mg/L，Co(NO3)2·6H2O 0 .1 mg/L，ZnSO4·7H2O 1 mg/L，CuSO4·5H2O 0 .1mg/L，MnSO4·5H2O 0 .1 mg/L。
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