CN103834698B - 一种通过温度转换发酵生产含γ‑亚麻酸油脂的方法 - Google Patents
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Abstract
一种通过温度转换发酵生产含γ‑亚麻酸油脂的方法。涉及生产γ‑亚麻酸油脂的方法。将小克银汉霉菌接种于PDA平板培养基中培养，再将菌块接种于新PDA平板培养基中再培养，新PDA平板培养基上的菌块接种于另一新的PDA平板培养基中培养；然后将另一新的PDA平板培养基上的菌块接种于装有种子培养基的摇瓶中，pH值调至5～7，培养后，得摇瓶种子；将所得摇瓶种子接种于装有发酵培养基的摇瓶中，pH值调至5～7，先于30～40℃培养6～8d，转速为100～250rpm，再于10～20℃培养4～6d，转速为100～250rpm，得发酵液，抽滤，润洗，得湿菌体，烘干、研磨、萃取，得到含γ‑亚麻酸油脂。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种生产γ-亚麻酸油脂的方法，尤其是涉及一种通过温度转换发酵生产含γ-亚麻酸油脂的方法。
背景技术
γ-亚麻酸，化学名称：6,9,12-十八碳三烯酸，它是前列腺素前体，存在于月见草、玻璃苣、黑加仑的种子油中。已有研究者将其做成胶囊对湿疹、经前紧张、糖尿病、癌症和许多其他疾病等有良好疗效（Horrobin,D.F.1992）。已经有许多研究者尝试通过微生物来生产GLA，然而，他们发现只有部分属于毛霉目的低等真菌，尤其是被孢霉属（Mortierellaspp.）（Yokochi,Usita et al.1990;Hansson and Dostalek1988），毛霉属（Mucor spp.）（Aggelis,G.,Ratomahenina,R.et al.1988;Torlanova,Funtikova et al.1992;Lindbergand Hansson1991）和根霉属（Rhizopus spp.）（Herbert and Keith1991;Kristofikova,Vlnova et al.1991）可以成为有发展前景的GLA生产菌株。目前，已有人分别用深黄被孢霉和爪哇毛霉发展了两种大规模的生产工艺用于GLA的商业化生产（Ratledge1989）。
小克银汉霉属真菌作为生产GLA的潜在菌株（Chen and Chang1996;Chen andLiu1997;Gema,Kavadia et al2002;Kavadia,Komaitis et al2001）正越来越引起人们的关注。对于这种菌，Fakas（Fakas,Certik et al2008）等用番茄水解废渣培养它，结果生物量达17.6g/L，GLA达800mg/L。Gema（Gema,Kavadia et al2002）等在C/N比为163的培养基中培养霉菌，最高GLA产量为720mg/L。Fakas（Fakas,Certik et al2008）等人以木糖为碳源培养小克银汉霉，油脂产量为6.7g/L，GLA量为1119mg/L。尽管在前人的研究基础上GLA的产量已有所提高，但仅局限在培养基的优化上，几乎没有关注到温度对小克银汉霉油脂积累和GLA合成的影响，若要满足工业化生产的需求，还需要进一步提高GLA的产量，降低生产成本。
申请号为201210167671.8的中国专利公开了一种γ-亚麻酸的制备方法，提供一种用于提高GLA产量的γ-亚麻酸的制备方法。以刺孢小克银汉霉菌（Cunninghamellaechinulata ATCC7929）为出发菌株，以葡萄糖、蔗糖、硫酸镁、磷酸氢二钾、柠檬酸三钠、柠檬酸、玉米浆作为培养基的主要原料用于培养菌株，通过添加不同种类不同浓度维生素，发酵生产γ-亚麻酸，γ-亚麻酸较对照组提高近一倍。采用接种时添加不同浓度不同种类的维生素的方法，发酵生产γ-亚麻酸，γ-亚麻酸产量较传统方法提高一倍以上，具有操作简单、成本低、设备要求低，效果佳等优势。但该专利申请是局限在培养基的优化上，几乎没有关注到温度对小克银汉霉油脂积累和GLA合成的影响。
发明内容
本发明的目的在于提供采用小克银汉霉菌（Cunninghamella echinulataATCC7929）产γ-亚麻酸，可显著提高γ-亚麻酸产量的一种通过温度转换发酵生产含γ-亚麻酸油脂的方法。
本发明包括以下步骤：
1）菌种筛选：将冷藏贮存小克银汉霉菌（C.echinulata ATCC7929）接种于PDA平板培养基中，于20～40℃培养1～4d，再从PDA平板培养基中，将菌丝形态与长势较优的菌块接种于新PDA平板培养基中，于20～40℃再培养1～4d，然后冷藏贮存备用；
2）菌种活化培养：将冷藏贮存备用的新PDA平板培养基上的菌块接种于另一新的PDA平板培养基中，于20～40℃培养1～4d，观察菌落形态；
3）摇瓶种子培养：将步骤2）中所述另一新的PDA平板培养基上的菌块接种于装有种子培养基的摇瓶中，pH值调至5～7，于20～30℃，以100～250rpm培养1～3d，得摇瓶种子；
4）摇瓶发酵培养：将步骤3）所得摇瓶种子接种于装有发酵培养基的摇瓶中，pH值调至5～7，先于30～40℃培养6～8d，转速为100～250rpm，再于10～20℃培养4～6d，转速为100～250rpm，得发酵液；
5）将步骤4）所得发酵液抽滤，以去离子水润洗，得湿菌体，将湿菌体烘干、研磨、萃取，得到含γ-亚麻酸油脂。
在步骤1）中，所述PDA平板培养基的组成为马铃薯浸提液200g/L,葡萄糖20g/L，琼脂15～20g/L，自然pH值。
在步骤3）中，所述种子培养基的组成为葡萄糖80g/L，尿素6g/L，硫酸铵5g/L，酵母粉1g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸镁1g/L，生物素0.06mg/L，灭菌前pH值为6。
在步骤4）中，所述发酵培养基的组成为葡糖糖100g/L，蛋白胨6g/L，酵母粉5g/L，硝酸钠2g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁0.5g/L，灭菌前pH值为6.5。
为了测量含γ-亚麻酸油脂中的γ-亚麻酸含量，可将含γ-亚麻酸油脂甲酯化，再采用气相色谱仪测定其中γ-亚麻酸的含量。
与现有技术比较，本发明的有益效果如下：
本发明采用小克银汉霉菌（C.echinulata ATCC7929）生产含γ-亚麻酸油脂，最终γ-亚麻酸产量可达1200～1400mg/L。本发明通过发酵温度转化，在发酵前期升高发酵温度以促进菌体生物量的积累，先于30～40℃培养6～8d，转速为100～250rpm，发酵后期降低发酵温度，再于10～20℃培养4～6d，转速为100～250rpm，以促进不饱和脂肪酸和γ-亚麻酸合成。该发酵工艺生产含γ-亚麻酸油脂，可以有效提高不饱和脂肪酸和γ-亚麻酸的产量，能够在较短发酵周期内实现γ-亚麻酸的高产量积累，生产成本低，生产工艺简单，具有很大的应用前景，有利于工业化应用。
附图说明
图1为本发明实施例1小克银汉霉菌（C.echinulata）在前期发酵培养温度37℃，后期发酵培养温度14℃的条件下，生产含γ-亚麻酸油脂的过程曲线图。在图1中，横坐标为时间Time(h)，左纵坐标为残糖量Residual sugars(标记为●)，第一右纵坐标为菌体生物量Biomass(标记为■)，第二右纵坐标为油脂产量Lipid(标记为)，第三右纵坐标为γ-亚麻酸产量GLA(标记为)。
具体实施方式
实施例1
1）菌种筛选：将贮存于4℃冰箱中的菌丝形态有所差异的小克银汉霉菌（C.echinulata ATCC7929）取出，分别用接种铲割取1cm2的菌块接种到PDA平板上，于28℃培养4d，从PDA平板中割取1cm2的菌块接种到新的PDA平板上，于28℃培养2d，于4℃冰箱中贮存备用。PDA平板培养基组成为马铃薯浸提液200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15～20g/L，自然pH。
2）菌种活化培养：将步骤1）中的PDA平板，用接种铲割取1cm2的菌块接种于新的PDA平板上，于28℃培养2d，观察菌落形态。
3）摇瓶种子培养：将步骤2）中的PDA平板，用接种铲割取4个1cm2的菌块接种于装有50ml种子培养基的250ml摇瓶中，pH值调至6.0，于28℃，以150rpm培养2d。种子培养基组成为葡萄糖80g/L，尿素6g/L，硫酸铵5g/L，酵母粉1g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸镁1g/L，生物素0.06mg/L，灭菌前pH值6，得摇瓶种子。
4）摇瓶发酵培养：将步骤3）中得到的摇瓶种子，以10%的接种量接种于装有100ml发酵培养基的500ml摇瓶中，pH值调至6.5，前期发酵温度为37℃，以150rpm培养7d，然后继续发酵，后期发酵温度为14℃，以150rpm培养5d；发酵培养基组成为葡萄糖100g/L，蛋白胨6g/L，酵母粉5g/L，硝酸钠2g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁0.5g/L，灭菌前pH值6.5。
5）将步骤4）所得发酵液抽滤，以去离子水润洗，得湿菌体，将湿菌体烘干、研磨、萃取，得到含γ-亚麻酸油脂。
为了测量含γ-亚麻酸油脂中的γ-亚麻酸含量，可将含γ-亚麻酸油脂甲酯化，再采用气相色谱仪测定其中γ-亚麻酸的含量。
GC检测条件：Agilent7890A气相色谱仪，HP-88色谱柱，柱长30m，直径0.25mm。程序升温：初始温度140℃，保持5min；然后4℃/min升温，升到240℃，保持10min。载气：氮气，20ml/s。检测器温度：260℃。进样口温度：260℃。进样量：1μL。分流比为100∶1。
经气相色谱仪测定，无脂生物量可达24.6g/L，含γ-亚麻酸油脂中γ-亚麻酸含量可达1322.8mg/L（发酵过程曲线如图1）。采用本发明所述含γ-亚麻酸油脂制备方法，所得的γ-亚麻酸产量可显著提高。
实施例2
与实施例1类似，区别仅在于，步骤4）中所述前期发酵温度为30℃，后期发酵温度为10℃，所得的含γ-亚麻酸油脂中γ-亚麻酸的含量为1409.0mg/L。
实施例3
与实施例1类似，区别仅在于，步骤4）中所述前期发酵温度为40℃，后期发酵温度为20℃，所得的含γ-亚麻酸油脂中γ-亚麻酸的含量为1207.0mg/L。
实施例4
与实施例1类似，区别仅在于，步骤4）中所述前期发酵温度为40℃，后期发酵温度为10℃，所得的含γ-亚麻酸油脂中γ-亚麻酸的含量为1508.0mg/L。
实施例5
与实施例1类似，区别仅在于，步骤4）中所述前期发酵温度为30℃，后期发酵温度为20℃，所得的含γ-亚麻酸油脂中γ-亚麻酸的含量为1085.0mg/L。
有关小克银汉霉菌（C.echinulata ATCC7929）参见：
http://www.atcc.org/Search_Results.aspx?dsNav=Ntk:PrimarySearch%7cCunninghamella+echinulata+ATCC+7929%7c3%7c,Ny:True,Ro:10,N:1000552&searchTerms=Cunninghamella+echinulata+ATCC+7929&redir=1或http://www.atcc.org/en/Products/All/7929.aspx。
Claims (3)
1.一种通过温度转换发酵生产含γ-亚麻酸油脂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)菌种筛选：将冷藏贮存小克银汉霉菌Cunninghamella echinulata，生物保藏编号为ATCC7929接种于PDA平板培养基中，于20～40℃培养1～4d，再从PDA平板培养基中，将菌丝形态与长势较优的菌块接种于新PDA平板培养基中，于20～40℃再培养1～4d，然后冷藏贮存备用；
2)菌种活化培养：将冷藏贮存备用的新PDA平板培养基上的菌块接种于另一新的PDA平板培养基中，于20～40℃培养1～4d，观察菌落形态；
3)摇瓶种子培养：将步骤2)中所述另一新的PDA平板培养基上的菌块接种于装有种子培养基的摇瓶中，pH值调至5～7，于20～30℃，以100～250rpm培养1～3d，得摇瓶种子；
4)摇瓶发酵培养：将步骤3)所得摇瓶种子接种于装有发酵培养基的摇瓶中，pH值调至5～7，先于30～40℃培养6～8d，转速为100～250rpm，再于10～20℃培养4～6d，转速为100～250rpm，得发酵液；
所述发酵培养基的组成为葡萄糖100g/L，蛋白胨6g/L，酵母粉5g/L，硝酸钠2g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁0.5g/L，灭菌前pH值为6.5；
5)将步骤4)所得发酵液抽滤，以去离子水润洗，得湿菌体，将湿菌体烘干、研磨、萃取，得到含γ-亚麻酸油脂。
2.如权利要求1所述一种通过温度转换发酵生产含γ-亚麻酸油脂的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述PDA平板培养基的组成为马铃薯浸提液200g/L,葡萄糖20g/L，琼脂15～20g/L，自然pH值。
3.如权利要求1所述一种通过温度转换发酵生产含γ-亚麻酸油脂的方法，其特征在于，在步骤3)中，所述种子培养基的组成为葡萄糖80g/L，尿素6g/L，硫酸铵5g/L，酵母粉1g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸镁1g/L，生物素0.06mg/L，灭菌前pH值为6。
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