CN102399832B - 利用深黄被孢霉固态发酵玉米淀粉和麸皮生产饲用油脂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了利用深黄被孢霉固态发酵玉米淀粉和麸皮生产饲用油脂的方法，将玉米淀粉和麸皮按照1∶3的重量比混合后作为发酵底物，装料量60g/250mL，含水量60％，按30％接种发酵2d的种子液，调节初始pH为6.0，采用双温度培养发酵7d；所述双温度培养发酵即：前2d培养温度为28℃，后5d培养温度为26℃。使油脂产量高达10.18g/100g，其中γ-亚油酸(GLA)和DHA分别占总的粗脂肪含量的4.03％和1.7％。总能由发酵前的3779.77Kcal/Kg提高到了4885.39Kcal/Kg，成本比深层液态发酵大大降低。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用深黄被孢霉固态发酵玉米淀粉和麸皮生产饲用油脂的方法，属于畜禽饲料技术领域。
背景技术
在畜禽全价配合饲料中，能量饲料可占到60％～85％，油脂是补充饲料能量的有效方法。油脂的来源主要有动物油脂，植物油脂和微生物油脂。近年来，为配制高能量全价饲料和提高配合饲料的适口性，往往在配制饲料时添加适量的动植物油脂。然而，将动植物油脂添加于配合饲料中，不仅提高了饲料成本，且加剧了动植物油脂的短缺。微生物油脂是经产油微生物利用环境中碳水化合物获得，由于微生物培养简单，繁殖迅速，物质能量转换效率高，同时，大量未被利用的农业副产物可作为理想碳源，用于发酵生产油脂。因此，微生物油脂有潜力成为相对成本较低的油脂添加于配合饲料中以调节能蛋比平衡，对节约饲料成本，缓解能量饲料短缺和人畜争粮状况具有及其重要的作用。
经研究发现，微生物油脂的脂肪酸组成及物理化学性质都同植物油脂相类似，即大部分是偶数碳链脂肪酸，但是其消化率较植物油脂低一些。早在一战时期，德国科学家对微生物产油脂进行了研究，试图利用油脂酵母和单细胞藻类来生产油脂，以解决粮食不足问题。之后，美国也开始着手微生物油脂的研究，但均未实现工业化生产。直到二战前夕，德国科学家筛选到了适合于深层培养的菌种，才开始在德国工业化生产食用油。20世纪40年代，相继发现一系列高产油微生物(油脂积累量超过细胞总量20％的微生物)，如斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、曲霉属(Aspergillus)、毛霉属(Mucor)等。70年代，Wayman曾报道一株节杆菌AK19，产油脂达85％，但所含不饱和脂肪酸(PUFAs)含量太低；Cosel in所选育的假丝酵母TM300及韩国的红酵母NRRLY-1091产油脂皆在40％，并含有6％左右的PUFAs。进入80年代，Brown用里斯木霉生产油脂可达16％，并含有较高的亚油酸成分；Manresa用铜绿色假单孢菌生产油脂达38％，所含亚油酸达50％；1986年，日本、英国又首先推出含γ-亚麻酸(GLA)微生物油脂的保健食品、功能性饮料和高级化妆品等。20世纪90年代以来，特种油脂的发展愈来愈受到重视，相继从丝状真菌、微藻、细菌和酵母中，筛选到能生产许多特种油脂的菌种，并对多种脱饱和酶进行研究，构建基因工程菌。被孢霉为一种低等真菌，高产油被孢霉利用碳水化合物进行发酵合成的油脂含量可达到40～50％，尤其富含GLA、ARA和EPA这三种PUFAs。目前，在利用高产油微生物生产单细胞油脂时，所采用的发酵方式以深层液态发酵为主，少数采用半固态发酵。而深层液态发酵虽然能蓄积更多的油脂，但是生产成本较高，半固态发酵虽能降低生产成本，但是菌丝体生长及油脂的产率不及深层液态发酵。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种利用深黄被孢霉固态发酵玉米淀粉和麸皮生产饲用油脂的方法。
利用深黄被孢霉固态发酵玉米淀粉和麸皮生产饲用油脂的方法，将玉米淀粉和麸皮按照1∶3的重量比混合后作为发酵底物，装料量60g/250mL，含水量60％，按30％接种发酵2d的种子液，调节初始pH为6.0，采用双温度培养发酵7d；所述双温度培养发酵即：前2d培养温度为28℃，后5d培养温度为26℃；所述深黄被孢霉种子液培养方法为：种子培养基：葡萄糖10g，磷酸二氢钾0.1g，硫酸镁0.03g，酵母膏0.2g，硫酸铵0.2g，蒸馏水100mL，pH6，112℃灭菌20min；用灭菌的接种环勾取2环斜面孢子于种子液体培养基中，28℃、180r/min摇床培养48h。
本发明先通过筛选深黄被孢霉(Mortierella isabellina As 3.3410，一种产油菌株)固态发酵培养基营养液的适宜C源、N源的含量，发酵时间等，再对发酵底物组成及发酵条件进行优化，使油脂产量高达10.18g/100g，其中γ-亚油酸(GLA)和DHA分别占总的粗脂肪含量的4.03％和1.7％。总能由发酵前的3779.77Kcal/Kg提高到了4885.39Kcal/Kg，成本比深层液态发酵大大降低。
本发明利用深黄被孢霉研究以农作物副产物(玉米淀粉和麦麸)固态发酵生产微生物饲用油脂，提高了油脂的产量，降低了生产成本。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
实施例1
①碳源的筛选
采用单因素试验设计筛选C源：分别以葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖和葡萄糖+木糖(1∶1)替代原发酵培养基中的C源(葡萄糖)，其余培养基组分不变，28℃、180r/min摇床培养7d，过滤，65℃烘干，测定最终生物量。以不同的六碳糖和五碳糖作为发酵培养基的唯一碳源进行发酵，以生物量作为判定最适C源指标，结果发现，六碳糖较之五碳糖更有利于菌丝体的生长，差异达到极显著水平(P＜0.01)。其中六碳糖中葡萄糖为最适C源，发酵7d后生物量达到4.20g/L，其次为果糖和麦芽糖。
②氮源的筛选
采用单因素试验设计筛选N源：分别以酵母膏、蛋白胨、硫酸铵、磷酸二氢铵和硝酸铵替代原发酵培养基中的N源，其余培养基组分不变，28℃、180r/min摇床培养7d，过滤，65℃烘干，测定最终生物量。结果发现，有机碳源中的酵母膏和无机氮源中的磷酸二氢铵利于菌丝体的生长，其中前者又优于后者，差异达到极显著(P＜0.01)。以酵母膏作为发酵培养基的单一N源，经过7d的发酵，生物量达到4.35g/L。
③固态发酵动态
以玉米淀粉和麸皮的混合物(1∶1，重量比，下同)作为发酵底物，装料量20g/250mL，含水量40％，按20％接种发酵2d的种子液，调节初始pH为6.0，采用双温度培养发酵7d(即前2d培养温度为28℃，后5d培养温度为26℃)，分别于发酵第5d、7d、9d取样。将所取样品在65℃下烘干，过40目筛，测定其粗脂肪，总能及可溶性糖。结果发现，还原糖浓度随发酵时间的延长先上升，到达峰值后再下降。经过发酵总能显著提高，发酵5d、7d、9d的总能分别为4056.50cal/g、4092.71cal/g、4073.12cal/g，较发酵前分别提高了7.32％、8.28％和7.76％。经过发酵，油脂含量与发酵前相比有了极显著的提高(P＜0.01)。发酵第5d、7d的油脂含量差异不显著(P＞0.05)，分别为4.57g/100g和5.35g/100g。与发酵第9d的油脂产量相比差异极显著(P＜0.01)，经过9d的连续发酵，油脂含量可达7.25g/100g。
实施例2
深黄被孢霉(Mortierella isabellina As 3.3410)购自中国科学院北京微生物所，种子培养基：葡萄糖10g，磷酸二氢钾0.1g，硫酸镁0.03g，酵母膏0.2g，硫酸铵0.2g，蒸馏水100mL，pH 6，112℃灭菌20min。用灭菌的接种环勾取2环斜面孢子于种子液体培养基中，28℃、180r/min摇床培养48h，待用。
采用单因素试验设计，分别以玉米淀粉和麸皮(1∶1，重量比，下同)，玉米淀粉、复合蛋白饲料和麸皮(1∶1∶2)，复合蛋白饲料和麸皮(1∶1)作为发酵底物，装料量50g/500mL，含水量50％，按20％接种发酵2d的种子液，调节初始pH为6.0，采用双温度培养发酵7d(即前2d培养温度为28℃，后5d培养温度为26℃)，每24h摇动一次三角瓶，连续发酵7d。结果发现，三种发酵底物所获得的油脂产量分别为15.28±1.04g/100g，9.18±2.06g/100g和5.74±0.80g/100g，差异极显著(P＜0.01)。与发酵前相比，以玉米淀粉和麸皮(1∶1)与玉米淀粉、复合蛋白饲料和麸皮(1∶1∶2)进行发酵，极大的提高了油脂产量，油脂产量分别是发酵前的近7.5倍和3倍，仅以复合蛋白饲料(CPF)和麸皮的混合物作为发酵底物，油脂产量提高较少，仅提高了32.6％。因此，本发明的发酵底物选择玉米淀粉和麸皮。
发酵条件采用正交试验设计进行测定，主要考虑最佳底物组成(A)、含水量(B)、接种量(C)和装料量(D)四个因素，每个因素取三个水平(见表1)，采用L9(34)正交表安排试验，并进行三次完全重复试验，结果以三次试验结果的平均值表示。
表1发酵条件正交试验因素水平
结果发现(表2)，对产油脂量影响显著性因素依次是含水量＞装料量＞玉米淀粉∶麸皮＞接种量。最佳工艺条件为A2B3C3D3，即发酵底物中玉米淀粉与麸皮比值1∶3，含水量60％，接种量30％，装料量60g/250mL。
发酵条件三次重复试验的方差分析结果见表3。从表3可以发现，含水量和装料量对油脂产量有极显著的影响(P＜0.01)，而其余两个因素(底物中玉米淀粉与麸皮的比例和深黄被孢霉接种量)对油脂产量影响不显著，与表2综合评分结果一致。通过计算，可估计在最适条件下深黄被孢霉固态发酵玉米淀粉和麸皮的混合物，油脂产量将在7.71～10.29g/100g之间，此时的置信度为99％。从表3中可看出在处理3(A1B3C3D3)的条件下，油脂产量最高，达到9.20g/100g，此值亦在最适发酵条件的估计置信区间内，从考虑生产成本出发，将以玉米淀粉和麸皮1∶3的比例，含水量60％，接种量30％，装料量60g/250mL的条件(A2B3C3D3)进行验证试验。
表2不同的发酵条件对深黄被孢霉产油脂量的影响
表3深黄被孢霉产油脂量发酵条件的方差分析
实施例3
以玉米淀粉和麸皮的混合物(1∶3，重量比，下同)作为发酵底物，装料量60g/250mL，含水量60％，按30％接种发酵2d的种子液，调节初始pH为6.0，采用双温度培养发酵7d(即前2d培养温度为28℃，后5d培养温度为26℃)，每24h摇动一次三角瓶。结果发现，以玉米淀粉和麸皮(1∶3)作为发酵底物，在优化后的发酵条件下生产出的发酵产品粗脂肪含量为10.18g/100g，在估计的置信区间范围内，总能为4885.39cal/g。发酵产品的脂肪酸组成见表4，即通过发酵，发酵物中具有特殊功能的PUFAs含量增加，如亚麻酸(GLA)由发酵前的3.17％提高到4.03％，二十二碳六烯酸(DHA)由0.18％提高到1.7％，，底物中粗纤维、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维和酸性洗涤木质素均有不同程度的下降(表5)。
表4发酵后生成的微生物油脂中脂肪酸组成
表5固态发酵对纤维组成的影响
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (1)
1.利用深黄被孢霉固态发酵玉米淀粉和麸皮生产饲用油脂的方法，其特征在于，将玉米淀粉和麸皮按照1∶3的重量比混合后作为发酵底物，装料量60g/250mL，含水量60％，按30％接种发酵2d的种子液，调节初始pH为6.0，采用双温度培养发酵7d；所述双温度培养发酵即：前2d培养温度为28℃，后5d培养温度为26℃；所述深黄被孢霉种子液培养方法为：种子培养基：葡萄糖10g，磷酸二氢钾0.1g，硫酸镁0.03g，酵母膏0.2g，硫酸铵0.2g，蒸馏水100mL，pH 6，112℃灭菌20min；用灭菌的接种环勾取2环斜面孢子于种子液体培养基中，28℃、180r/min摇床培养48h。
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