CN102994579A - 一种醋酸液态发酵快速启动的方法 - Google Patents
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Abstract
一种醋酸液态发酵快速启动的方法，属于发酵优化和生物工程技术领域。本发明涉及发酵启动策略、醋酸菌发酵营养盐的配比和使用策略、补料策略。步骤为：（1）将乙醇和对数中后期的新鲜种子液混合，接种量为1∶5-1∶20，初始醋酸浓度10-20g/L，初始乙醇浓度40-60g/L，体积为终体积的30%；（2）醋酸含量达30g/L，加1‰-5‰发酵营养盐，再加15%终体积量的乙醇，体积为终体积的45%；（3）醋酸含量达40g/L，加22%终体积量的乙醇，醋酸浓度下降到27g/L；(4)醋酸含量又达40g/L，加最后33%终体积量的乙醇，补加发酵营养盐1‰-2.5‰。本发明设计独特，满足醋酸菌发酵的营养需要，缩短发酵启动周期、改善醋酸质量、提高醋酸产量、降低生产成本，适于大规模推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及液醋深层发酵启动技术，具体是指一种醋酸液态发酵快速启动的方法，属于发酵优化和生物工程技术领域。
背景技术
我国目前食醋的产量，据不完全统计约为300多万吨（3.5% HAC）。近20年食醋生产发展较快，每年约以7%的速度增长。人均年消费量也在逐年增长，从1980年的0.7kg，到2000年增长为1.5kg。
食醋的用途与功效较多，不仅能够作为酸性调味品，增进食物风味，而且能够作为保健品防病治病。此外，可作为食品防腐剂、农业杀虫剂以及印染工业、化学工业、食品工业、发酵工业的重要原材料。食醋是人们生活中必不可少的调味品，随着人民生活水平的提高，对健康饮食生活的追求，市场消费结构发生了很大的变化，消费者对食醋的需求逐年增加。醋酸发酵主要分为固态和液态深层发酵两种，前者主要是作为高档食醋的生产，后者为目前最主要的发酵方式。
醋酸发酵过程当中所遇到的最大的问题就是产物抑制作用，醋酸浓度4%（m/v）对于醋酸杆菌有明显的抑制作用，甚至会致醋酸杆菌死亡和自溶。解决这一限制，通常的措施分为菌种选育、发酵在线分割和发酵优化等方法；无论哪种方法目前仍然存在一个关键问题，即醋酸发酵启动时间过长，醋酸杆菌因为初期受到抑制，因此生长很难达到高浓度，其生产强度受到严重制约。
通常在发酵生产过程中都需要加入一定量的无机离子和营养因子以促进菌体生长；在工业生产中也有高比例应用营养盐代替醋酸菌培养基的现象。因此，营养盐的质量好坏不仅影响醋酸菌的发酵产酸能力，对醋酸质量也有很大的影响。但是目前醋酸菌营养盐技术中大部分以葡萄糖为碳源，再添加一定量的酵母粉或者酵母膏制成，缺少醋酸菌生长所必须的无机离子，存在着性价比低、成分不明确、物化性质不确切、发酵效果不稳定等诸多问题。往往并没有根据醋酸菌应对酸抵抗中生理机制出发以达到高产醋酸的目的。
同时在初始发酵阶段，如何能够避免短时期内积累到一定浓度的醋酸(4%)，从而解除较强的产物抑制，以缩短启动时间和增加醋酸杆菌的生物量，目前也无较好的发酵策略。
针对上述问题，本发明所涉及的一种醋酸液态发酵快速启动方法，较好的解决了醋酸发酵启动过程中的限制因素，提供了一种高产醋酸的发酵方法。
发明内容
本发明的目的是为了克服上述现有技术中的缺点，提供一种醋酸液态发酵快速启动方法，该方法设计独特，完全满足醋酸菌发酵启动的营养需要和解除了产物抑制，可以缩短发酵周期、提供醋酸杆菌生物量、提高醋酸产量，适于大规模推广应用。
为了实现上述目的，本发明的技术方案：一种醋酸液态发酵快速启动的方法，包括如下步骤：
（1）将乙醇和对数中后期的新鲜种子液混合，接种量为1:5-1:20，初始醋酸浓度为10-20 g/L，初始乙醇浓度为40-60 g/L，控制该步骤混合后的体积为终体积的30%，于30℃通气量为0.25vvm发酵；
较佳的接种量为1:8-1:15，初始乙醇浓度为45-55g/L；
所述对数中后期的新鲜种子液为在种子罐中发酵到对数中后期的醋酸发酵液；OD600达到1.1-1.3，无菌体沉降，镜检无菌体自溶现象；
（2） 发酵至醋酸含量达到30g/L时，加入醋酸菌发酵营养盐1‰-5‰（w/v），再加入15%终体积量的乙醇，使得本步骤发酵体积达到终体积的45%，于30℃通气量0.25vvm发酵；
所述醋酸菌发酵营养盐为本实验室已公开发明专利201010510084.5经过改良的营养盐：包括以重量百分计26％-27％水解酵母粉，15％-16％柠檬酸铵，44％-45％葡萄糖，4％-5％磷酸氢二钾，3％-4％磷酸氢二钠，5％-6％硫酸镁；在此基础上添加了1%-5%（重量）异戊醇、对羟基苯甲酸、莽草酸、3,3-二甲基丙烯酸、3-甲基-2-丁烯-1-醇中的一种；
较佳的添加了异戊醇、对羟基苯甲酸和3-甲基-2-丁烯-1-醇中的一种；
所述的醋酸菌发酵营养盐，发酵前12小时溶解于水中，制成15%-30%（w/v）浓度的营养盐溶液，发酵前加入1%（v/v）液态发酵醋，5%（v/v）食用酒精配制成营养盐溶液加入；
（3） 发酵至醋酸含量达到40 g/L 时，加入22%终体积量的乙醇，此时醋酸浓度下降到27g/L，于30℃通气量0.25vvm发酵；乙醇添加时间不得超过10min；
（4） 发酵至醋酸含量再次达到40 g/L时，加入最后33%终体积量的乙醇，补加醋酸菌发酵营养盐1‰-2.5‰（w/v），于30℃通气量0.25vvm发酵；乙醇添加时间不得超过10min；
步骤（3）、（4）中所述的加入乙醇的方法是流加，添加时间不超过10min，如发酵体积过大，采用2－3个进样口同时流加；
启动时间为：从初始到OD600达到0.8-1.0，启动时间应小于18h。
本发明的有益效果：基于三阶段补料结合基于醋酸杆菌生理改良的营养盐，通过发酵启动策略优化、醋酸菌发酵营养盐使用策略和补料策略优化，可以缩短发酵周期、改善醋酸质量、提高醋酸产量、降低生产成本，适于大规模推广应用。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。
实施例1：种子液制备及接种优化
1.1 种子培养基的配制：
将葡萄糖和水解酵母粉分别以55g/L和45g/L的含量溶解于去离子水中，调pH6.5，121℃灭菌20min。
1.2醋酸菌种活化及扩培
取斜面保藏的醋酸菌菌种于30℃恒温培养箱中活化24h，将斜面保藏菌种－沪酿1.01 (恒顺醋业提供)接种一环于50mL种子培养基的250mL三角瓶中，在转速120r/min，30℃摇床下振荡培养24h。活化的醋酸菌逐级扩大培养，经三级扩培后，即为醋酸发酵用种子液。
1.3醋酸发酵接种
在配制好的醋酸发酵醪中按照10%比例接入扩培好的醋酸发酵种子液，于30℃、通气量0.25vvm。
表1-1
实施例2：营养盐改良及其使用
2.1-2.2醋酸菌种子液制备方法同实施例1
2.3 基础醋酸菌发酵营养盐的配制
将醋酸菌发酵营养盐不同成分按照比例2配制：26%（重量）水解酵母粉，15%（重量）柠檬酸铵，44%（重量）葡萄糖，5%（重量）磷酸氢二钾，4%（重量）磷酸氢二钠，6%（重量）硫酸镁。
2.4 改良醋酸菌发酵营养盐的配制
在基础培养基中加入3% (w/v)的异戊醇。
2.5 营养盐溶液配制
将配制好的营养盐按照20%添加量（w/v），发酵前12小时溶解于水中，发酵前加入1%（v/v，终浓度）液态发酵醋，5%（v/v，终浓度）食用酒精，配制成营养盐溶液。
2.6醋酸发酵
当醋酸含量达到30g/L时，加入发酵营养盐1‰-5‰（w/v），再加入15%终体积的乙醇，使得发酵总体积达到终体积的45%，于30℃通气量0.25vvm发酵，醋酸生产强度此时为0.75 g/L*h、菌体量(干重)为0.67 g/L。
实施例3：第二阶段发酵控制
3.1-3.2醋酸菌种子液制备方法同实施例2
3.3醋酸发酵
当醋酸含量达到40 g/L 时，加入22% 终体积的乙醇，此时醋酸浓度下降到27g/L，于30℃通气量0.25vvm发酵，醋酸生产强度为1.11 g/L*h和菌体量为0.89 g/L。
实施例4：第三阶段发酵控制
4.1-4.5醋酸菌种子液制备方法同实施例2
4.6醋酸发酵
当醋酸含量再次达到40 g/L 时，加入33% 终体积的乙醇，补加醋酸菌发酵营养盐1‰-2.5‰（w/v），于30℃通气量0.25vvm发酵，醋酸生产强度为1.35 g/L*h和菌体量为1.05g/L。
步骤（3）、（4）中所述的加入乙醇的方法是流加，添加时间不超过10min，如发酵体积过大，采用2－3个进样口同时流加；
启动时间为：从初始到OD600达到0.8-1.0，启动时间应小于18h。
综上，本发明的醋酸液态发酵快速启动方法设计独特，完全满足醋酸菌发酵过程的营养需要，可以缩短发酵周期、提高醋酸杆菌生物量和醋酸产量、降低生产成本，适于大规模推广应用。
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书应被认为是说明性的而非限制性的。
Claims (1)
1.一种醋酸液态发酵快速启动的方法，其特征在于步骤如下：
（1）将乙醇和对数中后期的新鲜种子液混合，接种量为1:5-1:20，初始醋酸浓度为10-20 g/L，初始乙醇浓度为40-60 g/L，控制该步骤混合后的体积为终体积的30%，于30℃、通气量为0.25vvm发酵；
所述对数中后期的新鲜种子液为在种子罐中发酵到对数中后期的醋酸发酵液；该醋酸发酵液OD600达到1.1-1.3，无菌体沉降，镜检无菌体自溶现象；
（2） 发酵至醋酸含量达到30g/L时，加入醋酸菌发酵营养盐1‰-5‰（w/v），再加入15%终体积量的乙醇，使得本步骤发酵体积达到终体积的45%，于30℃通气量0.25vvm发酵；
所述醋酸菌发酵营养盐为本实验室已公开发明专利201010510084.5经过改良的醋酸菌发酵营养盐：包括以重量百分计26％-27％水解酵母粉，15％-16％柠檬酸铵，44％-45％葡萄糖，4％-5％磷酸氢二钾，3％-4％磷酸氢二钠，5％-6％硫酸镁；在此基础上加入1%-5%异戊醇、对羟基苯甲酸、莽草酸、3,3-二甲基丙烯酸、3-甲基-2-丁烯-1-醇中的一种；
所述的醋酸菌发酵营养盐，发酵前12小时溶解于水中，制成15%-30%（w/v）浓度的营养盐溶液，发酵前加入1%（v/v）液态发酵醋，5%（v/v）食用酒精配制成营养盐溶液加入；
（3） 发酵至醋酸含量达到40 g/L 时，加入22%终体积量的乙醇，此时醋酸浓度下降到27g/L，于30℃通气量0.25vvm发酵；
（4） 发酵至醋酸含量再次达到40 g/L时，加入最后33%终体积量的乙醇，补加醋酸菌发酵营养盐1‰-2.5‰（w/v），于30℃通气量0.25vvm发酵；
步骤（3）、（4）中所述的加入乙醇的方法是流加，添加时间不超过10min，如发酵体积过大，采用2－3个进样口同时流加；
启动时间为：从初始到OD600达到0.8-1.0，启动时间应小于18h。
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