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CN105886573B - 一种连续胞外酶生物法制备海藻糖的方法 - Google Patents

一种连续胞外酶生物法制备海藻糖的方法 Download PDF

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CN105886573B CN201610323539.XA CN201610323539A CN105886573B CN 105886573 B CN105886573 B CN 105886573B CN 201610323539 A CN201610323539 A CN 201610323539A CN 105886573 B CN105886573 B CN 105886573B
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Abstract

本发明涉及一种连续胞外酶生物法制备海藻糖的方法，该方法利用全细胞固定化或分泌海藻糖合酶基因工程菌连续高效生产海藻糖并连续色谱分离、纯化、结晶制备海藻糖。本发明首次建立了一套连续性强的产酶及制备海藻糖生产工艺，该工艺以全细胞表面展示或胞外分泌的海藻糖合酶或麦芽寡糖基海藻糖合成酶‑麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶进行转化，避免了细胞的破碎和分离纯化成本，酶液或固定化酶方便获取，操作简便。

Description

一种连续胞外酶生物法制备海藻糖的方法
技术领域
本发明涉及一种连续胞外酶生物法制备海藻糖的方法，特别涉及一种利用全细胞固定化或分泌海藻糖合酶基因工程菌连续高效生产海藻糖并连续色谱分离、纯化、结晶制备海藻糖的方法，属于发酵工程技术领域。
背景技术
海藻糖是由两个葡萄糖分子以α，α-1,1糖苷键构成的非还原性双糖，广泛存在于微生物、海藻类、蘑菇类、豆类、虾类等生物体中。由于海藻糖存在非还原末端，极端环境稳定性好，被广泛地应用于食品、医药、化妆品、农业等行业，外源性的海藻糖同样对生物体和生物大分子有非特异性的保护作用。海藻糖具有独特的不同于其它碳水化合物的生物学特性，如保护生物体细胞蛋白质、脂肪、糖类、核酸等组分不受损害，提高物种的干旱、高温、脱水、冷冻、高渗透压及毒性物质耐受能力等。在食品行业中可用作食品添加剂和甜味剂，保持食品贮藏寿命；在医药行业中替代血浆蛋白作为血液制品、疫苗等生物活性物质的稳定剂；在化妆品中作为超级防晒保湿因子，用于护肤在品和唇膏等；在农作物育种中用于种子保存。2000年，联合国粮农组织和世界卫生组织食品添加剂联合委员会(JECFA)确认海藻糖的每日允许摄入量不需限制。同年，美国食品和药物管理局(FDA)授予海藻糖GRAS(公认安全)地位，并批准进入美国食品领域。2005年3月，中国卫生部批准海藻糖为新资源食品。
传统的海藻糖生产方法是从酵母体内提取，酵母在恶劣环境下生长，体内能够积累大量海藻糖，但这种生产方法，分离提取过程复杂，产量低，成本高。1994年林原生化研究所发现了麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽糖寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)，双酶联合作用于淀粉水解物产生海藻糖。1995年，日本林原生化研究所从Pimelobacter、Psceuclomonus和Thermus三种属微生物中分离纯化了海藻糖合酶，它可以转化麦芽糖为海藻糖。以上两种酶法制备海藻糖的方法得到不断的研究和进步，现已成为海藻糖工业化生产的主要方法。为了加快海藻糖的产业化进程，提高海藻糖的生产效率，降低生产成本，实现海藻糖的国内大规模产业化进程。我国也相继筛选获得了产麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽糖寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)和产海藻糖合酶的微生物菌株，并对部分酶实现了异源表达，建立了通过透性化细胞、产酶重组菌制备海藻糖及利用色谱分离纯化海藻糖的工艺技术和方法。
中国专利文献CN103205475A(申请号201310128939.1)公开了一种新型麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶在海藻糖生产中的应用。该专利所用双酶分别在大肠杆菌中得到异源表达，经IPTG或乳糖诱导后，破碎细胞，离心收集上清液获得粗酶液。将双酶分别按照每升淀粉水解物中加入100-300U麦芽寡糖基海藻糖合成酶、300-900U麦芽寡糖基海藻糖水解酶进行转化反应，在温度50-65℃、pH5.3-5.5的条件下反应25-35h，制得海藻糖，海藻糖的转化率为76.5-85.4％。
中国专利文献CN103468624A(申请号201310296116.X)公开了一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶联合制备海藻糖的方法。该方法所用双酶同时在大肠杆菌进行异源表达，收集菌体后，破碎、离心同时获得双酶酶液用于转化淀粉水解液，转化率达85％。
中国专利文献CN1563372(申请号200410013007.3)公开的海藻糖合酶选自褐色喜热裂孢菌(Thermobifida fusca DSM 43792)，该海藻糖合酶的最适温度为20-30℃，最适pH为6.5-7.0。该海藻糖合酶基因在大肠杆菌中获得异源表达，经IPTG诱导17h后，离心洗涤，以破碎液破碎细胞，离心收集上清液获得海藻糖合酶，25℃转化30％的底物麦芽糖浆，转化率达到60％。
中国专利文献CN1648242(申请号200410093874.2)公开了一种采用1％-5％的甲苯或氯仿对亚栖热菌属的微生物细胞进行透性化处理的方法。该专利方法避免了细胞的破碎及逐级分离纯化步骤。细胞经过透性化处理后，整体结构完整，细胞壁和细胞膜通透性改变，底物可以进入细胞。透性化细胞使海藻糖合酶的pH值耐受性和热稳定性得到提高。中国专利文献CN101831474A(申请号201010137964.2)公开了一种恶臭假单孢菌透性化细胞转化麦芽糖制备海藻糖的方法。该方法以终浓度0.1％-1％的β-巯基乙醇进行细胞透性化处理。中国专利文献CN103146779A(申请号201310112536.8)公开了一种经表面活性剂处理产海藻糖合酶重组大肠杆菌制得透性化细胞转化麦芽糖制备海藻糖的方法，海藻糖生成率达到55％-60％。
中国专利文献CN103266152A(申请号201310182033.8)公开了一种固定化海藻糖合成酶生产海藻糖的方法。该方法是将产海藻糖合酶的菌株培养获得菌体后，在经过离心分离，破碎获得粗酶液，加入硫酸铵沉淀除杂后，获得海藻糖合成酶酶液，然后利用戊二醛和壳聚糖进行交联包埋制备固定化酶，采用固定化酶转化制备海藻糖。
中国专利文献CN105039455A(申请号201510036540.X)公开了一种规模化连续生产海藻糖的方法。利用PCS细胞支持物固定于机械通风搅拌轴上，接种构建好的重组大肠杆菌，培养后细胞固定于PCS细胞支持物上，然后添加1.0g/L-1.5g/L硫酸粘杆菌素改变固定化细胞通透性，以及25％的麦芽糖营养液，经固定化细胞转化制备生产海藻糖。
中国专利文献CN104418919A(申请号201310378497.6)公开了一种海藻糖的生产方法，该方法利用色谱分离技术，将转化麦芽糖或淀粉制备海藻糖后的混合糖液进行分离纯化。将混合液在高温高压下氢化，麦芽糖被氢化还原为麦芽糖醇，将麦芽糖醇与海藻糖分离。该分离技术通过两套色谱分离装置，最终实现多糖、葡萄糖、麦芽糖和海藻糖的分离。中国专利文献CN104017027A(申请号201410259263.4)公开了一种利用顺序式模拟移动色谱分离海藻糖和葡萄糖的方法。
到目前为止，双酶法路线已经实现了海藻糖工业化生产，而单酶法因其转化率较双酶法略低，所以其产业化生产仍在继续探索。如上所述，针对原始产酶菌种经过发酵产生的酶活力较低，发酵周期很长，能耗大，使得发酵成本很高，生产效率低下的限制因素，通过构建重组大肠杆菌可以增强双酶和单酶的表达量，但大肠杆菌产酶为胞内表达，需要经过破碎后获得，而且游离酶具有不能回收、利用率低、难于分离纯化、使用成本高等缺点，这不仅增加了破碎成本，而且存在食品安全限制因素。固定化产酶透性化细胞可以降低细胞的大量破碎，提高酶的稳定性，省去了提取和纯化酶的过程，但是，化学试剂的添加增加了制备成本，在工业化连续生产中设备利用率低，生产周期过长。
针对目前海藻糖的生产与分离问题，发明一种安全、高效的海藻糖生产工艺路线是非常具有实际意义的。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种连续胞外酶生物法制备海藻糖的方法。该方法为工业上可大量推广应用规模化、连续化生产海藻糖奠定了基础，该方法具有工艺简单，效率高，适用性强的特点。
本发明的技术方案如下：
一种连续胞外酶生物法制备海藻糖的方法，包括如下步骤：
(1)将胞外分泌或表面展示的以麦芽糖或可溶性淀粉为底物的产海藻糖合酶或麦芽寡糖基海藻糖合酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶的菌株进行活化培养，然后经扩大培养，制得菌体浓度为50～80g/L的菌液；
(2)将步骤(1)制得的菌液接种于发酵培养基中进行发酵培养，诱导酶的胞外分泌表达或芽孢表面展示或全细胞表面展示，然后过滤，制得全细胞表面展示菌体、表面展示芽孢或粗酶液，将粗酶液经膜浓缩后，制得浓缩酶液；
(3)将步骤(2)制得的浓缩酶液、全细胞表面展示菌体或表面展示芽孢与浓度为250～350g/L的麦芽糖溶液进行反应，在温度为15～55℃，pH7.5～8.5的条件下，反应24h～36h，反应液经过滤，制得糖液；
或者，将步骤(2)制得的浓缩酶液、全细胞表面展示菌体或表面展示芽孢与浓度为150～250g/L的可溶性淀粉进行反应，在温度为15～55℃，pH5.0～6.0的条件下，反应24h～36h，反应液经过滤，制得糖液；
(4)将步骤(3)制得的糖液升温至75～80℃，灭酶活0.4～0.6h，经硅藻土过滤，维持温度70～75℃进行活性炭脱色，然后降温至40～50℃，再次过滤后，进行离子交换，制得除盐糖液；
(5)将步骤(4)制得的除盐糖液浓缩至糖浓度为50％～55％(质量百分比)，进行一次色谱分离，去除多糖和葡萄糖，然后浓缩至糖浓度为50％～55％(质量百分比)，经二次色谱分离，制得海藻糖液和麦芽糖液，麦芽糖液回收再利用，海藻糖液经浓缩结晶，制得海藻糖。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中以可溶性直链淀粉为底物合成海藻糖的酶为麦芽寡糖基海藻糖合成酶与麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶，其表达菌株为表面展示麦芽寡糖基海藻糖合成酶与麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶的毕赤酵母菌株(参见中国专利文献CN105039191A(申请号201510571619.2)中公开的构建方法进行制备)或分泌表达麦芽寡糖基海藻糖合成酶与麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶的枯草芽孢杆菌(参见中国专利文献CN105039374A(申请号201510486544.8)中公开的构建方法进行制备)；以麦芽糖为底物合成海藻糖的酶为海藻糖合酶，其表达菌株为芽孢表面展示海藻糖合酶的枯草芽孢杆菌(参见中国专利文献CN105132450A(申请号201510571328.3)中公开的构建方法进行制备)或分泌表达海藻糖合酶的枯草芽孢杆菌(参见中国专利文献CN105039381A(申请号201510431599.9)中公开的构建方法进行制备)；
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，当以可溶性直链淀粉为底物合成海藻糖的麦芽寡糖基海藻糖合成酶与麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶在毕赤酵母菌株表面展示时，步骤如下：
将步骤(1)制得的菌液按体积百分比8～12％的比例接种于发酵培养基中，28～32℃发酵培养20～28h后，采用甲醇诱导80～120h，使毕赤酵母开始表面展示麦芽寡糖基海藻糖合成酶与麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶，所述甲醇在发酵液中的浓度控制在0.3～0.7g/L；
所述的发酵培养基(RSM)每升组分如下：
KH2PO4 42.9g，(NH4)2SO4 5g，CaSO4 0.6g，K2SO4 14.3g，无水柠檬酸1.92g，MgSO4·7H2O 11.7g，甘油40mL，PTM4微量元素溶液2.0mL；
上述PMT4微量元素溶液每升组分如下：
CuSO4·5H2O 2.0g，NaI 0.08g，MnSO4·H2O 3.0g，Na2MoO4·2H2O 0.2g，H3BO30.02g，CaSO4·2H2O 0.5g，CoCl2 0.5g，ZnCl2 7g，FeSO4·7H2O 22g，生物素0.2g，质量浓度为98％的H2SO4 1mL，pH为6.0～6.5。
上述发酵培养基中，甘油和MgSO4·7H2O按本领域常规配制方法需要分别灭菌。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，当以可溶性直链淀粉为底物合成海藻糖的麦芽寡糖基海藻糖合成酶与麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶在枯草芽孢杆菌中分泌表达时，步骤如下：
将步骤(1)制得的菌液按体积百分比8～12％的比例接种于发酵培养基中，35～38℃发酵培养18～24h后，添加淀粉诱导32～40h，使枯草芽孢杆菌开始分泌表达麦芽寡糖基海藻糖合成酶与麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶，所述淀粉在发酵液中的浓度为15～25g/L；
所述的发酵培养基每升组分如下：
蔗糖20g，蛋白胨7.5g，酵母浸粉5g，硫酸铵5g，磷酸氢二钾3g，磷酸二氢钾4g，硫酸镁0.8g，pH7.0～7.5。
进一步优选的，所述淀粉为可溶性淀粉。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，当以麦芽糖为底物合成海藻糖的海藻糖合酶在枯草芽孢杆菌芽孢表面展示时，步骤如下：
将步骤(1)制得的菌液按体积百分比8～12％的比例接种于发酵培养基中，35～38℃发酵培养48h后，控制营养成分，使枯草芽孢杆菌开始萌发形成芽孢，使芽孢表面展示海藻糖合酶；
所述的发酵培养基每升组分如下：
蔗糖20g，蛋白胨7.5g，酵母浸粉5g，硫酸铵5g，磷酸氢二钾3g，磷酸二氢钾4g，硫酸镁0.8g，pH7.0～7.5。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，当以麦芽糖为底物合成海藻糖的海藻糖合酶在枯草芽孢杆菌中分泌表达时，步骤如下：
将步骤(1)制得的菌液按体积百分比8～12％的比例接种于发酵培养基中，35～38℃发酵培养18～24h后，添加麦芽糖诱导24～36h，使枯草芽孢杆菌开始分泌表达海藻糖合酶，所述麦芽糖在发酵液中的底物浓度为25～30g/L；
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，膜浓缩为采用陶瓷膜过滤系统进行过滤，滤膜孔径为0.22μm，收集浓缩酶液；
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，酶与麦芽糖的反应比例为150～200U/g；全细胞表面展示酶与麦芽糖的反应比例以表面展示酶的酶活单位计，为150～200U/g；所述酶与可溶性淀粉的反应比例为150～200U/g；全细胞表面展示酶与可溶性淀粉的反应比例以表面展示酶的酶活单位计，为150～200U/g。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中，升温采用螺旋板换热器进行升温；活性炭脱色采用活性炭脱色柱进行脱色；过滤采用管道过滤器进行过滤。
在75～80℃，灭酶活0.4～0.6h，不仅可以将残留酶或蛋白灭活，加快蛋白絮凝，而且能够增强糖液流动性，缩短后续步骤的操作时间。
根据本发明优选的，所述步骤(5)中，浓缩为采用三效真空板式蒸发浓缩器进行浓缩，真空度为-0.09pa；一次色谱分离采用漂莱特Ca2+型树脂进行色谱分离；二次色谱分离采用Finix的Ca2+型树脂进行色谱分离；所述色谱分离温度为60℃，流动相为去离子水。
根据本发明优选的，所述步骤(5)中，麦芽糖液回收再利用为经三效真空板式蒸发浓缩器浓缩至糖浓度为60wt％，在步骤(2)或步骤(3)进行回用。
上述色谱分离系统可采用本领域常规色谱分离系统，优选中国专利文献CN203483914U(申请号：CN201320504144.1)所述的模拟移动床。
有益效果
1、本发明首次建立了一套连续性强的产酶及制备海藻糖生产工艺，该工艺以全细胞表面展示或胞外分泌的海藻糖合酶或麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶进行转化，避免了细胞的破碎和分离纯化成本，酶液或固定化酶方便获取，操作简便；
2、本发明通过枯草芽孢杆菌生产菌株分泌海藻糖合酶、毕赤酵母表面展示的麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶，以及枯草芽孢杆菌芽孢表面展示的海藻糖合酶，转化制备海藻糖，不仅解决了因酶的胞内表达带来的细胞破碎、酶分离纯化成本难题；还解决了透性化细胞制备过程中所使用化学试剂成本及酶的回收再利用困难及酶的稳定性差等问题；
3、本发明运用胞外分泌及全细胞固定化酶生产海藻糖，可以降低染菌机率和副产物生成，提高设备利用率，进一步降低海藻糖的生产成本。
4、本发明通过双套分离纯化系统逐级分离纯化海藻糖和麦芽糖，麦芽糖可以得到很好的回收再转化，增强了整体麦芽糖或可溶性糊精制备海藻糖的转化率；
5、本发明采用的枯草芽孢杆菌、毕赤酵母均为为食品安全菌株，可用于制备食品级海藻糖，所用表面展示酶，以酵母细胞或孢子为固定化载体，可多次回收利用。
具体实施方式
以下结合实例来进一步解释本发明，但实施案例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例中所述离子交换系统为购自厦门世达公司的膜连续离交系统；
实施例1
一种连续胞外酶生物法制备海藻糖的方法，包括如下步骤：
(1)将胞外分泌的以可溶性糊精为底物合成海藻糖的产酶菌株在37℃、LB培养基中活化10h，然后以体积百分比10％的比例接种至LB培养基，37℃进行扩大培养20h，制得菌体浓度为50～80g/L的菌液；
所述步骤(1)中以可溶性糊精为底物合成海藻糖酶为麦芽寡糖基海藻糖合成酶与麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶，其表达菌株为分泌表达融合酶的枯草芽孢杆菌(参见中国专利文献CN105039374A(申请号201510486544.8)中公开的构建方法进行制备)；
(2)将步骤(1)制得的菌液接种于发酵培养基中，37℃发酵培养24h，淀粉诱导表达胞外分泌，然后膜过滤分离菌体，将滤液经陶瓷膜过滤系统进行过滤，滤膜孔径为0.22μm，制得浓缩酶液；
所述步骤(2)中，发酵培养基每升组分如下：
蔗糖20g，蛋白胨7.5g，酵母浸粉5g，硫酸铵5g，磷酸氢二钾3g，磷酸二氢钾4g，硫酸镁0.8g，pH7.0。
所述诱导用淀粉为可溶性淀粉，其在发酵液中的浓度为15～25g/L；
(3)将步骤(2)制得的浓缩酶液与浓度为200g/L的可溶性淀粉溶液进行反应，酶与可溶性淀粉的反应比例为200U/g，在温度为25℃，pH8.0的条件下，反应24h，反应液经过滤去除酶，制得糖液；
经检测，糖液中主要成分为海藻糖、少量葡萄糖、麦芽糖和麦芽糖多糖，可溶性淀粉的转化率超过84％；
(4)将步骤(3)制得的糖液升温至75～80℃，灭酶活0.5h，加快其絮凝，增强糖液流动性，经硅藻土过滤，维持温度70～75℃进行活性炭脱色，然后降温至40～50℃，再次管道过滤器过滤后，进行离子交换，制得电导率低于30μs/cm除盐糖液；
(5)将步骤(4)制得的除盐糖液浓缩至糖浓度为55％(质量百分比)，进行一次色谱分离，去除多糖和葡萄糖，分离温度60℃，分离后混合糖(麦芽糖+海藻糖)纯度达到90％以上；然后浓缩至糖浓度为55％(质量百分比)，经二次色谱分离，制得海藻糖液和麦芽糖液，海藻糖溶液纯度达87％，麦芽糖液回收再利用，海藻糖液浓缩至糖含量为80％，降温结晶24h，离心分离后，60℃经震动流化床干燥获得海藻糖结晶，海藻糖纯度达到99％。
所述步骤(5)中，浓缩为采用三效真空板式蒸发浓缩器进行浓缩，真空度为-0.09pa；一次色谱分离采用漂莱特Ca2+型树脂进行色谱分离；二次色谱分离采用Finix的Ca2 +型树脂进行色谱分离；所述色谱分离温度为60℃，流动相为去离子水。
所述步骤(5)中，麦芽糖液回收再利用为经三效真空板式蒸发浓缩器浓缩至糖浓度为60wt％，在步骤(2)或步骤(3)进行回用。
上述色谱分离系统采用中国专利文献CN203483914U(申请号：CN201320504144.1)所述的模拟移动床。
实施例2
一种连续胞外酶生物法制备海藻糖的方法，包括如下步骤：
(1)将胞外分泌的以麦芽糖为底物制备海藻糖的产酶菌株在37℃、LB培养基中活化10h，然后以体积百分比10％的比例接种至LB培养基，37℃进行扩大培养20h，制得菌体浓度为50～80g/L的菌液；
所述步骤(1)中以麦芽糖为底物合成海藻糖的酶为海藻糖合酶，其表达菌株为分泌表达海藻糖合酶的枯草芽孢杆菌(参见中国专利文献CN105039381A(申请号201510431599.9)中公开的构建方法进行制备)；
(2)将步骤(1)制得的菌液接种于发酵培养基中，37℃发酵培养24h，麦芽糖诱导表达胞外分泌，然后膜过滤分离菌体，将滤液经陶瓷膜过滤系统进行过滤，滤膜孔径为0.22μm，制得浓缩酶液；
所述步骤(2)中，发酵培养基每升组分如下：
蔗糖20g，蛋白胨7.5g，酵母浸粉5g，硫酸铵5g，磷酸氢二钾3g，磷酸二氢钾4g，硫酸镁0.8g，pH7.0。
所述诱导用麦芽糖在发酵液中的终浓度为25g/L-30g/L；
(3)将步骤(2)制得的浓缩酶液与浓度为300g/L的麦芽糖进行反应，酶与麦芽糖反应比例为150U/g，在温度为25℃，pH8.0的条件下，反应24h，反应液经过滤去除酶，制得糖液；
经检测，糖液中主要成分为海藻糖、麦芽糖、少量葡萄糖和麦芽糖多糖，麦芽糖的转化率超过65％；
(4)将步骤(3)制得的糖液升温至75～80℃，灭酶活0.4h，加快其絮凝，增强糖液流动性，经硅藻土过滤，维持温度70～75℃进行活性炭脱色，然后降温至40～50℃，再次管道过滤器过滤后，进行离子交换，制得电导率低于30μs/cm除盐糖液；
(5)将步骤(4)制得的除盐糖液浓缩至糖浓度为50％(质量百分比)，进行一次色谱分离，去除多糖和葡萄糖，分离温度60℃，分离后混合糖(麦芽糖+海藻糖)纯度达到90％以上；然后浓缩至糖浓度为50％(质量百分比)，经二次色谱分离，制得海藻糖液和麦芽糖液，海藻糖溶液纯度达87％，麦芽糖液回收再利用，海藻糖液浓缩至糖含量为80％，降温结晶24h，离心分离后，60℃经震动流化床干燥获得海藻糖结晶，海藻糖纯度达到99％。
所述步骤(5)中，浓缩为采用三效真空板式蒸发浓缩器进行浓缩，真空度为-0.09pa；一次色谱分离采用漂莱特Ca2+型树脂进行色谱分离；二次色谱分离采用Finix的Ca2 +型树脂进行色谱分离；所述色谱分离温度为60℃，流动相为去离子水。
所述步骤(5)中，麦芽糖液回收再利用为经三效真空板式蒸发浓缩器浓缩至糖浓度为60wt％，在步骤(2)或步骤(3)进行回用。
上述色谱分离系统采用中国专利文献CN203483914U(申请号：CN201320504144.1)所述的模拟移动床。
实施例3
一种连续胞外酶生物法制备海藻糖的方法，包括如下步骤：
(1)将以麦芽糖为底物合成海藻糖的芽孢表面展示酶的菌株，在37℃、在LB培养基中活化8h，然后以10％的比例接种至发酵培养基中，37℃，高密度发酵培养48h后，进入营养匮乏阶段，枯草芽孢杆菌开始产生芽孢，继续发酵8h后，微滤膜过滤分离芽孢，获得表面展示海藻糖合酶的芽孢；
所述步骤(1)中以麦芽糖为底物合成海藻糖的酶为海藻糖合酶，其表达菌株为表面展示海藻糖合酶的枯草芽孢杆菌(参见中国专利文献CN105132450A(申请号201510571328.3)中公开的构建方法进行制备)；
(2)将步骤(1)制得的菌液接种于发酵培养基中，37℃发酵培养48h，进入芽孢生成阶段，继续发酵10h后，膜过滤分离芽孢，制得表面展示海藻糖合酶的枯草芽孢杆菌芽孢；
所述步骤(2)中，发酵培养基每升组分如下：
蔗糖20g，蛋白胨7.5g，酵母浸粉5g，硫酸铵5g，磷酸氢二钾3g，磷酸二氢钾4g，硫酸镁0.8g，pH7.0。
(3)将步骤(2)制得的表面展示海藻糖合酶的芽孢与浓度为300g/L的麦芽糖进行反应，酶与麦芽糖比例为180U/g，在温度为25℃，pH8.0的条件下，反应26h，反应液经过滤去除芽孢，制得糖液；
经检测，糖液中主要成分为海藻糖、麦芽糖、少量葡萄糖和麦芽糖多糖，麦芽糖的转化率超过64％；
(4)将步骤(3)制得的糖液升温至75～80℃，灭酶活0.6h，加快其絮凝，增强糖液流动性，经硅藻土过滤，维持温度70～75℃进行活性炭脱色，然后降温至40～50℃，再次管道过滤器过滤后，进行离子交换，制得电导率低于30μs/cm除盐糖液；
(5)将步骤(4)制得的除盐糖液浓缩至糖浓度为53％(质量百分比)，进行一次色谱分离，去除多糖和葡萄糖，分离温度60℃，分离后混合糖(麦芽糖+海藻糖)纯度达到90％以上；然后浓缩至糖浓度为53％(质量百分比)，经二次色谱分离，制得海藻糖液和麦芽糖液，海藻糖溶液纯度达87％，麦芽糖液回收再利用，海藻糖液浓缩至糖含量为80％，降温结晶24h，离心分离后，60℃经震动流化床干燥获得海藻糖结晶，海藻糖纯度达到99％。
所述步骤(5)中，浓缩为采用三效真空板式蒸发浓缩器进行浓缩，真空度为-0.09pa；一次色谱分离采用漂莱特Ca2+型树脂进行色谱分离；二次色谱分离采用Finix的Ca2 +型树脂进行色谱分离；所述色谱分离温度为60℃，流动相为去离子水。
所述步骤(5)中，麦芽糖液回收再利用为经三效真空板式蒸发浓缩器浓缩至糖浓度为60wt％，在步骤(2)或步骤(3)进行回用。
上述色谱分离系统采用中国专利文献CN203483914U(申请号：CN201320504144.1)所述的模拟移动床。
实施例4
一种连续胞外酶生物法制备海藻糖的方法，包括如下步骤：
(1)将以可溶性淀粉为底物合成海藻糖的全细胞表面展示酶的菌株，在30℃、在RSM培养基中活化12h，然后以10％的比例接种至RSM发酵培养基中，30℃，高密度发酵培养24h后，加入使底物浓度为0.5％的甲醇进行诱导，诱导120h，微滤膜过滤分离菌体，获得表面展示麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶的全细胞；
所述步骤(1)中以可溶性淀粉为底物合成海藻糖的酶为麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶，其表达菌株为表面展示麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶的毕赤酵母菌(参见中国专利文献CN105039191A(申请号201510571619.2)中公开的构建方法进行制备)；
(2)将步骤(1)制得的菌液接种于发酵培养基中，30℃发酵培养24h，添加底物浓度为0.5％的甲醇，维持浓度进入诱导阶段，继续发酵120h后，膜过滤分离菌体，制得表面展示麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶的毕赤酵母全细胞；
所述步骤(2)中，发酵培养基(RSM)每升组分如下：
KH2PO4 42.9g，(NH4)2SO4 5g，CaSO4 0.6g，K2SO4 14.3g，无水柠檬酸1.92g，MgSO4·7H2O 11.7g，甘油40mL，PTM4微量元素溶液2.0mL；
上述PMT4微量元素溶液每升组分如下：
CuSO4·5H2O 2.0g，NaI 0.08g，MnSO4·H2O 3.0g，Na2MoO4·2H2O 0.2g，H3BO30.02g，CaSO4·2H2O 0.5g，CoCl2 0.5g，ZnCl2 7g，FeSO4·7H2O 22g，生物素0.2g，质量浓度为98％的H2SO4 1mL，pH为6.0～6.5。
上述发酵培养基中，甘油和MgSO4·7H2O按本领域常规配制方法需要分别灭菌。
(3)将步骤(2)制得的表面展示麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶的毕赤酵母全细胞与浓度为200g/L的可溶性淀粉进行反应，酶与可溶性淀粉比例为175U/g，在温度为55℃，pH5.0的条件下，反应22h，反应液经过滤去除菌体，制得糖液；
经检测，糖液中主要成分为海藻糖、葡萄糖、少量麦芽糖和麦芽糖多糖，麦芽糖的转化率超过84％；
(4)将步骤(3)制得的糖液升温至75～80℃，灭酶活0.5h，加快其絮凝，增强糖液流动性，经硅藻土过滤，维持温度70～75℃进行活性炭脱色，然后降温至40～50℃，再次管道过滤器过滤后，进行离子交换，制得电导率低于30μs/cm除盐糖液；
(5)将步骤(4)制得的除盐糖液浓缩至糖浓度为50％～55％(质量百分比)，进行一次色谱分离，去除多糖和葡萄糖，分离温度60℃，分离后混合糖(麦芽糖+海藻糖)纯度达到90％以上；然后浓缩至糖浓度为50％～55％(质量百分比)，经二次色谱分离，制得海藻糖液和麦芽糖液，海藻糖溶液纯度达87％，麦芽糖液回收再利用，海藻糖液浓缩至糖含量为80％，降温结晶24h，离心分离后，60℃经震动流化床干燥获得海藻糖结晶，海藻糖纯度达到99％。
所述步骤(5)中，浓缩为采用三效真空板式蒸发浓缩器进行浓缩，真空度为-0.09pa；一次色谱分离采用漂莱特Ca2+型树脂进行色谱分离；二次色谱分离采用Finix的Ca2 +型树脂进行色谱分离；所述色谱分离温度为60℃，流动相为去离子水。
所述步骤(5)中，麦芽糖液回收再利用为经三效真空板式蒸发浓缩器浓缩至糖浓度为60wt％，在步骤(2)或步骤(3)进行回用。
上述色谱分离系统采用中国专利文献CN203483914U(申请号：CN201320504144.1)所述的模拟移动床。

Claims (1)

1.一种连续胞外酶生物法制备海藻糖的方法，包括如下步骤：
（1）将表面展示的以可溶性淀粉为底物的产麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶的毕赤酵母菌株在30℃、在RSM培养基中活化12h，然后以10%的比例接种至RSM培养基中，30℃，高密度发酵培养24h后，加入使底物浓度为0.5%的甲醇进行诱导，诱导120h，微滤膜过滤分离菌体，制得毕赤酵母菌液；
（2）将步骤（1）制得的毕赤酵母菌液按体积百分比8～12%的比例接种于RSM培养基中，30℃发酵培养24h，添加底物浓度为0.5%的甲醇，维持浓度进入诱导阶段，继续发酵120h后，膜过滤分离菌体，制得表面展示麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶的毕赤酵母全细胞；
所述的RSM培养基每升组分如下：
KH2PO4 42.9 g，(NH4)2SO4 5 g，CaSO4 0.6 g，K2SO4 14.3 g，无水柠檬酸 1.92 g，MgSO4·7H2O 11.7 g，甘油 40 mL，PTM4微量元素溶液2.0 mL；
所述PMT4 微量元素溶液每升组分如下：
CuSO4·5H2O 2.0 g，NaI 0.08 g，MnSO4·H2O 3.0 g，Na2MoO4·2H2O 0.2 g，H3BO3 0.02g，CaSO4·2H2O 0.5 g，CoCl2 0.5 g，ZnCl2 7 g，FeSO4·7H2O 22 g，生物素 0.2 g，质量浓度为98%的H2SO4 1mL，pH为6.0～6.5；
（3）将步骤（2）制得的表面展示麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶的毕赤酵母全细胞与浓度为200g/L的可溶性淀粉进行反应，酶与可溶性淀粉比例为175U/g，在温度为55℃，pH5.0的条件下，反应22h，反应液经过滤去除菌体，制得糖液；
（4）将步骤（3）制得的糖液升温至75～80℃，灭酶活0.5h，经硅藻土过滤，维持温度70～75℃进行活性炭脱色，然后降温至40～50℃，再次管道过滤器过滤后，进行离子交换，制得电导率低于30μs/cm除盐糖液；
（5）将步骤（4）制得的除盐糖液浓缩至糖浓度为质量百分比50%～55%，进行一次色谱分离，去除多糖和葡萄糖，然后浓缩至糖浓度为质量百分比50%～55%，经二次色谱分离，制得海藻糖液和麦芽糖液，麦芽糖液回收再利用，海藻糖液浓缩至糖含量为80%，降温结晶24h，离心分离后，60℃经震动流化床干燥获得海藻糖结晶；
所述步骤（5）中，浓缩为采用三效真空板式蒸发浓缩器进行浓缩，真空度为-0.09pa；一次色谱分离采用漂莱特Ca2+型树脂进行色谱分离；二次色谱分离采用Finix的Ca2+型树脂进行色谱分离；所述色谱分离温度为60℃，流动相为去离子水。
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