CN102337313A - 一种制备海藻糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物发酵生产领域，具体涉及一种通过干燥脱水法提高酵母菌株海藻糖产量的方法。本发明所述制备海藻糖的方法，将酵母菌株30-35℃发酵并扩大培养后，收集菌体并挤压脱水，并将脱水后的菌体于30-95℃鼓风干燥至含水率为5-25%；将干燥后的菌体超微粉碎，得到破壁菌体粉末；将菌体粉末溶于水并混合均匀，采用超滤膜超滤，收集滤过液得到溶有所需海藻糖的溶液。本发明通过鼓风干燥逐渐降低酵母菌体中的水分含量，刺激酵母菌体在干燥环境下大量合成海藻糖，提升酵母菌体内海藻糖的积累量，本发明方法可使酵母细胞海藻糖含量提高85%。

Description

一种制备海藻糖的方法

技术领域

本发明属于微生物发酵生产领域，具体涉及一种通过干燥脱水法提高酵母菌株海藻糖产量的方法。

背景技术

海藻糖(Trehalose)是一种由两个葡萄糖分子通过半缩醛羟基以 α-1,1糖苷键结合的非还原性双糖。分子式为C₁₂H₂₂O₁₁，相对分子量为378.33。其结构式如下所示：

自1853年由Wiggers氏从黑麦的麦角菌中获得以来，后来发现海藻糖广泛存在于多种细菌、酵母、真菌、藻类、昆虫和植物中。海藻糖是稳定性最好的天然双糖，不使菲林试剂还原变色，也不与氨基酸和蛋白质等发生美拉德反应，而且最奇特的是它对生物体具有非特异性的保护作用。这种非特异性保护作用主要体现在当生物细胞处于饥饿、高温、低温、冷冻、辐射、干燥、高渗透压及有毒试剂等各种胁迫环境时，胞内海藻糖含量迅速上升，从而保护生命本身。大量的研究证据表明，某些物种对外界恶劣环境所变现出的抗逆耐性均与其体内存在的海藻糖有关。其中最为著名例子的就是所谓的隐生生物，这类生物在极端干燥的条件下可将体内99%的水分脱去而不死亡，并能将生命保持数年乃至数十年以上，一旦条件适宜它们又可复活，其奥秘就是它们的细胞中含有丰富的海藻糖，因此海藻糖又称为“生命之糖”。

研究发现外源性的海藻糖同样对生物体和生物大分子有良好的非特异性保护作用。例如，一些医用制品（如血液制品、血浆、血液球蛋白、转移因子等) 、菌苗、疫苗、抗体、载药脂质体、抗血清、外科手术所需贮存的皮肤、器官等）和生物制品（菌种、分子生物学酶、工业生产用酶等）需要在低温下保藏，然而如果加入海藻糖后，可以干燥制成固体产品，则不需要冷冻保藏，恢复水分后又能恢复活性，使医用制品和生物制品的保藏和运输成本大大降低。此外，海藻糖在食品、化妆品、农业等领域也有广泛的应用，并显示出其特异性的优越性。

目前海藻糖的生产方法可分为以下两种：

1、酶转化法：利用微生物胞内酶，在特定条件下转化底物合成海藻糖。例如，利用海藻糖合酶，转化麦芽糖为海藻糖；以淀粉为原料，利用低聚麦芽糖苷基海藻糖生成酶和低聚麦芽糖苷基海藻糖水解酶联合作用合成海藻糖。酶转化法具有条件温和、特异性好等优点，但所用酶为胞内酶，需要先破碎菌体，提取精制酶，过程复杂。

2、酵母提取法：由于酵母细胞能够合成较高含量的海藻糖，且菌体培养简单，酵母提取法一直是海藻糖生产工艺研究的热点。酵母在高温、高渗、饥饿等极端条件下会积累大量海藻糖，可通过破碎酵母菌体细胞，分离提取海藻糖。然而海藻糖是胞内产物，酵母合成海藻糖受外界环境条件的影响较大，常规工艺条件下胞内积累的海藻糖含量还不是很高，此外酵母菌破壁困难，目前此方法尚未工业化生产。因此提高酵母胞内海藻糖含量，寻找一种简便的酵母破壁技术是实现酵母提取法工业化生产海藻糖的关键。

研究表明海藻糖是酵母菌体在外部环境发生恶劣变化时生成的一种应激代谢产物，利用这一原理，目前衍生出许多利用外界条件刺激促进酵母菌产海藻糖的研究，如利用升高温度、饥饿、高压等方法提高酵母胞内海藻糖含量，例如中国专利CN1458278A和中国专利CN1216152C，尤其是中国专利CN1458278A中，其应激态酵母细胞的培养分别通过氮饥饿培养、热休克培养和渗透胁迫培养的方式得到所需的菌体，并大量积累海藻糖。但采用干燥脱水处理酵母菌体获得海藻糖的研究尚属空白，而且海藻糖提取过程中，酵母细胞破壁问难的问题也依然存在。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于现有技术中酵母提取法生产海藻糖存在酵母胞内海藻糖偏低、提取过程中酵母破壁困难的问题，进而提供一种通过外界刺激提高酵母细胞内海藻糖含量的方法；

进一步提供一种酵母细胞破壁方法简单、海藻糖提取收率较高的制备海藻糖的方法。

为解决上述技术问题，本发明所述的制备海藻糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）菌体培养和收集：将酵母菌株30-35℃发酵并扩大培养后，收集菌体；

（2）将收集的菌体挤压脱水，并将脱水后的菌体于30-95℃鼓风干燥至含水率为5-25%；

（3）将步骤（2）中干燥后的菌体超微粉碎，得到菌体粉末；

（4）将得到的菌体粉末溶于水并混合均匀，采用超滤膜超滤，收集滤过液得到溶有所需海藻糖的溶液。 

所述步骤（2）中，所述鼓风干燥步骤包括：

（a）控制温度30-35℃、每分钟通风量与干燥箱体积比为0.5-2.5:1，干燥至菌体含水率为50-60%；

（b）升高温度至35-40℃、每分钟通风量与干燥箱体积比为0.5-2.5:1，干燥至菌体含水率为40-50%；

（c）升高温度至40-90℃、每分钟通风量与干燥箱体积比为0.5-1.5:1，干燥至菌体含水率为5-25%。

所述步骤（4）中，所述超滤步骤中所述超滤膜的截留分子量为1000-4000Da。

所述步骤（4）中，所述菌体粉末溶于水并混合均匀之后、超滤膜超滤步骤之前还包括采用硅藻土初过滤的步骤。

所述步骤（4）中，所述菌体粉末与水的质量体积比为1:2-10。

所述步骤（3）中，所述菌体粉碎的步骤是通过超微粉碎机处理的。

所述步骤（1）中，所述酵母菌株为活性干酵母活化得到。

所述步骤（1）中，所述发酵步骤的培养基为：玉米浆5-15%，蛋白胨2-7%，葡萄糖8-15%，MgSO₄ 0.01-0.035%，NaH₂PO₄ 0.1-0.25%，其余为蒸馏水，以上均为质量百分比，初始pH为6.0-7.2。

所述步骤（1）中，所述扩大培养步骤的培养基为：玉米浆5-15%，蛋白胨2-7%，葡萄糖8-15%，MgSO₄ 0.01-0.035%，NaH₂PO₄ 0.1-0.25%，其余为蒸馏水，以上均为质量百分比，初始pH为6.0-7.2。

所述玉米浆中固形物的重量含量为20-25wt%。

所述步骤（4）之后还包括将所得海藻糖溶液结晶的步骤（5）：将步骤（4）中超滤得到的滤过液蒸发至海藻糖浓度为70-90%，并结晶、分离、干燥即得所需海藻糖。

本发明中以海藻糖含量占菌体的干重比例表示海藻糖的生产情况，具体的海藻糖测定方法为：高效液相色谱法，见海藻糖国家标准(GB/T 23529-2009)。

本发明的上述技术方案与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明通过鼓风干燥逐渐降低酵母菌体中的水分含量，刺激酵母菌体在干燥环境下大量合成海藻糖，提升酵母菌体内的海藻糖积累量，在最佳条件下，海藻糖含量可占酵母干重的26%，而普通的高温、饥饿条件刺激酵母，菌体中海藻糖的积累量约为菌体干重的14%，本发明方法可使酵母细胞海藻糖含量提高85%；

2、由于本发明鼓风干燥后的菌体呈现干细胞状态，因此可以收集后采用超微粉碎机破坏酵母菌体的细胞壁，此为干法破碎，和传统的湿法破碎（细胞溶液，采用超声波破碎法、压力差法、有机溶剂法、捣碎、研磨等破碎细胞壁）相比，具有工艺简单、操作方便、能耗小，易于实现规模化生产等优点；

3、所述鼓风干燥步骤采用逐级控温干燥的方法，先通过分别控温30-35℃和35-40℃的两步控温通风干燥，实现菌体大量积累海藻糖，然后40-90℃通风干燥，进一步将菌体干燥，为后续的干式破碎做准备，同时也进一步提升海藻糖的积累量；

4、选用活性干酵母活化培养并收集菌体，活性干酵母细胞本身即是干燥缺水菌株，其体内海藻糖的产量要高于普通的酵母菌株，有助于大量合成海藻糖；

5、采用玉米浆为菌株活化及扩大培养的主要氮源，节约成本。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中

图1为本发明所述的海藻糖制备工艺流程。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体工艺条件、物料配比及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所描述的本发明。

如图1所示，本发明各实施例所述的制备海藻糖的方法将根据其所示工艺流程步骤进行。

实施例1 

本实施例选用的种子培养基和发酵培养基均为：玉米浆（含固形物25%）10%，蛋白胨7.0%，葡萄糖15%，MgSO₄ 0.01%，NaH₂PO₄ 0.1%，其余为蒸馏水，以上均为质量百分比，初始pH为6.0。 

所述制备海藻糖的方法包括：

（1）从保存的活性干酵母活化后得到的菌种斜面上刮取两环菌，接种到装有100 ml上述种子培养基的1 L摇瓶中，33℃、220 rpm培养20 h，作为菌种备用。装有4.5 L发酵培养基的7.5 L发酵罐121℃灭菌20 min后，将上述菌种按10%的接种量接种至4.5 L发酵罐发酵。发酵过程中，通过自动流加5 mol/L NaOH和HCI控制pH在5.0±0.1，转速300 rpm，通气量与发酵液体积比为1.5:1，33℃恒温培养20 h，菌体(干重)含量为120 g/L，将收集到的发酵液3000 rpm离心10 min收集菌体。 

（2）离心后菌泥中菌体含水率约为80%左右，通过挤压器挤压后，菌泥中菌体的含水率约为65%，然后将菌体置于鼓风干燥箱中进行鼓风干燥。

所述鼓风干燥包括：（a）在35℃保温5 h，并以每分钟风量：干燥箱体积（下同）为2.5:1的比例鼓风干燥，菌体中水分含率降为52.5%；（b）接着控制温度40℃保温5 h，通风量为0.5:1，菌体水分含率降为41%；（c）然后控温90℃干燥3.5 h，通风量为0.5:1，得到干燥酵母菌体，含水率约为5.5%（W/W），此时海藻糖含量可达到菌体干重的26%（W/W）。

（3）将上述得到的干酵母菌体在超微粉碎机粉碎30 min，装料体积为30%，菌体破碎率达到95%。

（4）然后将破壁菌体粉末和水按1:7溶解制备成水溶液，均匀搅拌1 h。将上述溶液采用硅藻土初过滤，除去菌体碎片等大颗粒杂质，然后采用卷式有机超滤膜过滤，超滤膜截留分子量为1000Da，操作温度为35℃，压力为6 bar，除去大分子蛋白、多糖等杂质，收集透过液，海藻糖回收率可到达88.5%。

（5）用旋转蒸发器70℃条件下将上述海藻糖溶液真空浓缩到70%，置结晶器结晶，首先溶液在70℃保温5 min，按海藻糖含量的2%加入晶种，缓慢降温，5 h内将温度从70℃降到5℃，然后离心分离，干燥得到海藻糖产品，相对纯度为98%。

实施例2 

本实施例选用的种子培养基和发酵培养基均为：玉米浆（含固形物20%）15%，蛋白胨2%，葡萄糖8%，MgSO₄ 0.035%，NaH₂PO₄ 0.25%，其余为蒸馏水，以上均为质量百分比，初始pH为7.2。

所述制备海藻糖的方法包括：

（1）从保存的活性干酵母活化后得到的菌种斜面上刮取两环菌，接种到装有100 ml种子培养基的1 L摇瓶中，30℃、150 rpm培养15 h，作为菌种。装有4.5 L发酵培养基的7.5 L发酵罐121℃灭菌20 min后，将菌种按15%的接种量接种发酵罐中。发酵过程中，通过自动流加5 mol/L NaOH和HCI控制 pH在6.5，转速250 rpm，通气量与发酵液体积比为1.5:1，30℃恒温培养28 h，菌体(干重)含量为95 g/L，发酵液过滤收集菌体。

（2）过滤后菌泥中菌体含水率约为83%左右，通过挤压器挤压后，菌泥中菌体的含水率约为65%，然后将菌体置于鼓风干燥箱中进行鼓风干燥。

所述鼓风干燥包括：（a）在33℃保温5 h，并以每分钟风量：干燥箱体积为0.5:1的比例鼓风干燥，菌体中水分含率降为约55.5%；（b）接着控制37℃保温5 h，通风量为2.5:1，菌体中水分含率降为45%；（c）然后在70℃保温5 h，通风量为1:1，得到干燥酵母菌体，水分含率为13%（W/W），此时海藻糖含量可达到菌体干重的22%（W/W）。

（3）将上述得到的干酵母菌体在超微粉碎机粉碎30 min，装料体积为20%，菌体破碎率达到97%。

（4）然后将破壁菌体粉末和水按1:10溶解，制备成水溶液，搅拌1 h。将上述溶液采用硅藻土初过滤，除去菌体碎片等大颗粒杂质，然后采用卷式有机超滤膜过滤，超滤膜截留分子量为2500Da，操作温度为35℃，压力为4 bar，除去大分子蛋白、多糖等杂质，收集透过液，海藻糖回收率可到达90.5%。  

（5）用旋转蒸发器75℃条件下将上述海藻糖溶液真空浓缩到80%，置结晶器结晶，首先溶液在75℃保温5 min，按海藻糖含量的3%加入晶种，缓慢降温，3 h内将温度从75℃降到10℃，然后离心分离，干燥得到海藻糖产品，相对纯度为98.5%。

实施例3 

本实施例选用的种子培养基和发酵培养基均为：玉米浆（含固形物23%）5%，蛋白胨5.0%，葡萄糖11%，MgSO₄ 0.02%，NaH₂PO₄ 0.2%，其余为蒸馏水，以上均为质量百分比，初始pH为6.5。

所述制备海藻糖的方法包括：

（1）从保存的活性干酵母活化后得到的菌种斜面上刮取两环菌，接种到装有100 ml种子培养基的1 L摇瓶中，35℃、180 rpm培养25 h，作为菌种备用。装有4.5 L发酵培养基的7.5 L发酵罐121℃灭菌20 min，然后将菌种按8%的接种量接种到发酵罐中。发酵过程中，通过自动流加5 mol/L NaOH和HCI控制 pH在6.0，转速250 rpm，通气量与发酵液体积比为1.0:1，35℃恒温培养24 h，菌体(干重)含量为105.5 g/L，发酵液5000 rpm离心10 min收集菌体。

（2）离心后菌泥中菌体含水率约为80%左右，通过挤压器挤压后，菌泥中菌体的含水率约为65%，然后将菌体置于鼓风干燥箱中进行鼓风干燥。

所述鼓风干燥包括：（a）在30℃保温5 h，通风量为1.5:1（每分钟风量：干燥箱体积），菌体中水分含率降为57.5%；（b）接着升温至35℃保温5 h，通风量为1.5:1，菌体中水分含率降为40.5%；（c）然后在40℃保温8 h，通风量为1.5:1，得到干燥酵母菌体，水分含率为23%（W/W），此时海藻糖含量可达到菌体干重的24%（W/W）。

（3）干酵母菌体在超微粉碎机粉碎30 min，装料体积为25%，菌体破碎率达到96%。

（4）然后将破壁菌体粉末和水按1:2溶解，制备成水溶液，均匀搅拌1 h。将上述溶液采用硅藻土初过滤，除去菌体碎片等大颗粒杂质，然后采用卷式有机超滤膜过滤，超滤膜截留分子量为4000Da，操作温度为35℃，压力为2.5bar，除去大分子蛋白、多糖等杂质，收集透过液，海藻糖回收率可到达91.5%。 

（5）用旋转蒸发器80℃条件下将上述海藻糖溶液真空浓缩到90%，置于结晶器结晶，首先溶液在80℃保温5 min，按海藻糖含量的2.5%加入晶种，缓慢降温，4 h内将温度从80℃降到15℃，然后离心分离，干燥得到海藻糖产品，相对纯度为97.5%。

实施例4

按照实施例1中所述的种子培养基及发酵培养的配方进行菌种的活化及扩大培养，其区别在于，本实施例选用从斜面平板刮取的新鲜的酵母菌株进行培养并用于制备海藻糖。

且其后续的鼓风干燥处理工艺及提取工艺条件，均与实施例1中所述的方法及工艺条件相同，得到干燥后的干燥酵母菌体，检测海藻糖的含量可达到菌体干重的20.4%（W/W）。

实施例5

按照实施例1中所述的种子培养基及发酵培养的配方进行活性干酵母活化菌种的扩大培养，用于制备海藻糖的菌株。

其与实施例1中所述的工艺条件的区别仅在于在鼓风干燥步骤中，一直控制干燥温度为60℃，干燥至含水率低于6%，得到干燥后的酵母菌体，此时海藻糖含量可达到菌体干重的6.5%（W/W）。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种制备海藻糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）菌体培养和收集：将酵母菌株于30-35℃发酵并扩大培养后，收集菌体；

（2）将收集的菌体挤压脱水，并将脱水后的菌体于30-95℃鼓风干燥至含水率为5-25%；

（3）将步骤（2）中干燥后的菌体超微粉碎，得到破壁菌体粉末；

（4）将得到的菌体粉末溶于水并混合均匀，采用超滤膜超滤，收集滤过液得到溶有所需海藻糖的溶液。

2.根据权利要求1所述的制备海藻糖的方法，其特征在于：

所述步骤（2）中，所述鼓风干燥步骤包括：

（a）控制温度30-35℃、每分钟通风量与干燥箱体积比为0.5-2.5:1，干燥至菌体含水率为50-60%；

（b）升高温度至35-40℃、每分钟通风量与干燥箱体积比为0.5-2.5:1，干燥至菌体含水率为40-50%；

（c）升高温度至40-90℃、每分钟通风量与干燥箱体积比为0.5-1.5:1，干燥至菌体含水率为5-25%。

3.根据权利要求1或2所述的制备海藻糖的方法，其特征在于：

所述步骤（4）中，所述超滤步骤中所述超滤膜的截留分子量为1000-4000 Da。

4.根据权利要求3所述的制备海藻糖的方法，其特征在于：

所述步骤（4）中，所述菌体粉末溶于水并混合均匀之后、超滤膜超滤步骤之前还包括采用硅藻土初过滤的步骤。

5.根据权利要求4所述的制备海藻糖的方法，其特征在于：

所述步骤（4）中，所述菌体粉末与水的质量体积比为1:2-10。

6.根据权利要求1-5任一所述的制备海藻糖的方法，其特征在于：

所述步骤（1）中，所述酵母菌株为活性干酵母活化得到。

7.根据权利要求6所述的制备海藻糖的方法，其特征在于：

所述步骤（1）中，所述发酵步骤的培养基为：玉米浆5-15%，蛋白胨2-7%，葡萄糖8-15%，MgSO₄ 0.01-0.035%，NaH₂PO₄ 0.1-0.25%，其余为蒸馏水，以上均为质量百分比，初始pH为6.0-7.2。

8.根据权利要求7所述的制备海藻糖的方法，其特征在于：

所述步骤（1）中，所述扩大培养步骤的培养基为：玉米浆5-15%，蛋白胨2-7%，葡萄糖8-15%，MgSO₄ 0.01-0.035%，NaH₂PO₄ 0.1-0.25%，其余为蒸馏水，以上均为质量百分比，初始pH为6.0-7.2。

9.根据权利要求7或8所述的制备海藻糖的方法，其特征在于：

所述玉米浆中固形物的含量为20-25wt%。

10.根据权利要求1-9任一所述的制备海藻糖的方法，其特征在于：

所述步骤（4）之后还包括将所得海藻糖溶液结晶的步骤（5）：将步骤（4）中超滤得到的滤过液蒸发至海藻糖浓度为70-90%，并结晶、分离、干燥即得所需海藻糖。