CN102294022B

CN102294022B - Sod制剂及其制取方法

Info

Publication number: CN102294022B
Application number: CN2010102107005A
Authority: CN
Inventors: 龚家骅
Original assignee: BEIJING LONGYI BIOTECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: BEIJING LONGYI BIOTECHNOLOGY CO LTD
Priority date: 2010-06-28
Filing date: 2010-06-28
Publication date: 2013-11-20
Anticipated expiration: 2030-06-28
Also published as: CN102294022A

Abstract

本专利技术提供了一种以野木瓜、猕猴桃、刺梨为主要原料，采用发酵、破壁释放SOD、冷浸萃取、粗滤、加热处理粗酶液、负压离心分离、CO2超临界萃取浓缩、修饰液进行分子修饰保护并稳定酶活力的新型蛋白酶活性物质的制取、稳定和保持技术，以及用这种技术制取的SOD制剂，这种制剂包括液体和冻干粉两种形态。

Description

SOD制剂及其制取方法

技术领域

本专利技术提供了一种以野木瓜、猕猴桃、刺梨为主要原料，采用发酵、冷浸萃取、离心分离、破壁释放SOD、分子筛筛选浓缩、修饰液进行分子修饰保护并稳定酶活力的新型蛋白酶活性物质制取、稳定和保持技术及用这种技术制取的SOD制剂。

背景技术

SOD(Superoxide dismutase)被世界卫生组织誉为21世纪最有开发和应用前景的药用酶。

几十年来，经过各国科学家们的不懈努力研究、实验、再实验，一致证明，外源SOD一旦进入人体内，进入血液，进入微循环，就能有效地保护机体细胞里的脂质、蛋白质、DNA、细胞膜等生命物质，使它们免受人体内多余的超氧阴离子自由基O^2-和羟自由基·OH的破坏，增强机体细胞和各种重要器官的免疫功能，对治疗自身免疫性疾病，病毒性疾病，心血管疾病，如各种炎症、高血压、血栓病、糖尿病、风湿关节炎、红斑狼疮和癌症等，有特殊功效，对辐射有防护作用。所以，SOD被称为是21世纪最有开发前途的药用酶。

然而，现有制取SOD技术有多种，包括从植物及果实中制取SOD，用微生物发酵方法制取SOD，以及用基因重组的方法制备Rh-SOD。植物中更多存在的是Cu-Zn-SOD，Mn-SOD较少。本发明提供一种制备复合SOD制剂的方法，该母液包括Cu-Zn-SOD，和Mn-SOD，另外使得SOD的得率有较大的提高。

发明内容

本申请的发明目的，是提供一种复合SOD制剂及其制取方法。

一种SOD制剂制取方法，其步骤依次包括配料、清洗沥干、破碎、加热发酵、破壁释放SOD、冷浸萃取、粗滤、加热处理粗酶液、负压离心分离、CO₂超临界萃取、加入修饰液进行分子修饰保护并稳定酶活力、和将SOD母液密封绝氧避光包装/或利用冻干技术将SOD母液成品制成冻干粉密封避光包装。

其中具体步骤为：

(一)配料。

要求原料水果，无杂质、无霉变、无烂果；

原料包括：不少于60％的野木瓜，刺梨不少于25％

(二)清洗沥干：将原料清洗并沥干。

(三)破碎：将沥干后的原料破碎至粗细度为30-50目。

(四)加热发酵

控制加热发酵温度为30-35℃，pH值调整至7，发酵期为三至五天。发酵过程伴有搅拌，搅拌速率为100-150转/分钟。

发酵可以使用不同的菌种，例如，大肠杆菌，酵母菌，酒酵母菌、芽孢杆菌等。其中优选的菌种为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CICC1308)。

(五)破壁释放SOD

采用超声波破壁技术对发酵过程大量生成的酒酵母菌破壁，该破壁包括破微生物的细胞壁和细胞内的线粒体的壁，使之释放出内在的SOD。超声波功率为100-200W；超声时间为5-10分钟。超声处理同时还可以将水果细胞壁进一步破碎以及将细胞内的线粒体壁进一步破碎，这将把细胞浆内和线粒体内的SOD释放出来。从而增加SOD和得率，即增加产出量。

(六)冷浸萃取。

以酒精度为30°的纯糯米酒为浸取液，温度控制在零下11-零下13℃之间，pH值控制为7，时间72小时。在零下低温下，尚未破壁的水果细胞体积膨胀破裂，释放出SOD。

(七)粗滤。

温度控制在20℃以下，以3000-4000转/分钟离心分离，得粗滤液，酶活力控制在800-1000u/ml之间，pH值调整至7-7.2。之后余下的粗滤弃渣即可作酒的原料或饲料。

如果需要进一步提取，也可以将粗滤弃渣再次执行步骤(六)冷浸萃取，而后再作酒的原料或饲料。

(八)加热处理粗酶液。

温度控制在60-70℃，时间控制在5-10分钟，加热处理粗酶液，以除去杂蛋白。这是因为SOD作为金属酶，热稳定性好，而其它杂蛋白耐热性差，所以可以通过热变，使之沉淀。

(九)负压离心分离。

在室温下逐步加入质量百分比为24％-27％的食盐水溶液入粗酶液体中，将pH值调至7.4-7.8，搅拌匀浆90分钟，这时杂蛋白逐渐絮凝沉淀下来，在负压的环境下，以6000转/分钟-8000转/分钟离心20分钟，酶活力仍控制在800-1000u/ml之间；离心弃渣可作口服液原料。

(十)CO₂超临界萃取和浓缩。

采用CO₂超临界萃取并带有酒精回收装置，通过CO₂超临界萃取可以将食盐溶液去除，通过酒精回收装置，回收酒精，得到浓缩到原体积的10％的SOD母液粗成品，通过浓缩将SOD母液酶活力提高至8000-10000u/ml之间。

(十一)分子修饰。

用纯净水将聚乙二醇8000(PEG8000)和纯度为95％的茶多酚配成复合修饰液，复合质量比为75∶25；修饰液匀浆加入SOD母液粗成品中，加入质量比为1∶10，在室温中搅拌90min定型，得SOD母液成品，酶活力控制在7000-9000u/ml之间。分子修饰目的在于茶多酚可以防止SOD被氧化。

(十二)SOD成品。

SOD成品分成两种形式，其1是上述分子修饰过的SOD母液，以液体状态存在；其2是通过冻干工艺技术，将上述分子修饰过的SOD母液制成冻干粉。作为冻干粉适于保存，容易保持活性。作为SOD母液成品入库，要求包装材料必须采用避光材料，SOD母液可以灌装在不透光的玻璃瓶或塑料瓶中，SOD冻干粉包装在密封的避光包装袋内，包装时都需在隔绝氧气和在避光的条件下进行。

本申请以多种野生山果为原料，通过发酵工艺培养和制取植物蛋白酶中的超氧化物歧化酶SOD，使其活性较长期稳定保持，并有效地应用于各种生物药品、食品、护肤品、动物饲料和农作物增长剂中。

本申请请求保护的工艺路线，其先进性和独创性在于它摒弃了国内外提取SOD一直沿用的化学药剂分离上柱层析的工艺路线，首创了复合发酵、冷浸萃取、离心分离、CO₂超临界萃取、修饰液进行分子修饰保护并稳定酶活力等工艺路线，它的先进性和独创性在于放弃了毒副作用大的化学药剂(盐酸、乙醚、丙酮等)作洗脱和分离剂，放弃了繁琐的上柱层析浓缩法，避免了产品成被化学药剂对产成品和生产车间造成的毒副作用，用水和低醇度糯米酒作洗脱和萃取液，以高速离心机作物理性分离，所得产成品天然纯净，无化学药剂之毒副性侵染，又便于工业化大生产，整个工艺过程提高了SOD的利率，提高了效率，降低了成本。为国内外所有提取SOD的工艺路线无可比性。

本申请请求保护的提取方法从原料组方的筛选到发酵、萃取、分离、浓缩到分子修饰等整个工艺技术，对原料进行多层利用，对分离浓缩的弃渣和弃液，均可回收利用、无一丢弃，是一项绿色环保型的、节约型的项目及系列产品。

由于本申请的方法提取的SOD酶活力远高于现有SOD提取物，因此本方法提取的SOD对消除负氧阴离子自由基对机体细胞的损伤，抗氧化、抗辐射、抗病毒、抗癌变、美容美颜、延缓衰老等有特殊效果，效果的大大增强也扩大了其有效使用范围，使之广泛应用于食品、药品、化妆品中，具有独特的实用价值。

同时，本发明通过多次试验将微生物发酵、细胞破壁与植物水果直接细胞破壁两种不同的SOD提取工艺创造性地融合在一起，不仅提高了SOD的产量，而且丰富了所提取出的SOD的种类，既含有Cu-Zn-SOD，又含有Mn-SOD。而Mn-SOD是人体内脏，如肝脏和心脏，最需要的抗氧化歧化酶

附图说明

图1是本申请的工艺流程图。

具体实施方式

参见图1，本申请的SOD母液提取步骤如下：

其具体操作如下：

(一)配料

由于野木瓜、猕猴桃和刺梨被称之为果中之王，含有极为丰富的SOD、多种维生素、生物酮、多种微量元素和多种活性成份。所以我们选择它们做为原料。其目的是组配更丰富的有效活性成份。当然，也可以用单一的品种的水果和植物，也可以用更多的品种的水果和植物，都可以制取SOD制剂。

原料包括：野木瓜、猕猴桃、刺梨。其比例以野木瓜为主要成份，野木瓜不少于60％，刺梨不少于25％。

(二)清洗沥干

将原料清洗并沥干。

(三)破碎

将沥干后的原料破碎至粗细度为30-50目。

(四)加热发酵

可以使用不同的菌种，例如，大肠杆菌，酵母菌，酒酵母菌、芽孢杆菌等。我们最佳实施方式选择酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CICC1308)。上述微生物中在往往存在Mn-SOD。发酵的缺氧情况下，酵母细胞为了维持正常的代谢，会形成包括超氧化物歧化酶SOD在内的细胞保护物质。对外界刺激和逆境环境产生应激反应，提高其适应力。环境威胁刺激增大，就产生更多的SOD。同时发酵过程利用果桨中的糖分等多种成份，产生乙醇。

(五)破壁释放SOD

(六)冷浸萃取

以酒精度为30°的纯糯米酒为浸取液，温度控制在零下11-13℃之间，pH值控制在7，时间72小时。在零下低温下，尚未破壁的水果细胞体积膨胀破裂，释放出SOD。

(七)粗滤

温度控制在20℃以下，以3000-4000转/分钟离心分离，持续时间为15-20分钟得粗滤液，酶活力控制在800-1000u/ml之间，pH调至7-7.2。之后余下的粗滤弃渣即可作酒的原料或饲料。

(八)加热处理粗酶液

(九)负压离心分离

(十)CO₂超临界萃取和浓缩

采用CO₂超临界萃取并带有酒精回收装置，通过CO₂超临界萃取可以将食盐去除，通过酒精回收装置，回收酒精，得到浓缩到原体积的10％的SOD母液粗成品，由于浓缩，SOD母液酶活力将有较大的提高，控制在8000-10000u/ml之间。

(十一)分子修饰

用纯净水将聚乙二醇8000(PEG8000)和纯度为95％的茶多酚配成复合修饰液，复合质量比为75∶25；修饰液匀浆进入SOD母液粗成品中，加入质量比为1∶10，在室温中搅拌90min定型，得SOD母液成品，酶活力控制在7000-9000u/ml之间。其目的在于茶多酚可以防止SOD被氧化。

(十二)SOD成品

SOD成品分成两种形式，其1是上述分子修饰过的SOD母液，以液体状态存在；其2是通过冻干工艺设备，将上述分子修饰过的SOD母液制成冻干粉。作为冻干粉适于保存，容易保持其活性。作为SOD母液成品入库，要求包装材料必须采用避光材料，SOD母液可以灌装在不透光的玻璃瓶或塑料瓶中，SOD冻干粉包装在密封的避光包装袋内，包装时都需在隔绝氧气和在避光的条件下进行。

本发明涉及用野木瓜、猕猴桃和刺梨制取SOD制剂，本专业技术领域的普通技术人员，完全可以根据本发明的教导，增加和减少水果和植物的品种，改变水果和植物之间的配比，制取SOD制剂，但这样的解决方案均在本发明保护范围内。

Claims

1.一种SOD制剂的制备方法，其具体步骤为：

(一)配料；

要求原料水果，无杂质、无霉变、无烂果；

原料包括：不少于60％的野木瓜，刺梨不少于25％；

(二)清洗沥干：将原料清洗并沥干；

(三)破碎：将沥干后的原料破碎至粗细度为30-50目；

(四)加热发酵：

使用酒酵母菌发酵，控制加热发酵温度为30-35℃，pH值调整至7，发酵期为三至五天；发酵过程伴有搅拌，搅拌速率为100-150转/分钟；

(五)破壁释放SOD：

采用超声波破壁技术对发酵过程大量生成的发酵菌破壁，使所述发酵菌释放出内在的SOD，超声波功率为100-200W；超声时间为5-10分钟；

(六)冷浸萃取：

以酒精度为30°的纯糯米酒为浸取液，温度控制在零下11-零下13℃之间，pH值控制为7，时间72小时；在零下低温下，尚未破壁的水果细胞体积膨胀破裂，释放出SOD；

(七)粗滤：

温度控制在20℃以下，以3000-4000转/分钟离心分离，得粗滤液，酶活力控制在800-1000u/ml之间，pH值调整至7-7.2；

(八)加热处理粗酶液：

温度控制在60-70℃，时间控制在5-10分钟，加热处理粗酶液，以除去杂蛋白；

(九)负压离心分离：

在室温下逐步加入质量百分比浓度为24％-27％的食盐水溶液入粗酶液中，将pH值调整至7.2-7.4，搅拌匀浆90分钟，使得杂蛋白逐渐絮凝沉淀下来，在负压的环境下，以6000转/分钟-8000转/分钟离心20分钟，酶活力仍控制在800-1000u/ml之间；

(十)CO₂超临界萃取和浓缩：

采用CO₂超临界萃取并带有酒精回收装置，通过CO₂超临界萃取可以将食盐溶液去除，通过酒精回收装置，回收酒精，得到浓缩到原体积的10％的SOD母液粗成品，通过浓缩将SOD母液酶活力提高至8000-10000u/ml之间；

(十一)分子修饰：

用纯净水将聚乙二醇8000(PEG8000)和纯度为95％的茶多酚配成复合修饰液，聚乙二醇8000与95％的茶多酚质量比为75∶25；修饰液匀浆加入SOD母液粗成品中，加入质量比为1∶10，在室温中搅拌90min定型，得SOD母液成品，酶活力控制在7000-9000u/ml之间；

(十二)SOD成品：

将所述SOD母液成品，以液体状态存在灌装在不透光的玻璃瓶或塑料瓶中入库；或者通过冻干工艺技术，将SOD母液成品制成冻干粉，将SOD冻干粉包装在密封的避光包装袋内；上述SOD母液灌装或者SOD冻干粉包装时，都需在隔绝氧气和在避光的条件下进行。

2.根据权利要求1所述的SOD制剂的制备方法制备的SOD母液或SOD母液制备的冻干粉。