CN104277978B - 黑曲霉种子液的制备方法以及发酵制备柠檬酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种黑曲霉种子液的制备方法，该方法包括将黑曲霉接种到种子培养液中进行培养，其中，该方法还包括将黑曲霉接种到种子培养液中进行培养之前，将黑曲霉孢子进行预培养，所述预培养的条件包括：pH值为6.2‑7.2。另外，本发明还公开了一种发酵制备柠檬酸的方法。采用本发明的黑曲霉种子液的制备方法，能够缩短黑曲霉在种子罐中的培养时间，从而提高了设备的利用率，降低了能耗，同时提高了种子液的质量，使发酵水平有了较大提高，具有可观的经济和社会效益。

Description

黑曲霉种子液的制备方法以及发酵制备柠檬酸的方法

技术领域

本发明涉及一种黑曲霉种子液的制备方法以及发酵制备柠檬酸的方法，具体地，涉及一种用于柠檬酸发酵生产的黑曲霉种子液的制备方法和利用该黑曲霉种子液发酵制备柠檬酸的方法。

背景技术

柠檬酸安全无毒，是目前世界上产量最大的发酵有机酸。大量应用于化工、医药、环保、食品等领域，如作为酸味剂、调味剂及防腐剂、保鲜剂、缓冲剂、螯合剂。在化工行业、化妆品行业及洗涤行业中可作抗氧化剂、增塑剂、洗涤剂。在医药行业中可作抗凝剂。在进行发酵以制备柠檬酸之前，通常需要对用于生产柠檬酸的黑曲霉进行培养，以扩大黑曲霉的量并使其生长状态处于适于进行发酵的状态。

目前在柠檬酸发酵之前对黑曲霉进行培养的方法通常为将黑曲霉麸曲接种到种子罐的种子培养基中，在pH为5-6，糖浓度在8-12重量%的条件下进行培养20-30小时得到黑曲霉种子液，再将该黑曲霉种子液接种到发酵罐中进行发酵。

现有工艺的缺点在于：种子罐培养通常在pH值为5-6的条件下进行是为了不影响种子培养基中各种营养物质的利用，但是，在上述条件下黑曲霉孢子吸水膨胀、萌发的时间较长，因此，种子罐的利用率较低。同时，在pH值为5-6的条件，黑曲霉孢子不能在最佳的条件下萌发会导致其萌发不充分，从而会影响最终得到的黑曲霉种子液的质量，进而会影响后续的柠檬酸发酵水平。

发明内容

本发明的目的在于为了解决上述问题，提供一种能够缩短黑曲霉孢子在种子罐中（缩短黑曲霉的扩大培养的时间）的培养时间，从而能够提高设备的利用率，降低能耗，同时提高黑曲霉种子液的质量，使发酵水平有较大提高的黑曲霉种子液的制备方法。

本发明的发明人发现，黑曲霉的孢子吸水膨胀和萌发的最佳pH值为6.2-7.2，但是，如果在现有条件下将种子培养液的pH调整到6.2-7.2时存在几个不利因素：（1）高pH将影响培养液中蛋白的性质；（2）高pH条件下高温灭菌会导致糖液中各组分发生变化，产生不可利用的糖；（3）调高pH导致培养基中其它离子浓度上升，不利于黑曲霉孢子生长。如果在种子罐中进行扩大培养之前，在pH值为6.2-7.2的条件下，先对黑曲霉孢子进行预培养，就能够使黑曲霉孢子更快地吸水膨胀和萌发，然后再将所述膨胀和萌发的黑曲霉孢子接种至种子培养液中进行培养，便可大大缩短黑曲霉孢子在种子罐中的时间。由于黑曲霉孢子在种子罐中的时间得到了缩短，同时又由于黑曲霉孢子在预培养阶段吸水膨胀和萌发的时间也缩短，因此，整个种子液制备的总时间得到了有效的双重缩短，进而大大提高了种子罐的利用率，并降低了能耗。另外，由于在预培养阶段，黑曲霉孢子在其适宜的条件下进行吸水膨胀和萌发，因此，其萌发的较为充分，从而可以提高后续制备的种子液的质量，进而可以提高发酵水平。

基于以上发现，本发明提供了一种黑曲霉种子液的制备方法，该方法包括将黑曲霉接种到种子培养液中进行培养，其中，该方法还包括将黑曲霉接种到种子培养基液中进行培养之前，将黑曲霉孢子进行预培养，所述预培养的条件包括：pH值为6.2-7.2。

优选地，在所述预培养之前，将黑曲霉孢子在无菌水中进行分散得到孢子悬浮液。并且，当黑曲霉孢子以黑曲霉麸曲的形式存在时，更优选地，在将黑曲霉分散于无菌水中之前，用无菌水对黑曲霉麸曲进行洗涤、过滤以除去黑曲霉麸曲，得到黑曲霉孢子。

另外，本发明还提供一种发酵制备柠檬酸的方法，该方法包括在能够生成柠檬酸的条件下，将通过本发明所述的黑曲霉种子液的制备方法得到的黑曲霉种子液接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液。

采用本发明的黑曲霉种子液的制备方法，能够缩短黑曲霉孢子在种子罐中的培养时间，从而提高了种子罐的利用率，降低了能耗，同时提高了种子液的质量，使发酵水平有所提高。优选情况下，在所述预培养之前，将黑曲霉孢子在无菌水中进行分散得到孢子悬浮液，便于黑曲霉孢子的储存并且能够延长其储存时间；同时，在发酵制备柠檬酸时，能够对黑曲霉的接种量进行准确计数，从而能够有效的控制发酵水平。因此，采用本发明的黑曲霉种子液的制备方法，具有可观的经济和社会效益。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

根据本发明的黑曲霉种子液的制备方法，该方法包括将黑曲霉接种到种子培养液中进行培养，其中，该方法还包括将黑曲霉接种到种子培养液中进行培养之前，将黑曲霉孢子进行预培养，所述预培养的条件包括：pH值为6.2-7.2。

本发明的发明人发现，当将预培养的pH值调节至6.5-7.2时，能够进一步实现本发明的目的。因此，优选地，所述预培养的条件包括：pH值为6.5-7.2。

根据本发明的黑曲霉种子液的制备方法，所述调节pH值的方法可以是本领域常用的方法，例如用碱性试剂调节；所述碱性试剂可以是本领域常用的各种碱性试剂，只要不影响黑曲霉的正常生理活动就可以，优选地，所述碱性试剂选自氨水、氢氧化钠和碳酸钙中的一种或多种。

根据本发明的黑曲霉种子液的制备方法，对于所述预培养的温度没有特别的限制，只要是有利于黑曲霉孢子萌发和生长的温度即可，例如，可以采用与种子罐的培养温度相同的温度。优选地，所述预培养的温度为30-35℃；另外，对于所述预培养的时间也没有特别的限制，但是为了使黑曲霉孢子充分膨胀和萌发并且节省预培养的时间，优选地，预培养的时间为4-8小时。

根据本发明的黑曲霉种子液的制备方法，对黑曲霉孢子预培养的状态没有特别的限制，例如，可以为动态培养，也可以为静置培养。但是为了让黑曲霉孢子更好的萌发和生长，所述预培养的条件还包括在10-50rpm条件下进行摇床培养，也即动态培养；或者，还可以向孢子培养液中通入无菌空气，所通入的无菌空气的量没有特别的限制，优选地，通气量为0.01-0.05体积:（体积·分钟）；或者，也可以采用摇床培养和通入无菌空气相结合的方法。

根据本发明的黑曲霉种子液的制备方法，为了使黑曲霉孢子更好地萌发和恢复生命代谢，进一步缩短整个种子液的制备时间并提高种子液的质量，优选地，所述预培养在营养物存在的条件下进行培养，例如可以在一定糖浓度的糖液中进行培养，为了使黑曲霉在低渗透压的条件下更好地膨胀和萌发，优选地，所述糖浓度为2-5g/100mL；同时，为了节省操作步骤，可以直接将糖液滴加入黑曲霉孢子中。其中，所述糖浓度为以葡萄糖计的单糖的含量。

其中，对为预培养阶段提供糖类等营养物的物质没有特别的限制，只要能够促进黑曲霉孢子的生长和生命代谢的恢复既可。综合考虑萌发后的黑曲霉孢子在种子培养液中的适应性，优选地，为预培养阶段提供糖类等营养物的物质和黑曲霉种子培养液相同。

现有技术中为了使黑曲霉孢子保持存活状态以及便于保存，通常将黑曲霉孢子置于麸曲（如麸皮）中制得黑曲霉麸曲。本发明的发明人发现，虽然可以直接将黑曲霉麸曲进行预培养之后再接种到种子培养液中，但是黑曲霉麸曲的保存时间较短，所占空间较大而不便于保存，并且将黑曲霉进行扩大培养时直接在种子罐中接种黑曲霉麸曲，而无法对黑曲霉的接种量进行准确计数，进而会影响后续柠檬酸发酵中在发酵培养基中的接种量。因此，为了节省原先用于保存黑曲霉麸曲所用的容器所占用的空间，而且延长保存时间，以及在黑曲霉的扩大培养以及柠檬酸发酵时便于对黑曲霉的接种量准确计数。优选地，该方法还包括在预培养之前，将黑曲霉麸曲中的黑曲霉孢子在无菌水中进行分散得到孢子悬浮液。制成孢子悬浮液进行保存时，在4℃下最长可保存20天，而通常的黑曲霉麸曲仅能够保存10-15天。

根据本发明的黑曲霉种子液的制备方法，将黑曲霉麸曲中的黑曲霉孢子制成孢子悬浮液的方法可以采用本领域技术人员公知的各种方法，例如，可以直接将黑曲霉麸曲与无菌水混合、搅拌，使黑曲霉悬孢子浮于无菌水中制得孢子悬浮液，而此时，游离出黑曲霉孢子的麸曲由于密度较大会沉于容器的底部，因此，可以直接取容器上部的黑曲霉孢子悬浮液进行计数。

根据本发明的黑曲霉种子液的制备方法，为了使黑曲霉孢子充分从麸曲中游离出来，并且能够得到均匀分散的孢子悬浮液，从而更有利于对黑曲霉孢子进行准确的计数。优选地，将黑曲霉在无菌水中进行分散得到孢子悬浮液的方法还包括：将黑曲霉分散到无菌水中，在300-1000rpm条件下，搅拌30-60min；然后在20000-40000频率下，超声处理20-40min。

根据本发明的黑曲霉种子液的制备方法，为了排除黑曲霉麸曲中麸曲的干扰而得到黑曲霉纯孢子悬浮液，从而更有利于准确计数，优选地，将黑曲霉麸曲中的黑曲霉孢子在无菌水中进行分散得到孢子悬浮液的方法还包括：在将黑曲霉分散于无菌水中之前，用无菌水对黑曲霉麸曲进行洗涤、过滤以除去麸曲，得到黑曲霉孢子。其中，所述洗涤和过滤的方法可以是本领域常用的各种洗涤和过滤方法，例如所述洗涤的方法可以为在盛有黑曲霉麸曲的容器中加入无菌水，并进行搅拌洗涤；所述过滤的方法可以利用四层医用纱布过滤，优选0.1mm的锦纶丝网过滤。

根据本发明的黑曲霉种子液的制备方法，对于所述孢子悬浮液中的黑曲霉的孢子的含量没有特别的限制，但是为了使黑曲霉孢子更好地分散并为了后续扩大培养时接种量的需要，优选地，所述孢子悬浮液中黑曲霉孢子的含量为4.0×10⁸-7.0×10⁸个孢子/ml。

根据本发明的黑曲霉种子液的制备方法，对于所述种子培养液没有特别的限制，可以是本领域常规的种子培养液，例如可以将制备发酵培养基过程中的酶解得到的产物，加水稀释至总糖浓度为8-12重量%，得到种子培养液。其中，所述糖浓度为以葡萄糖计的单糖的含量。

根据本发明的黑曲霉种子液的制备方法，对于将黑曲霉接种到种子液中进行培养的条件没有特别的限定，可以是本领域常用的条件，例如，可以包括：培养的温度为33-40℃，起始pH值为5-6，通气量为0.1-0.6体积：（体积·分钟）。对于将黑曲霉接种到种子液中进行培养的时间没有特别的限制，但是由于在接种到种子液中之前已经对黑曲霉孢子进行了预培养，即使培养时间少于现有技术的培养时间，黑曲霉也能够得到良好的生长，因此，为了节省种子罐运行所需成本的同时使已膨胀和萌发的黑曲霉充分的生长，优选的，在种子液中培养10-15小时。需要理解的是，在保证黑曲霉孢子在预培养阶段充分膨胀和萌发的情况下，其在种子罐中进行培养的时间可以根据黑曲霉生长的实际状况进行调整。例如，当预培养的时间较长，例如8小时时，可以适当的缩短黑曲霉在种子罐中的培养时间，例如可以为10小时；当预培养的时间较短，例如4小时时，则相反。

由以上可以看出，采用本发明的方法进行种子液的制备，预培养的时间与黑曲霉在种子罐中的培养时间的总和不会超过20小时，而采用现有技术的方法进行种子液的制备，其培养时间为25-30小时。因此，采用本发明的方法有效的缩短了黑曲霉种子液制备的时间，从而提供了种子罐的利用率。

另一方面，本发明提供了一种发酵制备柠檬酸的方法，所述方法包括在能够生成柠檬酸的条件下，将通过上述制备方法得到的黑曲霉种子液接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液。

由于本发明提供的制备柠檬酸的方法相对于现有技术的改进主要在于使用本发明的方法制备的黑曲霉种子液进行发酵，因此对于发酵制备柠檬酸的方法的其他条件和操作没有特别的要求，例如，发酵条件可以为本领域常规的发酵条件，例如，发酵的条件可以包括：温度为30-40℃，优选为35-37℃；起始pH值为4-5；通气量为0.1-1体积:（体积·分钟），优选为0.3-0.8体积:（体积·分钟）；时间为50-75小时，优选为55-65小时。

发酵过程就其本质来说是由微生物参与的生物化学反应过程，因此微生物细胞的数量、状态、代谢情况对产物的生物合成有着重要的影响。菌体浓度的大小对发酵产物的产率有着重要的影响。理论上菌体浓度越大，产物的产量也越大，但是菌体浓度过高会产生其他影响，如营养物质消耗过快，发酵液中的营养成分发生明显的改变，如有毒物质的积累等，这些可能改变菌体的代谢途径。因此，本发明中，以每升发酵培养基为基准，黑曲霉的接种量优选为1.8×10⁷-3.5×10⁷个孢子，进一步优选为2.2×10⁷-2.6×10⁷个孢子。

孢子的数量可以通过本领域公知的方法测定，例如，黑曲霉麸曲中、黑曲霉孢子悬浮液中、黑曲霉种子液中的孢子数均可以按照血球平板计数法测得。具体地，该方法为：称取1g黑曲霉麸曲5组，每组中加入含土蒽4体积%的无菌生理盐水，经过磁力搅拌器和超声波使孢子成为游离状态，分别在显微镜下进行孢子计数，取5组得到的数据的平均值。孢子悬浮液中的孢子数可以通过如下方法进行计数：血球计数板计数法。

本发明中，发酵培养基为本领域技术人员公知的概念，指微生物发酵所需的供微生物生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）以及维生素和水等。发酵液也为本领域技术人员公知的概念，指接入微生物菌株的液体培养基（该液体培养基也即本发明中所称发酵培养基），经过一段时间的培养后所得产物。

根据本发明的发酵制备柠檬酸的方法，对发酵培养基的成分没有特别的要求，只要可以用于柠檬酸发酵的发酵培养基即可。优选地，发酵培养基含有由淀粉质原料酶解得到的酶解产物，且优选由淀粉质原料酶解得到的酶解产物的量占发酵培养基总量的80-100重量%。一般地，淀粉质原料酶解得到的产物称为液化液，液化液经固液分离得到酶解残渣和液化清液，通常可以将液化清液用于制备发酵培养基，也可以将液化清液与液化液混合后用于制备发酵培养基。因此，本发明中，所述由淀粉质原料酶解得到的酶解产物包括上述经固液分离得到的液化清液，也包括未经固液分离的液化液，还包括上述二者的混合物。发酵培养基优选由液化液和液化清液与水混合或不与水混合得到，且进一步优选以发酵培养基的总重量为100重量份为基准，液化清液的用量为80-85重量份，液化液的用量为15-20重量份。

根据本发明的发酵制备柠檬酸的方法，液化清液可以通过多种方法制备得到，例如，可以通过如下方法制备得到：将淀粉质原料粉碎，将粉碎后的产物进行酶解，酶解得到的产物再经固液分离，得到液化清液和酶解残渣，固液分离的条件使酶解残渣的固含量为45-55重量%，优选为49-51重量%。

根据本发明的发酵制备柠檬酸的方法，淀粉质原料可以为本领域公知的各种可以用于酶解、发酵制备柠檬酸的含有淀粉的原料，例如，可以选自玉米、薯类（如木薯）和小麦中的一种或几种，优选情况下，所述淀粉质原料为玉米。

所述酶解步骤可以通过本领域常用的方法完成，比如向粉碎产物中添加产酶微生物和/或酶，在产酶微生物的生长温度和/或酶有活力的温度下保温完成。所述产酶微生物为能够分泌淀粉酶的产酶微生物。所述酶包括淀粉酶。

由于微生物生长会产生副产物，因此优选直接加入酶。所述酶的用量越多越好，出于成本考虑，优选以每克粉碎后的粉碎产物的干重计，淀粉酶的用量为15-50个酶活力单位。

本发明中，酶活力单位的定义为：在pH值为6.0、温度为70℃的条件下，1分钟将1毫克淀粉转化为还原糖所需的酶量为一个酶活力单位。

酶解的温度可以在很大范围内改变，优选为70-105℃，更优选为90-95℃。酶解的时间理论上越长越好，考虑到设备利用率，优选酶解的时间为90-150分钟，更优选为100-120分钟。酶解的pH值可以在很大范围内改变，优选为5.0-7.0，更优选为5.4-6.2，进一步优选为5.8-6.0。

淀粉酶是指能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，淀粉酶一般包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。

根据本发明的发酵制备柠檬酸的方法，优选使用α-淀粉酶和/或异淀粉酶。

根据本发明的发酵制备柠檬酸的方法，固液分离的方法与装置为本领域技术人员所公知，例如，压滤机或离心机。

根据本发明的发酵制备柠檬酸的方法，将经过种子培养得到的种子液加入到发酵培养基中进行发酵，优选，以每升发酵培养基为基准，黑曲霉的接种量在2.2×10⁷-2.6×10⁷个孢子。

根据本发明的发酵制备柠檬酸的方法，黑曲霉培养液的制备方法没有特别的限制，只要得到的培养液能够适用于黑曲霉菌种的生长即可。

术语“通气量”一般以通气比来表示，通常以每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比来表示（V／V·min），例如通气比为1:0.1-1，简称通气量为0.1-1体积:（体积·分钟）。

培养的设备为本领域技术人员所公知，例如，可以使用发酵罐进行培养。

按照本发明的方法制备得到的发酵产物柠檬酸可以用常规的方法，根据不同工业产品的要求分离并精制，比如中和、酸解、脱色、浓缩、结晶、包装。

根据本发明，糖浓度的测定方法可以是本领域公知的各种方法，优选为费林法，参照国标GBT50099-2008。以下实施例中，黑曲霉预培养过程中的糖浓度以及种子罐中的糖浓度均指以费林法测定的还原糖浓度计的糖浓度。

根据本发明，发酵液终点酸度的测定方法可以是本领域公知的各种方法，优选为NaOH滴定法，参照国标GBT8269-2006。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

实施例1

本实施例用于说明本发明提供的黑曲霉种子液和柠檬酸的制备方法。

（1）发酵培养基的制备

将收获的56千克玉米进行粉碎，得到颗粒直径平均为380微米的粉碎后产物，将粉碎后的产物按27重量%的浓度调浆，相对于每克粉碎后的产物，加入50个酶活力单位的淀粉酶（诺维信公司，α-淀粉酶，本发明实施例中均为此淀粉酶），进入喷射器，在95℃、pH为5.8的条件下酶解110分钟，得到酶解液化液，将酶解得到的酶解液化液通过用液压式板框压滤机进行压滤，分离出液化清液和酶解残渣，其中，酶解残渣的固含量为50重量%，将177.1千克的上述液化清液、38.9千克的酶解得到的产物灭菌后加入到300L的发酵罐中，得到发酵培养基。

（2）黑曲霉的培养

预培养

取360瓶成熟麸曲35L用无菌水冲洗并过滤，在800rpm条件下，搅拌45min；然后在30000频率下，超声处理30min，得到30L的分散均匀的孢子悬浮液，其中，孢子浓度为6.0×10⁸个孢子/ml悬浮液，取7.5L的上述孢子悬浮液，向所述孢子悬浮液中滴加浓度为35重量%的氢氧化钠水溶液，使pH值为6.8，再向所述孢子悬浮液中添加步骤（1）中制备的酶解液化液，使得以孢子悬浮液的总体积为基准，糖浓度为2重量%，在35℃的条件下，在转速为20rpm的摇床上，用软管通入0.01体积:（体积·分钟）无菌空气，培养8小时。

种子罐的培养

将制备发酵培养基过程中的部分酶解得到的产物，加水稀释至总糖为10重量%，得到种子培养液，将种子培养液投入种子罐，加热到121℃消毒，维持30分钟后快速降温至36℃，接入经过预培养的孢子悬浮液，每升培养液中黑曲霉的接种量为3×10⁸个孢子。在36℃、起始pH值为5.6、0.6体积:（体积·分钟）的通气条件下进行菌种培养，培养10小时，pH为2.3、酸度为0.8g/100mL、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时，停止培养。

（3）柠檬酸发酵

将经过培养的黑曲霉菌种加入到上述得到的发酵培养基中开始发酵，以发酵培养基的体积为基准，所述黑曲霉的接种量为2.5×10⁷个孢子/L，发酵条件包括温度为36℃，起始pH值为4.5，通气量为0.8体积:（体积·分钟），发酵55小时后，还原糖为0g/100mL，停止发酵，进行固液分离，测定柠檬酸溶液的浓度，计算单罐供酸量和转化率，具体结果见表1。

实施例2

本实施例用于说明本发明提供的黑曲霉种子液和柠檬酸的制备方法。

通过与实施例1相同的方法进行柠檬酸发酵，不同的是黑曲霉的培养过程如下：

预培养

取360瓶成熟麸曲35L用无菌水冲洗并过滤，在300rpm条件下，搅拌60min；然后在40000频率下，超声处理20min，得到30L的分散均匀的孢子悬浮液，其中，孢子浓度为7.0×10⁸个孢子/ml，取7.5L的孢子悬浮液，向所述孢子悬浮液中滴加浓度为35重量%的氢氧化钠水溶液，使pH值为7.2，再向所述孢子悬浮液中添加实施例1步骤（1）中制备的酶解液化液，使得以孢子悬浮液的总体积为基准，糖浓度为5重量%，在35℃的条件下，在转速为50rpm的摇床上，用软管通入0.03体积:（体积·分钟）微量无菌空气，培养4小时。

种子罐的培养

将制备发酵培养基过程中的部分酶解得到的产物，加水稀释至总糖为10重量%，得到种子培养液，将种子培养液投入种子罐，加热到121℃消毒，维持30分钟后快速降温至36℃，接入经过预培养的孢子悬浮液，每升培养液中黑曲霉的接种量为3×10⁸个孢子。在36℃、起始pH值为5.6、0.4体积:（体积·分钟）的通气条件下进行菌种培养，培养12小时，pH为2.3、酸度为0.8g/100mL、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时，停止培养。

进行柠檬酸发酵53小时后，还原糖浓度为0g/100mL，停止发酵，进行固液分离，测定柠檬酸溶液的浓度，计算单罐供酸量和转化率见表1。

实施例3

本实施例用于说明本发明提供的黑曲霉种子液和柠檬酸的制备方法。

通过与实施例1相同的方法进行柠檬酸发酵，不同的是黑曲霉的培养过程如下：

黑曲霉的培养

预培养

取360瓶成熟麸曲35L用无菌水冲洗并过滤，在1000rpm条件下，搅拌30min；然后在20000频率下，超声处理40min。得到30L的分散均匀的孢子悬浮液，其中，孢子浓度为4.0×10⁸个孢子/ml，取7.5L的孢子悬浮液，向所述孢子悬浮液中滴加浓度为35重量%的氢氧化钠水溶液，使pH值为6.5，再向所述孢子悬浮液中添加实施例1步骤（1）中制备的酶解液化液，使得以孢子悬浮液的总体积为基准，糖浓度为3.5重量%，在35℃的条件下，在转速为10rpm的摇床上，用软管通入0.05体积:（体积·分钟）无菌空气，培养6小时。

种子罐的培养

将制备发酵培养基过程中的部分酶解得到的产物，加水稀释至总糖为10重量%，得到种子培养液，将种子培养液投入种子罐，加热到121℃消毒，维持30分钟后快速降温至36℃，接入经过预培养的孢子悬浮液，每升培养液中黑曲霉的接种量为3×10⁸个孢子。在36℃、起始pH值为5.6、0.2体积:（体积·分钟）的通气条件下进行菌种培养，培养13小时，pH为2.3、酸度为0.8g/100mL、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时，停止培养。

进行柠檬酸发酵50小时后，还原糖浓度为0g/100mL，停止发酵，进行固液分离，测定柠檬酸溶液的浓度，计算单罐供酸量和转化率见表1。

实施例4

本实施例用于说明本发明提供的黑曲霉种子液和柠檬酸的制备方法。

按照与实施例1相同的方法对黑曲霉种子液的制备以及发酵制备柠檬酸，不同的是，在黑曲霉的预培养阶段，调节孢子悬浮液的pH值为6.2，预培养的时间为8h，种子罐培养的时间为12小时，pH为2.3、酸度为0.8g/100mL、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时，停止培养。进行柠檬酸发酵58小时后，还原糖浓度为0g/100mL，停止发酵，进行固液分离，测定柠檬酸溶液的浓度，计算单罐供酸量和转化率见表1。

实施例5

本实施例用于说明本发明提供的黑曲霉种子液和柠檬酸的制备方法。

按照与实施例1相同的方法对黑曲霉种子液的制备以及发酵制备柠檬酸，不同的是，黑曲霉成熟麸曲使用无菌水冲洗后不进行过滤。预培养的时间为8h，种子罐培养的时间为10.5小时，pH为2.3、酸度为0.8g/100mL、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时，停止培养。进行柠檬酸发酵56小时后，还原糖浓度为0g/100mL，停止发酵，进行固液分离，测定柠檬酸溶液的浓度，计算单罐供酸量和转化率见表1。

实施例6

本实施例用于说明本发明提供的黑曲霉种子液和柠檬酸的制备方法。

按照与实施例1相同的方法对黑曲霉种子液的制备以及发酵制备柠檬酸，不同的是，在预培养阶段，不向孢子悬浮液中添加酶解液化液，而是直接滴加氢氧化钠后按照实施例1的方法进行黑曲霉孢子的预培养。预培养的时间为8h，种子罐培养的时间为14小时，pH为2.3、酸度为0.8g/100mL、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时，停止培养。进行柠檬酸发酵60小时后，还原糖浓度为0g/100mL，停止发酵，进行固液分离，测定柠檬酸溶液的浓度，计算单罐供酸量和转化率见表1。

对比例1

按照与实施例1相同的方法对黑曲霉进行扩大培养以及发酵制备柠檬酸，不同的是，在黑曲霉的扩大培养时，直接将黑曲霉麸曲接种到含有种子培养液的种子罐中进行培养，不经过预培养步骤，每升种子培养液中黑曲霉的接种量约为3×10⁸个孢子，培养30个小时，pH为2.3、酸度为0.8g/100mL、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时，停止培养，并将种子液接种到发酵罐中继续后续的发酵过程。

按照实施例1的方法进行柠檬酸发酵63小时后，还原糖浓度为0g/100mL，停止发酵，测定柠檬酸溶液的浓度，计算单罐供酸量和转化率，具体结果见表1。

表1

从上表1中可知，在相同的发酵条件下，与传统的柠檬酸发酵方法（对比例1）相比，使用通过本发明的方法制备的黑曲霉种子液进行柠檬酸发酵（实施例1-6）能够显著的缩短柠檬酸的发酵所需的时间，且预培养和扩大培养所需的总时间也显著少于传统的种子扩培所需的时间。将实施例1与实施例4-6相比，可以看出，将预培养的pH控制在本发明的优选范围内、预培养前去除麸曲以及在含有糖的条件下进行预培养，均可以更好的实现本发明的目的。另外，对比例1中所使用的黑曲霉麸曲必须要在麸曲制备15天之内使用，但是根据本发明的方法制备成孢子悬浮液，可以在孢子悬浮液制备后20天内使用。

采用本工艺后相对于传统工艺，便于黑曲霉孢子的储存，增强了种子罐接种量的稳定性，缩短了黑曲霉在种子罐中的培养时间，从而提高了设备的利用率，降低了能耗，同时提高了种子液的质量，并能够对黑曲霉的接种量进行准确计数且便于黑曲霉孢子的储存，使发酵水平有较大提高，具有可观的经济和社会效益。

Claims (8)

1.一种黑曲霉种子液的制备方法，该方法包括将黑曲霉接种到种子培养液中进行培养，其特征在于，该方法还包括，将黑曲霉接种到种子培养液中进行培养之前，将黑曲霉孢子进行预培养，所述预培养的条件包括：pH值为6.2-7.2；

其中，所述预培养的条件还包括，将黑曲霉孢子在糖液中进行预培养，所述糖液中的糖含量为2-5g/100mL；

其中，所述糖液为淀粉质原料酶解得到的酶解产物；

该方法还包括，在预培养之前，将黑曲霉孢子在无菌水中进行分散得到孢子悬浮液；所述黑曲霉孢子以黑曲霉麸曲的形式存在，将黑曲霉麸曲中的黑曲霉孢子在无菌水中进行分散得到孢子悬浮液的方法还包括：在将黑曲霉孢子分散于无菌水中之前，用无菌水对黑曲霉麸曲进行洗涤、过滤以除去麸曲，得到黑曲霉孢子。

2.根据权利要求1所述的黑曲霉种子液的制备方法，其中，所述预培养的pH值为6.5-7.2。

3.根据权利要求1或2所述的黑曲霉种子液的制备方法，其中，所述预培养的条件还包括，预培养的温度为30-35℃，预培养的时间为4-8小时。

4.根据权利要求1或2所述的黑曲霉种子液的制备方法，其中，所述预培养的条件还包括，在10-50rpm条件下进行摇床培养。

5.根据权利要求1所述的黑曲霉种子液的制备方法，其中，将黑曲霉孢子在无菌水中进行分散得到孢子悬浮液的方法包括：将黑曲霉孢子分散到无菌水中，在300-1000rpm条件下，搅拌30-60min；然后在20000-40000频率下，超声处理20-40min。

6.根据权利要求1或5所述的黑曲霉种子液的制备方法，其中，所述孢子悬浮液中黑曲霉孢子的含量为4×10⁸-7×10⁸个孢子/ml。

7.根据权利要求1所述的黑曲霉种子液的制备方法，其中，将黑曲霉接种到种子培养液中进行培养的条件包括：糖含量为8-12重量％，培养的温度为33-40℃，起始pH值为5-6，通气量为0.1-0.5体积：(体积·分钟)，时间为10-15小时。

8.一种发酵制备柠檬酸的方法，该方法包括在能够生成柠檬酸的条件下，将通过权利要求1-7中任意一项所述的黑曲霉种子液的制备方法得到的黑曲霉种子液接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液。