CN102443611B

CN102443611B - 一种柠檬酸的生产方法

Info

Publication number: CN102443611B
Application number: CN201010511953.6A
Authority: CN
Inventors: 周永生; 周勇; 卢宗梅; 张继学; 叶志晨
Original assignee: Cofco Biochemical Anhui Co Ltd
Current assignee: COFCO Biotechnology Co., Ltd
Priority date: 2010-10-13
Filing date: 2010-10-13
Publication date: 2014-03-05
Anticipated expiration: 2030-10-13
Also published as: CN102443611A

Abstract

本发明提供了一种柠檬酸的生产方法，该方法包括在生成柠檬酸的条件下，将黑曲霉接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液，其特征在于，该方法还包括向发酵液中添加具有6个碳原子的单糖，添加具有6个碳原子的单糖的时间在将黑曲霉接种到发酵培养基后24小时至发酵完成前5小时的时间段内。本发明通过添加单糖，充分利用了黑曲霉的转化功能，在不改变设备和反应条件等能耗的前提下，得到了更大量的柠檬酸，相比现有技术，本发明提高了整体设备的利用率，进而提高了整体工艺的产能。

Description

一种柠檬酸的生产方法

技术领域

本发明涉及一种柠檬酸的生产方法。

背景技术

柠檬酸是有机酸中第一大酸，由于物理、化学等方面的优异性能，广泛应用于医药、化学、电子、纺织、石油、皮革、建筑、摄影、塑料、铸造和陶瓷等工业领域。

柠檬酸的生产方法主要有两种：一种是从天然含柠檬酸的果汁中提取；另一种是用发酵法进行生产，目前工业上主要以黑曲霉发酵法生产柠檬酸为主。具体的做法是将黑曲霉接种到发酵培养基中，发酵培养基中含有淀粉质原料酶解产物和氮源，经过发酵和固液分离得到柠檬酸的溶液。目前，工业上发酵法生产柠檬酸常用3×10⁵L的发酵罐，每次发酵使用的淀粉质原料为5.6×10⁴千克，最终发酵得到的柠檬酸为32.5×10³-3.4×10³千克。如果想要扩大产能，只能增大发酵罐的体积、增加发酵罐的数目或者其他改变现有设备的方法，这样势必造成工业生产成本的极大增加。

因此，迫切需要开发一种不改变现有设备就能使黑曲霉发挥其最大效用、提高柠檬酸产能的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够有效提高柠檬酸产能的柠檬酸的生产方法。

本发明的发明人经过研究发现，目前黑曲霉发酵法整体工艺产能较低的原因在于黑曲霉的利用率不高，黑曲霉的发酵过程大致可以分为三个阶段，一是发酵前期，主要是黑曲霉的生长阶段，同时菌体产生糖化酶，糖化酶将原料中的多糖转化为黑曲霉可以利用的葡萄糖，葡萄糖经过一系列代谢途径，将葡萄糖转化为柠檬酸，由于糖被黑曲霉利用合成了有机酸使pH值下降而进入主发酵期；二是主发酵期，即产酸阶段，在此阶段中，柠檬酸大量积累；三是发酵后期，即自溶阶段，随着养分的耗尽，菌体蛋白酶变得活跃，致使pH值又呈上升趋势，此时菌体趋于自溶而代谢活动终止。在整个发酵过程中，进入第二阶段后，由于pH值下降，糖化酶的活性受到抑制，导致在主发酵期过程中，部分黑曲霉没有足够的葡萄糖可以进行转化，造成了生物能源和设备的极大浪费。

本发明提供了一种柠檬酸的生产方法，该方法包括在生成柠檬酸的条件下，将黑曲霉接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液，其特征在于，该方法还包括向发酵液中添加具有6个碳原子的单糖，添加具有6个碳原子的单糖的时间在将黑曲霉接种到发酵培养基后24小时至发酵完成前5小时的时间段内。

本发明通过添加单糖，充分利用了黑曲霉的转化功能，在不改变设备和反应条件等能耗的前提下，得到了较高的柠檬酸产能，如实施例1和对比例2中，使用同样的300L型号的设备，发酵同样重量的淀粉质原料，实施例1可以得到45.69千克柠檬酸，而对比例2仅获得33.32千克柠檬酸。由此可见，相比现有技术，本发明提高了整体设备的利用率，进而提高了整体工艺的产能。

具体实施方式

本发明提供了一种柠檬酸的生产方法，该方法包括在生成柠檬酸的条件下，将黑曲霉接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液，其特征在于，该方法还包括向发酵液中添加具有6个碳原子的单糖，添加具有6个碳原子的单糖的时间在将黑曲霉接种至发酵培养基后24小时至发酵完成前5小时的时间段内。

其中，所述发酵培养基为本领域技术人员公知的概念，指微生物发酵所需的供微生物生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐(包括微量元素)以及维生素和水等。所述发酵液也为本领域技术人员公知的概念，指接入微生物菌种的液体培养基(该液体培养基也即本发明中所称发酵培养基)，经过一段时间的培养后所得产物。

根据本发明，所述单糖的添加量可以在较大范围内变化，考虑到既要充分利用黑曲霉的转化功能，又要结合成本因素，优选情况下，所述单糖的添加量与发酵液总量的重量比为1∶8-100，进一步优选为1∶10-50，最优选为1∶13-28。

添加单糖是为了充分利用黑曲霉的转化功能，添加的时间点很关键，过早的添加反而造成了转化效率的降低，本发明的对比例1在黑曲霉接种到发酵培养基之前就在在发酵液中添加了单糖，对比例1中柠檬酸的转化效率仅为92.5％，比不添加单糖的对比例2中柠檬酸的转化效率93.31％还低。究其原因可能有两方面，第一，对比例1中碳源过多，造成单糖转化为柠檬酸的速率过快，pH值降低的速率也过快，导致菌体生长不足和菌体早衰；第二，对比例1中补加了单糖，在发酵高泡沫期时容易产生溢料现象，从而造成原料的损失。而过晚的添加，黑曲霉已经到了生长的衰败期，将单糖转化为柠檬酸的功能变弱，即使添加单糖也难以得到很好的效果。

因此，优选开始添加具有6个碳原子的单糖的时间为将黑曲霉接种至发酵培养基后24-56小时，进一步优选为40-50小时，优选结束添加具有6个碳原子的单糖的时间为将黑曲霉接种至发酵培养基后60-70小时，这样能够在不改变设备和运转条件的情况下，提高柠檬酸的产能，从而提高整体设备的利用率。

根据本发明，对于所述单糖或含有单糖的水溶液的添加方式没有特殊的限定，可以一次添加，多次添加或连续添加。多次添加和连续添加能够使发酵液中总糖保持在一定范围内，因此，添加方式优选为多次添加或连续添加。

当添加方式为多次添加时，优选使多次添加均匀分布在添加时间段内，相邻两次添加的时间间隔不大于8小时，优选地，相邻两次添加的时间间隔不大于4小时，每次添加的单糖的量可以相同或不同，优选情况下，每次添加的单糖的量相同。

为了获得更高的柠檬酸产能和发酵反应的稳定性，所述添加方式进一步优选为连续添加，所述连续添加的单糖的量使得所述发酵液中总糖保持为2-5重量％。

根据本发明，对于所述添加的单糖的形态没有严格的要求，可以为单糖固体和/或含有单糖的水溶液。发酵液中总糖保持在一定范围内能够提高最终的柠檬酸产能，因此，优选添加的含有单糖的水溶液中单糖的浓度为25重量％以上。

根据本发明，所述单糖可以为任何含有6个碳原子的单糖，如葡萄糖，果糖，半乳糖等，优选为葡萄糖和/或果糖，由于葡萄糖是黑曲霉发酵生成柠檬酸过程中的天然原料单糖，同时考虑到成本因素，所述单糖优选为葡萄糖。

根据本发明，所述含有单糖的水溶液为各种含有单糖的水溶液，优选地，所述含有单糖的水溶液为葡萄糖母液。所述葡萄糖母液为本领域人员公知的概念，指的是工业上结晶法生产葡萄糖时，结晶后剩下的葡萄糖溶液。比较实施例1和实施例2可以看出，实施例1利用葡萄糖母液作为添加的单糖，实施例2利用纯的葡萄糖水溶液作为添加的单糖，实施例1与实施例2能够得到相当的柠檬酸产能，而利用葡萄糖母液作为添加的单糖能够更有效地降低生产成本，因此本发明优选使用葡萄糖母液作为添加的单糖。

根据本发明所述的方法，该方法还包括向发酵液中添加氮源，添加氮源的时间在将黑曲霉接种至发酵培养基后24小时至发酵完成前5小时的时间段内，添加氮源的作用是为了更好的维持黑曲霉的生长，因此优选情况下，以氮元素计，所述氮源的添加量可以为所述添加的单糖的量的0.033-0.35重量％，进一步优选为0.1-0.2重量％。

根据本发明，在将黑曲霉接种至发酵培养基后24小时内，对添加所述氮源的具体时间并没有特别的限定，可以与单糖的添加时间相同或不同，优选地，所述氮源的添加时间与所述单糖的添加时间相近，更优选地，所述氮源与单糖同时添加。需要明确的是，同时添加的氮源的量与单糖的量符合上述氮源添加总量与单糖添加总量之间的比例关系。

根据本发明，所述氮源可以为任何能够作为黑曲霉生长所需氮源的物质，包括有机氮源和/或无机氮源。优选地，所述氮源为尿素、硫酸铵、硝酸铵、玉米蛋白和玉米浆中的至少一种。有机氮源中含有其他的营养成分，对于黑曲霉发酵生产柠檬酸有更好的促进作用，因此更优选地，所述氮源为有机氮源，如玉米蛋白和/或玉米浆。

发酵过程就其本质来说是由微生物参与的生物化学反应过程，因此微生物细胞的数量、状态、代谢情况对产物的生物合成有着重要的影响。菌体浓度的大小对发酵产物的产率有着重要的影响。理论上菌体浓度越大，产物的产量也越大，但是菌体浓度过高会产生其他影响，如营养物质消耗过快，发酵液中的营养成分发生明显的改变，有毒物质的积累等，这些可能改变菌体的代谢途径。因此，对于柠檬酸发酵，接种量为2.4×10⁴个菌落形成单位才能达到最佳的产酸率，更多的接种量非但不会提高最终的柠檬酸产能，反而会影响柠檬酸产能。

但是本发明的发明人在研究中发现，在本发明中，接种比常规量高的黑曲霉菌种反而得到了更高的柠檬酸转化率和单次产量。如本发明的实施例1中，接种了3.5×10⁴个黑曲霉菌种形成单位，并且添加了单糖和氮源，实施例1中柠檬酸的转化率和单次产量分别为96.77％和45.69千克；对比例2与实施例1接种相同量的黑曲霉，但是没有添加单糖和氮源，对比例2中柠檬酸的转化率和单次产量分别为93.31％和33.32千克；实施例4接种常规量的黑曲霉菌种，添加了单糖和氮源，实施例4中柠檬酸的转化率和单次产量分别为95.60％和42.88千克；对比例3接种常规量的黑曲霉菌种，但没有添加单糖和氮源，对比例3中柠檬酸的转化率和单次产量分别为94％和33.57千克；分别比较实施例1与对比例2和实施例4与对比例3可以看出，在添加单糖和氮源的条件下，无论是否提高发酵罐中接种的黑曲霉的量，都能够提高柠檬酸的转化率和单次产量，比较实施例1和实施例4可以看出，在添加单糖和氮源的情况下，提高发酵罐中接种的黑曲霉的量能够提高柠檬酸的转化率和单次产量，但是比较对比例2和对比例3可以看出，没有添加单糖和氮源的情况下，只是单纯的提高发酵罐中接种的黑曲霉的量反而造成柠檬酸的转化率和单次产量的降低。

因此，本发明中，以每克发酵培养基为基准，所述黑曲霉的接种量可以为1.8×10⁴-5.3×10⁴个菌落形成单位，优选地，以每克发酵培养基为基准，所述黑曲霉的接种量为2.5×10⁴-4.0×10⁴个菌落形成单位。

本发明中，所述发酵的条件没有特别的限制，可以为本领域常规的发酵条件，例如，所述发酵的条件可以包括：温度为30-40℃，优选为30-35℃；pH值为1-7，优选为2-4，通气量为0.1-1体积：体积·分钟；优选为0.2-0.8体积：体积·分钟；时间为75-95小时，优选为80-90小时。

所述菌落形成单位的定义为将稀释后的一定量的菌液通过浇注或涂布的方法，让其内的微生物单细胞一一分散在培养基平板上，待培养后，每一活细胞就形成一个菌落。即每毫升菌液中含有的单细胞的数目。

所述菌落形成单位可以通过本领域公知的方法测定，例如，通过血球计数板计数。

根据本发明，对发酵培养基的成分没有特别的要求，只要可以用于柠檬酸发酵的发酵培养基即可。优选地，所述发酵培养基含有淀粉质原料酶解产物碳源含量为13-21重量％，氮源含量为0.06-0.14重量％，磷源含量为0.005-0.07重量％，无机盐含量0.1-2.6重量％，水含量为77-86重量％。一般地，淀粉质原料酶解得到淀粉质原料酶解残渣和淀粉质原料酶解液化清液，通常可以将淀粉质原料酶解液化清液用于制备发酵培养基，也可以将淀粉质原料酶解液化清液与淀粉质原料酶解残渣混合后用于制备发酵培养基。本发明所述淀粉质原料酶解产物优选由淀粉质原料酶解残渣和淀粉质原料酶解液化清液与水混合或不与水混合得到，且进一步优选以所述发酵培养基的总重量为100重量份为基准，所述淀粉质原料酶解液化清液的用量为80-95重量份，所述淀粉质原料酶解残渣的用量为0.5-10重量份，水的用量为0-15重量份。

根据本发明，所述淀粉质原料酶解液化清液可以通过多种方法制备得到，例如，可以通过如下方法制备得到：将淀粉质原料粉碎，将粉碎后的产物进行酶解，得到酶解产物，将酶解产物固液分离，得到淀粉质原料酶解液化清液和淀粉质原料酶解残渣，所述固液分离的条件使淀粉质原料酶解残渣的固含量为5-60重量％，更优选为30-50重量％。

根据本发明，所述淀粉质原料可以为本领公知的各种可以用于酶解、发酵制备柠檬酸的含有淀粉的原料，例如，可以选自玉米、薯类(如木薯)和小麦中的一种或几种，优选情况下，所述淀粉质原料为玉米。

所述酶解步骤可以通过本领域常用的方法完成，比如向粉碎产物中添加产酶微生物和/或酶，在产酶微生物的生长温度和/或酶有活力的温度下保温完成。所述产酶微生物为能够分泌淀粉酶的产酶微生物。所述酶包括淀粉酶。

由于微生物生长会产生副产物，因此优选直接加入酶。所述酶的用量越多越好，出于成本考虑，优选以每克粉碎后的粉碎产物的干重计，所述淀粉酶的用量为15-50个酶活力单位。

本发明所述酶的酶活力单位的定义为：在pH值为6.0、温度为70℃的条件下，1分钟将1毫克淀粉转化为还原糖所需的酶量为一个酶活力单位。

所述酶解的温度可以在很大范围内改变，优选为70-105℃，更优选为80-95℃。所述酶解的时间理论上越长越好，考虑到设备利用率，优选所述酶解的时间为90-150分钟，更优选为100-120分钟。所述酶解的pH值可以在很大范围内改变，优选为5.0-7.0，更优选pH值为5.4-5.7。

淀粉酶是指能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，所述淀粉酶一般包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。

根据本发明，优选使用α-淀粉酶和/或异淀粉酶。

根据本发明，所述固液分离的方法与装置为本领域技术人员所公知，例如，压滤机或离心机。

所述黑曲霉可以采用常规的方法接种，例如，在被接种至发酵培养基中之前，将所述黑曲霉经过种子培养处理，之后将得到的种子液加入到发酵培养基中。黑曲霉种子培养的程度可以通过取样显微镜镜检、酸度测定和pH测定对黑曲霉的生长进行观察，当pH在2.0-2.5、酸度0.5-2.0％、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时停止培养。

优选情况下，所述种子培养处理的方法包括：将黑曲霉接种在黑曲霉培养液中进行培养，所述黑曲霉培养液中含有10-17重量％的玉米粉，接种后黑曲霉培养液中黑曲霉的浓度为3×10⁵-4×10⁵个/毫升。

根据本发明，所述黑曲霉培养液的制备方法没有特别的限制，只要得到的培养液能够适用于黑曲霉的培养即可。

根据本发明，所述黑曲霉的培养条件可以在很大范围内改变，例如所述培养的条件可以包括：培养的温度可以为25-45℃，pH值可以为1-7，通气量可以为0.05-0.5体积：体积·分钟，培养的时间可以为45-65小时；更优选的情况下，所述培养的条件可以包括：培养的温度可以为30-40℃，pH值可以为2-4，通气量可以为0.1-0.3体积：体积·分钟，所述培养的时间可以为50-60小时。

术语“通气量”一般以通气比来表示，通常以每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比来表示(V/V·min)，例如通气比为1∶0.1-1，简称通气量为0.01-1体积：体积·分钟。

所述培养的设备为本领域技术人员所公知，例如，可以使用发酵罐进行培养。

按照本发明的方法制备得到的发酵产物柠檬酸可以用常规的方法，根据不同工业产品的要求分离并精制，比如中和、酸解、脱色、浓缩、结晶、包装。

下面结合实施例对本发明进行更详细的说明。

实施例1

本实施例用于说明本发明提供的柠檬酸的生产方法。

(1)将收获的56千克玉米在热水槽润焖，直至玉米的含水量为15重量％，然后进行粉碎，得到平均粒子直径为400微米的粉碎后产物。

(2)将粉碎后的产物按25重量％的浓度调浆，相对于每克粉碎后的产物，加入20个酶活力单位的淀粉酶(诺维信公司，α-淀粉酶，本发明实施例中均为此淀粉酶)，进入喷射器，在85℃、pH为5.5的条件下酶解100分钟，得到酶解产物A1。

(3)将酶解产物A1通过用液压式板框压滤机进行压滤，分离出酶解液化清液和酶解滤渣，其中，酶解残渣的含水量为50％。

(4)配制发酵培养基，将170千克的上述酶解液化清液、2.0千克的酶解残渣和13千克的水灭菌后加入到300L的发酵罐中，得到发酵培养基B1，其中碳源含量为16重量％，氮源含量为0.095重量％，磷源含量为0.06重量％，无机盐含量0.4重量％，水含量为83.4％。

(5)将步骤(2)中的部分酶解液化液，加水稀释至总糖的10重量％，得到培养液，将培养液投入种子罐，加热到121℃消毒，维持30分钟后快速降温至36℃，接入黑曲霉菌种(黑曲霉T01，天津工业微生物所，本发明实施例中均为此黑曲霉菌种，接种量为：每克酶解液化液3×10⁵个菌落形成单位)，在36℃、0.4体积：体积·分钟的通气条件下进行菌种培养；通过取样显微镜镜检、酸度测定和pH测定对黑曲霉的生长进行观察，当pH在2.0、酸度1％、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时，停止培养。

(6)将步骤(5)培养的黑曲霉菌种加入到步骤(4)的发酵罐中开始发酵，并在发酵过程中检测发酵液中的总糖，接种量为：每克发酵培养基3.5×104个菌落形成单位，发酵条件包括温度为35℃，pH值为3，通气量为0.4体积：体积·分钟，当发酵进行到第45小时的时候(从将黑曲霉接种到发酵罐中开始计算，本发明的实施例中的发酵时间均如此计算)，采用连续添加的方式，匀速地加入28千克的添加溶液，所述添加溶液为尿素浓度为0.16重量％的葡萄糖母液，其中葡萄糖的浓度为50重量％，当发酵进行到第65小时的时候停止加入，加入添加溶液的过程中发酵液的总糖含量为3.5重量％，发酵进行到第80小时的时候进行固液分离，得到柠檬酸溶液。

根据GB 1987-2007标准检测实施例1中所得柠檬酸溶液的浓度(简称酸度)，计算柠檬酸的转化率和单次产量，转化率(％)＝柠檬酸溶液的浓度(简称酸度)×柠檬酸溶液的体积/总糖的重量×100％，柠檬酸的单次产量＝柠檬酸溶液的浓度×柠檬酸溶液的体积，结果如表1所示。

对比例1

根据实施例1所述的方法生产柠檬酸，不同的是，步骤(6)中与实施例1相同量的葡萄糖和尿素在发酵之前加入到发酵罐中，即步骤(6)为：

在发酵罐中加入28千克的添加溶液，所述添加溶液为尿素浓度为0.16重量％的葡萄糖母液，其中葡萄糖的浓度为50重量％，将步骤(5)培养的黑曲霉菌种加入到步骤(4)的发酵罐中开始发酵，并检测发酵液中的总糖，接种量为：每克发酵培养基3.5×10⁴个菌落形成单位，发酵条件包括温度为35℃，pH值为3，通气量为0.4体积：体积·分钟，发酵进行到第80小时的时候进行固液分离，得到柠檬酸溶液。

对比例2

根据实施例1所述的方法生产柠檬酸，不同的是，在步骤(6)中不添加糖和尿素，而是添加28千克的发酵培养基B1，即对比例2的步骤(6)为：

将步骤(5)培养的黑曲霉菌种加入到步骤(4)的发酵罐中开始发酵，并检测发酵液中的总糖，接种量为：每克发酵培养基3.5×10⁴个菌落形成单位，发酵条件包括温度为35℃，pH值为3，通气量为0.4体积：体积·分钟，当发酵进行到第45小时的时候，采用连续添加的方式，匀速地加入28千克的发酵培养基B1，发酵进行到第80小时的时候进行固液分离，得到柠檬酸溶液。

实施例2

本实施例用于说明本发明提供的柠檬酸的生产方法。

(1)将收获的56千克的玉米在热水槽润焖，直至玉米的含水量为20重量％，然后进行粉碎，得到平均粒子直径为800微米的粉碎后产物。

(2)将粉碎后的产物按25重量％的浓度调浆，相对于每克粉碎后的产物，加入45个酶活力单位的淀粉酶，进入喷射器，在90℃、pH为5的条件下酶解90分钟，得到酶解产物A2。

(3)将酶解产物A2通过用液压式板框压滤机进行压滤，分离出酶解液化清液和酶解滤渣，其中，酶解残渣的含水量为30％。

(4)配制发酵培养基，具体组成为160千克的酶解液化清液、9千克的酶解残渣和16千克的水灭菌后加入到发酵罐中，得到发酵培养基B2。其中碳源含量为18.6重量％，氮源含量为0.1重量％，磷源含量为0.055重量％，无机盐含量0.17重量％，水含量为81％

(5)将步骤(2)中得到的部分酶解液化液，加水稀释至总糖10％，得到培养液，将培养液投入种子罐，投入种子罐，加入尿素，尿素的加入量为培养液总重量的0.35％，加热到120℃消毒，维持20分钟后快速降温至36℃，接入黑曲霉菌种(接种量为：每克酶解液化清液3.5×10⁵个菌落形成单位)，在36℃、0.4体积：体积·分钟的通气条件下进行菌种培养；通过取样显微镜镜检、酸度测定和pH测定对黑曲霉的生长进行观察，当pH在2.0、酸度1％、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时，停止培养。

(6)将步骤(5)培养的黑曲霉菌种加入到步骤(4)的发酵罐中开始发酵，并在发酵过程中检测发酵液中的总糖，接种量为：每克发酵培养基2.5×10⁴个菌落形成单位，发酵条件包括温度为30℃，pH值为2，通气量为1体积：体积·分钟，当发酵进行到第40小时的时候，采用连续添加的方式，匀速地加入30千克的添加溶液，所述添加溶液为尿素浓度为0.125重量％的葡萄糖水溶液(即添加溶液中只有尿素，葡萄糖和水)，其中葡萄糖的浓度为30重量％，当发酵进行到第60小时的时候停止加入，加入添加溶液的过程中发酵液的总糖含量为4.5重量％，发酵进行到第83小时的时候进行固液分离，得到柠檬酸溶液。

实施例3

本实施例用于说明本发明提供的柠檬酸的生产方法。

(1)将收获的56千克玉米在热水槽润焖，直至玉米的含水量为10重量％，然后进行粉碎，得到平均粒子直径为500微米的粉碎后产物。

(2)将粉碎后的产物按25重量％的浓度调浆，相对于每克粉碎后的产物，加入30个酶活力单位的淀粉酶，进入喷射器，在80℃、pH为6的条件下酶解120分钟，得到酶解产物A3。

(3)将酶解产物A3通过用液压式板框压滤机进行压滤，分离出酶解液化清液和酶解滤渣，其中，酶解残渣的含水量为15％。

(4)配制发酵培养基，具体组成为155千克的酶解液化清液、12千克的酶解残渣和18千克的水，灭菌后加入到发酵罐中，得到发酵培养基B3。其中碳源含量为14.75重量％，氮源含量为0.12重量％，磷源含量为0.015重量％，无机盐含量2.4重量％，水含量为82.7％。

(5)将步骤(3)中的部分酶解液化清液，加水稀释至总糖10％投入种子罐，得到培养液，将培养液投入种子罐，加入尿素，尿素的加入量为种子罐培养液总重量的0.35％，加热到120℃消毒，维持20分钟后快速降温至36℃，接入黑曲霉菌种(接种量为：每克酶解液化清液4×10⁵个菌落形成单位)，在36℃、0.4体积：体积·分钟的通气条件下进行菌种培养；通过取样显微镜镜检、酸度测定和pH测定对黑曲霉的生长进行观察，当pH在2.0、酸度1％、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时，停止培养。

(6)将步骤(5)培养的黑曲霉菌种加入到步骤(4)的发酵罐中开始发酵，并在发酵过程中检测发酵液中的总糖，接种量为：每克发酵培养基4×10⁴个菌落形成单位，发酵条件包括温度为32℃，pH值为4，通气量为0.1体积：体积·分钟，当发酵进行到第50小时的时候，采用连续添加的方式，匀速地加入18千克的添加溶液，所述添加溶液为尿素浓度为0.088重量％的葡萄糖母液，其中葡萄糖的浓度为40重量％，当发酵进行到第70小时的时候停止加入，加入添加溶液的过程中发酵液的总糖含量为2.5重量％，发酵进行到第88小时的时候进行固液分离，得到柠檬酸溶液。

实施例4

本实施例用于说明本发明提供的柠檬酸的生产方法。

按照实施例1所述的方法生产柠檬酸，不同的是，步骤(6)中黑曲霉的接种量为：每克发酵培养基2.4×10⁴个菌落形成单位。

对比例3

按照实施例4所述的方法生产柠檬酸，不同的是，步骤(6)中不添加糖和尿素，即对比例3的步骤(6)为：

将步骤(5)培养的黑曲霉菌种加入到步骤(4)的发酵罐中开始发酵，并检测发酵液中的总糖，接种量为：每克发酵培养基2.4×10⁴个菌落形成单位，发酵条件包括温度为35℃，pH值为3，通气量为0.4体积：体积·分钟，发酵88小时后进行固液分离，得到柠檬酸溶液。

实施例5

本实施例用于说明本发明提供的柠檬酸的生产方法。

按照实施例2所述的方法生产柠檬酸，不同的是，步骤(6)中，添加30千克的浓度为30重量％的果糖水溶液代替30千克的浓度为30重量％的葡萄糖水溶液。

实施例6

本实施例用于说明本发明提供的柠檬酸的生产方法。

按照实施例1所述的方法生产柠檬酸，不同的是，步骤(6)中不添加尿素，即实施例6的步骤(6)为：

将步骤(5)培养的黑曲霉菌种加入到步骤(4)的发酵罐中开始发酵，并检测发酵液中的总糖，接种量为：每克发酵培养基3.5×10⁴个菌落形成单位，发酵条件包括温度为35℃，pH值为3，通气量为0.4体积：体积·分钟，当发酵进行到第45小时的时候，采用连续添加的方式，匀速地加入28千克的添加溶液，所述添加溶液为葡萄糖浓度为50重量％的葡萄糖母液，当发酵进行到第65小时的时候停止加入，发酵进行到第80小时的时候进行固液分离，得到柠檬酸溶液。

实施例7

本实施例用于说明本发明提供的柠檬酸的生产方法。

按照实施例1所述的方法生产柠檬酸，不同的是，步骤(6)中的单糖和氮源分多次添加，即实施例7的步骤(6)为：

将步骤(5)培养的黑曲霉菌种加入到步骤(4)的发酵罐中开始发酵，并在发酵过程中检测发酵液中的总糖，接种量为：每克发酵培养基3.5×10⁴个菌落形成单位，发酵条件包括温度为35℃，pH值为3，通气量为0.4体积：体积·分钟，当发酵进行到第45小时的时候分6次加入28千克葡萄糖母液，其中葡萄糖的浓度为50重量％，平均每4小时添加一次，在每次添加葡萄糖固体后的10分钟内，一次性添加0.15千克浓度为20％的玉米蛋白，当发酵进行到第65小时的时候停止加入，当发酵进行到第80小时的时候进行固液分离，得到柠檬酸溶液。

表1

编号	发酵酸度％	发酵转化率(％)	柠檬酸的单次产量(kg)
				实施例1	18.65	96.77	45.69
对比例1	15.60	92.50	38.22
				对比例2	13.60	93.31	33.32
实施例2	18.55	96.23	45.45
				实施例3	18.50	95.96	45.33
实施例4	17.50	95.60	42.88
				对比例3	13.70	94.00	33.57
实施例5	18.40	95.43	45.08
				实施例6	15.70	94.50	38.47
实施例7	18.30	95.89	44.84

从上表1中的数据可以看出，本发明提供的生产柠檬酸的方法，在不改变设备和反应条件的前提下，得到了较高的产酸酸度、转化率和柠檬酸单次产量，在每次生产的生产周期不变的情况下，柠檬酸单次产量的提高无疑提高了整体设备的利用率，提高了整体工艺的单次产量。

对比例1在发酵开始就添加葡萄糖和尿素，相比于实施例1，对比例1的产酸酸度和转化率相差很大，甚至低于不添加葡萄糖和尿素的对比例2，说明选择合适的时间点加入葡萄糖和尿素才能够实现本发明。

本发明的实施例1中，接种了3×10⁴个黑曲霉菌种形成单位，并且添加了单糖和氮源，实施例1中柠檬酸的转化率和单次产量分别为96.77％和45.69千克；对比例2实施例1接种相同量的黑曲霉，但是没有添加单糖和氮源，对比例2中柠檬酸的转化率和单次产量分别为93.31％和33.32千克；实施例4接种常规量的黑曲霉菌种，并添加了单糖和氮源，实施例4中柠檬酸的转化率和单次产量分别为95.60％和42.88千克；对比例3接种常规量的黑曲霉菌种，但没有添加单糖和氮源，对比例3中柠檬酸的转化率和单次产量分别为94％和33.57千克；分别比较实施例1与对比例2和实施例4与对比例3可以看出，在添加单糖和氮源的条件下，无论是否提高发酵罐中接种的黑曲霉的量，都能够提高柠檬酸的转化率和单次产量，比较实施例1和实施例4可以看出，在添加单糖和氮源的情况下，提高发酵罐中接种的黑曲霉的量能够提高柠檬酸的转化率和单次产量，但是比较对比例2和对比例3可以看出，没有添加单糖和氮源的情况下，只是单纯的提高发酵罐中接种的黑曲霉的量反而造成柠檬酸的转化率和单次产量的降低。由此可以看出，在添加单糖和氮源的情况下，适当提高接种到发酵罐中黑曲霉的量是本发明的优选实施方式。

实施例5中添加的糖为果糖水溶液，与实施例1相比，实施例5的柠檬酸的转化率和单次产量略低，说明果糖也可以被黑曲霉利用，作为转化为柠檬酸的碳源，并且能够得到较高的柠檬酸转化率和单次产量，但是在目前的工业生产中，果糖的制备成本高于葡萄糖，更远远高于葡萄糖母液，因此，使用葡萄糖母液是本发明的优选实施方式。

实施例6与实施例1相比，没有添加尿素，实施例6的柠檬酸的转化率和单次产量跟实施例1相比相差较大，说明将黑曲霉接种至发酵培养基后32小时至发酵完成前5小时的时间段内，既添加单糖又添加氮源是本发明的优选实施方式。

实施例7与实施例1相比，单糖和氮源都是分多次加入，与实施例1相比，实施例7中柠檬酸的单次产量比实施例1略低，说明连续加入单糖和氮源是本发明的优选实施方式。

Claims

1.一种柠檬酸的生产方法，该方法包括在生成柠檬酸的条件下，将黑曲霉接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液，其特征在于，该方法还包括向发酵液中添加具有6个碳原子的单糖，添加具有6个碳原子的单糖的时间在将黑曲霉接种至发酵培养基后24小时至发酵完成前5小时的时间段内，发酵的时间为75-95小时，所述单糖的添加量与发酵液总量的重量比为1：8-100，所述单糖为葡萄糖和/或果糖。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述单糖的添加量与发酵液总量的重量比为1：13-28。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，开始添加具有6个碳原子的单糖的时间为将黑曲霉接种至发酵培养基后24-56小时。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，开始添加具有6个碳原子的单糖的时间为将黑曲霉接种至发酵培养基后40-50小时。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，结束添加具有6个碳原子的单糖的时间为将黑曲霉接种至发酵培养基后60-70小时。

6.根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其中，所述单糖分多次添加，相邻两次添加的时间间隔不大于8小时，每次添加的单糖的量相同。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述添加的方式为连续添加。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述连续添加的单糖的量使得添加过程中所述发酵液的总糖含量为2-5重量%。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述单糖以单糖固体和/或含有单糖的水溶液的形式添加，所述含有单糖的水溶液中单糖的浓度为25重量%以上。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述单糖为葡萄糖，所述含有单糖的水溶液为葡萄糖母液。

11.根据权利要求1-5和7-10中任意一项所述的方法，其中，该方法还包括向发酵液中添加氮源，添加氮源的时间在将黑曲霉接种至发酵培养基后24小时至发酵完成前5小时的时间段内，且以氮元素计，所述氮源的添加量为所述添加的单糖的量的0.033-0.35重量%。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述氮源与单糖同时添加。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述氮源为尿素、硫酸铵、硝酸铵、玉米蛋白和玉米浆中的至少一种。

14.根据权利要求1所述的方法，其中，以每克发酵培养基为基准，黑曲霉的接种量为1.8×10⁴-5.3×10⁴个菌落形成单位，所述发酵的条件包括：温度为30-40℃，通气量为0.1-1体积：（体积·分钟），发酵的时间为80-90小时。

15.根据权利要求1所述的方法，其中，以每克发酵培养基为基准，黑曲霉的接种量为2.5×10⁴-4.0×10⁴个菌落形成单位。

16.根据权利要求1所述的方法，其中，所述发酵培养基含有淀粉质原料酶解产物，所述淀粉质原料酶解产物中碳源含量为13-21重量%，氮源含量为0.06-0.14重量%，磷源含量为0.005-0.07重量%，无机盐含量0.1-2.6重量%，水含量为77-86重量%。