CN105420160A - 一种热凝胶多糖产生菌株及其应用 - Google Patents
一种热凝胶多糖产生菌株及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种热凝胶多糖产生菌株及其应用，菌株为根瘤菌(Rhizobium？sp.)DH-6，保藏编号为CGMCC？No.11547，核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示。将根瘤菌(Rhizobium？sp.)DH-6经种子培养和液体深层发酵，制得热凝胶多糖。本发明提供的热凝胶多糖产生菌株具有所产凝胶多糖凝胶强度高、分子量大、高产等特性。
Description
技术领域
本发明属于多糖产生菌株及其应用领域，特别涉及一种热凝胶多糖产生菌株及其应用。
背景技术
热凝胶多糖是一种由微生物产生的胞外多糖，由葡萄糖残基通过β-1,3糖苷键连接而成的葡聚糖，具有受热形成凝胶的特性。热凝胶多糖形成的胶不仅具有很强的热稳定性，而且具有冻融稳定性，能耐受多轮冻融处理仍保持稳定的结构，可作为食品固型剂、增稠剂、可食性膜等，也可作为功能性物质改善食品的粘弹性和适口性等品质。作为一种安全的多糖，热凝胶多糖已被美国食品和药品管理局(FDA)批准可用于食品添加剂，在食品工业有着广阔的应用前景。热凝胶多糖还具有重要的药理性能，磺酸化的热凝胶多糖具有抗HIV病毒的活性，在制药工业具有巨大的市场潜力。
目前热凝胶多糖工业化生产在日本已获得成功，我国相关生产和研究尚处于起步阶段。近些年我国虽在热凝胶多糖产生菌种和发酵工艺方面取得了一些进展，提高了热凝胶多糖的产量，但所生产的热凝胶多糖凝胶强度仍较低，产品性能差，在市场上缺乏竞争力。
热凝胶多糖产生菌种主要有土壤杆菌属、根瘤菌属和纤维单胞菌菌属等属的细菌,产生菌种类较少。菌种产热凝胶多糖的量和多糖的凝胶强度间无相关性。有的菌种热凝胶多糖产量高，但凝胶性差，凝胶强度低；有的菌种产热凝胶多糖凝胶强度高，但产量低。目前的研究注重通过菌种选育和工艺优化提高产量，而很少结合凝胶特性进行选育菌种和优化工艺，使得产品的性能不能满足应用需求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种热凝胶多糖产生菌株及其应用，该菌株产生的热凝胶多糖分子量大、凝胶强度高、产量高，具有工业化应用前景。
本发明的一种热凝胶多糖产生菌株，所述菌株为根瘤菌(Rhizobiumsp.)DH-6，保藏编号为CGMCCNo.11547，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
本发明的一种热凝胶多糖产生菌株的应用，包括：
将根瘤菌(Rhizobiumsp.)DH-6为出发菌株，经种子培养和液体深层发酵，得到发酵液，然后分离提纯，干燥，制得热凝胶多糖；
其中种子培养为：在种子培养基中培养，温度为28-30℃，摇床转速180-200rpm，培养时间16-20h；液体深层发酵为：在发酵培养基中发酵，温度为28℃-30℃，接种量3％-10％(v/v),摇床转速200-240rpm，培养时间3d-5d。
所述种子培养基为：蔗糖20g/L、(NH)2HPO43g/L、KH2PO41g/L、MgSO4.7H2O0.5g/L、酵母提取物1g/L、CaCO33g/L，pH＝6.8-7.2。
所述发酵培养基为：碳源60g/L、(NH)2HPO42.3g/L、KH2PO41g/L、MgSO4.7H2O0.5g/L、有机氮源1g/L、CaCO33g/L，pH＝6.8-7.2。
所述碳源为葡萄糖或/和蔗糖。
所述有机氮源为酵母提取物和/或玉米浆。
所述分离提纯具体为：取发酵液于4500-5000rpm离心3-5min，除去上清液，再加水补充至原体积，然后按体积比1:1加入0.3-0.6MNaOH溶液，搅拌均匀，静止放置0.5-1h，然后于9000-12000rpm离心5-10min，取上清液，加入0.3MHCl调至最终pH值为中性，再用80目滤布进行过滤，所得的固形物中再加入1-2倍体积的水，再过滤，最后将过滤得到的固形物中加入2-3倍体积的95％乙醇，搅匀后于7000-9000rpm离心5-10min。
所述干燥温度为50-60℃。
所述热凝胶多糖的分子量为2.25×106-2.50×106Da，纯度为88-92％(w/w)。
2％(w/v)热凝胶多糖95℃加热10min的凝胶强度是760-900g/cm2。
本发明的热凝胶多糖产生菌株根瘤菌DH-6(Rhizobiumsp.DH-6)于2015年10月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所），保藏编号为CGMCCNo.11547，系从土壤中分离筛选得到的。
热凝胶多糖产生菌株的筛选方法是从土壤中经平板菌落初筛，摇瓶发酵复筛，经测定热凝胶多糖产量和凝胶强度而得到。
筛选平板培养基(g/L)：10g葡萄糖，5g酵母提取物，0.05g苯胺蓝，20g琼脂，pH7.2.30℃培养2～3d。
挑选筛选平板上蓝色的菌落，接种于发酵培养基中，30℃培养4d后，取发酵液95℃加热10分钟，观察能否形成凝胶。对能形成凝胶的发酵液提取其凝胶多糖。
热凝胶多糖产量的测定方法：取一定量发酵液于5000rpm离心5min，除去上清液，再加水补充至原体积。然后按体积比1:1加入0.6MNaOH溶液，搅拌均匀，静止放置1小时。然后于9000rpm离心10min，取上清液，加入0.3MHCl中和至pH＝7。然后用80目滤布进行过滤，所得固形物中再加入2倍体积的水，再过滤，最后将过滤得到的固形物中加入3倍体积的95％乙醇，搅匀后于9000rpm离心10min，取沉淀放入烘箱中60℃干燥。
凝胶强度测定方法：取0.3g样品于15mL水中，用高速搅拌机使样品在水中分散均匀，制成悬浮液，将悬浮液转移至18mm×180mm的试管中，在真空状态下抽气3min，然后将试管放入95℃水中加热10min，取出后在冷水中冷却30min。从试管中取出凝胶，取离底部20mm和30mm处的一段10mm的凝胶，用质构仪进行测定(探头：P5，直径0.5cm不锈钢活塞式圆柱体。探头移动速度：250mm/min)。
本发明的根瘤菌(Rhizobiumsp.)DH-6，已于2015年10月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNo.11547。
有益效果
本发明提供了一株热凝胶多糖产生菌，该菌株产生的热凝胶多糖分子量大、凝胶强度高、产量高，具有工业化应用前景。采用本发明制备热凝胶多糖的方法，热凝胶多糖产量达23.9g/L，分子量为2.25×106-2.50×106Da，2％热凝胶多糖95℃加热10min的凝胶强度为760～900g/cm2。
附图说明
图1热凝胶多糖的1HNMR图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
菌株的筛选
(1)称取土样10g，加入90mL无菌水，少量玻璃珠放入锥形瓶中，摇床振荡10min，制成土壤悬浊液。
(2)静置10min后，取0.1mL加入到0.9mL无菌生理盐水中，经系列梯度稀释至10-4、10-5、10-6三个梯度，分别取0.1mL涂筛选平板。
(3)将平板置于30℃培养箱倒置培养2-3d后观察。
(4)挑选菌落变蓝且颜色较深的菌落，在平板上划线，挑取单菌落保藏。将平板上筛选得到的菌株进一步接种到发酵培养基中进行摇瓶发酵复筛，培养条件为30℃、240rpm、4d。
(5)取5ml发酵液于95℃水浴加热10min，观察能否形成凝胶。对能形成凝胶的发酵液提取其凝胶多糖，测定热凝胶含量和凝胶强度。最终得到一株产量高、凝胶强度大、性能稳定的菌株DH-6。
筛选平板培养基(g/L)：10g葡萄糖，5g酵母提取物，0.05g苯胺蓝，20g琼脂，pH7.2.发酵培养基(g/L)：蔗糖60、(NH)2HPO42.3、KH2PO41、MgSO4.7H2O0.5、酵母提取物1、CaCO33、pH＝7.0。
实施例2
分离菌株DH-6的鉴定
⑴形态鉴定
在LB平板培养1d后，菌落圆形，表面光滑湿润，边缘整齐，菌落微微凸起，灰白色。显微镜下菌体细杆状，革兰氏染色阴性。
⑵生理生化鉴定
菌株DH-6的生理生化特征见表1.
表1：菌株DH-6生理生化特征
其中，“+”表示呈阳性反应，“-”表示呈阴性反应。
⑶16SrDNA序列鉴定
提取菌株DH-6的总基因组DNA，并以此为模板，扩增该菌株的16SrDNA序列，其引物序列为SEQIDNo.1，F:5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'，SEQIDNo.2，R:5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'，SEQIDNo.3。该菌种的16SrDNA序列在NCBI数据库中比对结果显示，该菌株与Rhizobiumsp.最为接近，该菌株为根瘤菌属(Rhizobiumsp.)细菌。
结合该菌株的形态、生理生化特征及16SrDNA序列，最终判定菌株DH-6应属于根瘤菌属的一种(Rhizobiumsp.)，命名为Rhizobiumsp.DH-6。此菌株于2015年10月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNo.11547。
实施例3
从斜面上刮取一环菌种(根瘤菌(Rhizobiumsp.)DH-6)，接种于装有30ml种子培养基的250ml三角瓶中，30℃，180r/min，摇床培养20h，得到种子液。取种子液以8％的接种量接入装有100ml发酵培养基的500ml三角瓶中，于30℃、240r/min摇床培养4d。
种子培养基(g/L)：蔗糖20、(NH)2HPO43、KH2PO41、MgSO4.7H2O0.5、酵母提取物1、CaCO33、pH＝7.0。
发酵培养基(g/L)：蔗糖60、(NH)2HPO42.3、KH2PO41、MgSO4.7H2O0.5、玉米浆1、CaCO33、pH＝7.0。
取发酵液于5000rpm离心5min，除去上清液，再加水补充至原体积。然后按体积比1∶1加入0.6MNaOH溶液，搅拌均匀，静止放置1小时。然后于10000rpm离心10min，取上清液，加入0.3MHCl调至最终pH值为中性。然后用80目滤布进行过滤，所得的固形物中再加入2倍体积的水，再过滤，最后将过滤得到的固形物中加入3倍体积的95％乙醇，搅匀后于9000rpm离心10min，取固形物放入烘箱中60℃干燥。热凝胶多糖产量为23.9g/L。
实施例4
从斜面上刮取一环菌种(根瘤菌(Rhizobiumsp.)DH-6)，接种于装有30ml种子培养基的250ml三角瓶中，30℃，200r/min，摇床培养16h，得到种子液。取种子液以5％的接种量接入装有100ml发酵培养基的500ml三角瓶中，于28℃、220r/min摇床培养5d。
种子培养基(g/L)：蔗糖20、(NH)2HPO43、KH2PO41、MgSO4.7H2O0.5、酵母提取物1、CaCO33、pH＝7.0。
发酵培养基(g/L)：葡萄糖60、(NH)2HPO42.3、KH2PO41、MgSO4.7H2O0.5、酵母提取物1、CaCO33、pH＝7.0。
取发酵液于5000rpm离心5min，除去上清液，再加水补充至原体积。然后按体积比1∶1加入0.6MNaOH溶液，搅拌均匀，静止放置1小时。然后于12000rpm离心5min，取上清液，加入0.3MHCl调至最终pH值为中性。然后用80目滤布进行过滤，所得的固形物中再加入2倍体积的水，再过滤，最后将过滤得到的固形物中加入3倍体积的95％乙醇，搅匀后于9000rpm离心5min，取固形物放入烘箱中60℃干燥。热凝胶多糖产量为22.2g/L。
实施例5
从斜面上刮取一环菌种(根瘤菌(Rhizobiumsp.)DH-6)，接种于装有30ml种子培养基的250ml三角瓶中，30℃，190r/min，摇床培养18h，得到种子液。取种子液以3％的接种量接入装有100ml发酵培养基的500ml三角瓶中，于30℃、240r/min摇床培养3d。
种子培养基(g/L)：蔗糖20、(NH)2HPO43、KH2PO41、MgSO4.7H2O0.5、酵母提取物1、CaCO33、pH＝7.0。
发酵培养基(g/L)：葡萄糖60、(NH)2HPO42.3、KH2PO41、MgSO4.7H2O0.5、酵母提取物0.5、玉米浆0.5、CaCO33、pH＝7.0。
取发酵液于5000rpm离心5min，除去上清液，再加水补充至原体积。然后按体积比1∶1加入0.6MNaOH溶液，搅拌均匀，静止放置1小时。然后于9000rpm离心10min，取上清液，加入0.3MHCl调至最终pH值为中性。然后用80目滤布进行过滤，所得的固形物中再加入2倍体积的水，再过滤，最后将过滤得到的固形物中加入3倍体积的95％乙醇，搅匀后于7000rpm离心10min，取固形物放入烘箱中60℃干燥。热凝胶多糖产量为13.2g/L。
实施例6
从斜面上刮取一环菌种(根瘤菌(Rhizobiumsp.)DH-6)，接种于装有30ml种子培养基的250ml三角瓶中，30℃，200r/min，摇床培养20h，得到种子液。取种子液以10％的接种量接入装有100ml发酵培养基的500ml三角瓶中，于30℃、220r/min摇床培养4d。
种子培养基(g/L)：蔗糖20、(NH)2HPO43、KH2PO41、MgSO4.7H2O0.5、酵母提取物1、CaCO33、pH＝7.0。
发酵培养基(g/L)：葡萄糖30、蔗糖30、(NH)2HPO42.3、KH2PO41、MgSO4.7H2O0.5、酵母提取物1、CaCO33、pH＝7.0。
取发酵液于5000rpm离心5min，除去上清液，再加水补充至原体积。然后按体积比1∶1加入0.6MNaOH溶液，搅拌均匀，静止放置1小时。然后于9000rpm离心10min，取上清液，加入0.3MHCl调至最终pH值为中性。然后用80目滤布进行过滤，所得的固形物中再加入2倍体积的水，再过滤，最后将过滤得到的固形物中加入3倍体积的95％乙醇，搅匀后于8000rpm离心10min，取固形物放入烘箱中60℃干燥。热凝胶多糖产量为21.6g/L。
实施例7
热凝胶多糖的性质
用苯酚-硫酸法测定所得热凝胶多糖的纯度为88～92％，用乌式粘度计测定该多糖的分子量为2.25×106～2.50×106Da。热凝胶多糖的1HNMR图谱见图1，表明该多糖是由葡萄糖通过β-1,3糖苷键连接聚合而成。2％(w/v)热凝胶多糖的凝胶强度为760～900g/cm2。6％(w/v)热凝胶多糖形成的凝胶TPA分析见表2，与市售进口商品相比，该菌株产生的热凝胶多糖形成的凝胶硬度上略低于市售样品，弹性和内聚性略高于市售样品，两者的咀嚼性接近。
表26％凝胶的TPA分析
Claims (10)
1.一种热凝胶多糖产生菌株，其特征在于：所述菌株为根瘤菌(Rhizobiumsp.)DH-6，保藏编号为CGMCCNo.11547，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
2.一种如权利要求1所述的热凝胶多糖产生菌株的应用，包括：
将根瘤菌(Rhizobiumsp.)DH-6经种子培养和液体深层发酵，得到发酵液，然后分离提纯，干燥，制得热凝胶多糖；
其中种子培养为：在种子培养基中培养，温度为28-30℃，摇床转速180-200rpm，培养时间16-20h；液体深层发酵为：在发酵培养基中发酵，温度为28℃-30℃，接种量3％-10％(v/v),摇床转速200-240rpm，培养时间3d-5d。
3.根据权利要求2所述的一种热凝胶多糖产生菌株的应用，其特征在于：所述种子培养基为：蔗糖20g/L、(NH)2HPO43g/L、KH2PO41g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L、酵母提取物1g/L、CaCO33g/L，pH＝6.8-7.2。
4.根据权利要求2所述的一种热凝胶多糖产生菌株的应用，其特征在于：所述发酵培养基为：碳源60g/L、(NH)2HPO42.3g/L、KH2PO41g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L、有机氮源1g/L、CaCO33g/L，pH＝6.8-7.2。
5.根据权利要求4所述的一种热凝胶多糖产生菌株的应用，其特征在于：所述碳源为葡萄糖或/和蔗糖。
6.根据权利要求4所述的一种热凝胶多糖产生菌株的应用，其特征在于：所述有机氮源为酵母提取物和/或玉米浆。
7.根据权利要求2所述的一种热凝胶多糖产生菌株的应用，其特征在于：所述分离提纯具体为：取发酵液于4500-5000rpm离心3-5min，除去上清液，再加水补充至原体积，然后按体积比1:1加入0.6MNaOH溶液，搅拌均匀，静止放置0.5-1h，然后于9000-12000rpm离心5-10min，取上清液，加入0.3MHCl调至最终pH值为中性，再用80目滤布进行过滤，所得的固形物中再加入1-2倍体积的水，再过滤，最后将过滤得到的固形物中加入2-3倍体积的95％乙醇，搅匀后于7000-9000rpm离心5-10min。
8.根据权利要求2所述的一种热凝胶多糖产生菌株的应用，其特征在于：所述干燥温度为50-60℃。
9.根据权利要求2所述的一种热凝胶多糖产生菌株的应用，其特征在于：所述热凝胶多糖的分子量为2.25×106-2.50×106Da，纯度为88-92％(w/w)。
10.根据权利要求2所述的一种热凝胶多糖产生菌株的应用，其特征在于：2％(w/v)热凝胶多糖95℃加热10min的凝胶强度是760-900g/cm2。
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