CN102277319A - 放射形根瘤菌及采用该菌种生产可得然胶发酵液的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物发酵，特别是指放射形根瘤菌及采用该菌种生产可得然胶发酵液的方法。本发明采用放射形根瘤菌CGMCC No.5031为菌种通过将扩培后含有放射形根瘤菌CGMCC No.5031的种子液按照质量百分比为5%-10%的接种量接入到发酵罐的培养液中，发酵培养液中含有碳源、必要的氮源及营养物质；调节发酵培养液的pH，进行通气发酵；在发酵过程中补入碳源、氮源、营养物质及水，经不低于90小时的通气发酵得到含有可得然胶的发酵液。本发明解决了现有技术存在的可得然胶发酵液中固形物含量低的缺陷，具有菌种能够较好地利用发酵液中的碳源，发酵过程中转化率高，发酵液中固形物含量高，生产成本大幅降低等优点。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵，特别是指放射形根瘤菌及采用该菌种生产可得然胶发酵液的方法。
背景技术
可得然胶是一种新型的微生物胞外多糖，由于该多糖具有在加热条件下形成凝胶的独特性质，故又称作热凝胶，英文名称Curdian，可广泛应用于食品、医药等行业。可得然胶制备的传统工艺是将生产菌种（菌种使用土壤杆菌属Agrobacterium biovar1）接种于以蔗糖为主要碳源的无菌培养基中进行发酵，控制温度、PH等工艺条件，发酵结束得到可得然胶发酵液，上述现有技术存在着所制备的可得然胶产品中固形物含量低的缺陷。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种能够产生可得然胶的放射形根瘤菌，即放射形根瘤菌（Rhizobium radiobacter） CGMCC NO.5031。
本发明的目的之二在于提供利用放射形根瘤菌CGMCC NO.5031生产可得然胶发酵液的方法，使发酵液中的固形物含量指标较高且优于现有产品。
本发明的整体技术构思是：
本发明中用于生产可得然胶的的菌种放射形根瘤菌（Rhizobium radiobacter）已于2011年7月12日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC NO.5031。
该菌种的DNA序列测定结果为：
GGGCTACCATGCAGTCGACGCCCCGCAAGGGGAGTGGCAGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAATCTACCCATCTCTGCGGAATAGCTCTGGGAAACTGGAATTAAGACCGCGTACGCCCTACGGGGGAAAGATTTATCGGGGATGGATGAGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCACCGATGAAGATAATGACGGTAGTCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGATATTTAAGTCAGGGGTGAAATCCCGCAGCTCAACTGCGGAACTGCCTTTGATACTGGGTATCTTGAGTATGGAAGAGGTAAGTGGAATTACCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTACTGGTCCATTACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGTTAGCCGTCGGGCAGTATACTGTTCGGTGGCGCAGCTAACGCATTAAACATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGCTCTTGACATTCGGGGTATGGGCATTGGAGACGATGTCCTTCAGTTAGGCTGGCCCCAGAACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGGGACTGCCGGTGATAAGCCGAGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTGGTGACAGTGGGCAGCGAGACAGCGATGTCGAGCTAATCTCCAAAAGCCATCTCAGTTCGGATTGCACTCTGCAACTCGAGTGCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGTTTTACCCGAAGGTAGTGCGCTAACCGCAAGGAGGCAGCTACC。
上述菌种具有如下表中所描述的细胞形态和理化特性：
| 试验项目 | 结果 | 试验项目 | 结果 | 试验项目 | 结果 | 试验项目 | 结果 |
| 细胞形态 | 杆状 | 革兰氏染色 | 阴性 | 接触酶 | + | 氧化酶 | + |
| β-半乳糖苷酶 | + | 精氨酸双水解酶 | - | 赖氨酸脱羧酶 | - | 鸟氨酸脱羧酶 | - |
| 脲酶 | + | 色氨酸脱氨酶 | - | 柠檬酸盐利用 | - | V.P．反应 | - |
| 吲哚产生 | - | H2S产生 | - | 明胶液化 | - | 硝酸盐还原 | - |
| 淀粉水解 | - | 酪素水解 | - | 七叶灵水解 | + | 葡萄糖产酸 | + |
| 甘露糖产酸 | + | 蔗糖产酸 | + | 阿拉伯糖产酸 | + | 木糖产酸 | + |
| 鼠李糖产酸 | + | 蜜二糖产酸 | + | 纤维二糖产酸 | + | 乳糖产酸 | + |
| 对照 | - | D-蜜二糖 | + | p-苯乙醇酸 | - | L-组氨酸 | + |
| a-环糊精 | - | 甲基葡糖苷 | + | 衣康酸 | - | 羟基脯氨酸 | + |
| 糊精 | - | D-阿洛酮糖 | + | a-氧代丁酸 | - | L-亮氨酸 | - |
| 糖原 | - | D-棉子糖 | + | a-氧代戊二酸 | - | L-鸟氨酸 | + |
| Tween40 | - | L-鼠李糖 | + | a-氧代戊酸 | - | L-苯丙氨酸 | - |
| Tween80 | - | D-山梨醇 | + | D,L-乳酸 | + | L-脯氨酸 | + |
| N-乙酰半乳糖胺 | - | 蔗糖 | + | 丙二酸 | - | L-焦谷氨酸 | + |
| N-乙酰葡萄糖胺 | + | D-海藻糖 | + | 丙酸 | - | D-丝氨酸 | - |
| 核糖醇 | + | 松二糖 | + | 奎尼酸 | + | L-丝氨酸 | + |
| L-阿拉伯糖 | + | 木糖醇 | + | D-己糖酸 | - | L-苏氨酸 | + |
| D-阿糖醇 | + | 丙酮酸甲酯 | + | 葵二酸 | - | D，L-肉碱 | - |
| D-纤维二糖 | + | 丁二酸一甲酯 | + | 丁二酸 | + | g-氨基丁酸 | + |
| i-赤藓醇 | - | 乙酸 | + | 溴代丁二酸 | + | 尿刊酸 | + |
| D-果糖 | + | 顺-阿康酸 | + | 琥珀酰胺酸 | - | 肌苷 | - |
| L-岩藻糖 | + | 柠檬酸 | - | 葡糖醛酰胺 | b | 尿苷 | + |
| D-半乳糖 | + | 甲酸 | - | L丙氨酰胺 | - | 胸苷 | - |
| 龙胆二糖 | + | D-半乳糖酸内酯 | + | D-丙氨酸 | b | 苯基乙胺 | - |
| a-D-葡萄糖 | + | D-半乳糖醛酸 | - | L-丙氨酸 | + | 腐胺 | - |
| m-肌醇 | + | D-葡糖酸 | + | L-丙氨酰甘氨酸 | + | 2-氨基乙醇 | - |
| a-D-乳糖 | + | b-甲基葡糖苷 | - | L-天冬酰胺 | + | 2，3-丁二醇 | - |
| Lactulose | + | D-葡糖醛酸 | + | L-天冬氨酸 | + | 甘油 | + |
| 麦芽糖 | + | a-羟基丁酸 | - | L-谷氨酸 | + | D，L-甘油磷酸盐 | - |
| D-甘露醇 | + | b-羟基丁酸 | - | 甘氨酰天冬氨酸 | + | D-葡糖-1-磷酸 | + |
| D-甘露糖 | + | g-羟基丁酸 | - | 甘氨酰谷氨酸 | + | D-葡糖-6-磷酸 | + |
以放射形根瘤菌为菌种生产可得然胶发酵液的方法，该方法包括如下工艺步骤：
A、将扩培后含有放射形根瘤菌CGMCC NO.5031的种子液按照质量百分比为5%-10%的接种量接入到发酵罐的培养液中，发酵培养液中含有碳源、必要的氮源及营养物质；
B、调节发酵培养液的pH，进行通气发酵；
C、在发酵过程中补入碳源、氮源、营养物质及水，经不低于90小时的通气发酵得到含有可得然胶的发酵液。
本发明的具体技术解决方案还有：
所述的步骤A中的发酵培养液由下列质量百分数的组分组成：
葡萄糖6%-8%、硝酸钠0.3%-0.45%、磷酸氢二钾0.1%-0.2%、磷酸二氢钾0.15%-0.3%、FeSO4 10ppm-15ppm、生物素20ppm-30ppm、聚醚消泡剂0.03%-0.1%、余量为无菌水；发酵培养液的pH=6-7。
所述的步骤C中的发酵条件为：
C1、10小时内：温度30℃-32℃、压力0.04 MPa-0.06MPa、pH值6-7，通风量0.3vvm-0.4vvm；
C2、10-20小时：温度30℃-32℃、压力0.04 MPa-0.06 MPa、pH值6-7、通风量0.4vvm-0.5vvm；
C3、20-30小时：温度30-32℃、压力0.04MPa-0.06MPa、pH值6-6.5，通风量0.6vvm-0.7vvm；
C4、30-40小时：温度28℃-30℃、压力0.04MPa-0.06MPa、pH值6-6.5、通风量0.7vvm-0.8vvm ；按发酵液体积的1/4补料；所补入的物料由下列质量百分数的组分组成：
葡萄糖10%-12%、硝酸钠0.3%-0.45%、磷酸氢二钾0.1%-0.2%、磷酸二氢钾0.15%-0.3%、FeSO4 10ppm-15ppm、生物素20ppm-30ppm、聚醚消泡剂0.03%-0.1%、余量为无菌水；
C5、40-60小时：温度28℃-30℃、压力0.04MPa-0.06MPa 、通风量0.5vvm-0.6vvm，50小时补入发酵液总体积1%-1.5%的无菌水；
C6、60-70小时：温度29℃、压力0.04MPa、pH值6-7、通风量0.5vvm-0.6vvm，65小时补入发酵液总体积1.5%-2%的无菌水；
C7、70-80小时：温度28℃-32℃、压力0.04MPa-0.06MPa、pH值6-7、通风量0.4vvm-0.5vvm ；
C8、80-90小时：温度28℃-32℃、压力0.04MPa-0.06MPa 、通风量0.5vvm-0.6vvm；
C9、90-120小时：温度28℃-32℃、压力0.04MPa、pH值6-7、通风量0.4vvm-0.5vvm。
所述的步骤A中扩培过程包括：
A1、将斜面菌种制成摇瓶种子；
A2、将摇瓶种子制成一级种子；
A3、将一级种子制成二级种子，将二级种子接入发酵罐中的培养液，进行发酵。
步骤A1是用接种铲挑取2平方厘米斜面菌种中的原菌接入灭菌后的摇瓶种子培养液中经培养制成摇瓶种子，摇瓶种子的培养条件是培养温度为28℃-32℃、转速为160-200转/分钟、培养周期为24-36小时的条件下振荡培养，摇瓶种子培养液由下列质量分数的组分组成：
葡萄糖0.8%-1.5%、鱼粉0.5%-0.15%、胰蛋白胨0.2%-0.3%、大豆蛋白粉0.1%-0.19%、豆油0.01%-0.03%、余量为无菌水。
步骤A2中是将摇瓶种子按照质量百分比为0.2%-0.5%的接种量接入灭菌后的一级种子培养液中经通气培养制成一级种子，一级种子的培养条件是培养温度为28℃-32℃、压力为0.04MPa-0.06MPa、通风量0.3vvm-0.4vvm、培养周期为26-48小时的条件下通气培养，一级种子培养液由下列质量分数的组分组成：
葡萄糖2%-2.5%、氯化铵0.3%-0.5%、硫酸铵0.3%-0.5%、硫酸镁 0.1%-0.2%、硫酸亚铁10ppm -20ppm、聚醚消泡剂0.05%-0.1%、余量为无菌水。
步骤A3是将一级种子按照质量百分比为5%-10%的接种量接入灭菌后的二级种子培养液中经通气培养制成二级种子，二级种子的培养条件是培养温度为28℃-32℃、压力为0.04MPa-0.06MPa、通风量0.5 vvm -0.7vvm、培养周期为24小时的条件下通气培养，二级种子培养液由下列质量分数的组分组成：
葡萄糖2%-2.5%、氯化铵0.4%-0.6%、硫酸铵0.3%-0.5%、硫酸镁 0.1%-0.2%、硫酸亚铁10ppm-20ppm、聚醚消泡剂0.05%-0.1%、余量为无菌水。
步骤A1中摇瓶种子培养液的灭菌条件为蒸汽压力0.1 Mpa -0.12Mpa、温度121℃-125℃、时间30-35分钟。
步骤A2、A3中一级种子培养液及二级种子培养液的灭菌条件为温度121℃-125℃，时间25-30分钟。
本发明中产品鉴别方法及固形物的检测方法是：
一、固含量的测定：
（一）将发酵液倒入一定体积的小烧杯中，用玻璃棒搅拌使其无气泡，用玻璃棒把表面抹平，把杯子外的发酵液清洗干净。发酵液用90-95%的乙醇提取、沉降、过滤布挤干，将其撕碎后全部彻底移入到培养皿中，在微波炉小火烘3分钟，然后放入100+5℃烘箱中烘至恒重（约4小时），拿出称重。实际检测结果固定物含量达到了78g/L（每升发酵液中的固形物含量）以上。
（二）计算：
固形物含量（g/L）=（称样克数/发酵液体积）×100%
二、产品鉴别：因我国的可得然胶产品的食品安全标准（报批稿）尚处于公示期，未颁布实施。按照JECFA（2001）中记载的鉴别方法对发酵液进行检测，检测结果为：均符合下列标准，则判定结果为可得然胶。
检测方法及结果：
（一）溶解度：不溶于水和乙醇（标准）。实际检测结果：不溶于水和乙醇。
（二）在碱中的溶解度：取0.2g样品加入5ml水中，加入1ml3N的NaOH溶液，振荡，样品溶解。实际检测结果：样品溶解。
（三）形成凝胶：对质量百分比为2%悬浮液沸水浴加热10分钟，冷却至室温，形成坚实的凝胶。实际检测结果：形成坚实的凝胶。
（四）酒石酸铜沉淀反应：向10ml质量百分比浓度为2%的样品悬浮液中加入5ml分析纯浓硫酸，沸水浴30分钟后冷却，用BaCO3中和，900转/分钟离心10分钟，取1ml上清液，加入5ml热的碱性酒石酸铜溶液中，生成大量红色氧化亚铜沉淀。实际检测结果：生成大量红色氧化亚铜沉淀。
本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：
1、由于本发明所公开的菌种能够较好地利用发酵液中的碳源，发酵过程中转化率高，生产成本大幅降低。经检测，发酵液中的固形物含量至少达到78g/L（每升发酵液中的固形物含量）以上。
2、所制备的可得然胶产品经检测，符合FCCⅤ和JECFA（2001）的标准。
3、发酵过程中采用补水、补料工艺，有利于快速稳定合成可得然胶。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步描述，但不作为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据本说明书所作出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范围。
实施例1
本实施例包括如下工艺步骤：
A、将扩培后含有放射形根瘤菌CGMCC NO.5031的种子液按照质量百分比为5%的接种量接入到发酵罐的培养液中，发酵培养液中含有碳源、必要的氮源及营养物质；
B、调节发酵培养液的pH，进行通气发酵；
C、在发酵过程中补入碳源、氮源、营养物质及水，经不低于90小时的通气发酵得到含有可得然胶的发酵液。
所述的步骤A中的发酵培养液由下列质量百分数的组分组成：
葡萄糖6%、硝酸钠0.3%、磷酸氢二钾0.1%、磷酸二氢钾0.15%、FeSO4 10ppm、生物素20ppm、聚醚消泡剂0.03%、余量为无菌水；发酵培养液的pH=6。
所述的步骤C中的发酵条件为：
C1、10小时内：温度30℃、压力0.04 MPa、pH值6，通风量0.3vvm；
C2、10-20小时：温度30℃、压力0.04 MPa、pH值6、通风量0.4vvm；
C3、20-30小时：温度30℃、压力0.04MPa、pH值6，通风量0.6vvm；
C4、30-40小时：温度28℃、压力0.04MPa、pH值6、通风量0.7vvm ；按发酵液体积的1/4补料；所补入的物料由下列质量百分数的组分组成：
葡萄糖12%、硝酸钠0.3%、磷酸氢二钾0.1%、磷酸二氢钾0.15%、FeSO4 10ppm、生物素20ppm、聚醚消泡剂0.03%、余量为无菌水；
C5、40-60小时：温度28℃、压力0.04MPa、通风量0.5vvm，50小时补入发酵液总体积1%的无菌水；
C6、60-70小时：温度29℃、压力0.04MPa、pH值6、通风量0.5vvm，65小时补入发酵液总体积1.5%的无菌水；
C7、70-80小时：温度28℃、压力0.04MPa、pH值6、通风量0.4vvm ；
C8、80-90小时：温度28℃、压力0.04MPa 、通风量0.5vvm；
C9、90-120小时：温度28℃、压力0.04MPa、pH值6、通风量0.4vvm。
所述的步骤A中扩培过程包括：
A1、将斜面菌种制成摇瓶种子；
A2、将摇瓶种子制成一级种子；
A3、将一级种子制成二级种子，将二级种子接入发酵罐中的培养液，进行发酵。
步骤A1是用接种铲挑取2平方厘米斜面菌种中的原菌接入灭菌后的摇瓶种子培养液中经培养制成摇瓶种子，摇瓶种子的培养条件是培养温度为28℃、转速为160转/分钟、培养周期为24小时的条件下振荡培养，摇瓶种子培养液由下列质量分数的组分组成：
葡萄糖0.8%、鱼粉0.5%、胰蛋白胨0.2%、大豆蛋白粉0.1%、豆油0.01%、余量为无菌水。
步骤A2中是将摇瓶种子按照质量百分比为0.2%的接种量接入灭菌后的一级种子培养液中经通气培养制成一级种子，一级种子的培养条件是培养温度为28℃、压力为0.04MPa、通风量0.3vvm、培养周期为26小时的条件下通气培养，一级种子培养液由下列质量分数的组分组成：
葡萄糖2%、氯化铵0.3%、硫酸铵0.3%、硫酸镁 0.1%、硫酸亚铁10ppm、聚醚消泡剂0.05%、余量为无菌水。
步骤A3是将一级种子按照质量百分比为5%-10%的接种量接入灭菌后的二级种子培养液中经通气培养制成二级种子，二级种子的培养条件是培养温度为28℃、压力为0.04MPa、通风量0.5 vvm、培养周期为24小时的条件下通气培养，二级种子培养液由下列质量分数的组分组成：
葡萄糖2%、氯化铵0.5%、硫酸铵0.4%、硫酸镁 0.15%、硫酸亚铁10ppm、聚醚消泡剂0.06%、余量为无菌水。
步骤A1中摇瓶种子培养液的灭菌条件为蒸汽压力0.1 Mpa、温度121℃、时间30分钟。
步骤A2、A3中一级种子培养液及二级种子培养液的灭菌条件为温度121℃，时间25分钟。
实施例2
本实施例包括如下工艺步骤：
A、将扩培后含有放射形根瘤菌CGMCC NO.5031的种子液按照质量百分比为10%的接种量接入到发酵罐的培养液中，发酵培养液中含有碳源、必要的氮源及营养物质；
B、调节发酵培养液的pH，进行通气发酵；
C、在发酵过程中补入碳源、氮源、营养物质及水，经不低于90小时的通气发酵得到含有可得然胶的发酵液。
本发明的具体技术解决方案还有：
所述的步骤A中的发酵培养液由下列质量百分数的组分组成：
葡萄糖8%、硝酸钠0.45%、磷酸氢二钾0.2%、磷酸二氢钾0.3%、FeSO4 15ppm、生物素30ppm、聚醚消泡剂0.1%、余量为无菌水；发酵培养液的pH=7。
所述的步骤C中的发酵条件为：
C1、10小时内：温度32℃、压力0.06MPa、pH值7，通风量0.4vvm；
C2、10-20小时：温度32℃、压力0.06 MPa、pH值7、通风量0.5vvm；
C3、20-30小时：温度32℃、压力0.06MPa、pH值6.5，通风量0.7vvm；
C4、30-40小时：温度30℃、压力0.06MPa、pH值6.5、通风量0.8vvm ；按发酵液体积的1/4补料；所补入的物料由下列质量百分数的组分组成：
葡萄糖10%、硝酸钠0.45%、磷酸氢二钾0.2%、磷酸二氢钾0.3%、FeSO4 15ppm、生物素30ppm、聚醚消泡剂0.1%、余量为无菌水；
C5、40-60小时：温度30℃、压力0.06MPa 、通风量0.6vvm，50小时补入发酵液总体积1.5%的无菌水；
C6、60-70小时：温度29℃、压力0.04MPa、pH值7、通风量0.6vvm，65小时补入发酵液总体积的2%无菌水；
C7、70-80小时：温度32℃、压力0.06MPa、pH值7、通风量0.5vvm ；
C8、80-90小时：温度32℃、压力0.06MPa 、通风量0.6vvm；
C9、90-120小时：温度32℃、压力0.04MPa、pH值7、通风量0.5vvm。
所述的步骤A中扩培过程包括：
A1、将斜面菌种制成摇瓶种子；
A2、将摇瓶种子制成一级种子；
A3、将一级种子制成二级种子，将二级种子接入发酵罐中的培养液，进行发酵。
步骤A1是用接种铲挑取2平方厘米斜面菌种中的原菌接入灭菌后的摇瓶种子培养液中经培养制成摇瓶种子，摇瓶种子的培养条件是培养温度为32℃、转速为200转/分钟、培养周期为36小时的条件下振荡培养，摇瓶种子培养液由下列质量分数的组分组成：
葡萄糖1.5%、鱼粉0.15%、胰蛋白胨0.3%、大豆蛋白粉0.19%、豆油0.03%、余量为无菌水。
步骤A2中是将摇瓶种子按照质量百分比为0.5%的接种量接入灭菌后的一级种子培养液中经通气培养制成一级种子，一级种子的培养条件是培养温度为32℃、压力为0.06MPa、通风量0.4vvm、培养周期为48小时的条件下通气培养，一级种子培养液由下列质量分数的组分组成：
葡萄糖2.5%、氯化铵0.5%、硫酸铵0.5%、硫酸镁0.2%、硫酸亚铁20ppm、聚醚消泡剂0.1%、余量为无菌水。
步骤A3是将一级种子按照质量百分比为10%的接种量接入灭菌后的二级种子培养液中经通气培养制成二级种子，二级种子的培养条件是培养温度为32℃、压力为0.06MPa、通风量0.7vvm、培养周期为24小时的条件下通气培养，二级种子培养液由下列质量分数的组分组成：
葡萄糖2.5%、氯化铵0.6%、硫酸铵0.3%、硫酸镁 0.2%、硫酸亚铁15ppm、聚醚消泡剂0.08%、余量为无菌水。
步骤A1中摇瓶种子培养液的灭菌条件为蒸汽压力0.12Mpa、温度125℃、时间35分钟。
步骤A2、A3中一级种子培养液及二级种子培养液的灭菌条件为温度125℃，时间30分钟。
实施例3
本实施例包括如下工艺步骤：
A、将扩培后含有放射形根瘤菌CGMCC NO.5031的种子液按照质量百分比为8%的接种量接入到发酵罐的培养液中，发酵培养液中含有碳源、必要的氮源及营养物质；
B、调节发酵培养液的pH，进行通气发酵；
C、在发酵过程中补入碳源、氮源、营养物质及水，经不低于90小时的通气发酵得到含有可得然胶的发酵液。
本发明的具体技术解决方案还有：
所述的步骤A中的发酵培养液由下列质量百分数的组分组成：
葡萄糖7%、硝酸钠0.4%、磷酸氢二钾0.15%、磷酸二氢钾0.2%、FeSO4 12ppm、生物素25ppm、聚醚消泡剂0.08%、余量为无菌水；发酵培养液的pH=7。
所述的步骤C中的发酵条件为：
C1、10小时内：温度31℃、压力0.05MPa、pH值6.5，通风量0.35vvm；
C2、10-20小时：温度31℃、压力0.05MPa、pH值6.5、通风量0.45vvm；
C3、20-30小时：温度31℃、压力0.05MPa、pH值6，通风量0.65vvm；
C4、30-40小时：温度29℃、压力0.05MPa、pH值6、通风量0.75vvm ；按发酵液体积的1/4补料；所补入的物料由下列质量百分数的组分组成：
葡萄糖11%、硝酸钠0.4%、磷酸氢二钾0.15%、磷酸二氢钾0.2%、FeSO4 12ppm、生物素25ppm、聚醚消泡剂0.08%、余量为无菌水；
C5、40-60小时：温度29℃、压力0.05MPa 、通风量0.5vvm，50小时补入发酵液总体积1.2%的无菌水；
C6、60-70小时：温度29℃、压力0.04MPa、pH值6、通风量0.55vvm，65小时补入发酵液总体积的1.5%无菌水；
C7、70-80小时：温度29℃、压力0.05MPa、pH值6、通风量0.45vvm ；
C8、80-90小时：温度28℃-32℃、压力0.05MPa 、通风量0.55vvm；
C9、90-120小时：温度28℃-32℃、压力0.04MPa、pH值6、通风量0.45vvm。
所述的步骤A中扩培过程包括：
A1、将斜面菌种制成摇瓶种子；
A2、将摇瓶种子制成一级种子；
A3、将一级种子制成二级种子，将二级种子接入发酵罐中的培养液，进行发酵。
步骤A1是用接种铲挑取2平方厘米斜面菌种中的原菌接入灭菌后的摇瓶种子培养液中经培养制成摇瓶种子，摇瓶种子的培养条件是培养温度为30℃、转速为180转/分钟、培养周期为30小时的条件下振荡培养，摇瓶种子培养液由下列质量分数的组分组成：
葡萄糖1%、鱼粉0.4%、胰蛋白胨0.25%、大豆蛋白粉0.15%、豆油0.02%、余量为无菌水。
步骤A2中是将摇瓶种子按照质量百分比为0.3%的接种量接入灭菌后的一级种子培养液中经通气培养制成一级种子，一级种子的培养条件是培养温度为30℃、压力为0.05MPa、通风量0.35vvm、培养周期为36小时的条件下通气培养，一级种子培养液由下列质量分数的组分组成：
葡萄糖2.2%、氯化铵0.4%、硫酸铵0.4%、硫酸镁 0.15%、硫酸亚铁15ppm、聚醚消泡剂0.08%、余量为无菌水。
步骤A3是将一级种子按照质量百分比为8%的接种量接入灭菌后的二级种子培养液中经通气培养制成二级种子，二级种子的培养条件是培养温度为30℃、压力为0.05MPa、通风量0.6vvm、培养周期为24小时的条件下通气培养，二级种子培养液由下列质量分数的组分组成：
葡萄糖2.5%、氯化铵0.6%、硫酸铵0.5%、硫酸镁 0.2%、硫酸亚铁20ppm、聚醚消泡剂0.1%、余量为无菌水。
步骤A1中摇瓶种子培养液的灭菌条件为蒸汽压力0.1Mpa 、温度121℃、时间30分钟。
步骤A2、A3中一级种子培养液及二级种子培养液的灭菌条件为温度121℃，时间30分钟。
按照JECFA（2001）中记载的鉴别方法对实施例1-3制备的发酵液进行检测，检测结果为：实施例1-3中制备的发酵液为可得然胶。按照说明书中公开的固形物的检测方法测定实施例1-3中发酵液的固形物含量依次分别为78g/L、81g/L、79g/L。
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<110> 河北鑫合生物化工有限公司
<120> 放射形根瘤菌及采用该菌种生产可得然胶发酵液的方法
<130> none
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1363
<212> DNA
<213> Rhizobium sp.
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gggctaccat gcagtcgacg ccccgcaagg ggagtggcag acgggtgagt aacgcgtggg 60
aatctaccca tctctgcgga atagctctgg gaaactggaa ttaagaccgc gtacgcccta 120
cgggggaaag atttatcggg gatggatgag cccgcgttgg attagctagt tggtggggta 180
aaggcctacc aaggcgacga tccatagctg gtctgagagg atgatcagcc acattgggac 240
tgagacacgg cccaaactcc tacgggaggc agcagtgggg aatattggac aatgggcgca 300
agcctgatcc agccatgccg cgtgagtgat gaaggcctta gggttgtaaa gctctttcac 360
cgatgaagat aatgacggta gtcggagaag aagccccggc taacttcgtg ccagcagccg 420
cggtaatacg aagggggcta gcgttgttcg gaattactgg gcgtaaagcg cacgtaggcg 480
gatatttaag tcaggggtga aatcccgcag ctcaactgcg gaactgcctt tgatactggg 540
tatcttgagt atggaagagg taagtggaat taccgagtgt agaggtgaaa ttcgtagata 600
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ttagccgtcg ggcagtatac tgttcggtgg cgcagctaac gcattaaaca ttccgcctgg 780
ggagtacggt cgcaagatta aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga 840
gcatgtggtt taattcgaag caacgcgcag aaccttacca gctcttgaca ttcggggtat 900
gggcattgga gacgatgtcc ttcagttagg ctggccccag aacaggtgct gcatggctgt 960
cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac cctcgccctt 1020
agttgccagc atttagttgg gcactctaag gggactgccg gtgataagcc gagaggaagg 1080
tggggatgac gtcaagtcct catggccctt acgggctggg ctacacacgt gctacaatgg 1140
tggtgacagt gggcagcgag acagcgatgt cgagctaatc tccaaaagcc atctcagttc 1200
ggattgcact ctgcaactcg agtgcatgaa gttggaatcg ctagtaatcg cagatcagca 1260
tgctgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tgggagttgg 1320
ttttacccga aggtagtgcg ctaaccgcaa ggaggcagct acc 1363
Claims (10)
1.放射形根瘤菌CGMCC NO.5031，其特征在于该菌种的DNA序列为：
GGGCTACCATGCAGTCGACGCCCCGCAAGGGGAGTGGCAGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAATCTACCCATCTCTGCGGAATAGCTCTGGGAAACTGGAATTAAGACCGCGTACGCCCTACGGGGGAAAGATTTATCGGGGATGGATGAGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCACCGATGAAGATAATGACGGTAGTCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGATATTTAAGTCAGGGGTGAAATCCCGCAGCTCAACTGCGGAACTGCCTTTGATACTGGGTATCTTGAGTATGGAAGAGGTAAGTGGAATTACCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTACTGGTCCATTACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGTTAGCCGTCGGGCAGTATACTGTTCGGTGGCGCAGCTAACGCATTAAACATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGCTCTTGACATTCGGGGTATGGGCATTGGAGACGATGTCCTTCAGTTAGGCTGGCCCCAGAACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGGGACTGCCGGTGATAAGCCGAGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTGGTGACAGTGGGCAGCGAGACAGCGATGTCGAGCTAATCTCCAAAAGCCATCTCAGTTCGGATTGCACTCTGCAACTCGAGTGCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGTTTTACCCGAAGGTAGTGCGCTAACCGCAAGGAGGCAGCTACC。
2.以放射形根瘤菌为菌种生产可得然胶发酵液的方法，其特征在于该方法包括如下工艺步骤：
A、将扩培后含有放射形根瘤菌CGMCC NO.5031的种子液按照质量百分比为5%-10%的接种量接入到发酵罐的培养液中，发酵培养液中含有碳源、必要的氮源及营养物质；
B、调节发酵培养液的pH，进行通气发酵；
C、在发酵过程中补入碳源、氮源、营养物质及水，经不低于90小时的通气发酵得到含有可得然胶的发酵液。
3.根据权利要求2所述的以放射形根瘤菌为菌种生产可得然胶发酵液的方法，其特征在于所述的步骤A中的发酵培养液由下列质量百分数的组分组成：
葡萄糖6%-8%、硝酸钠0.3%-0.45%、磷酸氢二钾0.1%-0.2%、磷酸二氢钾0.15%-0.3%、FeSO410ppm-15ppm、生物素20ppm-30ppm、聚醚消泡剂0.03%-0.1%、余量为无菌水；发酵培养液的pH=6-7。
4.根据权利要求2所述的以放射形根瘤菌为菌种生产可得然胶发酵液的方法，其特征在于所述的步骤C中的发酵条件为：
C1、10小时内：温度30℃-32℃、压力0.04MPa-0.06MPa、 pH值6-7，通风量0.3vvm-0.4vvm；
C2、10-20小时：温度30℃-32℃、压力0.04MPa-0.06MPa、 pH值6-7、通风量0.4vvm-0.5vvm；
C3、20-30小时：温度30-32℃、压力0.04MPa-0.06MPa、 pH值6-6.5，通风量0.6vvm-0.7vvm；
C4、30-40小时：温度28℃-30℃、压力0.04MPa-0.06MPa、 pH值6-6.5、通风量0.7vvm-0.8vvm ；按发酵液体积的1/4补料；所补入的物料由下列质量百分数的组分组成：
葡萄糖10%-12%、硝酸钠0.3%-0.45%、磷酸氢二钾0.1%-0.2%、磷酸二氢钾0.15%-0.3%、FeSO4 10ppm-15ppm、生物素20ppm-30ppm、聚醚消泡剂0.03%-0.1%、余量为无菌水；
C5、40-60小时：温度28℃-30℃、压力0.04MPa-0.06MPa 、通风量0.5 vvm -0.6vvm，50小时补入发酵液总体积1%-1.5%的无菌水；
C6、60-70小时：温度29℃、压力0.04MPa、 pH值6-7、通风量0.5 vvm -0.6vvm，65小时补入发酵液总体积1.5%-2%的无菌水；
C7、70-80小时：温度28℃-32℃、压力0.04MPa-0.06MPa、pH值6-7、通风量0.4vvm-0.5vvm ；
C8、80-90小时：温度28℃-32℃、压力0.04MPa-0.06MPa 、通风量0.5 vvm-0.6vvm；
C9、90-120小时：温度28℃-32℃、压力0.04MPa、pH值6-7、通风量0.4vvm -0.5vvm。
5.根据权利要求2所述的以放射形根瘤菌为菌种生产可得然胶发酵液的方法，其特征在于所述的步骤A中扩培过程包括：
A1、将斜面菌种制成摇瓶种子；
A2、将摇瓶种子制成一级种子；
A3、将一级种子制成二级种子，将二级种子接入发酵罐中的培养液，进行发酵。
6.根据权利要求5所述的以放射形根瘤菌为菌种生产可得然胶发酵液的方法，其特征在于所述的步骤A1是用接种铲挑取2平方厘米斜面菌种中的原菌接入灭菌后的摇瓶种子培养液中经培养制成摇瓶种子，摇瓶种子的培养条件是培养温度为28℃-32℃、转速为160-200转/分钟、培养周期为24-36小时的条件下振荡培养，摇瓶种子培养液由下列质量分数的组分组成：
葡萄糖0.8%-1.5%、鱼粉0.5%-0.15%、胰蛋白胨0.2%-0.3%、大豆蛋白粉0.1%-0.19%、豆油0.01%-0.03%、余量为无菌水。
7.根据权利要求5所述的以放射形根瘤菌为菌种生产可得然胶发酵液的方法，其特征在于所述的步骤A2中是将摇瓶种子按照质量百分比为0.2%-0.5%的接种量接入灭菌后的一级种子培养液中经通气培养制成一级种子，一级种子的培养条件是培养温度为28℃-32℃、压力为0.04MPa-0.06MPa、通风量0.3vvm-0.4vvm、培养周期为26-48小时的条件下通气培养，一级种子培养液由下列质量分数的组分组成：
葡萄糖2%-2.5%、氯化铵0.3%-0.5%、硫酸铵0.3%-0.5%、硫酸镁 0.1%-0.2%、硫酸亚铁10ppm-20ppm、聚醚消泡剂0.05%-0.1%、余量为无菌水。
8.根据权利要求5所述的以放射形根瘤菌为菌种生产可得然胶发酵液的方法，其特征在于所述的步骤A3是将一级种子按照质量百分比为5%-10%的接种量接入灭菌后的二级种子培养液中经通气培养制成二级种子，二级种子的培养条件是培养温度为28℃-32℃、压力为0.04MPa-0.06MPa、通风量0.5 vvm -0.7vvm、培养周期为24小时的条件下通气培养，二级种子培养液由下列质量分数的组分组成：
葡萄糖2%-2.5%、氯化铵0.4%-0.6%、硫酸铵0.3%-0.5%、硫酸镁 0.1%-0.2%、硫酸亚铁10ppm-20ppm、聚醚消泡剂0.05%-0.1%、余量为无菌水。
9.根据权利要求6所述的以放射形根瘤菌为菌种生产可得然胶发酵液的方法，其特征在于所述的步骤A1中摇瓶种子培养液的灭菌条件为蒸汽压力0.1 Mpa-0.12Mpa、温度121℃-125℃、时间30-35分钟。
10.根据权利要求7或8所述的以放射形根瘤菌为菌种生产可得然胶发酵液的方法，其特征在于所述的步骤A2、A3中一级种子培养液及二级种子培养液的灭菌条件为温度121℃-125℃，时间25-30分钟。
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