CN103468624B - 一种用于高效生产海藻糖的基因工程菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于高效生产海藻糖的基因工程菌以及利用该工程菌高效生产海藻糖的方法。所述基因工程菌的保藏号为CCTCC NO：M2013237。所述方法包括以下步骤：A）将所述的基因工程菌进行发酵培养，收集菌体细胞；B）破碎菌体细胞，释放出MTSase和MTHase，得到包含这两种酶的水溶液；C）将包含上述两种酶的水溶液用于将直链淀粉或直链糊精转化为海藻糖。本发明构建的基因工程大肠杆菌可以将直链淀粉或直链糊精高效地转化为海藻糖，转化率高达85%以上，具有酶成本低，转化时间短、工艺操作简单等特点，具有大规模工业应用的广泛前景。

Description

一种用于高效生产海藻糖的基因工程菌

技术领域

本发明属于基因工程和酶催化领域，具体涉及一种用于高效生产海藻糖的基因工程菌以及利用该工程菌高效生产海藻糖的方法。

背景技术

海藻糖是由2个吡喃葡萄糖以α,α-1,1-糖苷键连接而成的非还原性双糖，广泛存在于自然界的动植物和微生物中，但含量很低。海藻糖无色无嗅，具有很强的热稳定性、酸稳定性和化学稳定性，对蛋白质、核酸、细胞膜等具有很强的稳定作用，通常在环境胁迫条件下大量产生，对生物大分子乃至生物体起保护作用。海藻糖是一种有效的保护剂，可以保护酶、蛋白、生物膜、生物医药制剂甚至待移植的器官，也可被开发成高级化妆品，在食品工业上常用作新型甜味剂、保湿剂和脱水剂，有着广泛的应用前景。

目前，海藻糖的生产方法主要有微生物细胞抽提法、基因工程菌发酵法、酶转化法，其中，酶转化法因其成本低廉、工艺简单而具有广阔的应用前景。特别是利用麦芽寡糖基海藻糖合成酶（MTSase）和麦芽寡糖基海藻糖水解酶（MTHase）以及海藻糖合成酶（Trehalose synthase）以淀粉、淀粉水解物、麦芽低聚糖、麦芽糖等为底物酶法转化生产海藻糖现已成为海藻糖工业化生产的主要方法。

KR20000037638、US5773282、CN101100658A、CN1563372A等专利公布了一些采用海藻糖合成酶生产海藻糖的方法。然而，海藻糖合成酶需要以麦芽糖为底物生产海藻糖，因此需要先制得含量较高的麦芽糖浆，麦芽糖浆中的麦芽糖部分被转化为海藻糖，所以从淀粉到海藻糖总的转化率不高，并且制备高麦芽糖浆的成本相对较高。

联合使用麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶生产海藻 糖的双酶法路线更具有优势，只需要将淀粉进行简单的液化和去支化，然后，在麦芽寡糖基海藻糖合成酶的作用下，淀粉及其部分水解物还原性末端形成具有海藻糖结构的非还原性末端，再经麦芽寡糖基海藻糖水解酶作用，将该海藻糖末端切下生成海藻糖，此过程重复进行，从而得到较高海藻糖产率。US2007087426A1、US5472863A、CN1504567A等专利公开了一些可以产生麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶的微生物，使用这些酶可以生产海藻糖。

Tetsuya Nakada等（Purification and characterization of a novel enzyme,maltooligosyl trehalose trehalohydrolase,from Arthrobacter sp.Q36.Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,1995,59(12):2215-2218）对来自节杆菌的MTSase和MTHase进行了研究，以10%淀粉溶液为原料，双酶的加量分别为2.5U MTSase/g淀粉、10U MTHase/g淀粉，经72h转化，海藻糖产率为75%。US5472863A中所述菌株发酵周期长达72小时以上，MTSase和MTHase的发酵酶活分别为1.3U/mL和1.8U/mL；US2007087426A1采用大肠杆菌基因工程菌分别表达两个酶，该双酶以20%可溶性淀粉水溶液为原料，经过100～120小时的转化，海藻糖产率不到80%；Masaru Kato（Trehalose production with a new enzymatic system from Sulfolobus solfataricus KM1.Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic,1999,6(3):223-233）研究中采用与US2007087426A1所述相同的两个酶，原料为10～25%淀粉浓度，酶加量分别为30U MTSase/g淀粉和30U MTHase/g淀粉，最终获得78.6～81.5%的转化率。在当淀粉浓度达到20%以上时，海藻糖转化率最高不到80%，并且这个来源的麦芽寡糖基海藻糖水解酶具有较强的淀粉酶活性，容易造成原料的损失。CN1504567A也是采用大肠杆菌基因工程菌分别表达这两个酶，发酵酶活分别为：MTSase60U/mL发酵液，MTHase250U/mL发酵液，在30%淀粉浓度、2U MTSase/g淀粉、10U MTHase/g淀粉的条件下，转化周期长达64小时，经分离纯化后，海藻糖收率只有50%。

到目前为止，双酶法路线已经实现了海藻糖的工业化生产，然而还有以下问题和不足之处：一，原始产酶菌种经过发酵产生的酶活力较低，发酵周期很 长，能耗大，使得发酵成本很高，生产效率低下；二，重组菌产生这两个酶的菌株需要分别进行发酵，然后再经过测定酶活，按照合适的比例投入酶进行反应，增加了操作难度；三、已有菌种发酵酶活不够高，以致酶成本较高，或者是转化时间比较长。所以，构建发酵周期短，酶活力高，后续工艺操作简单的基因工程菌株对于海藻糖生产具有重要的实际意义。

发明内容

本申请的发明人利用基因工程技术对大肠杆菌进行改造，一方面，利用敲除技术同时敲除大肠杆菌染色体上的海藻糖酶基因和麦芽转葡糖基酶基因，降低宿主菌内源性的降解海藻糖的能力，另一方面，将不同来源的编码麦芽寡糖基海藻糖合成酶的和编码麦芽寡糖基海藻糖水解酶的多核苷酸序列同时导入大肠杆菌中，增强宿主菌转化直链淀粉或直链糊精成为海藻糖的能力，通过大规模筛选，最终获得一株能够高效生产海藻糖的基因工程菌，保藏号为CCTCC NO：M2013237，经测试，其海藻糖转化率高达85%以上。

本发明的第一个目的在于提供一种用于高效生产海藻糖的基因工程菌，保藏号为CCTCC NO：M2013237。

本发明的第二个目的在于提供所述的基因工程菌在高效生产海藻糖上的应用。

本发明的第三个目的在于提供一种高效生产海藻糖的方法，包括以下步骤：

A）所述的基因工程菌进行发酵培养，收集菌体细胞；

B）破碎菌体细胞，释放出MTSase和MTHase，得到包含这两种酶的水溶液；

C）将包含上述两种酶的水溶液用于将直链淀粉或直链糊精转化为海藻糖。

根据本发明，所述步骤A）包括：

a、种子培养 

将所述的基因工程菌接种至种子培养基，30～37℃振荡培养3～12小时，待种子培养基OD600=0.5～2时，按照0.5～5%的比例接种至发酵培养基；

b、发酵培养 

先在35～37℃振荡培养2～12小时，然后加入终浓度50～500μM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，再于22～30℃继续振荡培养15～24小时，收集菌体细胞。

根据本发明，所述种子培养基的组成如下：蛋白胨5～10g/L，酵母粉5～10g/L，氯化钠2～10g/L。

根据本发明，所述发酵培养基只要上述菌种能在其中生长并且产生麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶，则任何培养基和培养条件均可使用，一般地，所述发酵培养基包括氮源、碳源、无机盐等，所述氮源包括酵母浸膏、酵母提取物、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、铵盐、硝酸盐等，所述碳源包括葡萄糖、甘油、淀粉糖浆、玉米浆等，所述无机盐包括氯化钠、磷酸盐、硫酸镁以及锰、锌、铁、铜元素的盐类等。

根据本发明的优选实施例，所述发酵培养基的组成如下：蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，三水磷酸氢二钾16.7g/L，磷酸二氢钾2.31g/L，甘油5g/L。

根据本发明，所述步骤B）中所述破碎菌体的方法包括：超声波处理、反复冻融、加压减压处理、表面活性剂或酶处理。

根据本发明，所述步骤C）包括：配制浓度为10～30%的直链淀粉或直链糊精溶液，加入步骤B）中得到的包含MTSase和MTHase的水溶液，维持温度30～50℃，pH6.0～8.0，当生成的海藻糖浓度达到要求时，加入糖化酶处理，最终得到含有海藻糖的溶液，海藻糖的转化率高达85%以上。

本发明的有益效果：本发明构建的基因工程大肠杆菌采用合适的发酵工艺发酵后，发酵酶活可高达300～600U/mL，收集到的菌体细胞经破壁处理后，所释放的酶液可以将直链淀粉或直链糊精高效地转化为海藻糖，转化率高达85%以上，具有酶成本低，转化时间短、工艺操作简单等特点，具有大规模工业应用的广泛前景。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用 于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

本发明提供了一株可以将直链淀粉或直链糊精高效转化为海藻糖的基因工程菌，保藏编号CCTCC NO：M2013237，保藏单位是中国典型培养物保藏中心，保藏地址是湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，菌种的拉丁学名是Escherichia coli CIBT1.1361，中文名称是大肠杆菌CIBT1.1361，保藏日期是2013年5月29日。

本发明中使用的培养基组成及配制方法如下：

种子培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，用去离子水配制，121℃灭菌20分钟；

发酵培养基：蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，三水磷酸氢二钾16.7g/L，磷酸二氢钾2.31g/L，甘油5g/L，用去离子水配制，121℃灭菌20分钟。

SOB培养基：胰蛋白胨20g/L，酵母提取物5g/L，NaCl0.5g/L，加水完全溶解后，加1%250mM KCl溶液，调pH=7.0，121℃，20分钟灭菌后，加入0.5%灭菌的2M MgCl₂溶液。

本发明中，所述直链淀粉或直链糊精是指分子中不包含或只含有少量的α-1,6-糖苷键的淀粉或其部分水解物，可通过自然界存在的原材料直接得到或支链淀粉经去支链得到（如经普鲁兰酶或异淀粉酶水解去除支链）。

实施例1、Escherichia coli BL21（DE3）染色体基因组上treA和malQ基因的敲除

1.1、实验路线

本发明首先对宿主菌Escherichia coli BL21（DE3）进行基因工程技术改造，将位于其染色体基因组上的海藻糖酶基因（treA）和麦芽转葡糖基酶基因（malQ）进行基因敲除，两个基因分步敲除，两个基因的敲除都按照下面的方法进行：

第一步：抗性基因打靶片段的构建；

第二步：用该抗性基因打靶片段取代treA基因或malQ基因；

第三步：消除该抗性基因。

1.2、treA抗性基因打靶片段的构建

合成引物P1和P2：

P1：5’-AACGCCGCTGGCTGGCTAAT-3’（SEQ ID NO：1）；

P2：5’-TATCTTCGGCAACCACGTAT-3’（SEQ ID NO：2）。

配制PCR反应液，含有如下组分：50pmol引物P1、50pmol引物P2、0.2mM dNTP、1μL模板（商业购买的敲除了treA基因的E.coli JW1186培养液，购买自耶鲁大学CGSC菌种保藏中心）、25mM MgSO₄、1×KOD neo plus buffer、KOD neo plus2U（购自TOYOBO公司），补水至50μL。

PCR的条件如下：94℃预变性4min，然后按如下参数循环25次：94℃变性30s，50℃退火30s，68℃延伸1min，最后一个循环68℃延伸10min。

PCR结束后，用琼脂糖电泳检测可见约1500bp大小的电泳条带，用胶回收试剂盒将PCR产物回收、纯化、浓缩，就可得到打靶片段。

1.3、用卡那霉素抗性基因取代treA基因

用氯化钙法制备Escherichia coli BL21（DE3）感受态细胞，将pKD46质粒（购自Biovector Science Lab,Inc）转入其中，涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上，30℃过夜培养后长出的单菌落接种于含有100μg/mL氨苄青霉素和20mM L-阿拉伯糖的SOB培养基中，30℃培养至OD600=0.4～0.6，诱导pKD46上的Exo、Bet和Gam三个蛋白得到充分表达，立刻冰上预冷30min，然后离心收集菌体并洗涤，浓缩100倍左右，然后与打靶片段混合进行电击转化，涂布于含有卡那霉素的LB平板上，30℃过夜培养，挑选单菌落为模板，采用P1和P2进行PCR和琼脂糖凝胶电泳分析，若得到1500bp左右大小的片段，该单菌落即为treA基因被卡那霉素抗性基因取代的Escherichia coli BL21（DE3）。

1.4、质粒pKD46的消除

质粒pKD46具有氨苄抗性，是温敏性质粒，在温度高时无法复制。将1.3中验证为正确的突变株在含有卡那霉素的LB液体培养基中于37℃过夜培养，次日转接到同样的培养基，在37℃培养2h，再提高温度至42℃培养4～6h，37℃划线分离单菌落，筛选卡那霉素抗性和氨苄青霉素敏感的菌株。

1.5、卡那霉素抗性基因的去除

将1.4中获得卡那霉素抗性的Escherichia coli BL21（DE3）突变株采用氯化钙法制备感受态细胞，导入质粒pCP20（购自Biovector Science Lab,Inc），在含有氨苄青霉素的平板上30℃培养，筛选阳性转化子，然后转接至无抗性的液体LB培养基中，在30℃培养2h，提高温度至42℃培养4～6h，在无抗性的LB平板上37℃划线分离单菌落，对单菌落进行氨苄青霉素和卡那霉素敏感性检测，获得均敏感的克隆即为去除了pCP20质粒和卡那霉素抗性基因的treA基因缺失突变株。

1.6、malQ基因的敲除

以1.5中敲除了treA的Escherichia coli BL21（DE3）为出发菌株，设计引物P3和P4取代P1和P2：

P3：5’-GCAGGTGGATGTGCTGTACC-3’（SEQ ID NO：3）；

P4：5’-GTGTGCGGTCTGGTAGGCTG-3’（SEQ ID NO：4）。

构建抗性打靶基因时以商业购买的敲除了malQ基因的E.coli JW3379培养液为模板（购买自耶鲁大学CGSC菌种保藏中心）。

重复1.2～1.5步骤即可得到敲除了treA和malQ基因的Escherichia coliBL21（DE3），并以此菌株做为下面试验的宿主。

实施例2、（Escherichia coli）BL21(DE3)MTSaseMTHase的构建

全基因合成来源于节杆菌、硫化叶菌、短杆菌、分支杆菌的麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因MTSase和麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因MTHase，亚克隆到表达质粒载体（如pTrc99a和pET24a等）上，分别获得包含编码MTSase多核 苷酸序列的质粒载体和包含编码MTHase多核苷酸序列的质粒载体。然后用两种合适的限制性内切酶酶切包含编码各种来源MTSase多核苷酸序列的质粒载体混合液，用相同的限制性内切酶酶切包含编码各种来源MTHase多核苷酸序列的质粒载体混合液，获得包含MTSase多核苷酸序列的片段和包含MTHase多核苷酸序列的片段，然后通过T4DNA连接酶于16℃连接过夜，用氯化钙法转化敲除了treA和malQ基因的Escherichia coli BL21（DE3）感受态细胞，涂布于含卡那霉素的LB平板，37℃培养过夜得到转化子。从转化平板上挑单克隆接种于摇瓶发酵筛选，得到转化最快的菌种CCTCC NO：M2013237。

筛选方法：将单菌落接入到装有50mL种子培养基的摇瓶中，在37℃和200转/分的摇床条件下培养6小时左右，当OD600＝3～4时，降低培养温度到28℃，并加入终浓度为500μM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，继续培养20小时，结束发酵。发酵结束后离心收集发酵液中的菌体细胞，按照质量加入2倍的去离子水，混合均匀后采用超声波细胞破碎机破碎细胞，得到了细胞破碎液。然后取1mL酶液加入到装有50mL麦芽糊精（含量10%w/v，DE值11）溶液的250mL摇瓶中，控制温度40℃，搅拌200转/分，1小时后取1mL反应液，加入1mL10%的盐酸中止反应，采用高效液相色谱检测反应液中的海藻糖含量，根据海藻糖含量的高低筛选高酶活的菌种。

实施例3、利用CCTCC NO：M2013237生产海藻糖

将CCTCC NO：M2013237菌种按照1‰的体积比接入到装有50mL种子培养基的摇瓶中，在37℃和200转/分的摇床条件下培养12小时，当OD600＝1～2时停止培养，将其接入装有1L发酵培养基的摇瓶中，在37℃、200转/分培养3小时，降低培养温度到28℃，并加入终浓度为500μM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，继续培养20小时，结束发酵。通过离心收集到发酵液中的菌体细胞，湿重为30g/L，按照质量加入2倍的去离子水，混合均匀后采用超声波细胞破碎机破碎细胞，得到了90ml细胞破碎液。

将玉米淀粉乳（淀粉质量浓度为31%）pH5.3～5.6，按照250mL/吨干物的量加入高温淀粉酶（Liquozyme supra，购自诺维信），106～108℃喷射，液 化维持柱60分钟，然后135℃灭酶20分钟，冷却到60℃后，按照100mL/吨干物的量加入普鲁兰酶（Promozyme D2，购自诺维信），处理18小时，就得到直链糊精溶液（糊精DE=3～6）。

向3L发酵罐加入1330mL上述直链糊精溶液和622mL去离子水，再加入9mL上述细胞破碎液，控制温度40℃，用20%氢氧化钠溶液控制pH7.0，搅拌200转/分，在10min时取样测定产生的海藻糖浓度为55.6g/L，根据这个浓度可以计算出发酵酶活是324.8U/ml，公式是：

其中，55.6g/L代表反应开始10分钟时产生的海藻糖浓度，2L代表反应液总体积，10⁶是从摩尔到微摩尔的换算倍数，90mL代表1L发酵液所能得到的细胞破碎液体积，10min代表反应时间，9mL代表加入的细胞破碎液体积，1000mL是将酶活单位从U/L换算为U/mL，342.3是海藻糖的分子量。

24小时后，用10%的盐酸调pH=5.0，温度为60℃，加入2mL复合糖化酶（DX，购自诺维信公司）反应3小时，用来水解反应混合物中的残留的淀粉、糊精、多糖、寡糖等糖类，停止反应，采用高效液相色谱检测反应液中的海藻糖质量产率达到86%。

Claims (9)

1.一种用于高效生产海藻糖的基因工程菌，其特征在于，保藏号为CCTCCNO：M2013237。

2.如权利要求1所述的基因工程菌的应用，其特征在于，用于生产海藻糖。

3.一种高效生产海藻糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A）将权利要求1中所述的基因工程菌进行发酵培养，收集菌体细胞；

B）破碎菌体细胞，释放出MTSase和MTHase，得到包含这两种酶的水溶液；

C）将包含上述两种酶的水溶液用于将直链淀粉或直链糊精转化为海藻糖。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤A）包括：

a、种子培养

将权利要求1中所述的基因工程菌接种至种子培养基，30～37℃振荡培养3～12小时，待种子培养基OD600=0.5～2时，按照0.5～5%的比例接种至发酵培养基；

b、发酵培养

先在35～37℃振荡培养2～12小时，然后加入终浓度50～500μM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，再于22～30℃继续振荡培养15～24小时，收集菌体细胞。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述种子培养基的组成如下：蛋白胨5～10g/L，酵母粉5～10g/L，氯化钠2～10g/L。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基包括氮源、碳源、无机盐，所述氮源包括酵母浸膏、酵母提取物、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、铵盐、硝酸盐，所述碳源包括葡萄糖、甘油、淀粉糖浆、玉米浆，所述无机盐包括氯化钠、磷酸盐、硫酸镁以及锰、锌、铁、铜元素的盐类。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的组成如下：蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，三水磷酸氢二钾16.7g/L，磷酸二氢钾2.31g/L，甘油5g/L。

8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤B）中所述破碎菌体的方法包括：超声波处理、反复冻融、加压减压处理、表面活性剂或酶处理。

9.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤C）包括：配制浓度为10～30%的直链淀粉或直链糊精溶液，加入步骤B）中得到的包含MTSase和MTHase的水溶液，维持温度30～50℃，pH6.0～8.0，当生成的海藻糖浓度达到要求时，加入糖化酶处理，最终得到海藻糖的溶液。