CN108546660B - 甲壳素脱乙酰基酶高产菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及甲壳素脱乙酰基酶高产菌株及其应用。所述甲壳素脱乙酰基酶高产菌株具体为马红球菌(Rhodococcus equi)F6，保藏编号为CGMCC No.14861。该菌株产甲壳素脱乙酰基酶的速度极快，是目前首次报道可生产甲壳素脱乙酰基的马红球菌，也是现有技术中所有发酵产甲壳素脱乙酰基酶最快的菌株，易于大规模培养。
Description
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及甲壳素脱乙酰基酶高产菌株及其应用。
背景技术：
甲壳素又名几丁质，学名为(1，4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡聚糖，是自然界生物所含有的一种含量仅次于纤维素的氨基多糖，主要存在于无脊椎动物，如虾、昆虫、海藻、真菌及酵母中。但是甲壳素不溶于水、酸、碱和有机溶剂，所以其没有太大的商业价值，而其脱去乙酰基后的产物壳聚糖则广泛应用于医药、食品、化工、化妆品等行业。目前生产壳聚糖主要使用的化学法存在诸多问题，例如，反应时间长、能耗大、产品质量不稳定，特别是排放物会造成巨大的环境污染。
甲壳素脱乙酰酶可以脱掉甲壳素上的乙酰基生产脱乙酰度稳定、分子质量分布范围窄的壳聚糖产品，为解决化学法生产壳聚糖存在的问题提供了一条新的途径。目前国内外关于甲壳素脱乙酰酶产生菌的研究仅有少量的文献报道，微生物来源的甲壳素脱乙酰酶也主要以真菌为主，细菌较少。
目前，国内外涉及利用筛选到的天然微生物发酵法生产甲壳素脱乙酰基酶的报道相对较少，国内CN102676485A、CN104450832A和CN104498365A三个专利关联性相对较高。其中CN102676485A公开了用短柄梨孢霉发酵培养90-100小时，获得了甲壳素脱乙酰酶；CN104450832A公开了利用嗜热芽孢杆菌发酵培养60-72h，获得了甲壳素脱乙酰基酶；；CN104498365A公开了利用菌株Aspergillus versicolor X发酵72-100h，获得了甲壳素脱乙酰基酶粗酶液。
但目前微生物发酵生产甲壳素脱乙酰基酶存在发酵时间长、酶活力低等一系列问题，所以目前该酶一直未能实现产业化。因此，从自然环境中筛选性能优良的产酶新菌种仍是解决CDA工业化应用的重要课题之一，也具有重要的实用价值和学术研究价值。
发明内容：
针对现有技术的不足，本发明旨在提供一株能高产甲壳素脱乙酰基酶的马红球菌及其发酵方法和应用，本发明提供的高产甲壳素脱乙酰基酶的菌株产酶速度极快，是目前首次报道可生产甲壳素脱乙酰基的马红球菌，也是现有技术中所有发酵产甲壳素脱乙酰基酶最快的菌株，易于大规模培养。
本发明的第一个目的在于提供一株高产甲壳素脱乙酰基酶的马红球菌(Rhodococcus equi)F6，该菌株已于2017年11月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.14861。
所述马红球菌(Rhodococcus equi)F6的理化特性如下：革兰氏阳性菌，LB培养基上菌落呈球形，潮湿，菌落颜色为柔和的粉红色。
本发明的第二个目的在于提供所述的马红球菌CGMCC No.14861在生产甲壳素脱乙酰基酶的中的应用。
本发明的第三个目的在于提供一种采用红球菌CGMCC No.14861发酵生产甲壳素脱乙酰基酶的生产方法，具体如下：
(1)种子培养
培养条件：搅拌转速为160-200rpm，温度为30-37℃，发酵12-24h；
种子培养基：蛋白胨5-10g/L，酵母浸粉3-8g/L，氯化钠5-10g/L，余量为水，pH6.0-7.0；
(2)发酵培养
发酵条件：接种量2-10％，搅拌转速为160-200rpm，温度为30-40℃，发酵6-10h；
发酵培养基：酵母浸粉5-10g/L，葡萄糖0.5-2.0g/L，硫酸镁1.0g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，磷酸氢二钾1.0g/L，氯化钠0.5-2.0g/L，余量为水，pH6.0-7.0；
发酵6-10h后，发酵液中的甲壳素脱乙酰基酶含量达到170-180U/mL。
有益效果：
本发明提供的马红球菌CGMCC No.14861能够利用普通碳源和氮源，快速进行细胞培养和甲壳素脱乙酰基酶的积累。通过条件优化，6-10h发酵产酶可达到最大，每mL发酵液酶活力为173.6U。相比现有技术，利用发明提供的马红球菌CGMCC No.14861，可实现快速地积累甲壳素脱乙酰基酶，达到高产的效果，具有广泛的工业应用前景。
附图说明：
图1为F6的菌落图片及显微镜照片；
其中，A为菌落图；B为显微镜照片；
图2 F6菌株系统发育树；
图3发酵过程曲线。
具体实施方式：
为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。
实施例1 F6菌株的筛选
将山东、沈阳、成都等地采集的土样制成悬浊液后涂布于富集培养基(细粉几丁质2.5g/L，磷酸氢二钾0.7g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钠0.1g/L)，然后将富集培养基里的菌液经无菌水稀释后涂布于筛选培养基(胶体几丁质2.5g/L，磷酸氢二钾0.7g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，硫酸镁0.1g/L，对硝基乙酰苯胺2.0g/L，琼脂20g/L)30℃培养3～5天。将获得的培养物转种于新的固体平板上，平板划线直至出现单菌落。经过三角瓶发酵产酶检测复筛后，最终得到一株纯培养物，编号为F6菌株。
将F6菌株进行了16SrDNA鉴定，经过用从NCBI blast中得到的部分序列构建进化树(图2所示)，用MP法构建进化树确定F6为马红球菌(Rhodococcus equi)。红球菌F6于2017年11月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.14861。
实施例2马红球菌CGMCC No.14861的发酵产酶
将实施例1获得的红球菌CGMCC No.14861进行多批次发酵培养。
(1)种子培养
培养条件：搅拌转速为200rpm，温度为37℃，发酵12h；
种子培养基为：蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠10g/L，余量为水，pH6.0-7.0；
(2)发酵培养
发酵条件：接种量8％，搅拌转速为200rpm，温度为37℃；
发酵培养基：酵母浸粉5g/L，葡萄糖0.5g/L，硫酸镁1.0g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，磷酸氢二钾1.0g/L，氯化钠0.5g/L，余量为水，pH6.0-7.0；
发酵30h，定时取发酵液进行甲壳素脱乙酰基酶酶活检测。发酵产酶曲线如图3所示，发酵至8h时达到最大酶活，经测定为173.6U/mL。
酶活检测方法如下：
发酵液12000r/min离心5min，然后将菌体用pH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液洗涤后经超声波破碎仪进行破碎，破碎条件为：功率30％，开3s停5s，时间55min。然后再经12000r/min离心5min获得粗酶液。0.3mL粗酶液加入0.3mL200mg/L的对硝基乙酰苯胺溶液和0.9mLpH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液，于45℃反应15min，检测400nm吸光值，通过标准曲线计算出酶活力。
实施例3马红球菌CGMCC No.14861的发酵产酶
将实施例1获得的红球菌CGMCC No.14861进行多批次发酵培养。
(1)种子培养
培养条件：搅拌转速为160rpm，温度为30℃，发酵24h；
种子培养基为：蛋白胨5g/L、酵母浸粉8g/L、氯化钠5g/L，余量为水，pH6.0-7.0；
(2)发酵培养
发酵条件：接种量10％，搅拌转速为160rpm，温度为40℃；
发酵培养基：酵母浸粉10g/L，葡萄糖2.0g/L，硫酸镁1.0g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，磷酸氢二钾1.0g/L，氯化钠2.0g/L，余量为水，pH6.0-7.0；
发酵至6h时，经测定发酵液酶活达到180.5U/mL。
实施例4酶的底物催化试验
将实施案例2获得的粗酶液分别加入过量的不同底物(底物见下表)，底物均以pH＝4.0的0.2M磷酸盐-柠檬酸缓冲溶液进行溶解，通过高效液相色谱检测脱乙酰基释放的乙酸含量验证酶对不同底物的催化活性，以对硝基乙酰苯胺生成乙酸含量作为标准，通过检测，发现该菌株发酵产生的粗酶液对胶体几丁质、不同脱乙酰度的壳聚糖以及几丁质单体N-乙酰氨基葡萄糖均有一定的脱乙酰作用，对于该酶的产业化应用具有良好的指导意义，检测结果如下：
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。
Claims (3)
1.一株高产甲壳素脱乙酰基酶的马红球菌，其特征在于，所述马红球菌具体为马红球菌(Rhodococcus equi)F6，保藏编号为CGMCC No.14861。
2.如权利要求1所述高产甲壳素脱乙酰基酶的马红球菌在生产甲壳素脱乙酰基酶中的应用。
3.如权利要求2所述的马红球菌在生产甲壳素脱乙酰基酶中的应用，其特征在于，发酵生产甲壳素脱乙酰基酶的方法具体如下：
(1)种子培养
培养条件：搅拌转速为160-200rpm，温度为30-37℃，发酵12-24h；
种子培养基：蛋白胨5-10g/L、酵母浸粉3-8g/L、氯化钠5-10g/L、余量为水，pH6.0-7.0；
(2)发酵培养
发酵条件：接种量2-10％，搅拌转速为160-200rpm，温度为30-40℃，发酵6-10h；
发酵培养基：酵母浸粉5-10g/L，葡萄糖0.5-2.0g/L，硫酸镁1.0g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，磷酸氢二钾1.0g/L，氯化钠0.5-2.0g/L，余量为水，pH6.0-7.0。
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