CN113186239B - 一种细菌纤维素粉剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种细菌纤维素粉剂及其制备方法，属于生物材料技术领域。其步骤为：向甘油中加入氮源，硫酸镁，柠檬酸，磷酸氢二盐，硫酸亚铁，醪糟和水，制成培养细菌纤维素菌株的培养基，并调节pH值。培养基灭菌冷却后，接种细菌纤维素的生产菌株，置摇床动态培养后，取出细菌纤维素，酸洗，水洗，再浸泡至中性，然后脱色处理；再次水洗，浸泡至中性，破碎成细小颗粒后，磨碎，低温冷冻后粉碎，干燥即可。本发明的制备方法能够将团球状的细菌纤维素粗品加工为粉末状产品，且产量高。通过冷冻超微粉碎，制成的细菌纤维素粉末，经干燥后能够通过3D生物打印技术直接加工成终端产品，扩大了细菌纤维素的应用价值。

Description

一种细菌纤维素粉剂及其制备方法

技术领域

本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种细菌纤维素粉剂及其制备方法。

背景技术

细菌纤维素(bacterial cellulose，BC)是除植物纤维素、动物纤维素之外的另一类纤维素，为细菌合成的天然惰性材料。细菌纤维素具有优异的生物亲和性、生物相容性、生物适应性和良好的生物可降解性，是医药、建筑、通讯等行业的原材料，也是世界上公认的性能优异的新型生物材料。目前，对BC的应用主要集中在高附加值的生物医用材料上，如组织工程支架、人造血管、人造皮肤、敷料等方面。能够产生以细菌纤维素的细菌主要有Acetobacter、Rhizobium、Agrobacterium和Sarcina等，其中产量最高的为木醋杆菌(Acetobacter xylinus)，属革兰氏阴性，严格好氧。公开号为CN102337311A的中国专利，公开了以木醋杆菌为生产菌株，利用土豆废渣做为培养基培养细菌纤维素的方法，该方法主要是采用静态培养，培养后形成细菌纤维素膜片。但是利用该方法制得的细菌纤维素，不能形成颗粒状或粉末状，无法与其他组分进行组合，加工成性能更高的含细菌纤维素的复合材料。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种细菌纤维素粉剂及其制备方法。

为实现上述目的，本案发明人经过长期研究和大量实践，得以提供本发明技术方案。具体实施过程如下：

一种细菌纤维素粉剂的制备方法，包括以下步骤：

s1、向甘油中加入氮源，硫酸镁，柠檬酸，磷酸氢二盐，硫酸亚铁，醪糟和水，混合制成细菌纤维素生产菌株的生产培养基，并调节培养基的pH值为5.8～6.2，然后在115～125℃条件下灭菌，冷却备用；

所述甘油，氮源，硫酸镁，柠檬酸，磷酸氢二盐，硫酸亚铁，醪糟和水的配方比例按g:g:g:g:g:g:g:L计为15:10～23:2～4:0.2～0.4:4～6:0.2～0.4:20～60:1；

s2、待灭菌后的上述培养基冷却至25～35℃时，接种细菌纤维素生产菌株，接种比例为6～7％；将接种好生产菌株的培养液置于恒温摇床中，在28～32℃条件下动态培养6～8天；摇床培养的摇动速率为80～180rpm，通气量为0.3～0.6v/v·min；

s3、培养结束后，从培养液中取出球团状的细菌纤维素，放入柠檬酸沸水溶液中煎煮，然后用清水冲洗表面杂质，再反复浸泡至中性，将酸洗后的细菌纤维素，浸泡于过氧化氢溶液中进行脱色处理，取出后用水冲洗，然后反复浸泡至中性，用剪切机将球团状细菌纤维素剪切成小颗粒状，烘干至至含水量为50～70％，然后迅速低温冷冻，行冷冻超微粉碎，干燥即可。

优选的，所述s1中，灭菌的温度为121℃，时间为20min。

优选的，所述s1中，氮源为硫酸铵、酵母浸粉和蛋白胨中的一种或多种。

优选的，所述s1中，磷酸氢二盐为磷酸氢二钾或磷酸氢二钠。

优选的，所述甘油，酵母浸粉，蛋白胨，硫酸镁，柠檬酸，磷酸氢二钠，硫酸亚铁，醪糟和水按g:g:g:g:g:g:g:g:L计为15:13:10:3:0.3:5:0.3:60:1。

优选的，所述s1中，调节培养基的pH值为6.0。

优选的，所述s3中，柠檬酸沸水溶液中柠檬酸的质量分数为0.5％，用于脱色处理的过氧化氢溶液中过氧化氢的质量分数为3％，pH值为10。经过醪糟-无机盐培养基培养完毕的细菌纤维素，因含有醪糟成分及金属离子，产出的细菌纤维素颜色较深，故需要进行洗脱金属离子和脱色处理。

优选的，所述s2中，细菌纤维素的生产菌株为木醋杆菌，接种比例为6.5％，动态培养时间为7天，摇床摇动速率为150rpm，通气量为0.45v/v·min。

优选的，所述木醋杆菌菌液的制备方法为：从-75℃冰箱中取出木醋杆菌菌种保藏管，火焰干法消毒下，敲碎木醋杆菌菌种保藏管管口，用吸管吸取木醋杆菌种子培养液若干，推入管中木醋杆菌菌粉至乳悬液状态，摇匀后接种至木醋杆菌种子培养液中，扩增为高生物量的木醋杆菌菌液，然后将接种了木醋杆菌菌液的培养基，置于30℃恒温摇床中连续动态培养48h，即可生产出大量团球状的细菌纤维素。

2、上述制备方法制得的细菌纤维素粉剂。

3、上述制备方法制得的细菌纤维素粉剂在制备人体血管支架中的应用。

将本发明经上述制备方法制得的团球状细菌纤维素迅速冷冻，再经过超微冷冻设备行超微冷冻粉碎，将细菌纤维素中的纤维完全破碎成湿粉末状，并且粒度均匀，经真空干燥后，可直接用于加工终端产品，如用3D生物打印机可打印出人工血管支架等。

本发明的有益效果在于：

本发明公开的细菌纤维素粉剂的制备方法，具有操作简单，反应条件温和，安全环保等优点，且制成的细菌纤维素球团颗粒产量高，从而降低了生产成本，再通过超微粉碎设备进行湿法超微粉碎，制成的细菌纤维素粉末经干燥后，能够直接加工成终端产品，如通过3D生物打印加工为人工血管支架，扩大了细菌纤维素的应用价值。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1

一种细菌纤维素粉剂的制备方法，包括以下步骤：

s1、打开洁净实验台，用紫外灯照射30min消毒，从-75℃冰箱中取出木醋杆菌生产菌种保藏管，火焰干法消毒下，用镊子敲碎木醋杆菌菌种保藏管管口，用吸管吸取木醋杆菌种子培养液若干，推入管中木醋杆菌菌粉至乳悬液状态，溶解完全后接种至木醋杆菌培养基中；然后将接种后的木醋杆菌培养基置于30℃恒温摇床中，连续动态培养48h，得木醋杆菌菌株种子液；

s2、向7.5g甘油中，加入6.5g酵母浸粉，5g蛋白胨，1.5g硫酸镁，0.15g柠檬酸，2.5g磷酸氢二钠，0.15g硫酸亚铁，30g醪糟和0.5L去离子水，醪糟为市面上通常购买的醪糟，将上述组分充分混合，制成细菌纤维素生产性培养基，并调节该培养基的pH值为6.0，分装至500mL的三角烧瓶中，每瓶200mL，分装2瓶，剩余的备用，然后在121℃条件下灭菌20min，待冷却至30℃左右时，按6％的比例接种前述木醋杆菌菌株种子液，将接种好种子液的培养液置于恒温摇床中，30℃条件下行好氧振荡培养7天；设摇床培养转速为150rpm，通气量为0.5v/v·min；

s3、培养结束后，从培养液中取出木醋杆菌生产的团球状细菌纤维素，放入0.5％的柠檬酸沸水溶液中煎煮30min，然后用清水冲洗表面杂质，再反复浸泡、冲洗至中性，将酸洗后的细菌纤维素，浸泡于pH为10的3％过氧化氢溶液中进行脱色处理2h，取出后用清水冲洗，然后反复浸泡至中性，离心分离水分至含水量为60％左右，在-20℃下迅速冷冻，取出冻结的物料后，先用胶体磨初粉碎，再用冷冻超微粉碎设备粉碎至粒径为800～1200目的细菌纤维素超微颗粒，真空干燥，即得细菌纤维素粉末。

本实施例1中，制得的细菌纤维素经过脱色处理，浸泡至中性，离心后，两瓶培养得到的细菌纤维素湿重为86.4g，二级粉碎、真空干燥后的细菌纤维素粉末中干重为2.04g。

实施例2

一种细菌纤维素粉剂的制备方法，包括以下步骤：

s1、打开洁净实验台，用紫外灯照射30min消毒，从-75℃冰箱中取出木醋杆菌生产菌种保藏管，火焰干法消毒下，用镊子敲碎木醋杆菌菌种保藏管管口，用吸管吸取木醋杆菌种子培养液若干，推入管中木醋杆菌菌粉至乳悬液状态，溶解完全后接种至木醋杆菌培养基中；然后将接种后的木醋杆菌培养基置于30℃恒温摇床中，连续动态培养48h，得木醋杆菌菌株种子液；

s2、向7.5g甘油中，加入6.5g酵母浸粉，1.5g硫酸镁，0.15g柠檬酸，2.5g磷酸氢二钠，0.15g硫酸亚铁，50g醪糟和0.5L去离子水，醪糟为市面上通常购买的醪糟，将上述组分充分混合，制成细菌纤维素生产性培养基，并调节该培养基的pH值为6.0，分装至500mL的三角烧瓶中，每瓶200mL，分装2瓶，剩余的备用，然后在121℃条件下灭菌20min，待冷却至30℃左右时，按6％的比例接种前述木醋杆菌菌株种子液，将接种好种子液的培养液置于恒温摇床中，30℃条件下行好氧振荡培养7天；设摇床培养转速为150rpm，通气量为0.5v/v·min；

s3、培养结束后，从培养液中取出木醋杆菌生产的团球状细菌纤维素，放入0.5％的柠檬酸沸水溶液中煎煮30min，然后用清水冲洗表面杂质，再反复浸泡、冲洗至中性，将酸洗后的细菌纤维素，浸泡于pH为10的3％过氧化氢溶液中进行脱色处理2h，取出后用清水冲洗，然后反复浸泡至中性，离心分离水分至含水量为60％左右，在-20℃下迅速冷冻，取出冻结的物料，先用胶体磨初粉碎，再用冷冻超微粉碎设备粉碎至粒径为800～1200目的细菌纤维素超微颗粒，真空干燥，即得细菌纤维素粉末。

本实施例2中，制得的细菌纤维素经过脱色处理，浸泡至中性，离心后，两瓶培养得到的细菌纤维素湿重为32.04g，二级粉碎、真空干燥后得细菌纤维素粉末干重为1.03g。

实施例3

一种细菌纤维素粉剂的制备方法，包括以下步骤：

s1、打开洁净实验台紫外灯照射30min后，从-75℃冰箱中取出木醋杆菌菌种，在火焰旁，用镊子敲碎木醋杆菌菌种，用一次性注射器吸取木醋杆菌培养液，稀释木醋杆菌菌粉，溶解完全后接种至木醋杆菌培养基中；然后将接种后的木醋杆菌培养基置于30℃恒温摇床中，动态培养48h，得木醋杆菌菌株种子液；

s2、向7.5g甘油中，加入6.5g酵母浸粉，5g蛋白胨，1.5g硫酸镁，0.15g柠檬酸，2.5g磷酸氢二钠，0.15g硫酸亚铁，10g醪糟和0.5L去离子水，醪糟为市面上通常购买的醪糟，混合制成生产细菌纤维素的培养基，并调节培养基的pH值为6.0，分装至500mL的三角烧瓶中，每瓶200mL，分装成2瓶，剩余的用于备用，然后在121℃条件下灭菌20min，冷却至30℃左右时，按6％的比例接种木醋杆菌菌株种子液，将接种好种子液的培养液在30℃条件下，恒温需氧摇床培养7天；摇床培养的转速为150rpm，通气量为0.5v/v·min；

s3、培养结束后，从培养液中取出细菌纤维素，放入0.5％的柠檬酸沸水溶液中煎煮30min，然后用清水冲洗表面杂质，再反复浸泡至中性，将酸洗后的细菌纤维素浸泡于pH为10的3％的过氧化氢溶液中进行脱色处理2h，取出后用水冲洗，然后反复浸泡至中性，离心，浓缩至含水量为60％左右，然后在-80～-20℃下冷冻，再用超微粉碎设备粉碎至粒径为800～1200目的颗粒，真空干燥，即得粉末细菌纤维素。

本实施例3中，制得的细菌纤维素经过脱色处理，浸泡至中性，离心后，两瓶培养得到的细菌纤维素的湿重为60.73g，粉碎烘干后的粉末细菌纤维素中干重为1.56g。

实施例4

一种细菌纤维素粉剂的制备方法，包括以下步骤：

s1、打开洁净实验台紫外灯照射30min后，从-75℃冰箱中取出木醋杆菌菌种，在火焰旁，用镊子敲碎木醋杆菌菌种，用一次性注射器吸取木醋杆菌培养液，稀释木醋杆菌菌粉，溶解完全后接种至木醋杆菌培养基中；然后将接种后的木醋杆菌培养基置于30℃恒温摇床中，动态培养48h，得木醋杆菌菌株种子液；

s2、向7.5g甘油中，加入5g蛋白胨，1.5g硫酸镁，0.15g柠檬酸，2.5g磷酸氢二钠，0.15g硫酸亚铁，7.5g醪糟和0.5L去离子水，醪糟为市面上通常购买的醪糟，混合制成生产细菌纤维素的培养基，并调节培养基的pH值为6.0，分装至500mL的三角烧瓶中，每瓶200mL，分装成2瓶，剩余的用于备用，然后在121℃条件下灭菌20min，冷却至30℃左右时，按6％的比例接种木醋杆菌菌株种子液，将接种好种子液的培养液在30℃条件下，恒温需氧摇床培养7天；摇床培养的转速为150rpm，通气量为0.5v/v·min；

s3、培养结束后，从培养液中取出细菌纤维素，放入0.5％的柠檬酸沸水溶液中煎煮30min，然后用清水冲洗表面杂质，再反复浸泡至中性，将酸洗后的细菌纤维素浸泡于pH为10的3％的过氧化氢溶液中进行脱色处理2h，取出后用水冲洗，然后反复浸泡至中性，离心，浓缩至含水量为60％左右，然后在-80～-20℃下冷冻，再用超微粉碎设备粉碎至粒径为800～1200目的颗粒，真空干燥，即得粉末细菌纤维素。

本实施例4中，制得的细菌纤维素经过氢氧化钠溶液静置处理2天后，两瓶培养得到的细菌纤维素的湿重为28g，粉碎烘干后的粉末细菌纤维素中干重为0.68g。

从实施例1至实施例4中得到的结果，综合分析可知，酵母浸粉和醪糟的加入可明显提高细菌纤维素的产量，且随着加入量的增加而增加。

本发明公开的细菌纤维素粉剂的制备方法，具有操作简单，反应条件温和，安全环保等优点，能够形成细菌纤维素颗粒，且产量高，从而降低了生产成本，通过超微粉碎设备进行粉碎，制成的粉末细菌纤维素能够直接加工成产品，如通过3D打印加工为人工骨架，扩大了细菌纤维素的应用价值。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (4)

1.一种细菌纤维素粉剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

s1、向甘油中加入酵母浸粉、蛋白胨、硫酸镁、柠檬酸、磷酸氢二钠、硫酸亚铁、醪糟和水，混合制成细菌纤维素生产菌株的生产培养基，并调节培养基的pH值为5.8～6.2，然后在115～125℃条件下灭菌，冷却；

所述甘油、酵母浸粉、蛋白胨、硫酸镁、柠檬酸、磷酸氢二钠、硫酸亚铁、醪糟和水按g:g:g:g:g:g:g:g:L计为15:13:10:3:0.3:5:0.3:60:1；

s2、待灭菌后的培养基冷却至25～35℃时，接种细菌纤维素的生产菌株，接种比例为6～7％，将接种好生产菌株的培养液置于恒温摇床中，在28～32℃条件下动态培养6～8天；摇床培养的摇动速率为80～180rpm，通气量为0.3～0.6v/v·min；所述细菌纤维素的生产菌株为木醋杆菌菌株；

s3、培养结束后，从培养液中取出球团状的细菌纤维素，放入柠檬酸沸水溶液中煎煮，然后用清水冲洗表面杂质，再反复浸泡至中性，将酸洗后的细菌纤维素，浸泡于过氧化氢溶液中进行脱色处理，取出后用水冲洗，然后反复浸泡至中性，离心分离水分至含水量为60％左右，在-20℃下迅速冷冻，取出冻结的物料后，先用胶体磨初粉碎，再用冷冻超微粉碎设备粉碎至粒径为800～1200目的细菌纤维素超微颗粒，真空干燥，即得细菌纤维素粉末。

2.根据权利要求1所述细菌纤维素粉剂的制备方法，其特征在于，所述s1中，调节培养基的pH值为6。

3.根据权利要求1所述细菌纤维素粉剂的制备方法，其特征在于，所述s3中，柠檬酸沸水溶液中柠檬酸的质量分数为0.5％，用于脱色处理的过氧化氢溶液中过氧化氢的质量分数为3％，pH值为10。

4.根据权利要求1所述细菌纤维素粉剂的制备方法，其特征在于，所述木醋杆菌菌株种子液的制备方法为：从-75℃冰箱中取出木醋杆菌菌种保藏管，在火焰旁干法消毒下，敲碎木醋杆菌菌种保藏管管口，用吸管吸取木醋杆菌种子培养液，推入管中木醋杆菌菌粉至乳悬液状态，摇匀后接种至木醋杆菌培养基中；然后将接种后的木醋杆菌培养基置于30℃恒温摇床中，动态培养48h，得木醋杆菌菌株种子液。