CN115873757A - 一株麦氏交替单胞菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一株麦氏交替单胞菌及其应用。本发明从大型海藻江蓠中分离获得一株麦氏交替单胞菌(Alteromonas macleodii)QZ9‑9，于2022年3月23日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CGMCCNO.24568。相比现有的麦氏交替单胞菌，该菌株能够充分地将琼胶降解为分子量小于3kDa的琼胶寡糖，所获得的琼胶寡糖具有显著的抗氧化作用。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一株麦氏交替单胞菌及其应用。
背景技术
琼胶是大型藻类海藻胶的主要组成成分，不仅在海藻体内起到支架作用，还是目前最具应用前景的一类生物活性物质。然而，琼胶多糖存在黏度高、水溶性低以及不易被吸收等问题，在实际应用中受到巨大限制，这已成为大型藻类高值化利用的重要瓶颈。
由琼胶多糖降解得到的聚合度在2-10的直链或支链化合物—琼胶寡糖，相比于琼胶多糖，不仅来源丰富、种类繁多、性质稳定、应用广泛、活性独特，还具有分子量小、易溶于水、无抗原性等显著优势，具有多种医药保健功效。
生物降解法是目前更为安全、高效、环保的琼胶寡糖制备方法。通过将大分子琼胶多糖降解成小分子寡糖片段，制备过程温和高效，同时具有不破坏多糖的结构、不产生有害副产物的优点。因此，生物解法逐渐成为新型琼胶寡糖工业制备的重要手段。
丰富的大型海藻资源蕴藏着多种结构各异的琼胶多糖，是开发海洋多糖功能食品，寻找新型多糖药物先导化合物的宝贵资源。然而，当下琼胶多糖资源应用不足，生产手段粗放，高新科技结合落后，仅仅作为原料销至国外或采用简单粗放加工提取琼脂作为食物或食品添加剂使用。在当前急需海洋生物创新技术产业化、产品高值化发展的背景下，研究可降解琼胶多糖的新的菌株及其高附加值应用具有重要的意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一株麦氏交替单胞菌及其应用，该菌株能够将琼胶降解为琼胶寡糖，降解率达86.45％，获得的琼胶寡糖具有显著的抗氧化作用。
本发明从大型海藻江蓠中分离获得菌株QZ9-9，该菌株为革兰氏阴性杆菌，菌落湿润、淡黄色、圆形，边缘整齐，好氧菌，可降解琼脂并在固体培养基上有水解圈，并随着时间的增加水解圈直径不断扩大。该菌株的16S rRNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。经形态学和16s rRNA基因鉴定为麦氏交替单胞菌(Alteromonas macleodii)，其保藏编号为CGMCCNO.24568。
本发明还提供了所述麦氏交替单胞菌在生产琼胶酶、制备琼胶寡糖中的应用。
本发明还提供一种制备琼胶寡糖的方法，由本发明所述的麦氏交替单胞菌QZ9-9降解琼胶制得。
一些实施方案中，本发明提供的制备琼胶寡糖的方法具体包括：
步骤(1)：将保藏编号为CGMCC NO.24568的麦氏交替单胞菌接种至种子培养基中，培养，获得种子液；
步骤(2)：将所述种子液接种于含琼胶的液体培养基中，培养，离心去除菌体，得到上清液；
步骤(3)：将所述上清液经分子截留、离心，收集分子量小于3kDa的组分。
一些实施方案中，步骤(1)中所述麦氏交替单胞菌QZ9-9的接种量为2～2.5％(v/v)；一些具体实施例中，所述接种量具体可为2.5％(v/v)。
一些实施方案中，所述培养的条件为：转速为160～180rpm，25～30℃下，培养12～15h；一些具体实施例中，所述培养的条件为：转速为180rpm，30℃下，培养12h。
一些具体实施例中，步骤(2)中，所述含琼胶的液体培养基包括如下质量百分数的组分：
0.12％琼胶、3％NaCl、0.5％(NH4)2SO4、0.26％K2HPO4·3H2O、0.1％MgSO4·7H2O、0.01％FeSO4·7H2O，pH为7.5。
一些实施方案中，步骤(2)中所述种子液的接种量为2～2.5％(v/v)；一些具体实施例中，所述接种量具体可为2.5％(v/v)。
一些实施方案中，步骤(2)中所述培养的条件为：转速为160～180rpm，25～30℃下,培养50～60h；一些具体实施例中，所述培养的条件为：转速为180rpm，30℃下，培养50h。
本发明还提供了由本发明所述的方法制得的琼胶寡糖。
本发明研究了由本发明所述的方法制得的琼胶寡糖(即分子量＜3kDa的粗琼胶寡糖)的抗氧化特性，发现其在pH 6.5～7.5的DPPH清除率为＞80％，在温度25～30℃的DPPH清除率为＞85％，具有显著的抗氧化作用。
基于以上效果，本发明还提供了所述的琼胶寡糖在制备抗氧化产品中的应用。
本发明从大型海藻江蓠中分离获得一株麦氏交替单胞菌(Alteromonasmacleodii)QZ9-9，于2022年3月23日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CGMCCNO.24568。该菌株能够将琼胶充分地降解为分子量小于3kDa的琼胶寡糖，所获得的琼胶寡糖具有显著的抗氧化作用。
生物保藏说明
QZ9-9，分类命名：麦氏交替单胞菌Alteromonas macleodii，于2022年3月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.24568。
附图说明
图1为菌株形态图；
图2为菌株革兰氏染色图；
图3为菌株扫描电镜图；
图4为不同时间段菌株降解琼胶的水解圈变化；
图5为菌株QZ9-9系统进化树图；
图6为小于3kDa的琼胶寡糖的抗氧化性；
图7为温度对琼胶寡糖的抗氧化性的影响；
图8为pH对琼胶寡糖的抗氧化性的影响；
图9为菌株QZ9-9和菌株QZ8-6制备的琼胶寡糖的抗氧化性的比较结果。
具体实施方式
本发明公开了一株麦氏交替单胞菌及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1麦氏交替单胞菌(Alteromonas macleodii)QZ9-9的筛选与鉴定
1.1培养基
(1)琼胶液体培养基中各组分的质量体积百分含量为：0.12％琼胶、3％NaCl、0.5％(NH4)2SO4、0.26％K2HPO4·3H2O、0.1％MgSO4·7H2O、0.01％FeSO4·7H2O，pH 7.5。
(2)琼胶固体培养基中各组分的质量体积百分含量为：1.5％琼胶、3％NaCl、0.5％(NH4)2SO4、0.26％K2HPO4·3H2O、0.1％MgSO4·7H2O、0.01％FeSO4·7H2O，pH 7.5。
1.2菌株筛选
1.2.1样品采集：采集海南近海大型海藻江蓠，取5g样品，加入50mL PBS缓冲液，于无菌研磨器中研磨后倒入100mL EP管，上下轻晃，静置10min之后备用。
1.2.2菌株QZ9-9的初筛：取10μL处理好的江蓠样品接种至以琼胶为唯一碳源的液体培养基进行发酵培养，在30℃、180rpm的条件下培养24h，并且3次传代。
1.2.3菌株QZ9-9的复筛：取3μL传代后的发酵液涂布至琼胶固体培养基上，待长出菌落后进行多次划线，直至分离出单菌落(图1)。
1.3菌株QZ9-9的形态特征
菌株QZ9-9为革兰氏阴性菌，且为杆菌，菌落湿润、淡黄色、圆形，边缘整齐，好氧菌，可降解琼脂并在固体培养基上有水解圈(图1-3)，并随着时间的增加水解圈直径不断扩大(5％卢戈碘液染色)(图4)。
1.4菌株QZ9-9的分子生物学鉴定
将QZ9-9提取基因组后，进行16S rDNA测序以及鉴定，该菌株鉴定为麦氏交替单胞菌(Alteromonas macleodii)，我们将其命名为麦氏交替单胞菌(Alteromonas macleodii)QZ9-9(图5)。
16S rRNA全基因序列长1381bp，序列如SEQ ID NO：1所示。
1.5菌株QZ9-9制备琼胶寡糖的方法
(1)将麦氏交替单胞菌QZ9-9以2.5％(v/v)的接种量接种到2216E种子培养基中，转数180rpm，装液量25％，30℃培养12h得到种子液。
(2)将种子液以2.5％的接种量接种于琼胶液体培养基中(制备琼胶寡糖的培养基为琼胶液体培养基：0.12％琼胶、3％NaCl、0.5％(NH4)2SO4、0.26％K2HPO4·3H2O、0.1％MgSO4·7H2O、0.01％FeSO4·7H2O，pH 7.5)。180rpm，30℃培养50h，获得发酵液，经离心去除菌体，得到上清液；
(3)上清液通过分子截留的方法，使用Ultra离心管获得分子量小于3kDa的粗琼胶寡糖。
1.6 QZ9-9琼胶寡糖抗氧化特征
1.6.1小于3kDa琼胶寡糖的抗氧化性
琼胶寡糖的抗氧化特性使用DPPH自由基清除法进行评估。使用无水乙醇配制0.1mM DPPH溶液。首先考察了＜3kDa的琼胶寡糖的抗氧化特性，将50μL DPPH溶液与150μL的＜3kDa的琼胶寡糖液混合(pH 7.0)，25℃下避光孵育60min后，在517nm处测量反应液的吸光度，并以无水乙醇代替样品作为阴性对照，计算小于3kDa琼胶寡糖的抗氧化效率。结果发现，分子截留后的＜3kDa琼胶寡糖的DPPH清除率为88％，相比于1.5小节步骤(2)相同体积的发酵液提高了近68％，表现出较强的抗氧化特性(图6)。
1.6.2温度对琼胶寡糖的抗氧化的影响
将50μL DPPH溶液与150μL的＜3kDa的琼胶寡糖液混合(pH 7.0)，不同温度下避光孵育60min后，在517nm处测量反应液的吸光度，并以无水乙醇代替样品作为阴性对照，考察＜3kDa琼胶寡糖在不同温度下的抗氧化效率，结果显示，温度范围在25～30℃的DPPH清除率为最佳且均＞87％(图7)。
1.6.3 pH对琼胶寡糖的抗氧化的影响
首先调节＜3kDa的琼胶寡糖液的pH为5～11。随后，将50μL DPPH溶液与150μL的＜3kDa的琼胶寡糖液混合，在25℃下避光孵育60min后，在517nm处测量反应液的吸光度，并以无水乙醇代替样品作为阴性对照，考察＜3kDa琼胶寡糖在不同温度下的抗氧化效率，结果显示，pH范围在6.5～7.5的DPPH清除率最佳且均＞83％。
对比例1
在实施例1的菌株筛选中，本发明同时还获得了菌株QZ8-6，按照1.5小节的方法利用菌株QZ8-6发酵制备琼胶寡糖，并按照1.6.1的方法测试获得的琼胶寡糖的抗氧化作用，结果见图9。
结果显示，菌株QZ8-6降解琼胶制备得到的分子量小于3kDa的琼胶寡糖的DPPH清除率远低于本发明菌株QZ9-9，约为14％，抗氧化效果远不如本发明菌株。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.保藏编号为CGMCC NO.24568的麦氏交替单胞菌(Alteromonas macleodii)。
2.根据权利要求1所述的麦氏交替单胞菌，其特征在于，其16S rRNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
3.权利要求1或2所述的麦氏交替单胞菌在生产琼胶酶、制备琼胶寡糖中的应用。
4.一种制备琼胶寡糖的方法，其特征在于，由权利要求1或2所述的麦氏交替单胞菌降解琼胶制得。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括：
步骤(1)：将保藏编号为CGMCC NO.24568的麦氏交替单胞菌接种至种子培养基中，培养，获得种子液；
步骤(2)：将所述种子液接种于含琼胶的液体培养基中，培养，离心去除菌体，得到上清液；
步骤(3)：将所述上清液经分子截留、离心，收集分子量小于3kDa的组分。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述麦氏交替单胞菌QZ9-9的接种量为2～2.5％(v/v)；所述培养的条件为：转速为160～180rpm，25～30℃下，培养12～15h。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述含琼胶的液体培养基中各组分的质量体积百分含量为：
0.12％琼胶、3％NaCl、0.5％(NH4)2SO4、0.26％K2HPO4·3H2O、0.1％MgSO4·7H2O、0.01％FeSO4·7H2O，pH为7.5。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述种子液的接种量为2.5％(v/v)；所述培养的条件为：转速为160～180rpm，25～30℃下，培养50～60h。
9.权利要求4～8任一项所述的方法制得的琼胶寡糖。
10.权利要求9所述的琼胶寡糖在制备抗氧化产品中的应用。
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