CN117165490B - 一株海洋来源的交替单胞菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株海洋来源的交替单胞菌及其应用，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号CGMCC No.28095。本发明的菌株P‑1属于交替单胞菌属的新种，可应用于海产品加工副产物中制备鱼皮胶原蛋白抗氧化肽。

Description

一株海洋来源的交替单胞菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术和水产加工废弃物综合利用技术领域，具体涉及一株海洋来源的交替单胞菌(Alteromonas sp.)P-1及其应用。

背景技术

这里的陈述仅提供与本发明相关的背景技术，而不必然地构成现有技术。

目前我国在水产加工过程中会产生大量加工下脚料，如鱼骨、鱼皮、内脏等，大部分会被直接丢弃，少部分会被粗加工成饲料、作物肥料或其他低值产品，造成了资源的浪费。探索更多水产加工下脚料综合利用的方法以及提高废弃物的附加值成为了当前水产养殖业的研究热点。鱼皮是鱼类加工废弃物的重要组成部分，富含生物活性胶原蛋白，最适合作为水产胶原蛋白肽的提取原料。胶原蛋白肽为胶原蛋白经水解作用发生分子链解体、断裂形成的介于蛋白质和氨基酸之间的肽混合物，其吸收性、溶解性、吸水性等均优于胶原蛋白，已成为继生物医药、食品及化妆品行业的热门原料之一。目前，通过不同的生产工艺，从鳕鱼皮、鲨鱼皮、罗非鱼皮、鲤鱼皮、草鱼皮和鲢鱼皮等鱼类组织中均生产出具有不同生物活性的胶原蛋白肽。

交替单胞菌属(Alteromonas genus)属于交替单胞菌目、交替单胞菌科，为好氧或兼性厌氧发酵型革兰氏阴性杆菌，常见的生存环境是海岸水源和公海。该属的细菌有丰富的胞外酶系，能够产生琼胶酶、几丁质酶、蛋白酶、褐藻胶裂解酶等酶类。该属的细菌及其胞外酶可以用于降解海洋绿藻和制备功能性低聚寡糖，还能制备生物絮凝剂和抑藻/杀藻剂。但目前并未见该属的细菌应用于水产加工废弃物综合利用领域。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一株海洋来源的交替单胞菌及其应用。

为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：

第一方面，本发明提供一株海洋来源的交替单胞菌(Ateromonas sp.)P-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号CGMCCNo.28095。

第二方面，本发明提供利用所述海洋来源的交替单胞菌进行发酵产酶的方法，包括如下步骤：将交替单胞菌P-1接种至发酵培养基中进行发酵培养即得。

在一些实施例中，所述发酵培养基中，包括以下组分：0.3％-1％玉米粉，0.4％-1％豆粕，0.2％-0.5％麸皮，0.05％-0.2％ CaCl₂，0.3％-0.5％ Na₂HPO₄，0.02％-0.05％KH₂PO₄，海水配制后调节pH值至弱碱性。

优选的，所述发酵培养基，采用海水配制后调节pH值为7.5。

第三方面，本发明提供一种海洋来源的交替单胞菌菌剂，包括所述交替单胞菌P-1或其发酵物或其代谢产物。

术语“发酵物”用于指代发酵产品。相应的发酵物可以是从发酵培养交替单胞菌P-1的过程获得的液体，因此，也可称为发酵液；液体可以含有细菌(菌体)，但并不必然需要含有细菌。液体优选的含有由本发明的交替单胞菌P-1产生的代谢产物。

以及，在本发明的实施方式中，包含菌体的发酵液或培养液经离心、过滤、沉降或所属领域中已知的其他手段将在发酵液或培养液中生长的菌体细胞与液体分离，去除菌体细胞时所剩余的液体为“上清液”，在本发明中，上清液内含有交替单胞菌P-1的胞外代谢产物。在本发明的实施方式中，所述菌剂也可以包含该上清液。

以及，在本发明的实施方式中，包含菌体的发酵液或培养液经离心、过滤、沉降或所属领域中已知的其他手段将在发酵液或培养液中生长的菌体细胞与液体分离获取菌体，菌体可进行破碎获取菌体破碎物，破碎方式可以为超声(比如冰浴超声破碎细胞)或者本领域已知的其他手段，或者，更进一步的，对该菌体破碎物离心收集上清液，该上清液记为无细胞提取物，并且在本发明中，该菌体破碎物或无细胞提取物内含有交替单胞菌P-1的胞内代谢产物。在本发明的实施方式中，所述菌剂也可以包含该菌体破碎物或无细胞提取物。

以及，在本发明的实施方式中，为方便存储、运输，提高菌株存活率等，所述菌剂也可以是固体，进一步优选为冻干粉剂。即针对上述交替单胞菌P-1或其发酵物或其代谢产物进一步进行冷冻干燥获得，所述冷冻干燥技术(包括真空冷冻干燥技术)可采用常规方法进行，在此不再赘述。

第四方面，本发明提供采用所述交替单胞菌菌剂酶解鱼皮制备抗氧化肽的方法，包括如下步骤：将鱼皮剪碎、清洗后，与蒸馏水按比例混合，在70-80℃加热20-40min，离心得到可溶性胶原蛋白；对上清液进行透析，获得鱼皮胶原蛋白；将交替单胞菌P-1发酵产物与鱼皮胶原蛋白按比例混合后，酶解，即得。

在一些实施例中，鱼皮与蒸馏水的质量比为1:4-12。

在一些实施例中，酶解的温度为40-50℃，酶解时间为30-180min。

优选的，酶解完成后，在90-100℃终止反应5-15min。

在一些实施例中，还包括采用超滤管对水解产物进行分级的步骤。

上述本发明的一种或多种实施例取得的有益效果如下：

本发明提供了一株海洋来源的交替单胞菌P-1，可应用于海产品加工副产物中制备鱼皮胶原蛋白抗氧化肽。本发明的菌株P-1属于交替单胞菌属的新种，目前并未见来源于该种属的细菌制备鱼皮胶原蛋白抗氧化肽的研究。

本发明获得了交替单胞菌P-1粗酶液酶解鱼皮胶原蛋白产生的小分子量的抗氧化肽，通过比较低分子肽段混合物组分和维生素C的DPPH自由基清除活性和羟基自由基清除活性，发现鱼皮胶原蛋白低分子肽段混合物的抗氧化活性与维生素C接近。本发明所要保护的菌株和酶制剂在海产品深加工方面有巨大应用潜力，本发明为海洋新菌和新酶资源的开发利用及水产加工废弃物的资源化转化、高值化利用奠定了研发基础。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例1中，交替单胞菌P-1蛋白酶活性检测图(A)，目视观察图(B)和扫描电镜观察图(C)菌株形态；

图2为本发明实施例1中系统发育树分析交替单胞菌P-1的进化位置图；

图3为本发明实施例3中交替单胞菌P-1酶液对鱼皮胶原蛋白的水解度曲线和自由基清除活性对比图，(A)水解度；(B)高分子量肽和低分子量肽的DPPH自由基清除活性对比图；

图4为本发明实施例4中，胶原蛋白肽的自由基清除活性(DPPH)(A)和羟基自由基清除活性(HRSA)测定(B)。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1交替单胞菌21CJ28菌株的分离与鉴定

Zobell 2216E培养基：蛋白胨5g，酵母膏1g，磷酸高铁0.01g，琼脂15g，陈海水1000mL，NaOH调pH 7.5。

牛奶平板：10％脱脂奶粉116℃灭菌30min后与2216E培养基按照1:9比例混合，混匀后倒平板。

取潮间带沉积物样品1g在100mL 2216E液体培养基中，25℃，180rpm培养3d。取100μL培养物涂布2216E培养基平板，将平板倒置于25℃培养箱中培养48h，挑选平板上长势良好的菌落在2216E平板上连续划线3次对菌株进行纯化，淘汰传代过程中生长能力弱的菌株。

通过上述的方法筛选获得一株菌株，命名为21CJ28。

将纯化的菌株在牛奶平板上划线，25℃培养48h，牛奶平板上生长出菌落，菌落周围出现透明圈，经测量牛奶平板上的透明圈直径与菌落直径之比为1.5～2.5不等，证明该菌株胞外能分泌蛋白酶。

取1mL 21CJ28的菌液，按照“百泰克细菌基因组提取试剂盒”说明书提取细菌总DNA。

设计16S通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)。以细菌基因组为模板，按照I-5^TM2×High-Fidelity MasterMix(北京擎科生物科技有限公司TP001)说明书中的PCR体系及程序，PCR获得DNA片段。利用DNA胶回收试剂盒(Omega)回收DNA片段，操作按试剂盒说明书进行。回收的PCR产物在铂尚生物技术(上海)有限公司测序。

测序共测得16S rRNA序列全长1455bp。将序列在NCBI数据库中BLAST比对分析:

(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastn&PAGE_TYPE＝ BlastSearch&LINK_LOC＝blasthome)，序列一致性较高的均为交替单胞菌属细菌，最相似序列为Alteromonas sp.RKMC-009全基因组序列中的一段序列(GenBank:CP031010.1，Microbiol Resour Announc 2019,8(25),e00508-19)，序列一致性为97.13％。16S rRNA序列已广泛应用于细菌和古细菌的分类和鉴定，几乎完整的16S rRNA基因序列的比较已被广泛用于建立原核生物菌株之间的分类关系，目前认为98.65％的相似性是划分物种的截断值，即16S rRNA相似性低于98.65％可认定为一个新种(Stackebrandt E,EbersJ.Microbiol Today.2006,4(4):6-9.；Mincheol Kim,Jongsik Chun MethodMicrobiol.2014,41：61-74.)。因此，交替单胞菌21CJ28属于该属的一个新种。将该16SrRNA序列提交NCBI Genbank数据库，编号OR078494.1。

实施例2交替单胞菌P-1菌株的紫外诱变、鉴定与保藏

紫外诱变：

取培养24h的出发菌株(交替单胞菌21CJ28)斜面，用接种环调取1环菌置于含有100ml无菌生理盐水的三角瓶中，180r/min振荡30min，将其稀释至菌浓约1×10⁸个/ml。

打开紫外灯(20W)预热20min。取0.1mL菌悬液放在无菌的培养皿(9cm)中，将培养皿平放在离紫外灯20cm(垂直距离)处的磁力搅拌器上，照射l min后打开培养皿盖，开始照射，与照射处理开始的同时打开磁力搅拌器进行搅拌，即时计算时间，照射时间分别为15s、30s、60s、120s、180s。照射后，诱变菌液在黑暗冷冻中保存1～2h，然后在红灯下稀释涂菌于牛奶平板，25℃培养48h进行初筛。计算不同诱变条件的致死率；观察在菌落周围出现的透明圈大小，并测量其透明圈直径与菌落直径之比，选择其比值大且菌落直径也大的菌落作为复筛菌株。

利用该方法获得突变株P-1，经测量P-1在牛奶平板上的透明圈直径与菌落直径之比为2.5(图1A)。目视观察P-1在2216E平板上的菌落形态为：白色，圆形，表面光滑，边缘整齐，菌体湿润(图1B)，扫描电子显微镜观察P-1菌株形态为：杆状，大小为0.7～1.3μm×1.8～2.5μm(图1C)。

利用实施例1的方法对突变株P-1进行16S rRNA鉴定，结果与交替单胞菌21CJ2816S rRNA序列一致性100％，命名为交替单胞菌P-1。利用Clustalx X1.83软件对序列一致性较高的菌株的16S rRNA进行多重比对，利用MEGA6.0软件的邻接法(Neighbor-JoiningMethod)绘制系统发育树(图2)。由图2知，交替单胞菌P-1与数据库中其他同属来源的细菌的16S rRNA亲缘关系较远，处在一支相对独立的分支上，结合其与其他最相似菌株的序列一致性为97.13％及文献报道，可推测交替单胞菌P-1是交替单胞菌属的一个新种。将该菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号CGMCC No.28095，保藏日期为2023年8月4日。

实施例3交替单胞菌P-1的发酵产酶

发酵培养基：0.5％玉米粉，0.5％豆粕，0.25％麸皮，0.1％ CaCl₂，0.4％ Na₂HPO₄，0.03％ KH₂PO₄，海水配制后用NaOH调pH 7.5。

交替单胞菌P-1的发酵产酶：种子液按照1:50(v/v,ml/ml)接入发酵培养基，在25℃，200rpm培养3d。10,000×g离心10min收集上清即为粗酶液。

按照Folin-酚法测定蛋白酶活力，反应条件为：30℃，10min。将在该反应条件下，每分钟转化1μmol底物的酶量定义为一个酶活力单位(U)(张树政，酶制剂工业(下)[J].1984.)。经测定，1L发酵液可获得粗酶液800U。粗酶液冻干成粉末后保存在-80℃用于后续实验。

实施例4酶解鱼皮胶原蛋白

鱼皮胶原蛋白的提取：一块三文鱼鱼皮被剪碎后用冷蒸馏水清洗5-7次，将鱼皮与蒸馏水按1:10的比例混合(w/v,g/ml)，在75℃下加热30min，在10,000×g下离心10min提取可溶性胶原蛋白。对上清进行透析，透析袋截留分子量8-14k Da。透析完毕后，将蛋白冻干成胶原蛋白固体粉末。

酶解：酶与底物比为1:10(v/w,ml/mg)，酶解温度为45℃，反应时间分别为30、60、90、120、150、180min。在95℃终止反应10min。在10,000×g,4℃离心10min收集水解产物，利用茚三酮显色法分析不同处理时间胶原蛋白的水解程度。

酶解产物分级：利用截留分子量3000Da的超滤管(Amicon Ultra，Millipore,USA)在4500×g下离心60min对酶解产物初步分级。将水解液上清液加入超滤管的上套管中，收集超滤后的截留在膜上的组分(Upper fractiion,UF,分子量>3kDa)、下套管中的馏分(Lower fraction,LF，肽分子量<3kDa)后分别冻干用于酶解产物抗氧化活性的测定。

水解产物抗氧化活性测定：

DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl)是一种稳定的自由基，，可用于测量抗氧化剂的自由基清除活性。测定方法：水解液20μl(100μg/ml)与DPPH溶液(100μl,0.1mM,95％乙醇)混合后，室温静置1h后在517nm测定溶液吸光度。利用蒸馏水代替水解液作为空白对照，200μg/ml维生素C作为阳性对照(Shimada K et al.,J Agric Food Chem,1992,40(6):945-948)。

羟基自由基清除活性(Hydroxy free radical scavenging activity，HRSA)是一种衡量物质抗氧化能力的重要指标。测定方法：FeSO₄溶液(40μl,2mM)、1,10-菲罗啉溶液(40μl,2mM)与水解液(80μl)逐步混合，然后加入40μl H₂O₂(0.03％v/v)，在37℃孵育60分钟后，536nm处测定所得溶液的吸光度。不加水解液的对照组为阴性对照，不含H₂O₂的混合物作为空白(Wang B et al.,Peptides,2012,36:240-250.)。

As，An，Ab分别为样品组、阴性对照组和空白组为536nm处的吸光度值。

利用交替单胞菌P-1的粗酶液酶解得到鲑鱼皮胶原蛋白的水解度，如图3A所示，随着水解时间的延长，释放出的-NH₂在增加，说明随酶解时间的延长，水解度在持续增加；当处理到150min至180min时，水解度没有显著增加，说明水解已接近最大值。

为了验证水解产物中抗氧化成分主要是分子量较大的肽段还是分子量较小的肽段，通过超滤将水解液分成>3kDa(Upper fraction,UF)和<3kDa((Lower fraction,LF)两部分。对不同酶解时间产生的两部分水解产物UF、LF分别测定DPPH自由基清除活力，发现随着产生的肽段的增加，产物的DPPH自由基清除活性均呈现增长趋势，且LF部分表现出更强的DPPH自由基清除活力(图3B)，说明分子量较小的肽段表现出更强的DPPH自由基清除活力。与胶原蛋白大分子相比，酶解产生的小分子肽/低聚肽具有独特的吸收特性、生物活性和低抗原性。

本发明通过酶解的办法获得了抗氧化活性较高的低分子肽段混合物组分。通过比较LF和维生素C的DPPH自由基清除活性(图4A)和羟基自由基清除活性(图4B)，发现LF中抗氧化肽的抗氧化活性与维生素C接近。

我国拥有丰富的海洋资源，开发利用海洋资源是建设海洋强国的需要。鱼类来源的蛋白质和肽类具有组成和结构多样性，显示多种生物活性，其开发与利用一直是基础研究和产业化研发的重点。本发明所保护的交替单胞菌P-1为海洋来源的交替单胞菌属的新种，其产生的胞外蛋白酶可能是具有新型酶学性质和酶解特点的新酶资源。本发明披露了该酶酶解鱼皮胶原蛋白制备抗氧化肽的技术方案和有益成果，酶解产物表现出优异的DPPH自由基清除活性和羟基自由基清除活性。上述为海洋新菌和新酶资源的开发利用及水产加工废弃物的资源化转化、高值化利用奠定了研发基础。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一株海洋来源的交替单胞菌（Ateromonas sp.）P-1，其特征在于：保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号CGMCC No. 28095。

2.利用权利要求1所述海洋来源的交替单胞菌进行发酵产酶的方法，其特征在于：包括如下步骤：将权利要求1所述交替单胞菌P-1接种至发酵培养基中进行发酵培养即得。

3.根据权利要求2所述的发酵产酶的方法，其特征在于：所述发酵培养基中，包括以下组分：0.3%-1%玉米粉，0.4%-1%豆粕，0.2%-0.5%麸皮，0.05%-0.2% CaCl₂，0.3%-0.5%Na₂HPO₄，0.02%-0.05% KH₂PO₄，海水配制后调节pH值至弱碱性。

4.根据权利要求2所述的发酵产酶的方法，其特征在于：所述发酵培养基采用海水配制后调节pH值为7.5。

5.采用权利要求1所述的交替单胞菌制备抗氧化肽的方法，其特征在于：包括如下步骤：将鱼皮剪碎、清洗后，与蒸馏水按比例混合，在70-80℃加热20-40 min，离心得到可溶性胶原蛋白；对上清液进行透析，获得鱼皮胶原蛋白；

将权利要求1所述交替单胞菌P-1接种至发酵培养基中进行发酵培养得到粗酶液；将其与鱼皮胶原蛋白按比例混合后，酶解，即得。

6.根据权利要求5所述的交替单胞菌制备抗氧化肽的方法，其特征在于：鱼皮与蒸馏水的质量比为1:4-12。

7.根据权利要求5所述的交替单胞菌制备抗氧化肽的方法，其特征在于：酶解的温度为40-50℃，酶解时间为30-180 min。

8.根据权利要求5所述的交替单胞菌制备抗氧化肽的方法，其特征在于：还包括采用超滤管对水解产物进行分级的步骤。

9.一种交替单胞菌菌剂，其特征在于：包括权利要求1所述交替单胞菌P-1。