CN111621448A - 一株贝莱斯芽孢杆菌sn-1及其发酵生产胞外多糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株贝莱斯芽孢杆菌SN‑1及其发酵生产胞外多糖的方法，属于微生物学领域。本发明是从东北传统自然发酵豆酱中分离得到，并发现其可以产生具有优良特性的胞外多糖。将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SN‑1接种于含2％蔗糖的LB基础培养基中，在初始培养基pH值为7，温度为37℃，摇床转速100‑200rpm条件下，培养48‑72h，得到发酵液；将粗多糖进行纯化，即得胞外多糖。本发明菌株及发酵生产方法具有产糖周期短、产糖量高、安全无毒副作用，且该胞外多糖具有较高的乳化性和热稳定性，为工业化应用提供了理论基础和依据，具有广泛的商业化应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一株贝莱斯芽孢杆菌SN-1及其发酵生产胞外多糖的方法，属于微生物学领域。
背景技术
胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)是微生物(细菌、酵母、真菌)在其生长代谢过程中分泌到细胞外的黏液多糖或荚膜多糖。随着植物、动物和真菌多糖的研究越来越深入，迫切需要从食用微生物中开发具有新颖特性和高产量的微生物胞外多糖。微生物胞外多糖因具有来源广泛、反应条件温和、易于分离纯化等优点，一直是胞外多糖理论和实践研究中的主要来源。
迄今为止，已经开发出大量微生物来源的商业EPS(葡聚糖，海藻酸盐，黄原胶和结冷胶)作为潜在的生物材料。然而其中一些是从致病菌中提取的，例如由StreptococcusZooepidemics生产的透明质酸和Xantho monascampestris生产的黄原胶，可能使人类存在被细菌内毒素污染的风险。由于胞外多糖具有多种性质并且被广泛的应用，越来越多的研究人员致力于开发具有新颖特性并且高产EPS的微生物。同时，从食用微生物中开发利用食品级EPS已成为工业微生物研究的热点之一。芽孢杆菌胞外多糖已作为稳定剂、生物絮凝剂被用于药品、化妆品等制品的生产中。此外，芽孢杆菌的胞外多糖具有优异的理化特性和生物学特性，如生物乳化剂、重金属螯合剂、抗病毒和免疫调节剂，也可以作为益生元促进肠道内有益菌的生长，调节肠道菌群平衡，促进宿主健康。因此与其他多糖相比，芽孢杆菌胞外多糖的研究更具有实际的应用价值，芽孢杆菌生命力顽强、对培养条件要求较低，它的胞外多糖提取工艺更简单，安全性较高、价格便宜，比其他微生物多糖更适用于人类。已经有大量的研究报道关于自然界中发现的产EPS的乳酸菌菌株，但普遍存在产量不高的问题。因此，充分挖掘自然界中丰富的芽孢杆菌资源，发现高产胞外多糖的细菌菌株，以短周期、低成本获得更多的胞外多糖，一直是微生物学领域的研究热点。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种高产直链甘露糖的菌株及其发酵生产方法。
本发明提供了一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SN-1，于2020年06月08日保藏至中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.1.18401。
一种高产直链甘露糖菌株，其为贝雷斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SN-1是从东北传统自然发酵豆酱中分离得到，并发现其可以产生具有优良特性的胞外多糖。经形态学和生理生化实验证明该菌为贝莱斯芽孢杆菌，并将其命名为贝莱斯芽孢杆菌SN-1(Bacillus velezensis SN-1)，已于2020年06月08日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.1.18401。
为了进一步验证该菌株的种属进而研究该菌株所产胞外多糖的结构和性质，进行了16s rDNA序列分析(SEQ ID NO.2：上游引物8F:5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3；SEQ IDNO.3：下游引物1492：5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3)；该菌株经16s rDNA基因测序的结果见序列表SEQ ID NO.1。
一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SN-1发酵生产胞外多糖的方法，包括以下步骤：
(1)将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SN-1接种于含糖的LB液体培养基中培养一段时间，得到发酵液；
(2)将发酵液进行离心，去除菌体，取上清；
(3)将离心去除菌体后的上清采用乙醇沉淀法沉淀、静置，离心，取沉淀，沉淀物溶于水后，采用savage法去除蛋白质，透析后得粗多糖水溶液；
(4)将粗多糖水溶液进行纯化，得到纯胞外多糖。
进一步地，上述技术方案中，步骤(1)中LB液体培养基中含糖量为2-5wt％；所述的糖包括蔗糖、葡萄糖或麦芽糖。
进一步地，上述技术方案中，步骤(1)中贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SN-1接种量为5％-10％(v/v)。
进一步地，上述技术方案中，步骤(1)中所述含糖的LB液体培养基的pH值为6-8，培养条件为：温度为25-37℃，摇床转速100-200rpm条件下，培养48-72h。
进一步地，上述技术方案中，步骤(2)所述离心温度为4-30℃，离心转速为10000-12000rpm，离心时间为15-20min。
进一步地，上述技术方案中，步骤(3)所述乙醇的体积百分比浓度为95-100％，所述乙醇沉淀法中乙醇体积是上清液体积的3-5倍；静置的温度为4-8℃，静置时间为12-14h；离心的条件为：4-8℃，10000-12000rpm离心20-40min。
进一步地，上述技术方案中，步骤(3)所述透析的截留分子量为14000Da，透析的条件为：4-8℃蒸馏水透析2-3d，每5-8h换一次蒸馏水。
进一步地，上述技术方案中，步骤(4)所述的纯化为采用凝胶过滤层析法对粗多糖进行纯化。
进一步地，上述技术方案中，所述胞外多糖为由α-(1→4)糖苷键连接的直链甘露糖。
通过傅里叶红外光谱(FT-IR)、高效液相色谱(HPLC)、凝胶渗透色谱(GPC)和核磁共振技术。对本发明产生的胞外多糖进行了结构分析，结果显示：本发明胞外多糖只含有一种糖单元，是一种主要由α-(1→4)糖苷键连接的甘露糖，不含有支链。基于热重分析(TG)和理化性质的研究证明本发明胞外多糖具有较高的乳化性和热稳定性，耐热性强(降解温度为270.7℃)。
本发明的有益效果为：本发明通过系列生物化学技术获得菌株发酵产物胞外多糖，采用现代提取技术对发酵液提取纯化获得高纯度多糖。经过系列实验验证，说明所获的菌株具有芽孢菌属的特性，在底物蔗糖的诱导下，可以产生大量胞外多糖。目前微生物EPS产量约为4.5g/L，本发明中贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SN-1EPS产量可达12.7g/L，相比于其他微生物EPS提高了2.82倍。因此，贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)SN-1在产糖发酵培养基中发酵而得的发酵液中，含有胞外多糖，具有产糖周期短、产糖量高、安全无毒副作用，且该胞外多糖具有较高的乳化性和热稳定性，为工业化应用提供了理论基础和依据，具有广泛的商业化应用前景。
附图说明
图1是贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SN-1菌落形态(A)和细胞个体形态(B)。
图2是贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SN-1基于16S rDNA基因序列的系统进化树。
图3是贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SN-1产胞外多糖的DEAE-52阴离子交换柱层析图(A)和G-100凝胶柱层析图(B)。
图4是贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SN-1产纯胞外多糖的紫外光谱图。
图5是贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SN-1产纯胞外多糖的高效液相色谱图(B)和单糖标品高效液相色谱图(A)。
图6是贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SN-1产纯胞外多糖的红外光谱图。
图7是贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SN-1产纯胞外多糖的扫描电镜图，标尺:100μm(A)；标尺:10μm(B)。
图8是贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SN-1产纯胞外多糖的1H NMR谱图(A)和13C NMR(B)。
图9是贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SN-1产纯胞外多糖的热失重谱图。
具体实施方式
下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SN-1的分离筛选
(1)培养基
LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，KH2PO4 1.6g，K2HPO4 2g，MgSO4·7H2O0.25g，CaSO4·2H2O 1g，FeCl3 2g，蒸馏水1000mL，pH值7.0，115℃灭菌20min。
LB固体琼脂培养基：LB液体培养基中加15～20g琼脂粉，115℃灭菌20min。
LB产糖发酵液体培养基：蔗糖50g，胰蛋白胨10g，酵母粉5g，KH2PO4 1.6g，K2HPO42g，MgSO4·7H2O 0.25g，CaSO4·2H2O 1g，FeCl3 2g，蒸馏水1000mL，pH值7.0，115℃灭菌20min。
(2)样品预处理
称取东北自然发酵农家酱1g(所述东北自然发酵农家酱是将黄豆清洗蒸煮熟后，粉碎并制成酱块，于阴凉透风处自然发酵，发酵后清洗去除酱块表面的菌毛，破碎为小块后于太阳下暴晒，然后放入酱缸中，加入凉水和食用碘盐，密封，置于阳光充足处自然发酵。本发明所述东北自然发酵农家酱可采用上述方式制备，但不局限于该方法)加入装有9mL的无菌生理盐水中，震荡混匀，80℃水浴20min。从上述处理中取适量溶液制成10-1浓度的样品液，后逐级稀释到10-2、10-3静置备用。
(3)产粘菌落初筛
取上述各稀释度的菌液100μL涂布于LB固体琼脂培养基平板中，于37℃恒温培养箱中倒置培养24-48h。挑取平板上产粘的菌落区域，于LB固体琼脂培养基平板上反复划线，得到纯培养物的平板置于4℃冰箱保存。
(4)菌株复筛
将从平板上得到的纯培养物接种到LB液体培养基中培养18h，再按2％(v/v)的接种量接种到LB产糖发酵液体培养基中，于37℃培养48h。取发酵液于90℃水浴中加热10min，除去菌液中可能降解多糖的酶，冷却到室温。向发酵液中加入80％三氯乙酸(TCA)溶液至终浓度为5％(m/v)，室温下搅拌2h，10000×g，4℃离心20min，去除细胞和蛋白沉淀。上清液装入透析袋中(截留分子量14000Da)，4℃冰箱中超纯水透析2d，每8h换一次水。定容后，测定菌株产胞外多糖的产量。结合产粘菌落的粘液浓度，选取多糖产量较高的菌株。
实施例2贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SN-1的鉴定
(1)SN-1菌株的形态学鉴定
将SN-1菌株接种到LB平板上三区划线，37℃培养24-48h后，观察记录菌株在平板上的单菌落特征。SN-1菌落形态如图1A所示，菌落形态学观察结果汇总如表1所示。用接种针挑取少量新鲜菌体涂布在干净玻片上进行革兰氏染色，然后在显微镜下观察细胞个体形态及排列方式(图1B)。
表1 SN-1菌株的形态学观察结果汇总
(2)SN-1菌株的生理生化鉴定
①接触酶试验：挑选革兰氏染色结果为阳性的菌株少量划线接种于LB固体培养基平板上，37℃培养24h，滴加质量分数为10％的H2O2，观察菌落上气泡产生情况，产气泡则为接触酶阳性。结果如表2所示，SN-1菌株的接触酶反应为阴性。
②葡萄糖产酸、产气试验：在葡萄糖液体发酵培养基(蛋白胨2.7g，氯化钠5.0g，0.2％溴麝香酚兰0.03g，琼脂3g，KH2PO4 0.3g，葡萄糖10.0g，水1000mL)中加入溴甲酚紫指示剂和倒置的杜氏小管，培养基中按1％(v/v)接种量接入SN-1菌株，轻缓摇动试管，使其均匀，防止倒置的小管进入气泡。37℃培养48h后，观察结果，培养基中的指示剂颜色由紫变黄表示SN-1能利用葡萄糖产酸，若还是呈紫色则表示不产酸，杜氏小管中如果有气泡产生则表示SN-1菌株能利用葡萄糖产气。结果如表2所示，结果表明，SN-1菌株能利用葡萄糖产酸和产气。
③产H2S试验：用接种针将SN-1菌株穿刺接入醋酸铅培养基(蛋白胨10.0g/L，牛肉浸粉3.0g/L，氯化钠5.0g/L，硫代硫酸钠2.5g/L，琼脂12.0g/L，PH：7.3±0.1(25℃))中，置于37℃培养48h，观察有无黑色硫化铅的产生。结果如表2所示，结果表明，SN-1菌株不能产H2S。
④淀粉水解试验：将SN-1菌株画线接种于淀粉培养基(牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，氯化钠0.5g，可溶性淀粉0.2g，水100mL，pH 7.0～7.2，琼脂2g，灭菌115℃，0.1Mpa，20min)，将平板置于37℃温箱中培养24h。观察菌株生长情况，后滴入少量卢戈氏碘液于平板上，菌落周围出现无色透明圈说明淀粉被完全水解，菌株具备分解淀粉的能力。结果如表2所示。
⑤产生吲哚实验：将SN-1菌株接种至蛋白胨水培养基(蛋白胨1g，氯化钠0.5g，水加至100mL，PH调至7.8)中，37℃下在培养液中加入乙醚1-2mL，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入5-10滴吲哚试剂，如有吲哚存在，乙醚层呈现玫瑰红色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应。结果如表2所示。
⑥明胶液化试验：取明胶培养基试管(NaCl 5g，蛋白胨10g，牛肉膏3g，明胶120g，蒸馏水1000mL，pH 7.2～7.4)，用接种针穿刺接种SN-1菌株，将接种后试管置于20℃中培养3-5天，观察明胶液化情况。结果如表2所示。
⑦运动性：利用悬滴法，将一滴菌悬液悬浮于凹槽载玻片的盖玻片上，后通过普通显微镜在弱光线下观察其运动性。结果如表2所示。
表2 SN-1菌株的生理生化鉴定结果
注：“+”表示阳性反应；“－”表示阴性反应。
⑧糖发酵试验：将LB产糖发酵液体培养基中的葡萄糖分别换成蔗糖、L-阿拉伯糖、果糖、半乳糖、乳糖、甘露糖、麦芽糖、鼠李糖配制不同糖类培养基，加入溴甲酚紫指示剂，接入1％(v/v)SN-1菌株并标记，空白对照不接种。37℃培养48h后，观察结果，若培养基中指示剂变成黄色，表明SN-1菌株能利用该糖产酸，为阳性反应。试验结果如表3所示，试验表明，SN-1菌株能利用蔗糖、甘露糖、麦芽糖和鼠李糖产酸。
表3 SN-1菌株糖发酵试验结果
注：“+”表示阳性反应；“－”表示阴性反应。
(3)SN-1菌株的16S rDNA序列分析
①细菌基因组DNA的提取
吸取100μL SN-1菌株菌悬液于灭菌后的LB液体培养基中，在37℃振荡培养箱中培养24h。按照细菌基因组试剂盒(Solarbio D1600)上的操作步骤提取SN-1 4-3的基因组DNA。
②PCR扩增
设计的PCR引物为：
SEQ ID NO.2：上游引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
SEQ ID NO.3：下游引物1492R：5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’，引物由上海派森诺生物工程公司合成并送货。
PCR反应条件为：95℃预热5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，循环35次，72℃保持7min，4℃保温。
③PCR产物的回收
PCR产物用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(Boyao ASJ0013)回收，具体操作按试剂盒说明书进行。
④16S rDNA测序及序列比对
阳性PCR产物送样至上海派森诺进行测序，将测序结果在NCBI数据库中应用BLAST工具与GenBank数据库已有序列进行比对分析，分析待测菌株与已知菌株相应序列的同源性，确定筛选出来的产糖菌株种属。SN-1菌株基于16S rDNA基因序列的系统进化树如图2所示。
结合SN-1菌株的形态学、生理生化性状以及16S rDNA序列同源性比对结果，确认SN-1为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。
所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)。贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SN-1的菌种保藏号为CGMCC No.1.18401，保藏日期为2020年06月08日，分类命名为莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，菌株名称为SN-1。
实施例3贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SN-1菌株发酵产胞外多糖的发酵工艺
本实施例一种莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SN-1菌株发酵高产胞外多糖菌株的发酵工艺，按以下步骤进行：
(1)制备种子液
将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SN-1接种于LB液体培养基中，使培养基中初始细胞浓度为1.0×108CFU/mL，即为种子液。
(2)产糖发酵条件
将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SN-1以0.5％(V/V)的接种量，接种于初始pH值为7的LB产糖发酵液体培养基中，在37℃的温度下恒温100rpm振荡培养36-72h，利用苯酚硫酸法测定发酵上清液中多糖含量。
将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SN-1以0.5％(V/V)的接种量，接种于初始pH值为7的LB产糖发酵液体培养基中，在温度为37℃、摇床转速100rpm条件下，培养48h，得到发酵液，将发酵液4℃，10000rpm离心20min，除去菌体。上清液加入3倍体积的预冷95％乙醇，4℃孵化过夜以沉淀多糖。4℃，10000rpm离心20min收集多糖沉淀，用超纯水溶解多糖沉淀，加入与溶解多糖所用的超纯水等体积10％三氯乙酸溶液除去蛋白，4℃静置10h，4℃，10000rpm离心20min收集上清液。加入3倍体积的预冷95％乙醇，4℃孵化过夜以沉淀多糖。4℃，10000rpm离心20min收集多糖沉淀，重溶于超纯水中(大约200mL)，装入透析袋(截留分子量14000Da)中，4℃蒸馏水透析2d，每8h换一次水。，冻干获得胞外多糖。本实施例获得的发酵液中获得胞外多糖的含量为12.7g/L。
实施例4贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SN-1菌株发酵产胞外多糖的分离纯化工艺
(1)粗胞外多糖制备
将活化好的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SN-1菌液按6％(v/v)的接种量接种到LB产糖发酵液体培养基中，37℃，120rpm培养48h得到胞外多糖发酵液。将1000mL发酵液于4℃，10000rpm离心20min，除去菌体。上清液加入3倍体积的预冷95％乙醇，4℃孵化过夜以沉淀多糖。4℃，10000rpm离心20min收集多糖沉淀，将得到的沉淀用蒸馏水溶解后，利用savage法去除蛋白(利用蛋白质在三氯乙烷等有机溶剂中变性的特点，将提取液与Sevage试剂[氯仿：正丁醇＝5：1(V/V)]5：1混合，振荡，离心，变性后的蛋白质介于提取液与Sevage试剂交界处)后，装入透析袋(截留分子量14000Da)中，4℃蒸馏水透析2d，每8h换一次水。最终得到粗多糖的水溶液，冻干保存。
(2)多糖纯化
取上述粗多糖的水溶液直接或先适度稀释后进行凝胶过滤层析，合并收集管多糖溶液，冷冻干燥24h，得到纯胞外多糖，利用苯酚硫酸法测得纯化胞外多糖含量为73.75％。如图3所示，为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SN-1菌株产胞外多糖凝胶过滤层析图谱。首先通过DEAE-52阴离子交换柱进行纯化(图3A)。洗脱了两个峰。第一个峰很强，表明存在大部分EPS。对第一个峰EPS进行合并，透析，冷冻干燥并在G-100凝胶柱层柱进一步纯化。最终获得纯化均一多糖组分(图3B)。
(3)胞外多糖纯度鉴定
紫外-可见光谱法纯度分析：
准确称取纯胞外多糖5mg，溶于10mL超纯水中，制成0.5mg/mL的多糖溶液，用紫外可见光谱仪于200-400nm波段进行紫外扫描，检测多糖纯度。结果如图4所示。紫外光谱显示胞外多糖除蛋白后在低于190nm处显示出较低的吸光度。而氨基酸通常在200-280nm范围内显示吸光度。说明所提胞外多糖成分均一且无蛋白质所污染。
(4)胞外多糖结构鉴定
高效液相色谱单糖组成分析：利用K-501高效液相色谱、KS-805Shodex糖柱和示差检测器对在柱温60℃、流速1.0mL/min、0.1mol/L、NaNO3作流动相、样品质量浓度5.0mg/mL、进样量10μL的条件下检测。结果与单糖标品(图5A)比对显示EPS(图5B)主要由甘露糖组成。
红外光谱法结构分析：如图6所示，使用傅里叶红外光谱仪在800-4000cm-1光谱范围内扫描EPS样品。结果显示，吸收峰在3387.19cm-1、2928.24cm-1、1640cm-1、1400.91cm-1和1023.07cm-1处分别对应于O-H、C-H、C-O、C-H和C-O-C结构，从而证实了EPS中碳水化合物的存在。
核磁共振法结构分析：将干燥的胞外多糖样品以10mg/mL的浓度溶解在D2O中，使用Ascend 500仪器进行1H和13C核磁共振(NMR)分析。通过1H谱可以推断出胞外多糖含有α-糖苷键(图8A)。通过13C谱可以推断出胞外多糖是具有→4-Man-1→残基分支结构的多糖(图8B)。
纯化胞外多糖扫描电镜如图7所示，结果表明EPS具备多糖的不规则结构，且表面光滑有利于生物膜的形成，而表面均一的EPS聚合物可赋予生物膜机械稳定性。
热失重分析(TG)法：将3mg EPS加入Al2O3测试盒中，一并置入热分析仪，并以10℃/min的速率在25-700℃的范围内进行加热。结果显示EPS具有较高的热稳定性，耐热性强(图9)。综上，通过傅里叶红外光谱(FT-IR)、高效液相色谱(HPLC)、凝胶渗透色谱(GPC)和核磁共振技术。对本发明产生的胞外多糖进行了结构分析，结果显示：本发明胞外多糖只含有一种糖单元，是一种主要由α-(1→4)糖苷键连接的甘露糖，不含有支链。无蛋白及核酸污染，纯度达94.04％。基于热失重分析(TG)的研究发现胞外多糖具有较高热稳定性，耐热性强。
SEQUENCE LISTING
<110> 沈阳农业大学
<120> 一株贝莱斯芽孢杆菌SN-1及其发酵生产胞外多糖的方法
<130> 2020
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1467
<212> DNA
<213> 贝莱斯芽孢杆菌SN-1 (Bacillus velezensis SN-1)
<400> 1
ccttcggcgg ctggctccta aaggttacct caccgacttc gggtgttaca aactctcgtg 60
gggtgacggg cggggtgtac aaggcccggg aacgtattca ccgcggcatg ctgatccgcg 120
attactagcg attccagctt cacgcagtca agttgcaaac tgcgatccga actgaaaaca 180
gatttgtggg attggcttaa cctcgcggtt tcgctgccct ttgttctgtc cattgtagca 240
cgtgtgtagc ccaggtcata aggggcatga tgatttgacg tcatccccac cttcctccgg 300
tttgtcaccg gcagtcacct taaagtgccc aactgaatgc tggcaactaa aatcaagggt 360
tgcgctcgtt gcggaactta acccaacatc tcacgacacg agctgacaac aaccatgcac 420
cacctgtcac tctgcccccg aaggggacgt cctatctcta ggattgtcaa aggatgtcaa 480
gacctggtaa ggttcttcgc gttgcttcaa attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg 540
gcccccgtca attcctttga gtttcagtct tgcgaccgta ctccccaggc ggagtgctta 600
atgcgttagc tgcagcacta aggggcggaa accccctaac acttagcact catcgtttac 660
ggcgtggact accagggtat ctaatcctgt tcgctcccca cgctttcgct cctcagcgtc 720
agttacagac cagagagtcg ccttcgccac tggtgttcct ccacatctct acgcatttca 780
ccgctacacg tggaattcca ctctcctctt ctgcactcaa gttccccagt ttccaatgac 840
cctccccggt tgagccgggg gctttcacat cagacttaag aaaccgcctg cgagcccttt 900
acgcccaata attccggaca acgcttgcca cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta 960
gttagccgtg gctttctggt taggtaccgt caaggtgccg ccctatttga acggcacttg 1020
ttcttcccta acaacagagc tttacgatcc gaaaaccttc atcactcacg cggcgttgct 1080
ccgtcagact ttcgtccatt gcggaagatt ccctactgct gcctcccgta ggagtctggg 1140
ccgtgtctca gtcccagtgt ggccgatcac cctctcaggt cggctacgca tcgtcgcctt 1200
ggtgagccgt tacctcacca actagctaat gcgccgcggg tccatctgta agtggtagcc 1260
gaagccacct tttatgtctg aaccatgcgg ttcaaacaac catccggtat tagccccggt 1320
ttcccggagt tatcccagtc ttacaggcag gttacccacg tgttactcac ccgtccgccg 1380
ctaacatcag ggagcaagct cccatctgtc cgctcgactt gcatgtatta agcacgccgc 1440
cagcgttcgt cctgagccag gatcaaa 1467
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 3
ctacggctac cttgttacga 20
Claims (10)
1.贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SN-1，于2020年06月08日保藏至中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.1.18401。
2.一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SN-1发酵生产胞外多糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SN-1接种于含糖的LB液体培养基中培养一段时间，得到发酵液；
(2)将发酵液进行离心，去除菌体，取上清；
(3)将离心去除菌体后的上清采用乙醇沉淀法沉淀、静置，离心，取沉淀，沉淀物溶于水后，采用savage法去除蛋白质，透析后得粗多糖水溶液；
(4)将粗多糖水溶液进行纯化，得到纯胞外多糖。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中LB液体培养基中含糖量为2-5wt％；所述的糖包括蔗糖、葡萄糖或麦芽糖。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)SN-1接种量为5-10％(v/v)。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述含糖的LB液体培养基的pH值为6-8，培养条件为：温度为25-37℃，摇床转速100-200rpm条件下，培养48-72h。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述离心温度为4-30℃，离心转速为10000-12000rpm，离心时间为15-20min。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述乙醇的体积百分比浓度为95-100％，所述乙醇沉淀法中乙醇体积是上清液体积的3-5倍；静置的温度为4-8℃，静置时间为12-24h；离心的条件为：4-8℃，10000-12000rpm离心20-40min。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述透析的截留分子量为14000Da，透析的条件为：4-8℃蒸馏水透析2-3d，每5-8h换一次蒸馏水。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述的纯化为采用凝胶过滤层析法对粗多糖进行纯化。
10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述胞外多糖为由α-(1→4)糖苷键连接的直链甘露糖。
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