CN103421718A - 一种少动鞘氨醇单胞菌菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种少动鞘氨醇单胞菌菌株及其应用，该少动鞘氨醇单胞菌菌株命名为少动鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas paucimobilis）QHZJUJW，保藏号为CGMCC No.7783。本发明的少动鞘氨醇单胞菌菌株是从青藏高原的野生微孔草种籽内分离筛选得到的内生菌，能用于结冷胶的工业化生产，为内生菌工业化生产结冷胶提供了新途径。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种少动鞘氨醇单胞菌菌株及其应用。
背景技术
微生物多糖一般无毒、无害、可降解、对环境无污染，与植物多糖和动物多糖相比，有生长周期短，不受季节、气候和地理条件影响等优势。由于其种类繁多、结构各异，具有独特多样的理化性质，被用于食品、医药、日用轻化、石油等工业的需求。目前微生物多糖的研究越来越受到关注，而细菌多糖的研究也日益扩大。为了提高微生物多糖的生产发酵能力，越来越多的微生物多糖如黄原胶、结冷胶、曲霉胶、α-葡聚糖和环状糊精等已被开发利用。其中结冷胶于1978年由美国斯比·凯可(CP-Kelco)公司首次发现而开发的一种微生物食用胶；1992年便获得了美国FDA安全认证，1994年又被欧共体正式列入食品安全代码表中。1988年，日本政府就批准其作为食品添加剂使用，而我国是在1996年批准其作为添加剂可以适量添加食用。
结冷胶(Gellan Gum)最初是由伊乐假单胞杆菌(Pseudomonas elodea)在中性条件下，以葡萄糖为碳源，有机氮或硝酸铵为氮源及一些无机盐所组成的培养基中，经有氧发酵而产生的细胞胞外多糖胶质。结冷胶较同类产品来说，具有很多优点如用量少，凝结度高，形成的凝胶透明度和强度高，呈味性能优越，性能稳定，热稳定性好且耐酸耐酶等，广泛应用于化工、轻工日用、食品、医药及造纸等多个领域。具有广阔的应用领域和较好的市场前景。结冷胶食用安全无毒，易溶于水，是一种新型的全透明的凝胶剂，在食品领域主要用作多功能胶凝剂、增稠剂、凝结剂、乳化剂、悬浮剂和成膜剂等，已经应用的食品如饮料、布丁、果冻、乳制品、果酱制品、面包填料、糖果、糖衣、调味料等。作为一种新型的食品添加剂，结冷胶有极高的商业开发价值和市场前景，目前结冷胶年需求增长率在30％以上，是继黄原胶开发以来美国斯比·凯可(CP-Kelco)公司另一重点开发的微生物多糖。除了凯可(Kelco)公司具有较大的生产能力外(年产500吨)，我国生产结冷胶的企业少，且有生产能力不足，产品得率低，生产成本高等问题，难以满足我国对结冷胶的日益增长的需求量。基于其广阔的应用前景，结冷胶的微生物发酵也越来越受到人们关注。因此，加大对结冷胶发酵生产等方面的研究显得尤为重要。
结冷胶是一种高分子线性阴离子多糖，由4个单糖分子组成的基本单元重复聚合而成。单糖组成是β(1→3)-D-葡萄糖、β(1→4)-D-葡萄糖醛酸、β(1→4)-D-葡萄糖和α(1→4)-L-鼠李糖。按摩尔比2∶1∶1组成。结冷胶分为高酰基结冷胶和低酰基结冷胶。高酰基结冷胶(天然结冷胶)的碳骨架上连接有O-酰基(包括甘油酰基和乙酰基)侧链基团，可形成高弹性低硬度凝胶。天然结冷胶在经碱处理可脱除酰基后生成低酞基结冷胶，大多数商品结冷胶均为低酰基结冷胶。
目前研究高产结冷胶最多的方法就是通过筛选获得高产菌株，同时优化发酵培养基和发酵条件，这也是提高结冷胶产量的前提保证。目前国际上，研究生产结冷胶菌株主要是Sphingomonas paucimobilis(ATCC31461)(Bajaj IB，West TP，et al.)，该菌株的最高结冷胶产量可达35.7g/L(BajajIB，et al.2006)。另外还有Sphingomonas paucimobilis-GS1(NampoothiriKM，et al.1995)、Sphingomonas paucimobilis NK2000(Jin H，et al.2003)等；而国内公开报道的结冷胶生产菌株主要有：少动鞘脂单胞菌S1(彭志英等，2000)；少动鞘脂单胞菌G1(李海军等，2007)；少动鞘脂单胞菌G3.1(杨冬月等，2011)；少动鞘脂单胞菌ZJU311(徐晓琴等，2011)等。目前围绕产结冷胶的微生物菌株报道较多，但从植物组织中分离获得能产结冷胶的内生菌菌株几乎未见报道。为此，对于结冷胶的研究，除了生产上的限制因素，还需获得更多新型的符合生产需求的结冷胶生产菌株资源。
发明内容
本发明提供了一种少动鞘氨醇单胞菌菌株，是能用于结冷胶工业化生产的内生菌。
一种少动鞘氨醇单胞菌菌株，分类命名为少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)，完整命名为少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)QHZJUJW，该菌株已于2013年6月13日保藏在位于北京市朝阳区北辰两路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC No.7783。
少动鞘氨醇单胞菌QHZJUJW是从青藏高原的野生微孔草种籽内分离筛选得到的内生菌。该菌株的主要形态及生物学特征如下：淡黄色、圆形菌落，表面光滑，革兰氏阴性短杆菌，0.5-1.0um×1.5-2.5um；无荚膜、无芽孢，未见鞭毛；接触酶阳性；氧化酶阳性；42℃不生长。通过对该菌株进行生理生化特性测定和16S rRNA测定及系统发育分析，最终鉴定其为少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)的一个菌株。
本发明提供了上述少动鞘氨醇单胞菌QHZJUJW在生产结冷胶中的应用。该菌株通过合适的培养方法和培养条件进行发酵，能够高产结冷胶。
本发明还提供了一种生产结冷胶的方法，包括：
(1)将经活化的少动鞘氨醇单胞菌QHZJUJW接入种子培养液中进行培养，得到种子液；
(2)将种子液接入发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵液；
(3)从发酵液中提取得到结冷胶。
步骤(1)中，所述的活化为：将少动鞘氨醇单胞菌QHZJUJW接种到活化培养基中，于26-30℃培养24-72h。
所述的活化培养基为LB培养基或YPD培养基；优选为YPD培养基。以重量百分比计，所述的YPD培养基包括以下原料：酵母浸粉1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，琼脂粉2％；YPD培养基的pH为7.2。
以重量百分比计，所述的种子培养液包括以下原料：蔗糖0.5-1.5％，酵母膏0.1-0.3％，牛肉膏0.2-0.3％，蛋白胨0.3-0.5％，NaCl 0.4-0.6％；种子培养液的pH为7.0-7.2。优选地，所述的种子培养液包括以下原料：蔗糖0.5％，酵母膏0.1％，牛肉膏0.3％，蛋白胨0.5％，NaCl 0.5％；种子培养液的pH为7.2。
所述种子液的培养条件为培养温度29-31℃，培养时间16-28h，根据少动鞘氨醇单胞菌QHZJUJW在营养肉汤培养基中的生长曲线，可以知道该菌在14h以后达到生长稳定期，为此，种子液选择在16-28小时接种比较适合。优选地，培养温度30℃，培养时间20-24h。
所述种子液的培养为摇床振荡培养，摇床转速为160-220r/min。
步骤(2)中，所述种子液的接种量以体积百分比计为5-10％；优选为8％。
以重量百分比计，所述的发酵培养基包括以下原料：酵母膏0.1-0.2％，牛肉膏0.25-0.35％，蛋白胨0.35-0.5％，NaCl 0.4-0.6％，蔗糖0.4-0.6％；发酵培养基的pH为7.0-7.2；
或者，所述的发酵培养基包括以下原料：蛋白胨0.3-0.5％，NaCl0.4-0.6％，蔗糖3-5％；发酵培养基的pH为7.0-7.2；
或者，所述的发酵培养基包括以下原料：蛋白陈0.3-0.5％，蔗糖4-6％，硫酸镁0.25-0.35％，磷酸二氢钾0.6-0.9％，磷酸氢二钠0.4-0.6％，硫酸钾0.2-0.4％；发酵培养基的pH为7.0-7.2。
所述发酵培养的培养温度为29-31℃，培养时间为48-72h；优选地，培养温度为30℃，培养时间为72h，发酵效果最好，能生产出更多的结冷胶。
所述的发酵培养为摇床振荡培养，摇床转速为160-250r/min。
步骤(3)中，发酵培养完成后，结冷胶存在于发酵液中，通过合适的提取方法可以将其制备出来。
所述的提取包括：将发酵液在90-95℃加热10min，用KOH或NaOH调pH至10，在80℃下放置10min，用50％的三氯乙酸(TAC)调pH至7.15，静置，离心，收集上清液，向上清液内加入3倍体积的95％的冰乙醇，在4℃静置6h使结冷胶充分沉淀；接着将静置后的溶液离心，收集沉淀物，用乙醇冲洗脱色2-3次，于60℃下恒温烘干至恒重，得到结冷胶。
本发明提供的少动鞘氨醇单胞菌菌株QHZJUJW是从植物中分离得到的，是一种内生菌，能够用于制备结冷胶，增加了结冷胶生产菌株特别是内生菌株的来源；同时，利用该少动鞘氨醇单胞菌菌株制备结冷胶，结冷胶的产量达到15-21g/L，符合工业化生产需求，提供了采用内生菌进行工业化生产结冷胶的新途径。
附图说明
图1为少动鞘氨醇单胞菌QHZJUJW在营养肉汤培养基上培养48h的菌落形态；
图2为少动鞘氨醇单胞菌QHZJUJW的革兰氏染色的显微图片；
图3为少动鞘氨醇单胞菌QHZJUJW的分子鉴定进化树；
图4为少动鞘氨醇单胞菌QHZJUJW在营养肉汤培养基中的生长曲线。
具体实施方式
实施例1菌株的分离、纯化、鉴定和保藏
1、菌株的分离、纯化
采用内生菌分离方法从青藏高原的野生微孔草种籽内分离并筛选得到一株内生菌。具体为：以从青海高原野外采摘的微孔草种籽作为分离原料，将原料进行清洗，磨碎至60目大小，进行无菌处理(酒精处理1分钟，然后3.5％次氯酸钠消毒5分钟，然后消毒酒精处理1分钟，无菌水洗涤两次)，最后进行分离接种，每个培养皿至少重复3块，放置在25-28℃培养箱培养。待培养基中长出肉眼可见的菌落，采用接种方法接种到LB肉汤平板上进行自然纯化分离，并对目标菌种进行保存。
2、菌株的鉴定
(1)生理生化特性鉴定：将获得的菌株按《伯杰氏细菌鉴定手册(第8版)》中规定的方法进行生理生化特性的测定，得到该菌株的主要形态及生物学特征如下：淡黄色、圆形菌落，表面光滑，革兰氏阴性短杆菌，0.5-1.0um×1.5-2.5um；无荚膜、无芽孢，未见鞭毛；接触酶阳性；氧化酶阳性；42℃不生长。其具体生理生化鉴定见表1。该菌株在营养肉汤培养基上培养48h的菌落形态如图1所示；革兰氏染色的显微图片如图2所示。
表1菌株生化试验结果
注：+表明发酵利用，-表不发酵不利用
(2)菌株的序列测定：用PCR扩增产物进行切胶纯化测序，将测序结果与所有已知的16SrDNA序列进行最大同源性比较，发现该菌与已知的少动鞘氨醇单胞菌上的16SrDNA具有很高的同源性，与Pseudomonas sp.WB4.4-63的同源性达到99％，该菌株的分子鉴定进化树见图3。结合该细菌的培养特征、细胞形态及典型的生理生化特征，确定该内生菌菌株为少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)，命名为少动鞘氨醇单胞菌QHZJUJW。
(3)根据少动鞘氨醇单胞菌QHZJUJW在营养肉汤培养基中的生长曲线(见图4)，可以知道该菌在14小时以后达到生长稳定期，为此，种子培养基选择在16-28小时接种比较适合。
3、菌株的保藏
将少动鞘氨醇单胞菌QHZJUJW保藏在位于北京市朝阳区北辰两路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏日期为2013年6月13日，保藏号为CGMCC No.7783。
实施例2少动鞘氨醇单胞菌QHZJUJW发酵制备结冷胶
(1)菌株的活化：用接种环将少动鞘氨醇单胞菌QHZJUJW划线接种于活化培养基上，并于恒温培养箱中培养24-72h，培养温度设定为28±2℃；其中，活化培养基为YP或LB培养基，YPD包括以下原料(以重量百分比计)：Yeast Extract(酵母浸粉)1％，Peptone(蛋白胨)2％，Dextrose(glucose)(葡萄糖)2％，琼脂粉2％，蒸馏水配制，pH7.2；LB包括以下原料(以重量百分比计)：Yeast Extract(酵母浸粉)0.5％，Tryptone(胰蛋白胨)1％，NaCl(氯化钠)1％，琼脂粉2％，蒸馏水配制，pH7.2；
(2)种子液的制备：将步骤(1)培养获得的少动鞘氨醇单胞菌QHZJUJW的单菌落接种于50ml的种子培养液中，并将其置于恒温摇床中振荡培养24h，温度30±1℃，转速200r/min；其中，种子培养液包括以下原料(以重量百分比计)：蔗糖0.5％，酵母膏0.1％，牛肉膏0.3％，蛋白胨0.5％，NaCl0.5％，蒸馏水配制，pH7.2。
(3)发酵液的制备：以体积百分比为10％的接种量将步骤(2)所获得的种子液转入已消毒灭菌的发酵培养基中，发酵培养48h，温度30±1℃，转速200r/min，获得所需的发酵液，收集备用，测粗胶产量；其中，发酵培养基包括以下原料(以重量百分比计)：酵母膏0.1％，牛肉膏0.3％，蛋白胨0.5％，NaCl0.5％，蔗糖0.5％，蒸馏水配制，调pH至7.2，121℃湿热灭菌20min。
(4)结冷胶的提取：将步骤(3)中收集到的发酵液在90-95℃加热10min，用1N KOH调pH至10，在80℃下放置10min，用50％的三氯乙酸(TAC)调pH至7.15，在25℃放置20min，置于转速为7000r/min的条件下离心30min，收集上清液，向该上清液内加入3倍体积的95％的冰乙醇，在4℃静置6h使结冷胶充分沉淀；接着将静置后的溶液置于转速为7000r/min的条件下离心30min，收集沉淀物；之后将收集到的沉淀物用乙醇冲洗脱色2-3次，然后把沉淀物放置在60℃下恒温烘干至恒重，即得结冷胶，称干重并计算得出结冷胶生产量为16.2g/L。
实施例3少动鞘氨醇单胞菌QHZJUJW发酵制备结冷胶
(1)菌株的活化：用接种环将少动鞘氨醇单胞菌QHZJUJW划线接种于活化培养基上，并于恒温培养箱中培养24-72h，培养温度设定为28±2℃；其中，活化培养基为YPD培养基，包括以下原料(以重量百分比计)：Yeast Extract(酵母浸粉)1％，Peptone(蛋白胨)2％，Dextrose(glucose)(葡萄糖)2％，琼脂粉2％，蒸馏水配制，pH7.2。
(2)种子液的制备：将步骤(1)培养获得的少动鞘氨醇单胞菌QHZJUJW的单菌落接种于50ml的种子培养液中，并将其置于恒温摇床中振荡培养24h，温度30±1℃，转速200r/min；其中，种子培养液包括以下原料(以重量百分比计)：蔗糖0.5％，酵母膏0.1％，牛肉膏0.3％，蛋白胨0.5％，NaCl0.5％，蒸馏水配制，pH7.2。
(3)发酵液的制备：以体积百分比为10％的接种量将步骤(2)所获得的种子液转入已消毒灭菌的发酵培养基中，发酵培养72h，温度30±1℃，转速220r/min，获得所需的发酵液，收集备用，测粗胶产量；其中，发酵培养基包括以下原料(以重量百分比计)：蛋白胨0.3％，NaCl0.5％，蔗糖4％，蒸馏水配制，调pH至7.2，121℃湿热灭菌20min。
(4)结冷胶的提取：将步骤(3)中收集到的发酵液在90-95℃加热10min，用1N KOH调pH至10，在80℃下放置10min，用50％的三氯乙酸(TAC)调pH至7.15，在25℃放置20min，置于转速为7000r/min的条件下离心30min，收集上清液，向该上清液内加入3倍体积的95％的冰乙醇，在4℃静置6h使结冷胶充分沉淀；接着将静置后的溶液置于转速为7000r/min的条件下离心30min，收集沉淀物；之后将收集到的沉淀物用乙醇冲洗脱色2-3次，然后把沉淀物放置在60℃下恒温烘干至恒重，即得结冷胶，称干重并计算得出结冷胶生产量为17.2g/L。
实施例4少动鞘氨醇单胞菌QHZJUJW发酵制备结冷胶
(1)菌株的活化：用接种环将少动鞘氨醇单胞菌QHZJUJW划线接种于活化培养基上，并于恒温培养箱中培养24-72h，培养温度设定为28±2℃；其中，活化培养基为YPD培养基，包括以下原料(以重量百分比计)：Yeast Extract(酵母浸粉)1％，Peptone(蛋白胨)2％，Dextrose(glucose)(葡萄糖)2％，琼脂粉2％，蒸馏水配制，pH7.2。
(2)种子液的制备：将步骤(1)培养获得的少动鞘氨醇单胞菌QHZJUJW的单菌落接种于50ml的种子培养液中，并将其置于恒温摇床中振荡培养24h，温度30±1℃，转速200r/min；其中，种子培养液包括以下原料(以重量百分比计)：蔗糖0.5％，酵母膏0.1％，牛肉膏0.3％，蛋白胨0.5％，NaCl0.5％，蒸馏水配制，pH7.2。
(3)发酵液的制备：以体积百分比为8％的接种量将步骤(2)所获得的种子液转入已消毒灭菌的发酵培养基中，发酵培养72h，温度30±1℃，转速220r/min，获得所需的发酵液，收集备用，测粗胶产量；其中，发酵培养基包括以下原料(以重量百分比计)：蛋白陈0.35％，蔗糖4％，硫酸镁0.32％，磷酸二氢钾0.75％，磷酸氢二钠0.5％，硫酸钾0.3％，蒸馏水配制，调pH至7.2，121℃湿热灭菌20min。
(4)结冷胶的提取：将步骤(3)中收集到的发酵液在90-95℃加热10min，用1N KOH调pH至10，在80℃下放置10min，用50％的三氯乙酸(TAC)调pH至7.15，在25℃放置20min，置于转速为7000r/min的条件下离心30min，收集上清液，向该上清液内加入3倍体积的95％的冰乙醇，在4℃静置6h使结冷胶充分沉淀；接着将静置后的溶液置于转速为7000r/min的条件下离心30min，收集沉淀物；之后将收集到的沉淀物用乙醇冲洗脱色2-3次，然后把沉淀物放置在60℃下恒温烘干至恒重，即得结冷胶，称干重并计算得出结冷胶生产量为20.2g/L。
由实施例2-4可知，利用实施例1的少动鞘氨醇单胞菌QHZJUJW制备结冷胶时，不仅操作简便，而且制备获得的结冷胶生产量不低于15g/L，是值得研究的一种新的产结冷胶的内生菌菌株。
综上，本发明利用获得的少动鞘氨醇单胞菌菌株制备结冷胶，即该少动鞘氨醇单胞菌菌株能够产结冷胶，从而增加了结冷胶生产菌株的新菌株来源。
Claims (10)
1.一种少动鞘氨醇单胞菌菌株，其特征在于，命名为少动鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas paucimobilis）QHZJUJW，保藏号为CGMCC No.7783。
2.如权利要求1中所述的少动鞘氨醇单胞菌QHZJUJW在生产结冷胶中的应用。
3.一种生产结冷胶的方法，其特征在于，包括：
（1）将经活化的少动鞘氨醇单胞菌QHZJUJW接入种子培养液中进行培养，得到种子液；
（2）将种子液接入发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵液；
（3）从发酵液中提取得到结冷胶。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，以重量百分比计，所述的种子培养液包括以下原料：蔗糖0.5-1.5%，酵母膏0.1-0.3%，牛肉膏0.2-0.3%，蛋白胨0.3-0.5%，NaCl0.4-0.6%；种子培养液的pH为7.0-7.2。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述种子液的培养条件为培养温度29-31℃，培养时间16-28h。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述种子液的接种量以体积百分比计为5-10%。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，以重量百分比计，所述的发酵培养基包括以下原料：酵母膏0.1-0.2%，牛肉膏0.25-0.35%，蛋白胨0.35-0.5%，NaCl0.4-0.6%，蔗糖0.4-0.6%；发酵培养基的pH为7.0-7.2；
或者，所述的发酵培养基包括以下原料：蛋白胨0.3-0.5%，NaCl0.4-0.6%，蔗糖3-5%；发酵培养基的pH为7.0-7.2；
或者，所述的发酵培养基包括以下原料：蛋白陈0.3-0.5%，蔗糖4-6%，硫酸镁0.25-0.35%，磷酸二氢钾0.6-0.9%，磷酸氢二钠0.4-0.6%，硫酸钾0.2-0.4%；发酵培养基的pH为7.0-7.2。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述发酵培养的培养温度为29-31℃，培养时间为48-72h。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述的发酵培养为摇床振荡培养，摇床转速为160-250r/min。
10.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述的提取包括：将发酵液在90-95℃加热10min，用KOH或NaOH调pH至10，在80℃下放置10min，用50%的三氯乙酸调pH至7.15，静置，离心，收集上清液，向上清液内加入3倍体积的95%的冰乙醇，在4℃静置6h使结冷胶充分沉淀；接着将静置后的溶液离心，收集沉淀物，用乙醇冲洗脱色2-3次，于60℃下恒温烘干至恒重，得到结冷胶。
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