CN109251950A - 具有高凝胶强度、高粘度、高酰基的结冷胶的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物发酵，特别是指一种具有高凝胶强度、高粘度、高酰基的结冷胶的制备方法。将鞘氨醇单胞菌接种到灭菌后且含有碳源、氮源及必要营养物质的高碳氮比发酵培养基，调节发酵培养基的pH进行高温通气发酵，发酵20‑30小时补入无菌水及携氧剂，当培养液粘度不再增长或发酵周期≤50小时发酵结束，发酵结束后将发酵液经后提取制备成具有高凝胶强度、高粘度、高酰基的结冷胶等工艺步骤，本发明解决了现有技术存在的结冷胶0.5％水溶液粘度及凝胶强度较低、酰基含量低等技术问题，具有所制备的结冷胶产品酰基含量高、溶解速度快，0.5％水溶液粘度及凝胶强度好等优点。

Description

具有高凝胶强度、高粘度、高酰基的结冷胶的制备方法

技术领域

本发明属于微生物发酵，特别是指一种具有高凝胶强度、高粘度、高酰基的结冷胶的制备方法。

背景技术

结冷胶是继黄原胶之后的又一新型微生物胞外多糖,其凝胶性能比黄原胶更为优越。它于1978年由美国kelco公司首次发现，1988年，日本成功地完成了结冷胶的毒理实验并准许结冷胶在食品中应用。1992年，美国食品与药物管理局(FDA)批准结冷胶作为稳定剂和粘结剂在食品中广泛使用，1994年欧共体将其正式列入食用安全代码(E418)表中，我国1996年批准其可作为食品增稠剂、稳定剂使用。2010年国家出台了《食品安全国家标准食品添加剂结冷胶》(GB25535-2010)，标准对结冷胶的感官要求、理化指标、微生物指标进行了界定。结冷胶因其优越的凝胶性能被广泛的应用食品、医药等行业，具有广阔的应用前景。

结冷胶是以少动鞘脂单胞菌(Sphingomonas Paucimobilis)为生产菌经发氧发酵得到的。根据酰基含量结冷胶可分为低酰基结冷胶和高酰基结冷胶。低酰基结冷胶为透明的脆性凝胶，主要应用于透明果粒悬浮饮料。高酰基结冷胶是一种弹性凝胶，具有良好的弹性模量，具有赋型、固定、结膜的作用。高酰基结冷胶是一种热可逆凝胶，具有剪切稀释性和良好的流变性，凝胶温度高，悬浮能力强及与蛋白有协同作用，广泛应用于乳制品、果汁饮料、植物蛋白饮料等多个领域，具有广阔的市场前景。

虽然现有结冷胶工业化生产取得了许多成果,但还存在产品的0.5％水溶液粘度(一般在2000cp-3000cp)及凝胶强度低(一般为200g/m²-300g/m²)，尤其是0.5％结冷胶水溶液粘度与凝胶强度不能同时满足较高的性能等问题。

申请人检索的背景文献包括：

河北沣川生物科技有限公司在申请号为201710882514.1的发明专利申请中公开了一种鞘氨醇单胞菌以及在制备结冷胶中的应用，其主体技术解决思路是通过将将鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)CGMCC No.14238接种到灭菌后且含有碳源、氮源及必要营养物质的发酵培养基中，在培养过程中按发酵周期进行培养温度逐渐降低、通风量逐渐升高的梯度控制以及后提取之前通过对发酵终产物进行升温处理等技术措施，采用上述方法所制备的结冷胶的0.5％水溶液粘度可达6000cp-7000cp，凝胶强度可达500g/m²-700g/m²。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有高凝胶强度、高粘度、高酰基的结冷胶的制备方法，采用本发明的方法制备的结冷胶酰基含量高，溶解速度快，0.5％的水溶液具有较好的凝胶强度及粘度。

本发明的整体技术构思是：

具有高凝胶强度、高粘度、高酰基的结冷胶的制备方法，包括如下工艺步骤：

A、将鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)CGMCC No.14238按照10％-20％的接种量将其接种到灭菌后且含有碳源、氮源及必要营养物质的高碳氮比发酵培养基中；

B、调节发酵培养基的pH＝7.0-7.5，在温度为35℃-37℃，通风量为0.3vvm-0.8vvm的条件下进行通气发酵；

C、发酵20-30小时连续补入无菌水及携氧剂；

D、当培养液粘度不再增长或发酵周期≤50小时发酵结束；

E、发酵结束后将发酵液经后提取制备成具有高凝胶强度、高粘度、高酰基的结冷胶。

本发明的具体技术特征还有：

本发明的中步骤A、B中发酵培养基采用高碳氮比的培养基原料组成，其中优选由如下质量百分含量的原料组成：

葡萄糖或麦芽糖3％-4％；大豆分离蛋白0.1％-0.3％；硝酸钠0.1％-0.2％；碳酸钙0.1％-0.15％；磷酸二氢钾0.1％-0.25％；有机硅消泡剂0.05％-0.15％；余量为无菌水。

步骤C中补入无菌水及携氧剂的主要作用为在对数生长期增加溶氧，有利于种子的生长和结冷胶的合成。优选的技术方案是，步骤C中补入无菌水及携氧剂的工艺条件为：

发酵20-30小时补入占发酵液体积3％-5％的无菌水以及占发酵液体积0.3％-0.6％的携氧剂，所述的携氧剂选自双氧水、吐温20中的一种或其结合。

为防止结冷胶酰基的脱落，优选的技术方案是，将步骤D中发酵结束后的发酵液用质量百分比为10％-20％的酸溶液调pH＝5.0-6.0，所述的酸溶液选用盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、醋酸溶液中的一种或其结合。

为便于使结冷胶与醇充分接合，有利于结冷胶纤维的析出，减少包浆形成，提高了结冷胶溶解速度，降低发酵液温度，减少醇的挥发。优选的技术方案是，所述的步骤E的工艺条件如下：

将调整pH＝5.0-6.0的发酵液加热至70-80℃，当发酵液冷却至60℃以下时，先加入发酵液体积1/2、质量百分比浓度为85％-95％的醇溶液搅拌均匀，再加入发酵液体积1.5倍、质量百分比浓度为85％-95％的醇溶液，使结冷胶脱水析出，经离心、干燥、粉碎后制成具有高凝胶强度、高粘度、高酰基的结冷胶；醇溶液选用乙醇溶液或异丙醇溶液。

由于结冷胶的粘度及凝胶强度在现有结冷胶国标中未见描述，因此申请人参照相关标准并结合客户要求，对利用本发明的方法得到的结冷胶的酰基含量、0.5％水溶液粘度及结冷胶凝胶强度进行了如下测定：

一、0.5％结冷胶水溶液粘度的检测方法

1、试剂

纯净水；

2、设备

(1)NGJ-2型泥浆高速搅拌器；

(2)BROOKFIELD粘度计；

(3)分析天平(精确至0.001g)；

3、测定步骤：

量取300ml纯净水于搅拌杯中，置于搅拌器上开启电源，然后缓慢加入1.50g结冷胶，并于一档(4000rpm/分)搅拌30min；

在25±1℃条件下用BROOKFIELD粘度计3号转子60rpm检测此溶液的粘度。粘度(3#)＝读值×20。

二、凝胶强度的检测方法

1、试剂和溶液制备

浓度为0.3mol/L氯化钙溶液:33.3g无水氯化钙用少量蒸馏水溶解后定容至1升；

2、设备

(1)搅拌器；

(2)水浴钠；

(3)质购仪；

(4)电子天平(精确至0.001g)；

3、测定步骤

295ml去离子水(纯净水)，加入2ml 0.3mol/L的氯化钙溶液，在搅拌的条件下加入3.00g样品于800转(低速搅拌器5档)搅拌15min,溶液置于不锈钢烧杯中约，将烧杯放入已经预热的95℃水浴中，使烧杯中的溶液完全浸入水中，加热期间用玻璃棒间断搅拌3次，每次搅拌5-10下，加热30分钟后至样品全部水化，去掉上层泡沫搅拌均匀。趁热将胶溶液倾入平底容器，静置，自然冷却至凝胶，于室温下放置20h，用质构仪测定三个平行样，取平均值。

三、酰基含量检测方法：

准确称取0.2g样品于250ml具塞三角瓶中加水50ml使样品溶解，加5滴酚酞指示剂用0.1NNaOH溶液滴定至粉红色刚好不退为止；再准确加入25ml0.5NNaOH溶液，常温放置过夜(12小时以上)或50℃保温剧烈振荡30分钟，用0.3NHCL标准溶液滴定体系中过量的碱直到粉红色刚好消失，记下所用HCL溶液的体积S(ml)；另外用同一种HCL溶液标定0.5NNaOH溶液作空白，记下所耗HCL体积B(ml)。

计算：酰基％＝(B-S)×N×0.043×100/W(N：HCL溶液的标准当量浓度，W：样品重量g)。

本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：

1、采用高碳氮比培养基，在高温条件下对鞘氨醇单胞菌(Sphingomonassp.)CGMCCNo.14238进行培养，在发酵过程中补入无菌水及携氧剂，微生物生长代谢速度快，缩短发酵周期在50h以内，产物纯度及收率高，能得到高品质结冷胶，高温培养同时减少了降温水的利用。

2、发酵过程中连续补入无菌水和携氧剂，在菌种对数生长期增加溶氧，有利于种子的生长和结冷胶的合成。

3、采用弱酸条件下预处理及提取，有利于防止结冷胶酰基的脱落。

4、提取过程中醇加量阶梯控制：萃取时醇的加入分两次加入，第一次加入少量的醇，使结冷胶与醇充分接合，有利于结冷胶纤维的析出，减少包浆的形成，提高了结冷胶的溶解速度，第二次加醇同时降低了发酵液温度，减少了醇的挥发。

5、经申请人通过实验测定，采用本发明的方法制备的结冷胶酰基含量大于9％，溶解速度快，25℃5min内0.5％水溶液粘度大于5000cp，0.5％水溶液粘度最终粘度可达8000cp以上，凝胶强度可达800g/m²以上，明显优于现有产品，具有更好的工业适应性和应用前景。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步描述，但不作为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书作出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范围。

实施例1

具有高凝胶强度、高粘度、高酰基的结冷胶的制备方法，包括如下工艺步骤：

A、将鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)CGMCC No.14238按照10％-20％的接种量将其接种到灭菌后且含有碳源、氮源及必要营养物质的高碳氮比发酵培养基中；

B、调节发酵培养基的pH＝7.0，在温度为35℃，通风量为0.3vvm的条件下进行通气发酵；

C、发酵20-30小时补入无菌水及携氧剂；

D、当培养液粘度不再增长或发酵周期≤50小时发酵结束；

E、发酵结束后将发酵液经后提取制备成具有高凝胶强度、高粘度、高酰基的结冷胶。

本发明的中步骤A、B中发酵培养基由如下质量百分含量的原料组成：

葡萄糖或麦芽糖3％；大豆分离蛋白0.1％；硝酸钠0.1％；碳酸钙0.1％；磷酸二氢钾0.1％；有机硅消泡剂0.05％；余量为无菌水。

步骤C中补入无菌水及携氧剂的工艺条件为：

发酵20-30小时补入占发酵液体积3％的无菌水以及占发酵液体积0.3％的携氧剂，所述的携氧剂选自双氧水。

将步骤D中发酵结束后的发酵液用质量百分比为10％的酸溶液调pH＝5.0-6.0，所述的酸溶液选用盐酸溶液。

所述的步骤E的工艺条件如下：

将调整pH＝5.0-6.0的发酵液加热至70-80℃，当发酵液冷却至60℃以下时，先加入发酵液体积1/2、质量百分比浓度为85％-95％的醇溶液搅拌均匀，再加入发酵液体积1.5倍、质量百分比浓度为85％-95％的醇溶液，使结冷胶脱水析出，经离心、干燥、粉碎后制成具有高凝胶强度、高粘度、高酰基的结冷胶；醇溶液选用乙醇溶液或异丙醇溶液。

实施例2

本实施例与实施例1的区别在于:

B、调节发酵培养基的pH＝7.5，在温度为37℃，通风量为0.8vvm的条件下进行通气发酵；

步骤A、B中发酵培养基由如下质量百分含量的原料组成：

葡萄糖或麦芽糖4％；大豆分离蛋白0.3％；硝酸钠0.2％；碳酸钙0.15％；磷酸二氢钾0.25％；有机硅消泡剂0.15％；余量为无菌水。

步骤C中补入无菌水及携氧剂的工艺条件为：

发酵20-30小时补入占发酵液体积5％的无菌水以及占发酵液体积0.6％的携氧剂，所述的携氧剂选自吐温20。

将步骤D中发酵结束后的发酵液用质量百分比为20％的酸溶液调pH＝5.0-6.0，所述的酸溶液选用硫酸溶液。

实施例3

本实施例与实施例1的区别在于:

B、调节发酵培养基的pH＝7.2，在温度为36℃，通风量为0.5vvm的条件下进行通气发酵；

步骤A、B中发酵培养基由如下质量百分含量的原料组成：

葡萄糖或麦芽糖3.5％；大豆分离蛋白0.2％；硝酸钠0.15％；碳酸钙0.12％；磷酸二氢钾0.2％；有机硅消泡剂0.1％；余量为无菌水。

步骤C中补入无菌水及携氧剂的工艺条件为：

发酵20-30小时补入占发酵液体积4％的无菌水以及占发酵液体积0.5％的携氧剂，所述的携氧剂选自双氧水、吐温20的结合。

将步骤D中发酵结束后的发酵液用质量百分比为15％的醋酸溶液调pH＝5.0-6.0。

实施例4

本实施例与实施例1的区别在于:

具有高凝胶强度、高粘度、高酰基的结冷胶的制备方法，包括如下工艺步骤：

B、调节发酵培养基的pH＝7.4，在温度为36℃，通风量为0.7vvm的条件下进行通气发酵；

步骤A、B中发酵培养基由如下质量百分含量的原料组成：

葡萄糖或麦芽糖3.8％；大豆分离蛋白0.25％；硝酸钠0.18％；碳酸钙0.14％；磷酸二氢钾0.15％；有机硅消泡剂0.12％；余量为无菌水。

步骤C中补入无菌水及携氧剂的工艺条件为：

发酵20-30小时补入占发酵液体积4.5％的无菌水以及占发酵液体积0.5％的携氧剂，所述的携氧剂选用吐温20。

将步骤D中发酵结束后的发酵液用质量百分比为18％的盐酸与硝酸溶液调pH＝5.0-6.0。

实施例5

本实施例与实施例1的区别在于:

B、调节发酵培养基的pH＝7.1，在温度为35℃，通风量为0.4vvm的条件下进行通气发酵；

步骤A、B中发酵培养基由如下质量百分含量的原料组成：

葡萄糖或麦芽糖3.3％；大豆分离蛋白0.18％；硝酸钠0.13％；碳酸钙0.13％；磷酸二氢钾0.13％；有机硅消泡剂0.12％；余量为无菌水。

步骤C中补入无菌水及携氧剂的工艺条件为：

发酵20-30小时补入占发酵液体积3.5％的无菌水以及占发酵液体积0.35％的携氧剂，所述的携氧剂选自双氧水。

将步骤D中发酵结束后的发酵液用质量百分比为12％的磷酸溶液调pH＝5.0-6.0。

上述实施例中所制备产品的各项技术指标测定结果如下表。

Claims (5)

1.具有高凝胶强度、高粘度、高酰基的结冷胶的制备方法，其特征在于包括如下工艺步骤：

A、将鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)CGMCC No.14238按照10％-20％的接种量将其接种到灭菌后且含有碳源、氮源及必要营养物质的高碳氮比发酵培养基中；

B、调节发酵培养基的pH＝7.0-7.5，在温度为35℃-37℃，通风量为0.3vvm-0.8vvm的条件下进行通气发酵；

C、发酵20-30小时补入无菌水及携氧剂；

D、当培养液粘度不再增长或发酵周期≤50小时发酵结束；

E、发酵结束后将发酵液经后提取制备成具有高凝胶强度、高粘度、高酰基的结冷胶。

2.根据权利要求1所述的具有高凝胶强度、高粘度、高酰基的结冷胶的制备方法，其特征在于所述的步骤A、B中发酵培养基由如下质量百分含量的原料组成：

葡萄糖或麦芽糖3％-4％；大豆分离蛋白0.1％-0.3％；硝酸钠0.1％-0.2％；碳酸钙0.1％-0.15％；磷酸二氢钾0.1％-0.25％；有机硅消泡剂0.05％-0.15％；余量为无菌水。

3.根据权利要求1所述的具有高凝胶强度、高粘度、高酰基的结冷胶的制备方法，其特征在于步骤C中补入无菌水及携氧剂的工艺条件为：

发酵20-30小时补入占发酵液体积3％-5％的无菌水以及占发酵液体积0.3％-0.6％的携氧剂，所述的携氧剂选自双氧水、吐温20中的一种或其结合。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的具有高凝胶强度、高粘度、高酰基的结冷胶的制备方法，其特征在于所述的步骤E的工艺条件如下：

将步骤D中发酵结束后的发酵液用质量百分比为10％-20％的酸溶液调pH＝5.0-6.0，所述的酸溶液选用盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、醋酸溶液中的一种或其结合。

5.根据权利要求4所述的具有高凝胶强度、高粘度、高酰基的结冷胶的制备方法，其特征在于所述的步骤E的工艺条件如下：

将调整pH＝5.0-6.0的发酵液加热至70-80℃，当发酵液冷却至60℃以下时，先加入发酵液体积1/2、质量百分比浓度为85％-95％的醇溶液搅拌均匀，再加入发酵液体积1.5倍、质量百分比浓度为85％-95％的醇溶液，使结冷胶脱水析出，经离心、干燥、粉碎后制成具有高凝胶强度、高粘度、高酰基的结冷胶；醇溶液选用乙醇溶液或异丙醇溶液。