CN104164385A - 一株少动鞘氨醇单胞菌菌株gxas-815及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株少动鞘氨醇单胞菌菌株及其应用，其分类命名为少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)gxas-815，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M2013327。本发明利用少动鞘氨醇单胞菌以蔗糖为原料发酵生产结冷胶，结冷胶产量达13.75g/L。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体是一株少动鞘氨醇单胞菌菌株gxas-815，从广西南宁采集样品筛选获得，该菌株应用于以蔗糖为原料发酵生产结冷胶。
背景技术
结冷胶是一种新型微生物胞外多糖，是由D-葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖及L-鼠李糖或甘露聚糖4种糖单元构成的高分子聚合物。结冷胶用途非常广泛，在食品领域主要用作增稠剂，是目前国际上集增稠、悬浮、乳化、稳定于一体，性能优越的食品胶之一。作为新型的微生物胶，在食品、医药、化工等行业，结冷胶将逐步取代植物胶，如琼脂、卡拉胶等，具有良好的市场前景。(魏春，张栋慧，应向贤等.产结冷胶的黄色素缺陷型抗药性鞘氨醇单胞菌WZ013发酵条件优化.中国食品学报.2013,23(2):101-107)。结冷胶对酶稳定，是絮凝效果好、易自然降解、不会引起二次污染等特点的新型絮凝剂。
少动鞘氨醇单胞菌又译名少动鞘脂单胞菌，是结冷胶的发酵生产菌株。在污水处理的活性污泥中曾多次分离出少动鞘氨醇单胞菌，其具有絮凝活性，生产的结冷胶能溶于冷水，有良好的稳定性，耐酸、耐高温，热可逆等特性，还能抵抗微生物及酶的作用，能作为生物絮凝剂的组成部分行使废水处理等生物修复功能。国内结冷胶生产厂家的生产规模小、生产的结冷胶规格较少，工业化生产中依然存在发酵产率低，发酵过程中通气搅拌能耗高，产物提取繁琐，产品澄清困难等问题，直接导致生产成本较高，限制了国内结冷胶行业的发展。在微生物多糖的发酵过程中，选择合适的发酵条件是极其重要的。结冷胶是由少动鞘氨醇单胞菌在适宜的培养基中经糖代谢合成，在合成过程中，糖类为主的碳源、蛋白质为主的氮源构成发酵原料成本的最大部分(胡桂萍，刘波，朱育菁等.少动鞘脂单胞菌产结冷胶发酵培养基的响应面法优化.生物数学学报.2012,27(3):507-517)。
少动鞘氨醇单胞菌是一种好氧革兰氏阴性杆菌,能在以葡萄糖、淀粉、蔗糖等作碳源,硝酸铵、酵母膏、蛋白胨等为氮源以及含其他微量元素的培养基中生长并产胶。国内外众多学 者的研究发现，碳源、氮源、种龄、接种量、温度、发酵培养基初始pH都对其发酵产结冷胶有较大的影响。
以少动鞘氨醇单胞菌或者少动鞘脂单胞菌为检索要素，在中国知识产权局共检索到44项专利。这些专利涉及范围主要有：少动鞘氨醇单胞菌新菌株的发现、基因的发掘和基因敲除重组菌构建、相关酶制剂的生产、发酵产结冷胶的生产方法和提取方法、作为微生物添加剂用于食品风味改善和废水处理等应用。
发明内容
本发明的目的是提供一株少动鞘氨醇单胞菌菌株及其应用。这个菌株具有良好的发酵优化和遗传改造前景，同时也具有重要的工业应用价值。
本发明所提供的少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)gxas-815是从广西南宁采样分离筛选得到的。
所述少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)gxas-815CCTCC M2013327分离筛选方法：
a)采样：从广西南宁采集样品，
b)富集：每个样品各称取1g置于以蔗糖为主要碳源的培养基中，置于220r/min摇床30℃发酵72h，取粘度高的发酵醪进行初筛，
c)初筛：将粘度高的发酵醪稀释涂布筛选平板培养基，置于30℃培养箱中培养24h，从平板上挑选黄色、圆形、光滑、有光泽、低凸起、边缘整齐的菌落进行复筛，
d)复筛：从筛选平板上挑选单菌落于蔗糖发酵培养基中，置于220r/min摇床30℃发酵72h，发酵醪80℃水浴30min、离心去菌体、乙醇沉淀、烘干、经傅立叶变换红外光谱仪Nicoletis10(Thermo)检测，筛选结冷胶产量较高的菌株进行优化，
e)鉴定：经生化自动鉴定仪和16S rDNA鉴定本菌株为少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonaspaucimobilis)。
本发明的少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)gxas-815，可用于发酵生产结冷胶。
所述发酵生产结冷胶的具体方法是：将少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)gxas-815接种到发酵培养基中，置于220r/min摇床，发酵温度为30℃，发酵72h得到结冷胶发酵醪。
所述发酵培养基是以蔗糖为主要碳源的发酵培养基，蔗糖的质量百分含量为3～4％，最适量为3％；蛋白胨的质量百分含量为0.2～0.4％，最适量为0.3％；磷酸氢二钾的质量百分含 量为0.05～0.2％，最适量为0.15％；硫酸钾的质量百分含量为0.1～0.3％，最适量为0.15％；磷酸二氢钾质量百分含量为0.3～0.5％，最适量为0.25％；无水硫酸镁的质量百分含量为0.2～0.4％，最适量为0.3％。
所述接种是将生长至对数期的少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)gxas-815按照体积百分含量为10％的接种量接种到发酵培养基中。
本发明的少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)gxas-815以蔗糖为原料发酵生产结冷胶，结冷胶产量最高可达13.75g/L。
保藏信息说明
少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)gxas-815，已经保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC No：M 2013327。保藏日期为2013年7月10日，保藏地址为武汉市武昌路珈山武汉大学。
具体实施方式
下列实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1
少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)gxas-815的分离、筛选与鉴定
第一步：采样
在广西北海涠洲岛采集样品。
第二步：富集
富集培养基组分：蔗糖5g，蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，用蒸馏水定容到1000mL，pH6.0～7.2。将以上成份混合均匀，分装于250mL容积的三角瓶中，每瓶装50ml，115℃高压蒸汽灭菌20min。
每个样品各称取1g分别置于装有富集培养基的三角瓶中，置于30℃摇床，220r/min培养72h，挑选发酵醪粘度较高的进行筛选。
第三步：初筛
初筛平板培养基：蔗糖5g，蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.2，115℃高压蒸汽灭菌20min。
将发酵醪粘度较高的样品稀释涂布初筛平板培养基，置于30℃培养箱中培养24h，挑选黄色、圆形、光滑、有光泽、低凸起、边缘整齐的菌落进行复筛。
第四步：复筛
蔗糖发酵培养基：蔗糖30g，蛋白胨3g，磷酸氢二钾1.5g，硫酸钾1.5g，磷酸二氢钾2.5 g，无水硫酸镁3g，用蒸馏水定容到1000mL，pH7.0。将以上成份混合均匀，分装于250mL容积的三角瓶中，每瓶装50ml，115℃高压蒸汽灭菌20min。
从初筛培养基平板上挑选单菌落于发酵培养基中，30℃摇床220r/min发酵72h，对发酵醪进行离心去菌体后乙醇沉淀、烘干、用红外光谱仪检测分析，最终选定一株利用蔗糖发酵生产结冷胶产量较高的菌株，命名为gxas-815。
第五步：鉴定
生理生化特征：
(注：表中“+”为阳性，“－”为阴性)
16S rDNA鉴定：
对菌株少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)gxas-81516S rDNA序列扩增，测序分析后将获得的序列在GenBank数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)中进行比对。序列分析结果表明：少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)gxas-815与少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)同源性在99％以上。
该菌株少动鞘氨醇单胞菌形态学、生理生化特征符合少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)特征，最接近少动鞘氨醇单胞菌，且序列分析表明，菌株gxas-815与少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)同源性在99％以上。由此鉴定，菌株gxas-815属于少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)。
从自然界中成功分离筛选出一种能利用蔗糖为原料发酵高产结冷胶的新菌株，拓宽了利用微生物发酵生产结冷胶的菌株。
实施例2
少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)gxas-815发酵生产结冷胶
平板培养基：蔗糖5g，蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.2，115℃高压蒸汽灭菌20min。
种子培养基：蔗糖5g，蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，用蒸馏水定容到1000mL，pH7.0～7.2，115℃高压蒸汽灭菌20min。
蔗糖发酵培养基：蔗糖30g，蛋白胨3g，磷酸氢二钾1.5g，硫酸钾1.5g，磷酸二氢钾2.5g，无水硫酸镁3g，pH7.0，用蒸馏水定容到1000mL。将以上成份混合均匀，分装于250mL容积的三角瓶中，每瓶装50ml，115℃高压蒸汽灭菌20min。
取甘油保藏的少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)gxas-815涂布平板培养基， 置于30℃培养箱培养20h，挑单菌落于种子培养基中，在30℃摇床转速220r/min培养至OD600为1.0左右，按照体积百分含量为10％的接种量接种到装50ml发酵培养基的250ml三角瓶中，30℃摇床转速220r/min发酵72h，将发酵醪80℃水浴30min、离心去菌体、乙醇沉淀、烘干并用红外光谱仪检测。所用蔗糖发酵培养基经优化，结冷胶产量最高可达13.75g/L。
实施例3
结冷胶的检测分析
红外光谱仪检测分析：发酵醪加入2倍体积的水，80℃水浴30min，12000r/min离心30min去菌体，取上清液加入2倍体积的无水乙醇，4℃沉淀过夜，12000r/min离心30min，将沉淀60℃烘干，磨碎上样红外光谱仪检测，分析峰形。
通过以上实例可以看出少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)gxas-815在发酵过程中具有良好的发酵性能，经过发酵条件的优化结冷胶产量最高可达13.75g/L。
Claims (7)
1.一株少动鞘氨醇单胞菌菌株，其分类命名为少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonaspaucimobilis)gxas-815，于2013年7月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M2013327。
2.权利要求1所述的少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)gxas-815在发酵生产结冷胶中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述发酵结冷胶的方法是将少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)gxas-815接种到发酵培养基中，置于220r/min摇床，发酵温度为30℃，发酵72h得到结冷胶发酵醪。
4.根据权利要求2-3所述的应用，其特征在于，所述接种是将生长至对数期的少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)gxas-815按照体积百分含量为5～10％的接种量接种到发酵培养基中。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述发酵培养基是以蔗糖为主要碳源的发酵培养基，蔗糖的质量百分含量为3～4％。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述发酵培养基中还含有蛋白胨，质量百分含量为0.2～0.4％，磷酸氢二钾的质量百分含量为0.05～0.2％，硫酸钾的质量百分含量为0.1～0.3％，磷酸二氢钾质量百分含量为0.3～0.5％，无水硫酸镁的质量百分含量为0.2～0.4％。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述发酵培养基中各成分的质量百分含量为蛋白胨0.3％，磷酸氢二钾0.15％，的硫酸钾0.15％，磷酸二氢钾0.25％，无水硫酸镁0.3％。
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