CN110564580B

CN110564580B - 一种微生物共培养发酵生产含有吡咯喹啉醌食醋的方法

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Publication number: CN110564580B
Application number: CN201910796795.4A
Authority: CN
Inventors: 梁新乐; 韩程程; 季妍
Original assignee: Zhejiang Gongshang University
Current assignee: Zhejiang Gongshang University
Priority date: 2019-08-27
Filing date: 2019-08-27
Publication date: 2022-04-15
Anticipated expiration: 2039-08-27
Also published as: CN110564580A

Abstract

一种微生物共培养发酵生产吡咯喹啉醌食醋的方法，属于食醋酿造技术领域。其利用酿酒酵母、生丝微菌和巴氏醋杆菌构建共培养体系，生产富含吡咯喹啉醌的食醋。本发明采用酿酒酵母、生丝微菌和巴氏醋杆菌微生物共培养的方法，经过酒精发酵、醋酸发酵、发酵中止、产品过滤包装等阶段制得富含吡咯喹啉醌食醋，其中吡咯喹啉醌浓度为0.05‑0.2毫克/升。本发明方法新颖，采用微生物共培养方法，将营养因子与食醋相结合，增加了食醋的营养健康价值，具有可行性。

Description

一种微生物共培养发酵生产含有吡咯喹啉醌食醋的方法

技术领域

本发明属于食醋酿造技术领域，更具体地说，涉及一种微生物共培养发酵生产吡咯喹啉醌食醋的方法。

背景技术

食醋作为一种基本调味品，其营养健康功能也被重视起来。但现今营养健康功能食醋往往仅通过改变原料种类来达到其目的，方法较单一，对添加的营养功能因子种类具有局限性。多菌种共培养方法是一种新型发酵技术，在生物、食品、化学等领域中已有相关报道，但通过多菌种共培养的方式引入功能营养因子，改进食醋品质的研究报道较少。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种微生物共培养发酵生产吡咯喹啉醌食醋的方法的技术方案。该方法通过酿酒酵母、生丝微菌和巴氏醋杆菌进行共同发酵，实现了吡咯喹啉醌食醋的生产，改进了食醋品质。

具体技术方案包括以下步骤：

（1）以酒醪为基础，调整还原糖及pH值，补加甲醇后，接种生丝微菌和酿酒酵母进行共培养，得到酿酒酵母-生丝微菌共培养种子液；

（2）以大米和水为原材料经淀粉酶糖化处理、调浆处理及补加甲醇后，接种步骤（1）得到的酿酒酵母-生丝微菌共培养种子液进行发酵，发酵后调整乙醇和乙酸浓度，得到乙醇酒基；

（3）在步骤（2）得到的乙醇酒基中接种巴氏醋杆菌培养，得到巴氏醋杆菌种子液；

（4）在步骤（2）得到的乙醇酒基中接种步骤（1）得到的酿酒酵母-生丝微菌共培养种子液和步骤（3）得到的巴氏醋杆菌种子液进行多菌种共培养发酵，得到富含吡咯喹啉醌的食醋。

进一步地，步骤（1）中调整还原糖浓度至1-3% w/v，甲醇浓度至0.2-1.0% w/v，pH至6.0-7.0。

进一步地，步骤（1）培养条件为：温度25-32℃，时间48-96 小时。

进一步地，步骤（2）中大米与水的比例为1:3，加入0.3% α-淀粉酶及0.3%糖化酶进行淀粉酶糖化处理，加入0.1%的CaCl₂进行调浆处理，补加甲醇浓度至0.2-1.0% w/v。

进一步地，步骤（2）中发酵条件为：温度28-35℃，时间24-64小时，接种量1-5% v/v。

进一步地，步骤（2）中发酵后调整乙醇浓度至1-2% w/v和乙酸浓度至0.5-3.5% w/v。

进一步地，步骤（3）中培养条件为：温度30-35℃，时间16-24小时，接种量4-7% v/v。

进一步地，步骤（4）中发酵过程补加乙醇酒基，控制乙醇浓度为1-3% w/v，甲醇浓度为0.2-1.0% w/v，发酵温度30-35℃，发酵时间24-48 小时。

进一步地，步骤（4）中加入食盐中止发酵过程，沉淀过滤澄清、加水调配后制得富含吡咯喹啉醌的食醋。

本发明采用酿酒酵母、生丝微菌和巴氏醋杆菌微生物共培养的方法，经过酒精发酵、醋酸发酵、发酵中止、产品过滤包装等阶段制得富含吡咯喹啉醌食醋，其中吡咯喹啉醌浓度为0.05-0.2毫克/升。本发明方法新颖，采用微生物共培养方法，将营养因子与食醋相结合，增加了食醋的营养健康价值，具有可行性。

附图说明

图1为生丝微菌LXL-PQ-409系统发育树；

图2为生丝微菌LXL-PQ-409菌落形态及革兰氏染色图。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步说明本发明。

实施例1：本申请所用的生丝微菌为生丝微菌LXL-PQ-409，具体通过以下步骤得到：

从浙江黄酒酒醅中分离产吡咯喹啉醌的细菌。取发酵酒醅，用无菌生物理盐水适当稀释后涂布于甲醇固体培养基。固体培养基含有甲醇2%、（NH₄)₃C₆H₈O₄ 0.3%、KH₂PO₄0.14%、Na₂HPO₄ 0.3%、MgSO₄·7H₂O 0.1%、微量元素液0.07%、琼脂2%、余量为水，培养基pH为7，培养温度为30℃，培养时间为7天。然后挑出长势较好的菌落接种于液体培养基（除不含琼脂外，与固体培养基相同）进行培养7天，LC/MS分析检测后，获得产吡咯喹啉醌菌种。

取斜面菌种，加入10 mL生理盐水，制成细胞悬液，以300 Gy的辐照剂量进行¹³⁷Csγ射线辐照，辐照2小时。辐照完成后将悬浮液稀释后涂布于筛选培养基上，筛选培养基含有甲醇7%、0.3%乙醇、(NH₄)₃C₆H₈O₄ 0.3%、KH₂PO₄ 0.14%、Na₂HPO₄ 0.3%、MgSO₄.7H₂O 0.1%、10mmol/L乙硫氨酸、微量元素液0.07%、琼脂2%，所述微量元素液含有FeSO₄·7H₂O 0.75%、ZnSO₄·7H₂O 22.5%、MnSO₄·4～5H₂O 0.45%、CuSO₄•5H₂O 0.075%、NaCl 0.15%、(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.03%、KI 0.03%、CoCl₂·6H₂O 0.03%、H₃BO₃ 0.03%、CaCl₂·2H₂O 3%，培养基pH为7.0，培养温度为30℃，培养时间为9天，挑选大菌落以及吡咯喹啉醌正突变株。上述诱变-定向育种过程反复多次进行。最后，分离得到本发明的吡咯喹啉醌高产菌株LXL-PQ-409，质谱检测LXL-PQ-409可以甲醇为碳源高效发酵产生吡咯喹啉醌。

提取菌株LXL-PQ-409的基因组并测定16S rDNA基因序列，其16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示，采用邻位相连算法进行系统基因分析结果（图1），与生丝微菌同源性大于97%。形态观察表明，细胞呈卵圆形，无芽孢，一端具有膨大的较短菌丝，具有侧生单鞭毛，能运动，革兰氏阴性。在28～35^oC，pH中性偏酸条件下生长良好。在以甲醇为唯一碳源的固体培养基中表面生长5天，菌落由乳白色逐渐变为浅褐色，菌落光泽度下降，表面褶皱，菌落形态如图2所示。

根据菌株LXL-PQ-409的形态及其16S rDNA序列同源，其初步被鉴定为生丝微菌属。

将上述的生丝微菌LXL-PQ-409进行保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏日：2019年4月22日，保藏号：CCTCC NO：M 2019284，建议分类命名为Hyphomicrobium sp.LXL-PQ-409。

实施例2：

（1）取黄酒酒醪10份，甲醇1份，水89份配制酿酒酵母-生丝微菌培养基，调整还原糖至3% w/v，pH 至7.0。接种生丝微菌和酿酒酵母进行共培养，接种量为2%，培养条件为温度32℃培养96小时。酵母菌出芽率为98%，生丝微菌菌落形成单位数大于等于7.0×10⁸/毫升。

（2）以大米和水为原材料，以1:3比例调配，加入0.3% α-淀粉酶及0.3%糖化酶进行淀粉酶糖化处理，加入0.1%的CaCl₂进行调浆处理，补加甲醇浓度至1.0% w/v后，接种酿酒酵母-生丝微菌种子液进行发酵，接种量5% v/v，温度30℃培养64小时，得到乙醇酒基，乙醇浓度6% w/v。发酵后调整乙醇浓度至2% w/v，乙酸浓度至2% w/v。

（3）在所得乙醇酒基中接种巴氏醋杆菌培养，得到巴氏醋杆菌种子液，培养条件为温度30℃，时间20小时，接种量5% v/v。

（4）巴氏醋杆菌种子液接种到前述乙醇酒基中进行酿酒酵母-生丝微菌-巴氏醋杆菌共培养。第24小时再次接种生丝微菌强化发酵，接种量1% v/v。发酵过程补加乙醇酒基，控制乙醇浓度为1.5% w/v，甲醇浓度为1.0% w/v，发酵温度30℃，发酵时间24小时，加入食盐中止发酵过程，此时乙醇浓度小于等于0.8% w/v，甲醇浓度小于等于0.01% w/v。醋液经沉淀过滤澄清，加水调配后制得富含吡咯喹啉醌的食醋后制得富含吡咯喹啉醌的食醋，酸度3.8克/100毫升，吡咯喹啉醌浓度0.2毫克/升。

实施例3：

（1）取葡萄酒前酵酒醪10份，甲醇1份，水89份配制酿酒酵母-生丝微菌培养基，调整还原糖至1% w/v， pH 至6.0。接种生丝微菌-酿酒酵母进行共培养，温度25℃，培养48小时。酵母菌出芽率大于等于85%，生丝微菌菌落形成单位数大于等于0.2×10⁸/毫升。

（2）以大米和水为原材料，以1:3比例调配，加入0.3% α-淀粉酶及0.3%糖化酶进行淀粉酶糖化处理，加入0.1%的CaCl₂进行调浆处理，补加甲醇浓度至0.2% w/v后，接种酿酒酵母-生丝微菌种子液进行发酵，接种量1% v/v，温度28℃培养24小时，制得乙醇酒基，乙醇浓度2.5% w/v。发酵后调整乙醇浓度至1.5% w/v，乙酸浓度至2.5% w/v。

（3）在所得乙醇酒基中接种巴氏醋杆菌培养，得到巴氏醋杆菌种子液，培养条件为温度35℃，时间16小时，接种量4% v/v。

（4）巴氏醋杆菌种子液接种到前述乙醇酒基中进行酿酒酵母-生丝微菌-巴氏醋杆菌共培养。第24小时再次接种生丝微菌强化发酵，接种量4% v/v。发酵过程补加酒基，控制乙醇浓度为1.5% w/v，甲醇浓度为0.2% w/v，发酵温度35℃。发酵时间36小时，加入食盐中止发酵过程，此时乙醇浓度小于等于0.8% w/v，甲醇浓度小于等于0.01%w/v。醋液经沉淀过滤澄清，加水调配后制得富含吡咯喹啉醌的食醋，酸度3.8克/100毫升，吡咯喹啉醌浓度0.05毫克/升。

实施例4：

（1）取黄酒酒醪10份，甲醇1份，水89份配制酿酒酵母-生丝微菌培养基，调整还原糖至2% w/v， pH至 7.0。接种生丝微菌和酿酒酵母进行共培养，培养条件为温度30℃培养96小时。酵母菌出芽率为98%，生丝微菌菌落形成单位数大于等于2.0×10⁸/毫升。

（2）以大米和水为原材料，以1:3比例调配，加入0.3% α-淀粉酶及0.3%糖化酶进行淀粉酶糖化处理，加入0.1%的CaCl₂进行调浆处理，补加甲醇浓度至0.5% w/v后，接种酿酒酵母-生丝微菌种子液进行发酵，接种量3%v/v，温度32℃培养48小时，得到乙醇酒基，乙醇浓度3.6% w/v。发酵后调整乙醇浓度至1% w/v，乙酸浓度至0.5% w/v。

（3）在所得到的乙醇酒基中接种巴氏醋杆菌培养，得到巴氏醋杆菌种子液，培养条件为温度30℃，时间24小时，接种量6% v/v。

（4）巴氏醋杆菌种子液接种到前述乙醇酒基中进行酿酒酵母-生丝微菌-巴氏醋杆菌共培养。第24小时再次接种生丝微菌强化发酵，接种量6% v/v。发酵过程补加乙醇酒基，控制乙醇浓度为2% w/v，甲醇浓度为0.5% w/v，发酵温度30℃，发酵时间48小时，加入食盐中止发酵过程，此时乙醇浓度小于等于0.8% w/v，甲醇浓度小于等于0.01% w/v。醋液经沉淀过滤澄清，加水调后制得富含吡咯喹啉醌的食醋，酸度3.8克/100毫升，吡咯喹啉醌浓度0.07毫克/升。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种微生物共培养发酵生产吡咯喹啉醌食醋的方法，其特征在于，利用酿酒酵母、生丝微菌和巴氏醋杆菌构建共培养体系，生产富含吡咯喹啉醌的食醋，所述生丝微菌为生丝微菌LXL-PQ-409，其保藏号为：CCTCC NO：M 2019284，具体包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中调整还原糖浓度至1-3% w/v，甲醇浓度至0.2-1.0% w/v，pH至6.0-7.0。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）培养条件为：温度25-32℃，时间48-96 小时。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中大米与水的比例为1:3，加入0.3% α-淀粉酶及0.3%糖化酶进行淀粉酶糖化处理，加入0.1%的CaCl₂进行调浆处理，补加甲醇浓度至0.2-1.0% w/v。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中发酵条件为：温度28-35℃，时间24-64小时，接种量1-5% v/v。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中发酵后调整乙醇浓度至1-2% w/v和乙酸浓度至0.5-3.5% w/v。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中培养条件为：温度30-35℃，时间16-24小时，接种量4-7% v/v。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中发酵过程补加乙醇酒基，控制乙醇浓度为1-3%w/v，甲醇浓度为0.2-1.0%w/v，发酵温度30-35℃，发酵时间24-48 小时。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中加入食盐中止发酵过程，沉淀过滤澄清、加水调配后制得富含吡咯喹啉醌的食醋。