CN107058187A - 一种少动鞘氨醇单胞菌菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明从福建省南平市顺昌县的金桔叶片中分离并筛选得到能够高产胞外多糖的菌株，该菌株为少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT‑10625(Sphingomonas paucimobilis)，并揭露了利用该少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT‑10625制备胞外多糖的方法。本发明的优点在于：提供一种新的少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT‑10625(Sphingomonas paucimobilis)，且利用该菌株制备获得胞外多糖的产量较高，从而增加了胞外多糖生产菌株的来源；且采用本发明少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT‑10625(Sphingomonas paucimobilis)制备胞外多糖的过程简单、易于操作。
Description
【技术领域】
本发明涉及一种微生物及其应用，具体涉及一种少动鞘氨醇单胞菌菌株及其应用。
【背景技术】
多糖是以单糖为基本组成单位，按一定方式重复排列而成的聚合物。用于食品加工的多糖俗称为胶质，即胞外多糖。胞外多糖可来源于动物、植物、微生物，海藻类胞外多糖主要包括琼脂和卡拉胶以及海藻酸及其衍生物。植物类胞外多糖包括阿拉伯胶、纤维素胶及其衍生物、魔芋粉等。微生物胞外多糖主要包括黄原胶、结冷胶、卡拉胶等，具有粘着性、稳定性、乳化性和凝胶性等特点，在食品、医药领域等方面都有着广泛的应用，尤其是近些年来，随着分子生物学技术的引入，多糖在抗凝血、延缓衰老、抗癌防癌、疾病免疫等方面的功能也逐渐被揭示出来。按其用途，胞外多糖又可被分类为增稠剂和胶凝剂，可作为食品添加剂、凝结剂、保鲜剂等。已报道的可产胞外多糖的微生物菌属有鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、农杆菌属 (Agrobacterium)、黄单胞菌属(Xanthomonas)等。但现有微生物产胞外多糖的产量均较低，是胞外多糖大规模产业化的主要限制因素，因此从业者需要进一步研究，以期获得产量较高的新的胞外多糖生产菌株。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题在于提供一种少动鞘氨醇单胞菌菌株，该菌株为少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-10625(Sphingomonas paucimobilis)，于2016 年01月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为 CGMCC NO.11996，并揭露了利用该菌株制备胞外多糖。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：
本申请人从福建省南平市顺昌县的金桔叶片中分离并筛选得到能够高产胞外多糖的菌株，通过对该菌株进行生理生化特性测定和脂肪酸 Sherlock-MIDI系统分析，最终鉴定其为少动鞘氨醇单胞菌的一个菌株。
进一步地，利用该菌株制备胞外多糖，其制备方法的具体步骤为：
(1)权利要求1中所述的少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-10625的活化：用接种环将权利要求1中所述的少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-10625划线于 NA平板上，并于恒温培养箱中培养48h，且培养温度为30℃；
(2)制备种子液：将步骤(1)所获得的少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-10625 的单菌落接种于种子培养基中，并将其置于恒温振荡摇床中培养16h，温度 30℃，转速170rpm·min-1；
(3)制备发酵液：按体积百分比为2％的接种量将步骤(2)所获得的种子液转入已消毒灭菌的发酵培养基中发酵培养72h，温度30℃，转速190 rpm·min-1，即得发酵液；
(4)胞外多糖的提取：将步骤(3)所得的发酵液进行离心分离，收集上清液，向上清液中加入冰乙醇，且冰乙醇与上清液的体积比为3：1，之后于4℃下静置过夜沉降胞外多糖；接着将静置后的溶液进行离心分离，收集沉淀物；采用无水乙醇洗涤沉淀物3遍，然后氮气吹干，最后粉碎即得所述胞外多糖产品。
进一步地，所述NA平板的组分为：牛肉膏3g·L-1、蛋白胨5g·L-1、葡萄糖10g·L-1、酵母膏1g·L-1、琼脂粉17g·L-1、pH 7.2。
进一步地，所述种子培养基的组分为：蔗糖20g·L-1、蛋白胨5g·L-1、酵母膏5g·L-1、pH 7.0。
进一步地，所述发酵培养基的组分为：葡萄糖30g·L-1、蛋白胨3g·L-1、酵母膏2g·L-1、KH2PO4 1g·L-1、MgSO4 0.1g·L-1、微量元素盐溶液1mL·L-1、 pH 7.0；
其中，微量元素盐溶液的组分为：MnCl2·4H2O 1.8g·L-1、FeSO4·7H2O 2.4 g·L-1、H3BO3 0.283g·L-1、CuCl2 0.0027g·L-1、CoCl2·6H2O 0.0074g·L-1。
本发明的有益效果在于：
提供一种新的少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-10625(Sphingomonaspaucimobilis)，并利用该少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-10625制备胞外多糖，且制备获得胞外多糖的产量较高，即该少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-10625能够高产胞外多糖，从而增加了胞外多糖生产菌株的来源；且采用本发明少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-10625(Sphingomonas paucimobilis)制备胞外多糖的过程简单、易于操作。
【附图说明】
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。
图1是本发明中菌株FJAT-10625的脂肪酸图谱。
【具体实施方式】
本发明一种少动鞘氨醇单胞菌菌株即少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-10625(Sphingomonas paucimobilis)是从福建省南平市顺昌县的金桔叶片中分离并筛选得到能够高产胞外多糖的菌株，并揭露了利用该少动鞘氨醇单胞菌菌株 FJAT-10625制备胞外多糖的方法。
为了能够清楚的阐述本发明，本申请人给出了如下几个具体实施例。
实施例1、该菌株FJAT-10625的分离：
(1)分别称取福建省南平市顺昌县的金桔叶片5g，先将叶片用自来水冲洗干净，吸干叶片表面的水，之后在75％酒精里浸泡30s，接着用10％次氯酸钠浸泡5min，再用无菌水漂洗叶片3次；
(2)为了检验表面灭菌的效果，用灭过菌的镊子夹着经步骤(1)处理后的叶片，并使叶片表面与NA平板接触2min，然后把NA平板放在30℃下培养2d，若发现NA平板上没有菌落出现，证明该叶片表面灭菌彻底，能够作为后续操作使用，否则舍弃不能使用。
(3)取经步骤(2)检验后灭菌彻底的叶片，在无菌操作下，将叶片剪碎至研钵里并加入45mL无菌水，充分研磨匀浆制成10-1样品原液，静置30min；之后依次将样品原液进行梯度稀释，选用稀释度为10-2，10-3的稀释液；
(4)取200μL步骤(3)选用的稀释液并分别加到NA平板上，涂布至平板干燥，试验重复3次；将涂布后的NA平板置于30℃的恒温培养箱培养，培养24h后观察NA平板上长出的菌落的形态，挑取表面致密、颜色为金黄色的单菌落；并将所挑取的单菌落接种于种子液培养基中，30℃下培养16h 后得种子液；将所得种子液接入发酵培养基中进行发酵培养中，发酵培养72 h，温度30℃；发酵所得发酵液进行离心分离(室温下，转速6000rpm·min-1离心10min)，收集上清液，向上清液中加入冰乙醇，且冰乙醇与上清液的体积比为3：1，之后于4℃下静置过夜沉降胞外多糖；接着将静置后的溶液进行离心分离(室温下，转速6000rpm·min-1离心10min)，收集沉淀物；采用无水乙醇洗涤沉淀物3遍，然后氮气吹干，最后粉碎即得胞外多糖产品，称干重；比较不同菌株的胞外多糖产品产量，筛选出胞外多糖产品产量最高的菌株，并将该菌株命名为菌株FJAT-10625。
实施例2、该菌株FJAT-10625的鉴定
(1)生理生化特性鉴定：
将筛选获得的菌株FJAT-10625进行生理生化特性的测定，得到该菌株的主要形态学特征如下：菌落较小、圆形、黄色、表面光滑且湿润、微隆、边缘整齐、不透明、具有迁移性。
(2)Sherlock-MIDI系统鉴定：采用美国MIDI公司生产的微生物自动鉴定系统(Sherlock Microbial Identification System)对菌株FJAT-10625的脂肪酸进行分析，分析结果表明，该菌株FJAT-10625的脂肪酸与Sherlock-MIDI 系统中标准少动鞘氨醇单胞菌菌株的脂肪酸的相似系数达0.709；该菌株 FJAT-10625的脂肪酸图如图1所示。
综合上述2种方法的鉴定结果，则判定菌株FJAT-10625为少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)。
实施例3、利用该菌株FJAT-10625制备胞外多糖
该菌株FJAT-10625的活化：用接种环将所述的少动鞘氨醇单胞菌菌株 FJAT-10625划线于NA平板上，并于恒温培养箱中培养48h，且培养温度为 30℃；
制备种子液：将菌株FJAT-10625活化所获得的少动鞘氨醇单胞菌菌株 FJAT-10625的单菌落接种于种子培养基中，并将其置于恒温振荡摇床中培养 16h，温度30℃，转速170rpm·min-1，得种子液；
制备发酵液：按体积百分比为2％的接种量将所得的种子液转入已消毒灭菌的发酵培养基中发酵培养72h，温度30℃，转速190rpm·min-1，即得发酵液；
胞外多糖的提取：将所得发酵液进行离心分离(室温下，转速6000 rpm·min-1离心10min)，收集上清液，向上清液中加入冰乙醇，且冰乙醇与上清液的体积比为3：1，之后于4℃下静置过夜沉降胞外多糖；接着将静置后的溶液进行离心分离(室温下，转速6000rpm·min-1离心10min)，收集沉淀物；采用无水乙醇洗涤沉淀物3遍，然后氮气吹干，最后粉碎即得所述胞外多糖产品。
实施例4、本发明制得的胞外多糖测定
采用苯酚-硫酸法测定实施例3制得的胞外多糖产品中中性多糖的含量：取实施例3制得的胞外多糖产品精确配制2g·L-1的胞外多糖溶液，量取0.4mL 所配制的胞外多糖溶液，并采用超纯水补足至1mL，接着加入0.5mL 6％苯酚溶液和3mL浓硫酸，振荡混匀后沸水浴20min，然后冷却至室温，最后于 490nm波长处测定吸光度，以葡萄糖为对照，测定的结果如下表1。
表1胞外多糖产品中中性糖的含量
由表1可知，本发明制得的胞外多糖产品中中性多糖的含量高达2.333 g·L-1，因此，表明了利用本发明菌株FJAT-10625能够高产胞外多糖。
需要说明的是，在本发明中，NA平板的组分为：牛肉膏3g·L-1、蛋白胨 5g·L-1、葡萄糖10g·L-1、酵母膏1g·L-1、琼脂粉17g·L-1、pH 7.2；种子培养基的组分为：蔗糖20g·L-1、蛋白胨5g·L-1、酵母膏5g·L-1、pH 7.0；发酵培养基的组分为：葡萄糖30g·L-1、蛋白胨3g·L-1、酵母膏2g·L-1、KH2PO4 1g·L-1、MgSO4 0.1g·L-1、微量元素盐溶液1mL·L-1、pH7.0；发酵培养基中微量元素盐溶液的组分为：MnCl2·4H2O 1.8g·L-1、FeSO4·7H2O 2.4g·L-1、H3BO3 0.283g·L-1、CuCl2 0.0027g·L-1、CoCl2·6H2O 0.0074g·L-1。且在无特殊说明的情况下，本发明中的百分数均为质量百分数。
综上，本发明提供一种新的少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-10625 (Sphingomonaspaucimobilis)，并利用该少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-10625 制备胞外多糖，且制备获得胞外多糖的产量较高，即该少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-10625能够高产胞外多糖，从而增加了胞外多糖生产菌株的来源；且采用本发明少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-10625(Sphingomonas paucimobilis) 制备胞外多糖的过程简单、易于操作。
Claims (5)
1.一种少动鞘氨醇单胞菌菌株，其特征在于：所述菌株为少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-10625(Sphingomonas paucimobilis)，于2016年01月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.11996。
2.一种胞外多糖的制备方法，其特征在于：该制备方法具体包括如下步骤：
(1)权利要求1中所述的少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-10625的活化：用接种环将权利要求1中所述的少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-10625划线于NA平板上，并于恒温培养箱中培养48h，且培养温度为30℃；
(2)制备种子液：将步骤(1)所获得的少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-10625的单菌落接种于种子培养基中，并将其置于恒温振荡摇床中培养16h，温度30℃，转速170rpm·min-1；
(3)制备发酵液：按体积百分比为2％的接种量将步骤(2)所获得的种子液转入已消毒灭菌的发酵培养基中发酵培养72h，温度30℃，转速190rpm·min-1，即得发酵液；
(4)胞外多糖的提取：将步骤(3)所得的发酵液进行离心分离，收集上清液，向上清液中加入冰乙醇，且冰乙醇与上清液的体积比为3：1，之后于4℃下静置过夜沉降胞外多糖；接着将静置后的溶液进行离心分离，收集沉淀物；采用无水乙醇洗涤沉淀物3遍，然后氮气吹干，最后粉碎即得所述胞外多糖产品。
3.根据权利要求2所述的一种胞外多糖的制备方法，其特征在于：所述NA平板的组分为：牛肉膏3g·L-1、蛋白胨5g·L-1、葡萄糖10g·L-1、酵母膏1g·L-1、琼脂粉17g·L-1、pH7.2。
4.根据权利要求2所述的一种胞外多糖的制备方法，其特征在于：所述种子培养基的组分为：蔗糖20g·L-1、蛋白胨5g·L-1、酵母膏5g·L-1、pH 7.0。
5.根据权利要求2所述的一种胞外多糖的制备方法，其特征在于：所述发酵培养基的组分为：葡萄糖30g·L-1、蛋白胨3g·L-1、酵母膏2g·L-1、KH2PO4 1g·L-1、MgSO4 0.1g·L-1、微量元素盐溶液1mL·L-1、pH 7.0；
其中，微量元素盐溶液的组分为：MnCl2·4H2O 1.8g·L-1、FeSO4·7H2O 2.4g·L-1、H3BO30.283g·L-1、CuCl2 0.0027g·L-1、CoCl2·6H2O 0.0074g·L-1。
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