CN104946572A - 一种热凝性多糖、其发酵菌株及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一株产新型热凝性多糖（PGHX）菌株及其应用，属于生物工程技术领域。包括上述菌株应用于发酵制备新型热凝性多糖（PGHX）的方法，该发酵产物（PGHX）的结构特征及其热凝性能等内容。具体涉及该土壤杆菌筛选方法，该菌株经鉴定命名为土壤杆菌（Agrobacterium HX1126）保藏编号为CGMCC 10943，以及利用该微生物生产发酵产物（PGHX）的方法。该微生物在好氧条件下，发酵培养48～90小时，产量可达到24.9g/L发酵液。该菌所产多糖PGHX具有良好的热凝性能，在30g/L浓度下，100℃加热10分钟，可形成热凝胶，凝胶强度245～1450g/cm2，产品色泽纯白，胶体为半透明状，具有弹性。
Description
技术领域
本发明公开了一株土壤杆菌及其应用于发酵制备新型热凝性多糖（PGHX）的方法并且公开了该发酵产物的结构特征及其热凝性能。具体涉及该土壤杆菌筛选方法，该菌株经鉴定命名为土壤杆菌（Agrobacterium sp. HX1126）保藏编号为CGMCC 10943，以及利用该微生物生产PGHX的方法。
背景技术
每年，全球石化工业生产的塑料高达数千万吨，而其中部分用于生产附加值低且易损耗的各种包装盒、袋及农用地膜等，这些产品使用后散布于地表或漂浮于水面，难以循环再利用。更甚者，由于其生物不可降解性，造成了日益严重的生态环境污染。环境污染的压力已使许多国家考虑采用生物可降解塑料替代部分化工合成塑料，并陆续颁布了一些法规禁用某些塑料制品，同时鼓励科研人员加大对生物可降解塑料的研究力度。在此类研究中，由于具有生物可相容性和生物可降解性，采用发酵法生产聚羟基烷酸( Polyhydroxyalkanoate 简称PHAs)以及聚β-羟基丁酸( PHB)成为研究的热点。但与化工合成的塑料相比，生产成本较高，所以许多研究人员一直致力于提高发酵法生产强度和采用新的提取技术的研究，以期降低生产成本，提高市场竞争。
生产生物柴油过程中，甘油是其所产生副产物之一，由于生物柴油的迅猛发展产生了大量的副产物，大量的副产物的积累给环境造成极大的污染，对副产物的开发利用势在必行。
发明内容
本发明发明人对生物可降解材料的研究比较感兴趣，在筛选产PHB菌株的过程中，筛选到一株发酵液具有热凝性质的菌株，该菌株经鉴定为土壤杆菌，并命名为Agrobacterium sp. HX1126。在对该菌株发酵产热凝性产物的发酵条件，产物提取等方面进行研究的过程中发现，该菌株可利用甘油为唯一碳源，发酵产热凝性产物。经鉴定该产物为Agrobacterium sp. HX1126产胞外多糖，单糖组成成分为半乳糖。值得一提的是，该产物具有良好的吸水性能，可吸收超过30倍自身质量的水分，同时，该产物具有良好的热凝性能，30 g/L 浓度下，100℃加热10分钟，可形成热凝胶，凝胶强度245～1450 g/cm2，并且，随着研究的不断深入，凝胶强度有望得到继续提高。发酵过程中利用甘油作为低成本生产原料生产具有热凝性质且可生物降解的新型热凝性多糖（PGHX），不仅具有良好的经济前景而且对环境保护可以起到促进作用。
另外，提取工艺与采用发酵法生产聚羟基烷酸( Polyhydroxyalkanoate 简称PHAs)以及聚β-羟基丁酸( PHB)的提取工艺相比，简单易行。PHAs或者PHB作为胞内多糖，提取时通常需要对细胞进行破壁处理，提取成本相对比较高。而本发明说述具有热凝性的新型多糖（PGHX），该种多糖作为水不溶性胞外多糖，在本发明中，只需经过酒精，水的漂洗就可获得，所用酒精可通过旋转蒸发回收再利用。所得产品色泽纯白，凝胶后胶体为半透明状，具有很好的弹性。
本发明的一个目的，一株土壤杆菌（Agrobacterium sp.）HX1126，已于2015年06月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中科院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为CGMCC No. 10943。
本发明的另一个目的，提供了利用上述菌株进行发酵及提取吸水多糖的方法，包括如下步骤：
第1步、斜面培养：将菌株划线接种于斜面培养基中进行培养；
第2步、种子培养：将第1步中斜面种子接种至种子培养基进行培养；
第3步、发酵培养：按5～15%的接种量将培养好的种子接入发酵培养基进行培养，得到发酵液产物；
第4步、提取产物：提取采用如下两种方法之一，第一种：将发酵液产物过滤除杂，除上清，再依次加入乙醇和水进行清洗、除上清，离心分离后得到产物，冷冻干燥后即得；第二种：将发酵液产物过滤除杂，静置除上清，再加入NaOH 溶液，离心后，收集上清液，再于上清液中加入HCl溶液，调节pH至中性，离心后取沉淀，用水洗涤，冷冻干燥后即得。
所述的第1步中，斜面培养基中包含如下质量百分比的组分：20～50 g/L 甘油或者D-甘露醇，1-10 g/L 酵母粉，1～10 g/L 蛋白胨，1～10g/L 牛肉膏，15～20 g/L 琼脂，pH 6.5～7.5；发酵温度28～32℃，培养时间40～60小时。
所述的第2步中，种子培养基中包含如下质量百分比的组分：20～50 g/L 甘油或者D-甘露醇，1～10 g/L 酵母粉，1～10 g/L 蛋白胨，1～10 g/L 牛肉膏，1～5 g/L (NH4)2HPO4，0.5～5 g/L KH2PO4，5～20 ml/L 玉米浆，pH 6.5～7.5；发酵温度28～32℃，培养时间20～30小时。
所述的第3步中，发酵培养基中包含如下质量百分比的组分：5～60 g/L 甘油或者D-甘露醇，1～10 g/L 酵母粉，1～10 g/L (NH4)2HPO4，5～20 ml/L玉米浆，0.5～3g/L MgSO4·7H2O，0.2～1 g/L FeSO4·7H2O，0.02～1 g/L MnSO4·H2O，1g～20g/L NaHPO4·12H2O，1g～20g/L NaH2PO4·2H2O，pH 5.3～8.3；发酵温度28～32℃，好氧培养48～90小时。
培养基的灭菌温度为115～121℃，20min。碳源单独灭菌后分装，磷酸盐膜滤除菌。
所述的第4步中，第一种的提取方法参数是：乙醇的加入体积是发酵液体积的0.5～2倍，乙醇清洗次数为2次以上；水的加入体积是发酵液体积的5～10倍，水清洗次数为3次以上；第二种的提取方法参数是：NaOH溶液的体积是发酵液的1～3倍，浓度是0.5N，HCl溶液浓度是1N。
本发明的另一个目的，提供了利用上述菌株在发酵及提取PGHX中的应用。
本发明的另一个目的，一种具有吸水性，热凝性的多糖；
化学名称：β-1,3-聚半乳糖
分子式：（C6H10O5）n
n——聚合度，n>50。
结构式：
；
其中：
(1) n>50，当聚合度低于50时，该种多糖将较难形成热凝胶。聚合度与凝胶强度有关，聚合度越大，凝胶强度就越大。另外，发酵周期短，产物聚合度低；发酵周期长，产物聚合度高。可根据实际需求，生产不同聚合度，即不同凝胶强度的该种热凝性多糖。
(2) 本发明所涉及的多糖PGHX是以半乳糖为糖单元，以β 1-3糖苷键连接的直链线性结构。
(3)该产物具有良好的吸水性能，能吸收自身质量30倍甚至更多水分；
(4)具有良好的热凝性能，上述的多糖配置成30 g/L的水溶液，100℃加热10分钟，形成热凝胶，凝胶强度245～1450 g/cm2。
本发明筛选得到的产热凝性多糖的菌株，经16S rRNA基因测序和按《伯杰氏细菌鉴定手册》进行生理生化鉴定，认为该菌株属土壤杆菌属（Agrobacterium sp.）。该菌的细胞呈短杆状，革兰氏阴性，好氧。在斜面培养基上培养48小时，菌落呈圆形，淡黄色，表面光滑，边缘整齐。
生物样品材料保藏：本发明筛选得到的土壤杆菌（Agrobacterium sp.）菌株HX1126已保存在中国北京中关村中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，保藏编号为CGMCC No. 10943，保藏日期2015年06月02日。
有益效果
1 本发明的特点是从大量微生物中筛选得到产一种新的多糖的土壤杆菌HX1126，其在合适条件下，能产这种多糖，产率可以达到24.9 g/L以上。
2 对该种多糖的结构进行分析（单糖组成，红外光谱，核磁），该种多糖的单糖组成为半乳糖，是一种新型多糖；同时，该种多糖具备热凝性，生物可降解性，高吸水性，这些性能使该种多糖具有在生物可降解材料，医药，化妆，食品等领域具有广泛的应用前景；
3 本发明提取工艺简单，产品色泽纯白，所得产品胶体呈半透明状，且该产品的凝胶强度可以达到245～1450 g/cm2。
附图说明
图1a是产品外观；
图1b是凝胶外观；
图1c是凝胶被拉伸之后显示其弹性的表观效果图；
图2a是单糖组成分析，标准品的保留时间图，图谱中的图例1是氨基葡萄糖，2是鼠李糖，3是阿拉伯糖，4是氨基半乳糖，5是半乳糖，6是葡萄糖，7是木糖，8是甘露醇，9是果糖，10是核糖；
图2b是提取得到的产物的单糖组成分析，样品的保留时间图；
图3是产品红外光谱；
图4是产品氢谱；
图5是产品碳谱；
图6是异核二维谱。
具体实施方式
以下是土壤杆菌 （ Agrobacterium ）CGMCC 10943筛选、鉴定及发酵生产聚半乳糖研究的实施例。但本发明并不限于所列出的几个实例。
实施例1 菌株筛选
从京杭运河无锡段，江南大学处取土样6份。将样品于筛选培养基中，30℃，180rpm培养20小时后，稀释，涂布于筛选平板，30℃，培养72小时后挑选出单菌落划线分离培养。将菌株接种于装有30ml筛选培养基的三角瓶中，30℃，180rpm培养80小时。其中一瓶发酵液在煮沸处理的过程中，表现出热凝性质，挑选出该株菌株，进一步对其发酵条件，发酵产物进行研究。
筛选培养基：50 g/L 葡萄糖，1.5 g/L 酵母粉，0.3 g/L 蛋白胨，0.2 g/L 牛肉膏，1-2 g/L (NH4)2SO4，1g/L KH2PO4，2g/L CaCO3，0.5g/L MgSO4·7H2O，pH 6.5-7.5。
实施例2 发酵培养产PGHX
（1）斜面培养：将菌株划线接种于斜面培养基（20g/L 甘油，5 g/L 酵母粉，2 g/L 蛋白胨，2g/L 牛肉膏，20 g/L 琼脂，pH 6.5-7.5），28-32℃，培养40-60小时，备用。
（2）种子培养：将步骤（1）中斜面种子接种至种子培养基（20g/L 甘油，1-5 g/L 酵母粉，2 g/L 蛋白胨，2 g/L 牛肉膏，1-2 g/L (NH4)2HPO4，1 g/L KH2PO4，10-20 ml/L 玉米浆，pH 6.5-7.5），250ml三角瓶装液40-100ml，于28-32℃培养20-30小时。
（3）发酵培养：按5-15%的接种量将培养好的种子接入发酵培养基（50 g/L 甘油，1-2 g/L 酵母粉，1-2 g/L (NH4)2HPO4，2 ml/L玉米浆，0.5g/L MgSO4·7H2O，0.2 g/L FeSO4·7H2O，0.02 g/L MnSO4·H2O，5g-10g/L NaHPO4·12H2O，5g-10g/L NaH2PO4·2H2O，pH 5.3-7.3），培养温度28-32℃，好氧培养48-90小时。
以上各步发酵过程中，碳源除了甘油以外，还可以采用D-甘露醇替代。
（4）产物提取：
方法一：
发酵产物为水不溶性多糖，发酵结束后，将发酵液于纱布上过滤以去除部分杂质；收集发酵液，去除上清。加入0.5-2倍体积乙醇，搅拌5分钟，静置，去除上清液，重复两次；加入5-10倍体积自来水，搅拌5分钟，静置，去除上清，重复3次；离心，收集产物，冷冻干燥。产物如图1a的外观所示。产物纯度 >80%，凝胶强度245～1450 g/cm2。
方法二：
发酵产物为水不溶性多糖，发酵结束后，将发酵液于纱布上过滤以去除部分杂质；收集发酵液，静置后去除上清。加入1-3倍体积0.5N NaOH 溶液，搅拌1h，10000rpm离心30min，收集上清液。于上清液中加入1 N HCl 溶液，调溶液pH至中性，会有白色沉淀生成。10000rpm离心30min，收集白色沉淀，10倍体积自来水清洗，去除上清，重复3次；离心，收集产物，冷冻干燥。采用该种提取方法，产物纯度 >90%，凝胶强度245～358 g/cm2。
实施例3 产物结构分析
（1）单糖组成
取实施例2中（提取方法一）制备得到的样品适量，加入 2 mol/L 三氟醋酸，氮气保护下120 ℃水解2小时后去除三氟醋酸，加入适量去离子水，采用离子色谱仪（HPAEC）测定单糖组成。仪器型号：Dionex ICS-5000 (USA)， 柱型号：CarboPac PA20 (4 mm × 240 mm)。
结果显示（图2a和图2b，图2b中样品与图2a中的标准品的保留时间一致），该种多糖的单糖组成为半乳糖。
（2）红外光谱
将样品与KBr混合并在研钵中研磨至极细，压成薄片，采用美国Thermo公司，Nexus型红外色谱仪在400-4000 cm-1区间内扫描。
如图3所示，该产物具有明显的多糖特征，889cm-1显示该糖由β糖苷键连接，3415.7 cm-1为O-H，2917.8 cm-1为C-H。
（3）高碘酸氧化
取多糖样品25mg,溶于30mM高碘酸钠溶液,定容至25mL,4X:避光反应，分别于0h、6h、12h、24h、36h, 48h…等时间段间隔取样0.1 mL，用去离子水定容至25mL，测定OD 223nm。至OD值稳定时，加乙二醇破坏过量的高碘酸。计算高碘酸消耗量。取2mL反应液,滴定法测定甲酸生成量。
不同时间点取样测定OD 223nm，其紫外吸收光度值始终保持恒定数值，表明并未有高碘酸消耗；同时，氢氧化钠滴定法分析，亦无甲酸产生。根据该实验结果，得出结论为该多糖是以不消耗高碘酸钠的半乳糖残基以（1-3）糖苷键进行连接的多糖。
（4）核磁
将适量样品溶于氘代二甲基亚砜（DMSO）中，采用仪器：Bruker Avance III spectrometer，400 MHz。测产物氢谱、碳谱。
根据实验结果，分析得出该种多糖的结构式为：
如图4，图5，图6所示，氢谱显示H数目与该结构式氢数目相符合。具体分析结果如下： 5.123（s，1H，OH-6），4.568（m，2H，OH-2，OH-4），4.447（s，1H，H-1），3.633（s，1H，H-6），3.386-3.369（m，2H，H-3，H-6），3.272-3.185（m，3H，H-4，H-2，H-5）。
碳谱显示PGHX的碳架含有六种碳，与其结构式相符合；另外，在异头碳区域只有一组信号，且化学位移大于103，表明该种多糖是以无分枝单一β糖苷键连接；分析后得出结论如下：103.52 (C-1), 86.68 (C-3), 73.32 (C-2), 68.89 (C-4), 76.80 (C-5)，61.35 (C-6)。
根据分子量大小，其中，n>50，通过调节发酵参数，也可以获得n>100、n>200、n>300、n>400、n>500……的多糖。
实施例4产品性能
（1）吸水性
取实施例2中（提取方法一，发酵时间60小时）适量产品（质量m1），加入数倍体积水分，混匀，沸水浴10min。冷却后将胶体取出，去除表面水分，称重（m2）。
实验证明，该种多糖可以吸收超过自身重量30倍以上的水分。
（2）凝胶强度
取0.6 g样品(实施例2中，提取方法一）于20 ml水中，搅拌5 min，然后将悬浮液转移至18mm x l80mm的试管中，在真空状态下曝气3min，然后将试管放入沸水浴10min，然后在冷水中冷却20min。从试管中取出凝胶，取离底部10 mm-20mm处的一段10mm的凝胶，在物性测定仪上(Rheo Meter Model CR-200D ，Sun Scientific Co., Ltd.,Japan; Load cell: 1,000 g.) 采用P/0.5号探头测定凝胶破碎时所受的力B(g)，并按以下公式计算凝胶强度(Gel Strength)。
Gel Strength(g/cm2) = B/πr2
式中r为P/0.5号探头的半径(cm)。
经检测，该种多糖的凝胶强度可以达到245～1450 g/cm2。凝胶的外观如图1b和图1c所示，从图中可以看出，凝胶具有较好的弹性。
（5）分子量测定
采用Sephadex G-200凝胶层析分析发酵产物分子量： Sephadex G-200凝胶层析柱， 1% NaCl洗脱，自动分部收集，苯酚-硫酸法检测发酵产物出峰位置。采用T系列标准葡聚糖作为参照，计算分子量。
由上表可以得出结论，聚合度越高，凝胶强度就越大。另外，影响凝胶强度的还有产物的吸水性能。
Claims (9)
1.一株土壤杆菌（Agrobacterium sp.）HX1126，已于2015年06月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC )，保藏编号为CGMCC No.10943。
2.一种利用土壤杆菌进行发酵及提取吸水多糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：
第1步、斜面培养：将权利要求1所述的土壤杆菌（Agrobacterium）HX1126菌株划线接种于斜面培养基中进行培养；
第2步、种子培养：将第1步中斜面种子接种至种子培养基进行培养；
第3步、发酵培养：按5～15%的接种量将培养好的种子接入发酵培养基进行培养，得到发酵液产物；
第4步、提取产物：提取采用如下两种方法之一，第一种：将发酵液产物过滤除杂，除上清，再依次加入乙醇和水进行清洗、除上清，离心分离后得到产物，冷冻干燥后即得；第二种：将发酵液产物过滤除杂，除上清，再加入NaOH 溶液，离心后，收集上清液，再于上清液中加入HCl溶液，调节pH至中性，离心后取沉淀，用水洗涤，冷冻干燥后即得。
3.根据权利要求2所述的利用土壤杆菌进行发酵及提取吸水多糖的方法，其特征在于：所述的第1步中，斜面培养基中包含如下质量百分比的组分：20～50 g/L 甘油或者D-甘露醇，1-10 g/L 酵母粉，1～10 g/L 蛋白胨，1～10g/L 牛肉膏，15～20 g/L 琼脂，pH 6.5～7.5；发酵温度28～32℃，培养时间40～60小时。
4.根据权利要求2所述的利用土壤杆菌进行发酵及提取吸水多糖的方法，其特征在于：所述的第2步中，种子培养基中包含如下质量百分比的组分：20～50 g/L 甘油或者D-甘露醇，1～10 g/L 酵母粉，1～10 g/L 蛋白胨，1～10 g/L 牛肉膏，1～5 g/L (NH4)2HPO4，0.5～5 g/L KH2PO4，5～20 ml/L 玉米浆，pH 6.5～7.5；发酵温度28～32℃，培养时间20～30小时。
5.根据权利要求2所述的利用土壤杆菌进行发酵及提取吸水多糖的方法，其特征在于：所述的第3步中，发酵培养基中包含如下质量百分比的组分：5～60 g/L 甘油或者D-甘露醇，1～10 g/L 酵母粉，1～10 g/L (NH4)2HPO4，5～20 ml/L玉米浆，0.5～3g/L MgSO4·7H2O，0.2～1 g/L FeSO4·7H2O，0.02～1 g/L MnSO4·H2O，1g～20g/L NaHPO4·12H2O，1g～20g/L NaH2PO4·2H2O，pH 5.3～8.3；发酵温度28～32℃，好氧培养48～90小时。
6.根据权利要求2所述的利用土壤杆菌进行发酵及提取吸水多糖的方法，其特征在于：所述的第4步中，第一种的提取方法参数是：乙醇的加入体积是发酵液体积的0.5～2倍，乙醇清洗次数为2次以上；水的加入体积是发酵液体积的5～10倍，水清洗次数为3次以上；第二种的提取方法参数是：NaOH溶液的体积是发酵液的1～3倍，浓度是0.5N，HCl溶液浓度是1N。
7.权利要求1所述的土壤杆菌（Agrobacterium）HX1126在发酵及提取吸水多糖中的应用。
8.一种具有吸水性、热凝性的多糖，其特征在于，它的结构如下所示：
；其中，n>50。
9.根据权利要求8所述的具有吸水性的多糖，其特征在于：所述的多糖吸收水的重量是自身重量的30倍以上，上述的多糖配置成30 g/L的水溶液，100℃加热10分钟，形成热凝胶，凝胶强度范围245～1450 g/cm2。
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| CN104946572B (zh) | 2018-05-08 |
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|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Liu Yongmei Inventor after: Yu Xiaojun Inventor after: Yu Xiaobin Inventor after: Gu Qiuya Inventor before: Liu Yongmei Inventor before: Yu Xiaojun Inventor before: Yu Xiaobin |
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| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |