CN102206689B - 一种在发酵过程中改性细菌纤维素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属微生物发酵领域，涉及一种在发酵过程中改性细菌纤维素的方法，是将细菌纤维素发酵生产用菌株活化后制备种子液；将种子液加入到添加有羟丙甲基纤维素和羧甲基纤维素钠的发酵培养基中，静置发酵；收集培养基表面产生的细菌纤维素膜，碱洗，干燥至水含量低于5％。本发明简单易行，不需要后期处理，可直接在细菌纤维素发酵过程中改变其网状结构，降低其分子内和分子间的氢键作用，并且所用试剂成本较低，无需特殊设备，制备得到的细菌纤维素产品具有很好的复水性，扩大了其应用的范围。
Description
技术领域
本发明属微生物发酵领域，涉及一种在发酵过程中改性细菌纤维素的方法，以及利用此方法制备得到的细菌纤维素。
背景技术
细菌纤维素(Bacterial cellulose，BC)是指在不同条件下，由醋酸菌属(Acetobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)和八叠球菌属(Sarcina)等中的某种微生物合成的纤维素的统称。与天然纤维素相比，其具有高纯度、高结晶度、高聚合度、高持水性等优良性质，已广泛应用于各个领域。
现有的细菌纤维素均是在液体培养基中生产制备，得到的细菌纤维素凝胶膜含水量在98％以上，水分活度高，微生物极易滋生繁殖，不耐贮藏，同时由于水分含量高，体积庞大，运输和携带不便，运输费用昂贵。现通常通过压缩或干燥降低凝胶膜的含水量，减少体积和重量，方便运输。但压缩或干燥去除水分后细菌纤维素会变成一个很薄而且坚硬致密的半透明细菌纤维素干燥膜，因为细菌纤维素中存在大量的羟基可以形成很强的分子内和分子间氢键，这种氢键的作用使得这种干燥膜的复水率只能达到细菌纤维素自重的3-5倍，所以干燥后再复水得到的凝胶膜相对于原凝胶膜来说，状态和性质都有了很大改变，一些优良特性也被破坏，并且体积大大减小，成本增加，使其应用受到限制。
2009年12月2日公开的中国专利申请(CN101591448A)公开了一种高复水性细菌纤维素膜的制备方法，其制备的步骤是：(1)将已脱除细菌和培养基的细菌纤维素水凝胶膜碱化处理；(2)将处理后的膜进行醚化处理；(3)将醚化膜进行中和反应处理，得到羟丙基化的细菌纤维素膜；(4)将羟丙基化的细菌纤维素膜干燥，即得高复水性细菌纤维素膜。此发明利用细菌纤维素表面羟丙基化改性的方法破坏纤维素中部分氢键，通过复水率的测试发现干燥后的羟丙基化细菌纤维素膜具备很高的复水性和再溶胀能力。但此方法处理过程复杂，所用试剂成本较高，不利于大规模工业化生产，且使用的醚化试剂具有刺激性和毒性，在处理过程中会对工人身体有所损伤，并且在最终产品中很容易有残留，使产品无法应用于食品保健品行业。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种在发酵过程中改性细菌纤维素的方法，直接在细菌纤维素发酵过程中改变其网状结构，降低分子内和分子间的氢键作用，并且所用试剂成本低，无需特殊设备，不需要后期处理，制备得到的细菌纤维素产品具有很好的复水性。
本发明解决技术问题采用的技术方案是：一种在发酵过程中改性细菌纤维素的方法，包括以下步骤：
(1)活化细菌纤维素发酵生产用菌株，制备发酵生产用种子液；
(2)按体积比8～12％的接种量将种子液加入到含有供菌株生长的足量的碳源和氮源的发酵培养基中；所述发酵培养基中添加羟丙甲基纤维素和羧甲基纤维素钠；
(3)在25～35℃下静置发酵8～20天；
(4)收集培养基表面产生的细菌纤维素膜，碱洗，干燥至水含量低于5％。
本发明的方法，其中所述步骤(1)中的细菌纤维素发酵生产用菌株优选为木醋杆菌或木葡糖酸醋杆菌。
本发明的方法，其中所述步骤(1)中种子液的制备方法为将活化菌株接种至种子培养基中，25～35℃、150～220rpm培养20～48h；所述种子培养基中含有供菌株生长的足量的碳源和氮源。所述碳源优选为甘露醇、山梨醇和/或蔗糖。
本发明的方法，其中所述步骤(2)中的发酵培养基中羟丙甲基纤维素和羧甲基纤维素钠的重量百分比含量分别为0.1～10％、0.1～8％。优选添加有重量百分比0.5～5％的羟丙甲基纤维素和0.5～5％的羧甲基纤维素钠。最优选添加有重量百分比1％的羟丙甲基纤维素和1％的羧甲基纤维素钠。所述发酵培养基的碳源是菌种可以代谢利用的各种糖类物质，优选葡糖糖、果糖、蔗糖或椰子水；基于成本的考虑，更加优选以10～90％的椰子水作为碳源。
本发明的方法，其中所述步骤(2)中发酵培养基中还可以添加有表面活性剂，如吐温80、脂肪酸甘油酯等，添加量小于或等于0.1％。还可以根据需要添加易利用的无机氮源，如尿素等，促进菌株的代谢产膜。试验发现添加后对细菌纤维素的复水性能也有一定改进。
本发明简单易行，不需要后期处理，可直接在细菌纤维素发酵过程中改变其网状结构，降低其分子内和分子间的氢键作用，并且所用试剂成本较低，无需特殊设备，制备得到的细菌纤维素产品具有很好的复水性，扩大了其应用的范围。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中采用的原料如下：
HPMC(羟丙甲基纤维素)：取代基为甲氧基取代23％和羟丙氧基取代10％；
Na-CMC(羧甲基纤维素钠)：取代基为羧甲氧基取代65％；
吐温80：HLB 15；
脂肪酸甘油酯：HLB 3.6～4.0；
尿素(纯度≥99.5％)
实施例一
一种在发酵过程中改性细菌纤维素的方法，包括以下步骤：
(1)活化细菌纤维素发酵生产用菌株木葡糖酸醋杆菌，制备发酵生产用种子液：种子液体培养基含甘露醇25g/l，酵母提取物5g/l，蛋白胨3g/l，每1升摇瓶中装500ml液体培养基，180转、30度下培养24h得种子液；
(2)按体积比10％的接种量将种子液加入发酵培养基中，所述发酵培养基含：醋酸：0.2％，蔗糖：10％，HPMC：1％，Na-CMC：1％，其余为椰子水；
(3)30℃，250ml培养盘中静置培养14天；
(4)收集培养基表面形成的菌膜，在0.5N NaOH中煮沸10min，在室温下0.5N NaOH中浸泡24h，用去离子水漂洗至中性，测定其湿重为Wa，然后高速(3000rpm)离心30分钟，上清液测定质量为Wb，沉淀物冷冻干燥后称重为Wc，则可以得到产生的细菌纤维素产品的持水量为：
持水量(％)＝[(Wa-Wc)-Wb]/Wc×100％
再将冷冻干燥后的细菌纤维素(Wc)浸入去离子水中(W/V＝1∶2)，复水10min～7h，直至复水样品的质量(Wd)放置7小时也不再增加为止。复水率计算如下：
复水率(％)＝(Wd-Wc)/(Wa-Wb)×100％
本例得到的细菌纤维素产品持水量为10000％，复水率为35％。
实施例二
一种在发酵过程中改性细菌纤维素的方法，包括以下步骤：
(1)活化细菌纤维素发酵生产用菌株木葡糖酸醋杆菌，制备发酵生产用种子液：种子液体培养基含甘露醇25g/l，酵母提取物5g/l，蛋白胨3g/l，每1升摇瓶中装500ml液体培养基，180转、30度下培养24h得种子液；
(2)按体积比8％的接种量将种子液加入发酵培养基中，所述发酵培养基含醋酸：0.2％，葡萄糖：10％，HPMC：5％，Na-CMC：1％，其余为椰子水；
(3)30℃，250ml培养盘中静置培养16天；
(4)收集培养基表面形成的菌膜，在0.5N NaOH中煮沸10min，在室温下0.5N NaOH中浸泡24h，用去离子水漂洗至中性。按实施例一中方法测定其持水量为9000％，复水率为25％。
实施例三
一种在发酵过程中改性细菌纤维素的方法，包括以下步骤：
(1)活化细菌纤维素发酵生产用菌株木葡糖酸醋杆菌，制备发酵生产用种子液：种子液体培养基含甘露醇25g/l，酵母提取物5g/l，蛋白胨3g/l，每1升摇瓶中装500ml液体培养基，180转、30度下培养24h得种子液；
(2)按体积比12％的接种量将种子液加入发酵培养基中，所述发酵培养基含醋酸：0.2％，蔗糖：5％、果糖：5％，HPMC：1重％，Na-CMC：5％，其余为椰子水；
(3)30℃，250ml培养盘中静置培养12天；
(4)收集培养基表面形成的菌膜，在0.5N NaOH中煮沸10min，在室温下0.5N NaOH中浸泡24h，用去离子水漂洗至中性，按实施例一中方法测定其持水量为8500％，复水率为22％。
实施例四
一种在发酵过程中改性细菌纤维素的方法，包括以下步骤：
(1)活化细菌纤维素发酵生产用菌株木葡糖酸醋杆菌，制备发酵生产用种子液：种子液体培养基含甘露醇25g/l，酵母提取物5g/l，蛋白胨3g/l，每1升摇瓶中装500ml液体培养基，180转、30度下培养24h得种子液；
(2)按体积比10％的接种量将种子液加入发酵培养基中，所述发酵培养基含醋酸：0.2％，蔗糖：10％，HPMC：0.1％，Na-CMC：8％，其余为椰子水；
(3)30℃，250ml培养盘中静置培养18天；
(4)收集培养基表面形成的菌膜，在0.5N NaOH中煮沸10min，在室温下0.5N NaOH中浸泡24h，用去离子水漂洗至中性。按照实施例一中方法测定其持水量为8000％，复水率为20％。
实施例五
一种在发酵过程中改性细菌纤维素的方法，包括以下步骤：
(1)活化细菌纤维素发酵生产用菌株木葡糖酸醋杆菌，制备发酵生产用种子液：种子液体培养基含甘露醇25g/l，酵母提取物5g/l，蛋白胨3g/l，每1升摇瓶中装500ml液体培养基，180转、30度下培养24h得种子液；
(2)按体积比10％的接种量将种子液加入发酵培养基中，所述发酵培养基含醋酸：0.2％，蔗糖：10％，HPMC：10％，Na-CMC：0.1％，其余为椰子水；
(3)30℃，250ml培养盘中静置培养18天；
(4)收集培养基表面形成的菌膜，在0.5N NaOH中煮沸10min，在室温下0.5N NaOH中浸泡24h，用去离子水漂洗至中性。按照实施例一中方法测定其持水量为7500％，复水率为21％。
实施例六
一种在发酵过程中改性细菌纤维素的方法，包括以下步骤：
(1)活化细菌纤维素发酵生产用菌株木葡糖酸醋杆菌，制备发酵生产用种子液：种子液体培养基含甘露醇25g/l，酵母提取物5g/l，蛋白胨3g/l，每1升摇瓶中装500ml液体培养基，180转、30度下培养24h得种子液；
(2)按体积比10％的接种量将种子液加入发酵培养基中，所述发酵培养基含醋酸：0.2％，蔗糖：10％，HPMC：1％，Na-CMC：1％，吐温80：0.1重量％，尿素：0.05％，其余为椰子水；
(3)30℃，250ml培养盘中静置培养14天；
(4)收集培养基表面形成的菌膜，在0.5N NaOH中煮沸10min，在室温下0.5N NaOH中浸泡24h，用去离子水漂洗至中性。用实施例1中方法测定其持水量为11000％，复水率为38％。
实施例七
一种在发酵过程中改性细菌纤维素的方法，包括以下步骤：
(1)活化细菌纤维素发酵生产用菌株木葡糖酸醋杆菌，制备发酵生产用种子液：种子液体培养基含甘露醇25g/l，酵母提取物5g/l，蛋白胨3g/l，每1升摇瓶中装500ml液体培养基，180转、30度下培养24h得种子液；
(2)按体积比10％的接种量将种子液加入发酵培养基中，所述发酵培养基含醋酸：0.2％，蔗糖：10％，HPMC：1％，Na-CMC：1％，脂肪酸甘油酯：0.1％，尿素：0.1％，其余为椰子水；
(3)30℃，250ml培养盘中静置培养14天；
(4)收集培养基表面形成的菌膜，在0.5N NaOH中煮沸10min，在室温下0.5N NaOH中浸泡24h，用去离子水漂洗至中性。用实施例一中方法测定其持水量为11500％，复水率为40％。
实施例八
一种在发酵过程中改性细菌纤维素的方法，包括以下步骤：
(1)活化细菌纤维素发酵生产用菌株木葡糖酸醋杆菌，制备发酵生产用种子液：种子液体培养基含甘露醇25g/l，酵母提取物5g/l，蛋白胨3g/l，每1升摇瓶中装500ml液体培养基，180转、30度下培养24h得种子液；
(2)按体积比10％的接种量将种子液加入发酵培养基中，所述发酵培养基含醋酸：0.2％，葡萄糖：10％，HPMC：2％，Na-CMC：2％，吐温80：0.1％，尿素：0.1％，其余为椰子水；
(3)30℃，250ml培养盘中静置培养14天；
(4)收集培养基表面形成的菌膜，在0.5N NaOH中煮沸10min，在室温下0.5N NaOH中浸泡24h，用去离子水漂洗至中性。用实施例一中方法测定其持水量为10500％，复水率为33％。
本申请中涉及的百分比如没有特别说明，均指重量百分比。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种在发酵过程中改性细菌纤维素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)活化细菌纤维素发酵生产用菌株，制备发酵生产用种子液；
(2)按体积比8～12％的接种量将种子液加入到含有供菌株生长的足量的碳源和氮源的发酵培养基中；所述发酵培养基中添加羟丙甲基纤维素和羧甲基纤维素钠，所述发酵培养基中羟丙甲基纤维素和羧甲基纤维素钠的重量百分比含量分别为0.5～5％、0.5～5％；
(3)在25～35℃下静置发酵8～20天；
(4)收集培养基表面产生的细菌纤维素膜，碱洗，干燥至水含量低于5％。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述细菌纤维素发酵生产用菌株为木醋杆菌或木葡糖酸醋杆菌。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述种子液的制备方法为将活化菌株接种至种子培养基中，25～35℃、150～220rpm培养20～48h；所述种子培养基中含有供菌株生长的足量的碳源和氮源。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述种子培养基中的碳源为甘露醇、山梨醇或蔗糖中的一种或混合。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基中羟丙甲基纤维素和羧甲基纤维素钠的重量百分比含量分别为1％、1％。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基的碳源是葡糖糖、果糖、蔗糖或椰子水中的一种或混合。
7.根据权利要求1～6任一项所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基中添加有表面活性剂，添加量小于或等于0.1％。
8.权利要求1～7任一项所述的方法制备得到的改性细菌纤维素。
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