CN103819513B - 脱氧核糖核酸的洗脱液与洗脱方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种脱氧核糖核酸的洗脱液，包括酸碱缓冲溶液与离子液体；所述离子液体为含咪唑基阳离子的化合物，所述洗脱液的pH为5～13。本申请提供的洗脱液中含有含咪唑基阳离子的化合物，其与带负电的脱氧核糖核酸相互作用，促进脱氧核糖核酸自固相吸附材料表面洗脱；同时洗脱液的pH也能够降低固相吸附材料与脱氧核糖核酸片段之间的静电引力，进一步增加洗脱液的洗脱能力。本申请还提供了采用上述洗脱液将固相吸附材料吸附的脱氧核糖核酸洗脱的方法。
Description
技术领域
本发明涉及脱氧核糖核酸的分离与纯化的技术领域，尤其涉及用于洗脱脱氧核糖核酸的洗脱液与洗脱方法。
背景技术
固相萃取是一个包括液相和固相的物理萃取过程，在萃取过程中，固相对分析物的吸附力大于样品基液，当样品接触固相吸附材料时，分析物被吸附在固相吸附材料表面，再采用适当的溶剂将分析物洗脱下来。本申请中固相吸附材料是不溶的，具有能够与核酸主链的磷酸基团相互作用的表面的基质。固相吸附材料可以是多孔或非多孔颗粒、粉状颗粒或者纤维的形式，可以是纳米尺寸，也可以是微米尺寸，其基质表面可以修饰上指定的基团。而树枝状大分子是一类结构高度支化，规整精致，表面具有很高的官能团密度的新型高分子，其结构包括内核、与内核相连的重复单元内部结构，与最外层重复单元连接的尾部基团。最常见的是聚酰胺-胺结构的树枝大分子。
脱氧核糖核酸（DNA）在生物体内的含量较低。因而，高效、简便的DNA提取方法是影响后续分子生物技术如测序、变异分析、克隆等质量的重要一环。固相萃取法分离纯化DNA是利用某些固相介质，在某些特定的条件下，DNA被特异性地吸附在固相表面，再通过选择不同的洗脱条件，将杂质和DNA分步进行洗脱，从而获得纯化的DNA样品。
本领域内共知的基于有机溶剂的液相提取方法，如酚抽提法、异丙醇沉淀法以及甲酰胺裂解法等获得的DNA纯度比较高，能够满足后续的各种实验的要求。但是缺点也很明显，操作繁琐、用时长；而且，所用试剂具有一定的毒性。1979年，Vogelstein和Gillespiet首次在琼脂糖凝胶中加入高浓度碘化钠，使琼脂糖凝胶溶解，在该溶液中加入玻璃粉末，由于高浓度碘化钠的存在，扰乱了玻璃粉末表面上液态水的有序结构，使DNA吸附在玻璃粉末表面，经过离心后，用纯净水使DNA解吸，从而完成DNA的提取。相比于有机溶剂提取，这种提取方法操作方便、快速、不需要大量的有机溶剂，并且克服了液相提取中相分离不完全的缺点。因而，基于固相材料吸附-液相洗脱液解吸附的DNA提取方法越来越受到重视。但是由于Vogelstein和Gillespiet的提取法回收率仅在70%左右，后续的研究的重点之一旨在进一步提高回收率。
目前最常见的提高回收率的研究是从吸附机理上入手，提高DNA的吸附效率。由于DNA碱基上磷酸根的pKa约为1.2，其在很宽的pH值范围内都带负电，因而在固相吸附材料的基体表面键合上带正电荷的基团，通过静电引力作用可以显著提高吸附效率。Liu等人在石英材料表面键合上氨基对DNA进行萃取，Matsunaga等将聚酰胺-胺（PAMAM）树枝大分子键合在磁性纳米材料表面对DNA进行固相萃取，由于DNA和PAMAM的氨基之间结合力强，在洗脱液中加入2M氯化钠对DNA进行洗脱。2012年Tanaka等在一篇报道中使用相似的固相吸附方法，采用的洗脱液为1M磷酸盐，在吸附过程中需要加热到80℃。但是上述采用高盐溶液对DNA解吸的方法并不能有效克服DNA和固体吸附剂表面带正电基团的引力，洗脱能力较低。
发明内容
本发明解决的技术问题在于提供一种脱氧核糖核酸的洗脱液与洗脱方法，所述洗脱液对脱氧核糖核酸的洗脱率较高。
有鉴于此，本申请提供了一种脱氧核糖核酸的洗脱液，包括酸碱缓冲溶液与离子液体；所述离子液体为含咪唑基阳离子的化合物，所述洗脱液的pH为5～13。
优选的，所述酸碱缓冲溶液为磷酸盐、磷酸、金属氢氧化物、碳酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、硼酸和硼酸盐中的一种或多种。
优选的，所述离子液体为溴化1-烷基-3-甲基咪唑、氯化1-烷基-3-甲基咪唑、1-烷基-3-甲基咪唑四氟化硼、1-烷基-3-甲基咪唑六氟化磷和1-烷基-3-甲基咪唑三氟甲烷璜酰亚胺中的一种或多种。
优选的，所述酸碱缓冲溶液的浓度大于0且小于等于50mM。
优选的，所述酸碱缓冲溶液的浓度为3～20mM。
优选的，所述洗脱液的pH为9～12。
本申请还提供了一种脱氧核糖核酸的洗脱方法，包括：将固相吸附材料吸附的脱氧核糖核酸在洗脱液中进行洗脱；所述洗脱液包括酸碱缓冲溶液与离子液体；所述离子液体为含咪唑基阳离子的化合物，所述洗脱液的pH为5～13。
优选的，所述洗脱的时间为2min～20min。
优选的，所述离子液体的浓度与所述脱氧核糖核酸的碱基浓度比为（0.1～500）：1。
优选的，所述离子液体的浓度与所述脱氧核糖核酸的碱基浓度比为（0.5～100）：1。
本申请提供了一种脱氧核糖核酸的洗脱液，其包括酸碱缓冲溶液与离子液体；所述离子液体为含咪唑基阳离子的化合物，所述洗脱液的pH为5～13。本申请的洗脱液中含有含咪唑基阳离子的化合物，由于咪唑基阳离子与带负电的脱氧核糖核酸相互作用，促进脱氧核糖核酸从固相吸附材料表面脱除；并且在洗脱液pH为5～13的基础上，固相吸附材料表面修饰的带正电基团的电荷密度降低，从而其与脱氧核糖核酸片段之间的静电引力也降低，进一步增强了洗脱液的洗脱能力。另外，本申请提供的洗脱液的盐浓度较低，不会使脱氧核糖核酸发生变性。
附图说明
图1为本发明实施例1与对比例1采用不同的洗脱液对DNA洗脱率影响的曲线图；
图2为本发明实施例2提供的洗脱液的洗脱时间对洗脱率影响的曲线图；
图3为实施例3与对比例2～4提供的不同洗脱条件下DNA的电泳图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
本发明实施例公开了一种脱氧核糖核酸（DNA）的洗脱液，包括酸碱缓冲溶液与离子液体；所述离子液体为含咪唑基阳离子的化合物，所述洗脱液的pH为5～13。
本申请所采用的洗脱液用于将固相吸附材料表面吸附的DNA洗脱下来，以回收洗脱的DNA。本申请所采用的固相吸附材料是具有能够与核酸主链的磷酸基团相互作用的基质，其可以是多孔或非多孔颗粒、粉状颗粒或纤维的形式，也可以是纳米尺寸、微米尺寸，其基质表面可以修饰为树枝状大分子。目前最常见的固相吸附材料为表面修饰有聚酰胺-胺（PAMAM）的纳米材料或微米材料，并且本申请采用的也是上述固相吸附材料。
本领域技术人员熟知的，离子液体是由有机阳离子与无机阴离子或有机阳离子与有机阴离子构成，且在室温或室温附近温度下呈液态的盐类。本申请所述离子液体采用的是含咪唑基阳离子的化合物。所述离子液体优选为溴化1-烷基-3-甲基咪唑（[CnMIM]Br）、氯化1-烷基-3-甲基咪唑（[CnMIM]Cl）、1-烷基-3-甲基咪唑四氟化硼（[CnMIM]BF4）、1-烷基-3-甲基咪唑六氟化磷（[CnMIM]PF6）和1-烷基-3-甲基咪唑三氟甲烷璜酰亚胺（[CnMIM]NTf2）中的一种或多种。上述离子液体中烷基碳链的长度优选为2～12。本申请采用离子液体作为洗脱液的助脱剂，离子液体中的咪唑基阳离子与带负电的DNA相互作用，促进DNA从固相吸附材料表面洗脱。本申请所述洗脱液由于采用离子液体作为助脱剂，从而减少了酸碱缓冲溶液的浓度，则从一定程度上减少了洗脱液对DNA的影响，避免了DNA的变性。本申请对所述离子液体的浓度没有特别的限制，但是待洗脱DNA的浓度提高时，可以相应的提高离子液体的浓度。作为优选方案，所述离子液体的浓度与DNA碱基浓度的比例优选为（0.1～500）：1，更优选为（0.5～100）：1，最优选为（0.5～30）：1。
按照本发明，所述酸碱缓冲溶液优选为磷酸盐、磷酸、金属氢氧化物、碳酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、硼酸和硼酸盐中的一种或多种，更优选为磷酸盐。所述酸碱缓冲溶液的浓度优选大于0且小于等于50mM，更优选为3～20mM。在上述离子液体浓度最优的情况下，DNA的洗脱效率随着酸碱缓冲溶液浓度的提高而增加，实验结果表明，在酸碱缓冲溶液浓度为7mM时，DNA的洗脱率最高，如果继续增大酸碱缓冲溶液的浓度，则DNA的洗脱率没有明显变化；但是采用高浓度的酸碱缓冲溶液，会使DNA发生变性。
本发明所述洗脱液的pH为5～13，优选为9～12，最优选为11。本申请通过所述酸碱缓冲溶液的浓度与组分来保证洗脱液的pH，但是酸碱缓冲溶液的浓度与成分并不是唯一确定的，可以通过调节酸碱缓冲溶液的浓度与组分来保证洗脱液的pH。洗脱液在此pH值下，固相吸附材料表面修饰的PAMAM树枝大分子上带正电基团的电荷密度降低，从而固相吸附材料与DNA片段之间的静电引力也降低，进一步增加了洗脱液的洗脱能力。
本申请还提供了一种利用上述洗脱液洗脱固相吸附材料吸附的脱氧核糖核酸的方法，包括：将固相吸附材料吸附脱氧核糖核酸在洗脱液中进行洗脱；所述洗脱液包括酸碱缓冲溶液与离子液体；所述离子液体为含咪唑基阳离子的化合物，所述洗脱液的pH为5～13。
在将固相吸附材料吸附的DNA在本申请所述洗脱液中进行洗脱的过程中，所述洗脱的时间优选为2～20min，更优选为5～8min。在洗脱之后还包括洗脱液与固相吸附材料分离的步骤，上述两个步骤为本领域技术人员熟知的技术手段，本申请不再进行赘述。本申请对于固相吸附材料吸附DNA的过程没有特别的限制，为本领域技术人员熟知的方式即可；但是在吸附过程中本申请采用的固相吸附材料是表面修饰有聚酰胺-胺结构的纳米材料或微米材料。
本申请提供了一种脱氧核糖核酸的洗脱液，其包括酸碱缓冲溶液与离子液体；所述离子液体含咪唑基阳离子的化合物，所述洗脱液的pH为5～13。本申请的洗脱液中含有含咪唑基阳离子的化合物，由于咪唑基阳离子与带负电的脱氧核糖核酸相互作用，促进脱氧核糖核酸从固相吸附材料表面脱除；并且在洗脱液pH为5～13的基础上，固相吸附材料表面修饰的带正电基团的电荷密度降低，从而其与脱氧核糖核酸片段之间的静电引力也降低，进一步增强了洗脱液的洗脱能力。另外，本申请提供的洗脱液的盐浓度较低，对脱氧核糖核酸的结构不会产生影响。基于本申请提供的洗脱液，本申请提供了一种脱氧核糖核酸的洗脱方法，在洗脱脱氧核糖核酸的过程中，由于洗脱液中含有离子液体，则洗脱液的总盐浓度降低，脱附的DNA可以直接进行毛细管电泳监测分析，并且本申请可以在常温下进行洗脱，而不需要加热，且洗脱时间短，在5min即可达到最大的洗脱率。实验结果表明，本申请DNA的洗脱率超过99%。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的脱氧核糖核酸的洗脱液与洗脱方法进行详细说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
按照本发明，PAMAM修饰的纳米材料或微米材料可以按照现有技术中公开的方法制备。
实施例1
脱氧核糖核酸（DNA）的吸附：将3微升，浓度为90μg/mL的DL2000DNAMarker和5微升4g/L的树枝大分子修饰的二氧化硅纳米材料（SNP-PAMAM）作为固相吸附材料加入200微升离心管中，室温下震荡10min后，4℃下静置10min，在3500转/分钟转速下离心10min，收集SNP-PAMAM-DNA复合物。
上清液中残留的DNA含量用荧光分光光度计(CaryEclipse,Varian,PaloAlto,CA,USA)以溴化乙锭为荧光探针进行检测。具体方法如下：
向5mL的刻度试管中加入1.5微升1mg/mL溴化乙锭（EB）溶液，加入三次蒸馏水水定容至刻度，摇匀，在荧光分光光度计上510nm波长下激发和620nm波长下发射（发射和激发狭缝均为10nm，荧光池厚度为1cm），测量荧光发射强度。
向7个5mL的刻度试管中分别加入1.5微升1mg/mLEB溶液，加入DNA的含量分别为252ng/mL，200ng/mL，160ng/mL，120ng/mL，80ng/mL，40ng/mL，10ng/mL，分别测量荧光发射强度。以荧光发射强度对DNA的浓度作图，得到荧光发射强度-DNA浓度的标准曲线。
向5mL刻度试管中加入离心取得的上清液，加入1.5微升1mg/mLEB溶液，加三次蒸馏水定容至刻度，摇匀，同上测得荧光强度。通过标准曲线求得上清液中残余的DNA的量。
固相吸附材料结合的DNA量是起始加入的DNA的量减去上清液中残留的DNA的含量。
DNA的洗脱：向收集到的SNP-PAMAM-DNA复合物中加入10微升含有3.5mM磷酸氢二钠与3.5mM磷酸钠缓冲组分以及4mM[C6MIM]Br，pH为11的洗脱液中，室温下震荡10min后，转速为3500转/分钟离心10min，收集上清液，用毛细管电泳-紫外检测法在254nm波长下进行分离检测。以峰面积进行定量，计算洗脱出的DNA的量。
DNA的洗脱率通过洗脱出DNA的量和固相吸附材料结合的DNA量之间的比值求得。如图1所示，图1为本实施例1与对比例1采用不同的洗脱液对DNA洗脱率影响的曲线图。
实施例2
将4微升鲱鱼精DNA（100μg/mL）和5微升4g/L树枝大分子修饰的二氧化硅纳米材料（SNP-PAMAM）作为固相吸附材料加入200微升离心管中，室温下震荡10min后，在转速3500转/分钟下为离心10min，收集SNP-PAMAM-DNA复合物。
上清液中残留的DNA含量用荧光分光光度计(CaryEclipse,Varian,PaloAlto,CA,USA)以溴化乙锭为荧光探针进行检测，并计算出固相吸附材料结合的DNA量。
将收集到的SNP-PAMAM-DNA复合物中加入含15微升洗脱液的离心管中，洗脱液中含有1mM磷酸、3mM氢氧化钠与2mM四硼酸钠的缓冲组分以及5mM的[C8MIM]BF4离子液体，且洗脱液的pH为10.8。室温下震荡若干时间后，在转速为3500转/分钟离心10min，收集上清液，用毛细管电泳-紫外检测法在254nm波长下进行分离检测。以峰面积进行定量，计算洗脱出的DNA的量。
DNA的洗脱率通过洗脱出DNA的量和固相吸附材料结合的DNA量之间的比值求得。如图2所示，图2为洗脱时间对洗脱率影响的曲线图，由图2可以看出，洗脱5分钟后，就可以达到最大洗脱率。
实施例3
本实施例采用的DNA为DL2000DNAMarker（浓度为90μg/mL），除非特别说明，本实施例的操作参数与实施例1相同。
DNA的吸附过程采用3微升DL2000DNAMarker（浓度为90μg/mL），经过吸附、洗脱以及毛细管电泳-紫外技术分离检测。
对比例1
将实施例1收集到的SNP-PAMAM-DNA复合物中加入10微升只含有磷酸盐缓冲组分浓度为7mM，pH为11而不含有离子液体的洗脱液中，室温下震荡10min后，在转速为3500转/分钟下离心10min，收集上清液，用毛细管电泳-紫外检测法在254nm波长下进行分离检测。以峰面积进行定量，计算洗脱出的DNA的量，并计算此洗脱液对DNA的洗脱率。如图1所示，图1为实施例1与对比例1采用不同的洗脱液对DNA洗脱率影响的曲线图，图中●曲线为实施例1提供的洗脱液对DNA洗脱率影响的曲线，图中◆曲线为对比例1提供的洗脱液对DNA洗脱率影响的曲线。由图1可知，洗脱液中加入离子液体作为助脱剂后，DNA的洗脱效率显著提高，平均洗脱率达到99.2%。
对比例2
本对比例采用的DNA为DL2000DNAMarker（浓度为90μg/mL）与实施例1相同，区别在于：3微升DL2000DNAMarker（浓度为90μg/mL）用10微升洗脱液直接稀释后，用毛细管毛细管电泳-紫外技术分离检测。
对比例3
本对比例采用的DNA为DL2000DNAMarker（浓度为90μg/mL），DNA的吸附与洗脱过程与实施例1相同，区别在于：在洗脱过程中，3微升DL2000DNAMarker（浓度为90μg/mL），经过吸附后，将收集到的SNP-PAMAM-DNA复合物中加入10微升2MNaCl溶液中，在50℃恒温15分钟。在转速为3500转/分钟离心10min，收集上清液。用毛细管毛细管电泳-紫外技术分离检测。
对比例4
本对比例采用的DNA为DL2000DNAMarker（浓度为90μg/mL）与实施例1相同，区别在于：3微升DL2000DNAMarker（浓度为90μg/mL）直接用10微升三次蒸馏水稀释后，用毛细管毛细管电泳-紫外技术分离检测。
如图3所示，图3为实施例3与对比例2～4提供的不同洗脱条件对DNA的电泳图，图3中曲线A为实施例3提供的洗脱条件下DNA的电泳曲线图，曲线B为对比例2提供的洗脱条件下DNA的电泳曲线图，曲线C为对比例3提供的洗脱条件下DNA的电泳曲线图，曲线D为对比例4提供的洗脱条件下DNA的电泳曲线图。由图3可知，采用本发明的洗脱液洗脱的DNA的毛细管电泳峰的形状、顺序，没有杂峰出现，说明吸附-洗脱过程没有引起DNA变性。而曲线A与曲线B这两个电泳谱图与用三次蒸馏水稀释的DNA标准品图谱相似，说明含有离子液体的洗脱液溶解DNA后，没有改变DNA的性质。
应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (7)
1.一种脱氧核糖核酸的洗脱液，包括酸碱缓冲溶液与离子液体；所述离子液体为溴化1-烷基-3-甲基咪唑、氯化1-烷基-3-甲基咪唑、1-烷基-3-甲基咪唑四氟化硼、1-烷基-3-甲基咪唑六氟化磷和1-烷基-3-甲基咪唑三氟甲烷璜酰亚胺中的一种或多种，所述洗脱液的pH为9～12；
所述离子液体中烷基碳链的长度为2～12；
所述酸碱缓冲溶液为磷酸盐、磷酸、金属氢氧化物、碳酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、硼酸和硼酸盐中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的洗脱液，其特征在于，所述酸碱缓冲溶液的浓度大于0且小于等于50mM。
3.根据权利要求2所述的洗脱液，其特征在于，所述酸碱缓冲溶液的浓度为3mM～20mM。
4.一种脱氧核糖核酸的洗脱方法，包括：将固相吸附材料吸附的脱氧核糖核酸在洗脱液中进行洗脱；所述洗脱液包括酸碱缓冲溶液与离子液体；所述洗脱液的pH为9～12；
所述离子液体为溴化1-烷基-3-甲基咪唑、氯化1-烷基-3-甲基咪唑、1-烷基-3-甲基咪唑四氟化硼、1-烷基-3-甲基咪唑六氟化磷和1-烷基-3-甲基咪唑三氟甲烷璜酰亚胺中的一种或多种；
所述离子液体中烷基碳链的长度为2～12；
所述酸碱缓冲溶液为磷酸盐、磷酸、金属氢氧化物、碳酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、硼酸和硼酸盐中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述洗脱的时间为2min～20min。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述离子液体的浓度与所述脱氧核糖核酸的碱基浓度比为(0.1～500)：1。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述离子液体的浓度与所述脱氧核糖核酸的碱基浓度比为(0.5～100)：1。
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