CN102533725A - 一体化缓冲液及使用该一体化缓冲液分离核酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种一体化缓冲液，和从各个的来源(包括但不局限于生物样本，琼脂糖凝胶，和溶液，等等)来分离与净化核酸以用于各种目的的一种方法。这个一体化缓冲液包括一个优化浓度的硫氰酸胍和非离液序列高的盐，例如氯化钠，醋酸钾，以实现核酸与固相硅胶基质的最大结合力；这个方法适合从细菌中分离质粒基因，从琼脂糖凝胶中提取脱氧核糖核酸(脱氧核糖核酸)片断，从溶液中回收脱氧核糖核酸片断，如此，不再需要研究人员购买不同的溶液以用于不同目的核酸分离，简单便捷。

Description

一体化缓冲液及使用该一体化缓冲液分离核酸的方法

技术领域

本发明涉及生物学应用领域的一种用一个从各式各样的样本来源中分离和纯化核酸的一体化缓冲液，以及与使用固相硅胶基质分离核酸的方法。

背景技术

目前，核酸通常要求无杂质，杂质会干扰下游的处理或分析过程，例如逆转录，克隆，限制酶分析，测序，转染，连接，体内注射，聚合酶链反应，等等。杂质物常为(1)大分子例如蛋白，多糖，多核苷酸；(2)盐，化学药品，有机溶剂，微量金属，染料；(3)从生物的样本而来的成分例如内毒素，脂类，低分子量酶抑制剂，核苷酸。这些杂质常常阻碍或抑制在许多分子生物学技术中广泛应用的化学反应，或降解，分离或聚合核酸同其他成分。从复杂的系统中提取得到无杂质的核酸的过程是繁复的。这些复杂的系统，例如细胞，组织，血液，琼脂糖，聚丙烯酰胺凝胶，溶液，都包含大量杂质。所以对于多数分子生物学应用而言，使用简单而有效的方法从复杂的系统中提取高纯度核酸是必须的。

在过去二十多年中已发展了许多关于从不同样本来源分离核酸的方法。常规分离核酸的方法是借用有机溶剂，例如苯酚和氯仿，来裂解生物样本和从而提取核酸，在盐的存在下由乙醇或异丙醇将核酸沉淀出来。这些方法有重大的缺点：第一它用有机物质、化学物来提取核酸。对许多酶而言，这些物质通常是强烈的抑制剂。第二，它需要用有机溶剂多次提取使核酸从其他生物成分例如蛋白，油脂，细胞的细胞器等等中分离。第三，这些使用的有机溶剂是有毒的，例如苯酚，氯仿。处理这些溶剂要特别的慎重和保护。最后，苯酚是一个强烈氧化剂——能氧化核酸从而导致毁损核酸。

硅胶基质技术是之后开发出来分离核酸的一种方法。与以上描述的传统方法比较，硅胶基质技术优势在于简单，高效，无需有机溶剂，提取的核酸高纯度。硅胶基质分离核酸基本原理主要包括：

(1)在高的盐浓度下，钠离子打破水和二氧化硅中带负电荷的氧离子间的氢键。钠作为一个阳离子桥，吸引核酸分子中磷酸盐带负电荷的氧离子。

(2)通过几次洗涤脱氧核糖核酸-硅胶基质后，盐被消除，基因能被三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶剂或水从硅胶基质上洗脱分离。

当然，硅胶基质包括很多二氧化硅材料例如玻璃颗粒，玻璃粉，二氧化硅颗粒，玻璃超细纤维，硅胶膜等等。二氧化硅颗粒和硅酸颗粒存在的问题是很大程度上取决于如何被包装，并且很难被复制。硅胶膜技术能提供一个一致且均一的二氧化硅表面从而使结果可重复，过程更简单。

核酸分子结合到硅胶表面依赖于某些盐的存在，在并需要一定的pH条件。一般来说，离液试剂和某些非离液盐强度和pH值条件是核酸与硅胶结合所必需的。许多离液试剂如胍盐酸盐，异硫氰酸胍，碘化钠，钠高氯酸盐和三氯乙酸钠已在这个方面使用。然而，不同研究者发现这些离液试剂的最佳浓度并不同，从0.5M至7M，和pH值范围从3.6至6.8。没有一个溶液优化的浓度和组分被明确定义。此外，不同离液试剂用于不同目的的分离程序。例如，盐酸胍，主要是用于在质粒脱氧核糖核酸的提取和脱氧核糖核酸的纯化，硫氰酸胍被广泛应用于核糖核酸的提取，碘化钠被用于从琼脂糖凝胶回收脱氧核糖核酸片段。研究人员不得不购买不同的溶液以用于不同目的核酸分离，纷繁复杂。

综上所述，为了避免上述情形，一种新的，从复杂的系统中提取高纯度核酸的方法的发明是势在必行的。

发明内容

本发明的目的是解决如下技术问题：常规借用有机溶剂分离核酸的方法，有机溶剂或者是强烈的抑制剂，或者是有毒的、或者是能氧化核酸从而导致毁损核酸；而之后开发出来分离核酸的硅胶基质技术由于没有一个溶液优化的浓度和组分被明确定义，而且，不同分离液试剂用于不同目的的分离程序，造成研究人员不得不购买不同的溶液以用于不同目的核酸分离，纷繁复杂；都不能简单，高效的从复杂的系统中提取高纯度核酸。

本发明提供了一种从复杂的系统中提取高纯度核酸的方法，该方法中提供了一种一体化缓冲液，其包括优化的离液试剂，非离液盐强度，pH值，以实现最大的硅胶膜与核酸结合。这溶液可用于所有目的的核酸分离，包括质粒脱氧核糖核酸的提取，脱氧核糖核酸凝胶回收和溶液中脱氧核糖核酸纯化等；不再需要研究人员购买不同的溶液以用于不同目的核酸分离，简单便捷。

本发明提供一种本发明的目的通过以下技术方案来实现：

一种一体化缓冲液，可用于不同目的的核酸分离，其特征在于，其包括：离液试剂、非离液试剂以及硅胶膜柱。

所述离液试剂包括异硫氰酸胍，所述硫氰酸胍的终浓度为2.0M至2.5M。

所述非离液试剂包括氯化钠和/或钾醋酸，所述氯化钠浓度为130mM至140mM；醋酸钾浓度为0.3M。

所述非离液试剂盐浓度约为0.43～0.44mM。

所述硅胶膜柱为佑科纯化柱。

所述佑科纯化柱中硅胶膜填充厚度为2毫米或/和0.5毫米。

所述的使用该一体化缓冲液分离核酸的方法，可用于不同目的的核酸分离，包括质粒脱氧核糖核酸的提取，脱氧核糖核酸凝胶回收和脱氧核糖核酸纯化，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将一体化缓冲液加入到包含核酸的溶液中，并使成分达到最后的最佳浓度；

(2)在一体化缓冲液中的核酸会结合在硅胶膜柱的硅胶基质上；

(3)清洗核酸中的内毒素和其他杂质成分；

(4)将核酸从固相硅胶基质上洗脱下来。

所述质粒脱氧核糖核酸的提取，主要包括如下步骤：

第一，裂解细胞壁，质粒脱氧核糖核酸被释放但被变性；

第二，变性的质粒脱氧核糖核酸在加入1-4倍一体化缓冲液后恢复超螺旋结构从而溶于水；

第三，细胞裂解液穿过硅胶膜，脱氧核糖核酸将与之结合而其他成分将穿过硅胶膜；

第四，结合在硅胶膜上的脱氧核糖核酸洗涤除去内毒素和其它杂质后被洗脱。

所述脱氧核糖核酸凝胶回收，主要包括如下步骤：

第一，脱氧核糖核酸片段从琼脂糖凝胶中切除，加入3-5倍凝胶体积的一体化缓冲液；

第二，50-55度孵育5-10分钟以完全溶解琼脂糖凝胶；

第三，将所有溶液穿过硅胶膜，脱氧核糖核酸将与之结合而其他成分将穿过硅胶膜；

第四，结合在硅胶膜上的脱氧核糖核酸洗涤除去其它杂质后被洗脱。

所述溶液中脱氧核糖核酸的纯化，主要包括如下步骤：

第一，加入3-5倍溶液体积的一体化缓冲液，

第二，将所有溶液穿过硅胶膜，脱氧核糖核酸将与之结合而其他成分将穿过硅胶膜；

第三，结合在硅胶膜上的脱氧核糖核酸洗涤除去其它杂质后被洗脱。

本发明相对现有技术具有以下优点和有益效果：本发明所提供的一种从复杂的系统中提取高纯度核酸的一体化缓冲液及使用该缓冲液的方法，该一体化缓冲液，其包括优化的离液试剂，非离液盐强度，pH值，以实现最大的硅胶膜与核酸结合。这溶液可用于所有目的的核酸分离，包括质粒脱氧核糖核酸的提取，脱氧核糖核酸凝胶回收和溶液中脱氧核糖核酸纯化等；不再需要研究人员购买不同的溶液以用于不同目的核酸分离，简单便捷。

附图说明：

通过以下对本发明的实施例结合其附图的描述，可以进一步理解其发明的目的、具体结构特征和优点。其中，附图为：

图1为本发明一体化缓冲液中的硅胶膜柱-佑科纯化柱的示意图；

图2是本发明使用一体化缓冲液和佑科纯化柱-1提取质粒的示意图；

图3是本发明使用一体化缓冲液和佑科纯化柱-2对琼脂糖凝胶脱氧核糖核酸片段回收的示意图；

图4是本发明使用一体化缓冲液和佑科纯化柱-2从溶液中回收和纯化脱氧核糖核酸的示意图。

具体实施方式：

下面结合图中的实例对本发明作进一步的描述。

本发明是有关于用一个从各式各样的样本来源中分离和纯化核酸的一体化缓冲液；本发明公开了的所述一体化缓冲液以及使用该缓冲液从复杂的系统中提取高纯度核酸的方法，本发明也与使用固相硅胶基质分离核酸的方法相关，或者说是从各个的来源(包括但不局限于生物样本，琼脂糖凝胶，和溶液，等等)来分离与净化核酸以用于各种目的的一种方法。

本发明所述的一体化缓冲液，其包括一个优化浓度的硫氰酸胍和非离液序列高的盐，例如氯化钠，醋酸钾，以实现核酸与固相硅胶基质的最大结合力；本发明所述的这个方法适合从细菌中分离质粒基因，从琼脂糖凝胶中提取脱氧核糖核酸片断，从溶液中回收脱氧核糖核酸片断。基本的常规流程包括(1)包含核酸的样本一体化缓冲液直接破坏或一体化缓冲液被加入到包含核酸的溶液中。任何一种方法均可使每个成分都能达到最后最佳浓度；(2)在一体化缓冲液中核酸会结合在固相硅胶基质上；(3)清洗核酸中的内毒素和其他杂质成分；(4)将核酸从固相硅胶基质上洗脱下来。

本发明提出一体化缓冲液的优化缓冲液组分可用于不同目的的核酸分离，包括质粒脱氧核糖核酸的提取，脱氧核糖核酸凝胶回收和脱氧核糖核酸纯化等。所述的一体化缓冲液包括离液试剂，所使用的离液试剂是异硫氰酸胍。其中，硫氰酸胍的终浓度为2.0M至2.5M，一体化缓冲液的pH4.8-4.9。其中，所述硫氰酸胍有以下几个作用：(1)分解生物材料或其他材料，如琼脂糖，充分释放核酸；(2)促进硅膜与核酸结合；(3)足够的酶抑制力，包括脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶，从而防止在分离过程中核酸的降解；(4)充分去除一些杂质，如内毒素。

本发明所描述的一体化缓冲液包括非离液试剂，所使用的非离液试剂是氯化钠和钾醋酸。这两种盐均可增强硅膜与核酸结合。氯化钠浓度为130mM至140mM；醋酸钾浓度为0.3M。整个非离液试剂盐浓度约为0.43～0.44mM。

本发明所描述的一体化缓冲液包括硅胶膜柱，所用的硅胶膜柱为佑科纯化柱，如图1显示。柱中硅胶膜填充厚度为2毫米(用于质粒脱氧核糖核酸提取)，和0.5毫米(用于脱氧核糖核酸凝胶回收和纯化)。即，所述的佑科纯化柱硅膜的厚度在膜组成分一致的条件下根据目的实验中核酸提取量而定，分别是质粒提取纯化柱内部硅膜的厚度为2mm、凝胶回收纯化柱内部硅膜的厚度为0.5mm。在这个条件下可最大化的发挥试剂的效力，使样本与硅膜的结合度达到最优。本发明如下所述的实施例中只对佑科纯化柱的具体应用有详细阐述，即，如下所述的实施例中的一体化缓冲液是为佑科纯化柱设计且对其进行测试。当然，本发明所描述的一体化缓冲液也可用于其他硅胶基质或硅胶膜。其他类似物质的类似操作方法本领域的技术人员皆无须通过创造性劳动即可知晓，在此不在赘述。

使用上述的一体化缓冲分离提取高纯度核酸，用于不同目的的核酸分离，包括质粒脱氧核糖核酸的提取，脱氧核糖核酸凝胶回收和脱氧核糖核酸纯化等，主要包括如下步骤：

(1)对于质粒脱氧核糖核酸提取，首先用十二烷基硫酸钠和氢氧化钠裂解细胞壁，质粒脱氧核糖核酸被释放但被变性；第二变性的质粒脱氧核糖核酸在加入2.3倍一体化缓冲液后恢复超螺旋结构从而溶于水；细胞裂解液穿过硅胶膜，脱氧核糖核酸将与之结合而其他成分将穿过硅胶膜；结合在硅胶膜上的脱氧核糖核酸洗涤除去内毒素和其它杂质后被洗脱。

(2)对于脱氧核糖核酸凝胶回收，脱氧核糖核酸片段从琼脂糖凝胶中切除，加入3-5倍凝胶体积的一体化缓冲液。55度孵育10分钟以完全溶解琼脂糖凝胶。然后，将所有溶液穿过硅胶膜，脱氧核糖核酸将与之结合而其他成分将穿过硅胶膜；结合在硅胶膜上的脱氧核糖核酸洗涤除去其它杂质后被洗脱。

(3)对于溶液中脱氧核糖核酸的纯化，加入3-5倍溶液体积的一体化缓冲液，然后，将所有溶液穿过硅胶膜，脱氧核糖核酸将与之结合而其他成分将穿过硅胶膜；结合在硅胶膜上的脱氧核糖核酸洗涤除去其它杂质后被洗脱。

如下将通过实例的具体的实验数据，对上述发明内容进行进一步的详细叙述：

以下溶液将在下述的实例中使用：

P1缓冲液：50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，pH 8.0，10mM乙二胺四乙酸，100ug/mL核糖核酸酶A；

P2缓冲液：200mM氢氧化钠，1％十二烷基硫酸钠；

P3缓冲液：2.3x一体化缓冲液；

内毒素洗涤缓冲液：1x一体化缓冲液，70％异丙醇；

洗涤缓冲液：1％三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH＝8.0)，1％乙二胺四乙酸，80％乙醇；

洗脱缓冲液：10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，pH 8.0；

实例1，质粒脱氧核糖核酸提取实验，如图2所示：

用50毫升或15毫升离心管离心1-10毫升细菌培养液5分钟(4000-6000转/分钟)，弃上清。

加入200微升P1的缓冲液(冷)管中和完全重悬细菌沉淀，转移悬浮液到的一个新的1.5毫升离心管中。

再加入200微升的P2缓冲液，反复倒置离心管4--5次以混匀溶液。在室温下放置3-4分钟。

加入300微升P3的缓冲液(一体化缓冲液)，反复倒置离心管4--5次以混匀溶液。不要旋涡震荡，于冰上裂解液孵育10分钟。

在4℃，离心样品≥10,000xg，10-15分钟。

将佑科纯化柱-1放置于收集管上，小心将第5步的上清加入佑科纯化柱-1，不要把任何颗粒细胞碎片加入。

离心佑科纯化柱-1/收集管，30-60秒，≥10000xg。

废弃收集管中液体，重组佑科纯化柱-1/收集管。

在佑科纯化柱-1加入200微升内毒素洗涤缓冲液，离心≥60秒10,000xg。

废弃收集管中液体，重组佑科纯化柱-1/收集管。

在佑科纯化柱-1加入750微升洗涤缓冲液，离心≥60秒10,000xg。

清空收集管，离心佑科纯化柱-1/收集管1分钟，≥10,000xg，去除残留洗涤缓冲液。

将佑科纯化柱-1转移到一个干净的1.5ml离心管上，然后加入50微升洗脱缓冲液于佑科纯化柱-1中硅胶膜的中央，静置1分钟。离心60秒，≥10,000xg，洗脱质粒脱氧核糖核酸。

如图2片段中使用本发明的一体化缓冲液和佑科纯化柱-1提取质粒。M：脱氧核糖核酸分子量标记；1：质粒脱氧核糖核酸的小量制备，采用Qiagen公司提供的试剂盒中的纯化柱及缓冲试剂；2和4：质粒脱氧核糖核酸的小量制备，使用本发明一体化缓冲液和佑科纯化柱-1；3：质粒脱氧核糖核酸的小量制备，使用Qiagen公司的纯化柱和本发明一体化缓冲液。本发明一体化缓冲液可以增加Qiagen纯化柱的脱氧核糖核酸产量。

实例2，脱氧核糖核酸凝胶回收试验，如图3所示：

用一个干净的刀片或手术刀切除含脱氧核糖核酸片段的琼脂糖凝胶，并将其转移至1.5ml的离心管中。

加入3倍体积的一体化缓冲液于切除的琼脂糖凝胶体积(如100微升(毫克)琼脂糖凝胶片加入300微升一体化缓冲液)。

55℃孵育10分钟，直到凝胶片完全溶解。每3-5分钟混合溶液与凝胶3-5次，以帮助凝胶完全溶解。

融化的琼脂糖凝胶溶液转移入佑科纯化柱-2中，并置于收集管上。

离心≥10000xg，30-60秒。清空收集管。

加入200微升洗涤缓冲液至佑科纯化柱-2中，离心≥30秒10,000xg。清空收集管。重复洗涤步骤。

将佑科纯化柱-2放入一个新的1.5ml离心管中。加12微升微升洗脱缓冲液或水于佑科纯化柱-2中硅胶膜的中央，静置1分钟。离心60秒，≥10,000xg，洗脱脱氧核糖核酸。

如图3所示，使用本发明的一体化缓冲液和佑科纯化柱-2对琼脂糖凝胶脱氧核糖核酸片段回收。M：脱氧核糖核酸分子量标记；1-2：使用Zymo凝胶回收试剂盒回收的脱氧核糖核酸片段；3-4：使用本发明一体化缓冲液和佑科纯化柱-2回收的脱氧核糖核酸片段；5-6：凝胶回收前的脱氧核糖核酸片段。

实例3，脱氧核糖核酸的纯化试验，如图4所示：

于每个脱氧核糖核酸样本中加入3-5倍体积的一体化缓冲液，(例如：使用3倍体积的一体化缓冲液用于质粒，基因组脱氧核糖核酸样品，聚合酶链式反应片段，酶消化产品；5倍体积的一体化缓冲液用于单链脱氧核糖核酸样本)。例如：加入300微升一体化缓冲液于100微升的聚合酶链式反应产物中，混匀。

将溶液加入佑科纯化柱-2中，并置于收集管上。

离心≥10,000xg 30-60秒。清空收集管。

加入200微升洗涤缓冲液至佑科纯化柱-2中，离心≥30秒10,000xg。清空收集管。重复洗涤步骤。

将佑科纯化柱-2放入一个新的1.5ml离心管中。加12微升洗脱缓冲液或水于佑科纯化柱-2中硅胶膜的中央，静置1分钟。离心60秒，≥10,000xg，洗脱脱氧核糖核酸。

表1用Qiagen公司的相关试剂或本发明一体化缓冲液小量制备的质粒脱氧核糖核酸浓度比较

图4采用本发明的一体化缓冲液和佑科纯化柱-2从溶液中回收和纯化脱氧核糖核酸。质粒脱氧核糖核酸被限制性内切酶消化(回收前)；一体化缓冲液直接加入含脱氧核糖核酸片段的溶液而回收脱氧核糖核酸，佑科纯化柱-2用于此试验。

本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明的目的，而并非用作对本发明的限定，只要在本发明的实质范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明的权利要求的范围内。

Claims (10)

1.一种一体化缓冲液，可用于不同目的的核酸分离，其特征在于，其包括：离液试剂、非离液试剂以及硅胶膜柱。

2.根据权利要求1所述的一体化缓冲液，其特征在于，所述离液试剂包括异硫氰酸胍，所述硫氰酸胍的终浓度为2.0M至2.5M。

3.根据权利要求1所述的一体化缓冲液，其特征在于，所述非离液试剂包括氯化钠和/或钾醋酸，所述氯化钠浓度为130mM至140mM；醋酸钾浓度为0.3M。

4.根据权利要求3所述的一体化缓冲液，其特征在于：所述非离液试剂盐浓度约为0.43～0.44mM。

5.根据权利要求1所述的一体化缓冲液，其特征在于，所述硅胶膜柱为佑科纯化柱。

6.根据权利要求5所述的一体化缓冲液，其特征在于，所述佑科纯化柱中硅胶膜填充厚度为2毫米或/和0.5毫米。

7.根据权利要求1所述的使用该一体化缓冲液分离核酸的方法，可用于不同目的的核酸分离，包括质粒脱氧核糖核酸的提取，脱氧核糖核酸凝胶回收和脱氧核糖核酸纯化，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将一体化缓冲液加入到包含核酸的溶液中，并使成分达到最后的最佳浓度；

(2)在一体化缓冲液中的核酸会结合在硅胶膜柱的硅胶基质上；

(3)清洗核酸中的内毒素和其他杂质成分；

(4)将核酸从固相硅胶基质上洗脱下来。

8.根据权利要求7所述的使用该一体化缓冲液分离核酸的方法，其特征在于，所述质粒脱氧核糖核酸的提取，主要包括如下步骤：

第一，裂解细胞壁，质粒脱氧核糖核酸被释放但被变性；

第二，变性的质粒脱氧核糖核酸在加入1-4倍一体化缓冲液后恢复超螺旋结构从而溶于水；

第三，细胞裂解液穿过硅胶膜，脱氧核糖核酸将与之结合而其他成分将穿过硅胶膜；

第四，结合在硅胶膜上的脱氧核糖核酸洗涤除去内毒素和其它杂质后被洗脱。

9.根据权利要求7所述的使用该一体化缓冲液分离核酸的方法，其特征在于，所述脱氧核糖核酸凝胶回收，主要包括如下步骤：

第一，脱氧核糖核酸片段从琼脂糖凝胶中切除，加入3-5倍凝胶体积的一体化缓冲液；

第二，50-55度孵育10-30分钟以完全溶解琼脂糖凝胶；

第三，将所有溶液穿过硅胶膜，脱氧核糖核酸将与之结合而其他成分将穿过硅胶膜；

第四，结合在硅胶膜上的脱氧核糖核酸洗涤除去其它杂质后被洗脱。

10.根据权利要求7所述的使用该一体化缓冲液分离核酸的方法，其特征在于：所述溶液中脱氧核糖核酸的纯化，主要包括如下步骤：

第一，加入3-5倍溶液体积的一体化缓冲液，

第二，将所有溶液穿过硅胶膜，脱氧核糖核酸将与之结合而其他成分将穿过硅胶膜；

第三，结合在硅胶膜上的脱氧核糖核酸洗涤除去其它杂质后被洗脱。

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