CN108456675A - 一种用于凝胶DNA回收的溶胶buffer、回收凝胶DNA的试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于凝胶DNA回收的溶胶buffer、回收凝胶DNA的试剂盒及其使用方法。其由异硫氰酸胍和NaCl组成；优选的，由3‑3.2M异硫氰酸胍和1.5‑3M NaCl组成。还公开了与所述溶胶buffer配套使用的DNA特异性吸附材料的制备方法，及其用于回收凝胶DNA的试剂盒和试剂盒的使用方法。本发明用于凝胶DNA回收的溶胶buffer和配套使用的DNA特异性吸附材料的成本低，制备简单快速(2个小时左右)，使用简单、效果好，回收率高达50％以上，仅需要实验室常规的仪器、试剂，单次回收DNA的起始量可达到200μg以上，回收的DNA可用于后续的PCR、测序等。
Description
技术领域
本发明涉及DNA回收领域，尤其涉及一种用于凝胶DNA回收的溶胶buffer、回收凝胶DNA的试剂盒及其使用方法。
背景技术
在基因克隆实验操作过程中，纯化回收经琼脂糖电泳的DNA是最常见的实验环节。目前，对于经过琼脂糖电泳的DNA纯化回收常用方法包括：低熔点琼脂糖胶回收、试剂盒柱式回收和玻璃奶法。但是这些方法操作相对繁琐、耗时长且每次实验的成本较高。此外，对于玻璃奶回收DNA法，使用的溶胶buffer的主要成分为NaI，该物质易被空气中的氧氧化而析出变色，影响DNA回收。
目前实验室最常用的凝胶DNA回收方法是试剂盒柱式回收法。如Qiaquick GelExtraction Kit(Qiagen)、Universal DNA Purification Kit(天根)、EasyPure QuickGel Extraction Kit(全式金)等，它们均采用特殊的缓冲液和离心吸附柱，可以从TAE或TBE琼脂糖凝胶中回收DNA片段。尽管它们操作不是十分复杂，但成本相对较高，每次回收的最低成本6-20元，这对于大量回收DNA的实验室来说，耗费了很大的经济成本。此外，这类离心吸附柱的单个最高吸附能力为10ug左右，若大于10ug的量则需要使用多个吸附柱分开纯化，进而影响回收效率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种成本低，高效，稳定，制备方法简单的用于凝胶DNA回收的溶胶buffer—AG buffer。
本发明还提供了快速制备高效DNA特异性吸附材料—Glass milk的方法，同时制备出与Glass milk配套使用的效果更佳更稳定的溶胶buffer—AG buffer。同时，提供采用Glass milk快速、高效回收凝胶DNA产物的实验方案。本发明主要解决凝胶DNA回收时间长、经济成本高、DNA回收能力有限、与Glass milk配套溶胶buffer不稳定等问题。本发明的Glass milk制备方法简单、高效，并且成本低，使得凝胶DNA回收成本相对于试剂盒柱式回收法，降低了95％左右，并且使得DNA的回收能力到达200μg，甚至更大。
为实现上述目的，本发明提供一种用于凝胶DNA回收的溶胶buffer，其特征在于，由异硫氰酸胍和NaCl组成；优选的，由3-3.2M异硫氰酸胍和1.5-3M NaCl组成。
进一步，由3.2M异硫氰酸胍和3M NaCl组成。
本发明还提供一种与所述用于凝胶DNA回收的溶胶buffer配套使用的DNA特异性吸附材料，其特征在于，制备方法为，称取Silica，加入超纯水A搅拌至混匀，离心，用超纯水重悬沉淀，再依次加入超纯水B和浓硝酸后混匀，加热至接近沸腾后冷却至室温，离心弃上清，再用超纯水C重悬，离心弃上清；再重复重悬，离心弃上清步骤1-4次；最后加入超纯水重悬沉淀即可；优选的，按照超纯水和沉淀1：1的体积比加入超纯水重悬沉淀即可。
进一步，所述Silica：超纯水A：超纯水B：浓硝酸的用量比例为10g：(50-70)ml：(3-5)ml：(5-15)ml；优选的，用量比例为10g：60ml：4ml：10ml。
进一步，所述离心为8000g离心10min；
所述加超纯水B和浓硝酸后混匀，加热至接近沸腾后冷却至室温步骤是在通风橱中进行的。
本发明还提供一种用于回收凝胶DNA的试剂盒，其特征在于，含有权利要求所述的用于DNA回收的溶胶buffer。
进一步，还含有所述的DNA特异性吸附材料。
本发明还提供一种所述用于回收凝胶DNA的试剂盒的使用方法，其特征在于，
根据切取的DNA凝胶重量，加入所述溶胶buffer，55-68℃下融化凝胶，优选65℃下融化凝胶；再将融化的凝胶恢复至室温；加入充分混匀的所述DNA特异性吸附材料进行混匀，第一次室温放置后第一次离心弃上清，沉淀加入洗液buffer，第二次离心弃上清；加入洗液buffer，第三次离心弃上清；开盖第二次室温放置，加入无菌水混匀，第三次放置；第四次离心后将上清转移至新管内，-20℃或-80℃保存即可。
进一步，所述洗液buffer为11.7g/L NaCl，0.74g/L EDTA,2.42g/L Tris-HCl，pH7.5；使用前加入2倍体积的无水乙醇。
进一步，所述切取的DNA凝胶重量：溶胶buffer：DNA特异性吸附材料：洗液buffer的用量比例为100mg：(250-350)μl：(3-8)μL：(400-1000)μL；优选的，比例为100mg：300μl：5μL；
所述第一次离心为13000rpm离心30s；第二次离心为13000rpm离心10s，第三次离心为13000rpm离心30s，第四次离心为13000rpm离心1min；
所述第一次室温放置为室温下放置5min；第二次室温放置为室温下放置5-10min；第三次放置为放置3min。
本发明的有益效果：
1、本发明的Glass milk制备方法简单、快速，仅需要实验室常规的仪器、试剂，2个小时左右就能够完成Glass milk的制备；
2、采用本发明制备的Glass milk对经琼脂糖电泳的DNA的回收效率高，可达到50％以上；
3、本发明的溶胶buffer(命名为AG buffer)与Qiagen试剂盒中的溶胶buffer有相当的效果且成本更低；
4、本发明的溶胶buffer与6M NaI效果相同，但比6M NaI稳定且不会出现被氧化问题；
5、试剂盒柱式回收法采用的离心柱体积均为750μl，若溶胶后体积大约750μl，则需要多次加入处理，多次离心。本发明的凝胶DNA回收方案，可根据实际情况，自行选用不同规格的离心管，避免了溶胶后反复过柱操作；
6、本发明的凝胶DNA回收方案可根据DNA的量，自行调节Glass milk的使用量，单次回收DNA的起始量不再仅限于10μg，可达到200μg,甚至更大。
7、采用本发明的凝胶DNA回收方案，DNA的回收率，可达到与Qiaquick GelExtraction Kit(Qiagen)相媲美，但成本仅仅是其1/40。
8、采用本发明的凝胶DNA回收方案成本是Universal DNA Purification Kit(天根)、EasyPure Quick Gel Extraction Kit(全式金)的1/20左右；
9、该方案回收的DNA可用于后续的PCR、测序等等。
附图说明
图1是不同溶胶buffer配合Glass milk回收凝胶DNA比较结果图。
图2是不同浓度GuSCN和NaCl组合配合Glass milk回收凝胶DNA比较结果图。
图3是常用的溶胶buffer配合Glass milk回收凝胶DNA比较结果图。
图4是常用的溶胶buffer配合Glass milk回收凝胶DNA效率统计结果图。
图5是Glass milk配合溶胶AG buffer使用与国产商品化的凝胶回收试剂盒比较结果图。
图6是Glass milk配合溶胶AG buffer使用与国产商品化的凝胶回收试剂盒回收DNA效率比较结果图。
图7是Glass milk配合溶胶AG buffer使用与进口商品化的凝胶回收试剂盒比较结果图。
图8是Glass milk配合溶胶AG buffer使用与商品化的凝胶回收试剂盒回收DNA效率比较结果图。
图9是采用本方案回收纯化DNA后的测序结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
DNA特异性吸附材料—Glass milk的制备：
1、称取10g Silica于烧杯中；(缩小了制备体系，Silica及浓硝酸的使用量进行了缩减)
2、加入含有(50～70)ml(优选60ml)超纯水，搅拌1h；
3、转移至离心管中，8000g离心10min，移除上清；
4、纯水重悬沉淀，转移烧杯中；
5、在通风橱中进行，向烧杯中加入(3～5)ml(优选4ml)超纯水后，再加入(5～15)ml(优选10ml)浓硝酸，混匀；
6、在通风橱内加热接近沸腾；
7、冷却至室温后转入离心管中，8000g离心10min后，移除上清；
8、加入40ml超纯水悬匀，8000g离心10min后，移除上清；
9、再重复上一步操作3次后，进行下一步操作；
10、估算沉淀体积后，按照超纯水：沉淀＝1:1的体积比例加入超纯水重悬沉淀，保存备用；
(二)、溶胶buffer—AG buffer的配制
1、称量Guanidine thiocyanate(异硫氰酸胍)和NaCl，使Guanidine thiocyanate(异硫氰酸胍)浓度为(3-3.2)M；使NaCl浓度为(1.5-3)M。优选3.2M异硫氰酸胍和2MNaCl；
2、置于50ml离心管中；
3、加入超纯水至50ml，充分溶解；
4、室温保存；
(三)、洗液buffer的配制
1、称取11.7g NaCl，0.74g EDTA(C10H14N2O8Na2·H2O),2.42g Tris-HCl；
2、定容到1L将pH调整到7.5；
3、高温高压湿热灭菌；
4、室温保存。
(四)、凝胶DNA回收操作步骤
1、称量切取的DNA凝胶重量；
2、根据凝胶重量，加入3倍体积的溶胶buffer，即100mg凝胶加入(250-350)μl(优选300μl)溶胶buffer；
3、65℃下融化凝胶约5-10min；
4、将融化的凝胶恢复至室温；
5、取出准备好的Glass milk，涡旋充分混匀；
6、加入(3-8)μL(优选5μl)Glass milk，充分混匀；
7、室温下放置5min，期间保持Glass milk处于悬浮状态或期间混匀2-3次；
8、13000rpm离心30s，移除上清；
9、加入(400-1000)μl(优选500μl)洗液buffer(使用前加入2倍体积的无水乙醇)，13000rpm离心10s，移除上清；
10、重复上一步操作1次；
11、13000rpm离心30s，移除上清；
12、开盖室温放置5-10min；
13、加入无菌水混匀，放置3min；
14、13000rpm 1min将上清转移至新管内，-20℃或-80℃保存。
实施例1：Glass milk配套溶胶buffer的成分确定
选用等量的相同DNA样品(PBOBI质粒DNA，大小约9000bp，可购自普如汀生物技术(北京)有限公司)，1％琼脂糖胶电泳后，切取DNA条带，切取的胶条大小基本相同，分别加入不同成分的溶胶buffer(Buffer A:3M GuSCN+3M NaCl；Buffer B:3M GuSCN+3M NaAC；Buffer C：3M GuSCN+3M GuHCl；Buffer D：6M GuSCN)，采用该研究中的凝胶DNA回收步骤进行DNA回收，最终使用等体积的无菌水进行洗脱后，取等体积的DNA溶液进行1％琼脂糖电泳检测后，结果见图1。其中3M GuSCN+3M NaCl泳道表示其溶胶buffer采用的是3M GuSCN+3MNaCl；泳道3M GuSCN+3M NaAC表示其溶胶buffer采用的是3M GuSCN+3M NaAC；buffer C：泳道3M GuSCN+3M GuHCl表示其溶胶buffer采用的是3M GuSCN+3M GuHCl；泳道6M GuSCN表示其溶胶buffer采用的是6M GuSCN。由图1中3M GuSCN+3M NaCl对应的泳道可以看出条带的亮度高于其他的泳道，从而说明3M GuSCN+3M NaCl可作为溶胶buffer，并且配合Glassmilk具有较好的DNA回收效果；尽管3M GuSCN+3M NaAC对应的泳道也具有较高的亮度，但由于NaAC具有刺激性气味，因此不适合作为常用的溶胶buffer。
实施例2：溶胶buffer各成分浓度优化
选用等量的相同DNA样品，1％琼脂糖胶电泳后，切取DNA条带，切取的胶条大小基本相同，采用不同浓度GuSCN和NaCl的混合液(Buffer A：3M GuSCN+3M NaCl；Buffer B：3.2M GuSCN+3M NaCl；Buffer C：3M GuSCN+2M NaCl；Buffer D：3.2M GuSCN+2M NaCl；Buffer E：3M GuSCN+1.5M NaCl；Buffer F：3.2M GuSCN+1.5M NaCl)作为溶胶buffer，采用该研究中的凝胶DNA回收步骤进行DNA回收，最终使用等体积的无菌水进行洗脱后，取等体积的DNA溶液进行1％琼脂糖电泳检测后，结果见图2。其中泳道3M GuSCN+3M NaCl表示其溶胶buffer采用的是3M GuSCN+3M NaCl；3.2M GuSCN+3M NaCl泳道表示其溶胶buffer采用的是3.2M GuSCN+3M NaCl；3M GuSCN+2M NaCl泳道表示其溶胶buffer采用的是3M GuSCN+2MNaCl；3.2M GuSCN+2M NaCl泳道表示其溶胶buffer采用的是3.2M GuSCN+2M NaCl；3MGuSCN+1.5M NaCl泳道表示其溶胶buffer采用的是3M GuSCN+1.5M NaCl；3.2M GuSCN+1.5MNaCl泳道表示其溶胶buffer采用的是3.2M GuSCN+1.5M NaCl。由图2中可以看出：泳道3.2MGuSCN+3M NaCl的条带的亮度高于其他的泳道并且相对于其他比例的溶胶速度较快，说明3.2M GuSCN和3M NaCl(AG buffer)是最适合的浓度比例。
此外，发明人也尝试了GuSCN浓度高于3.2低于3M配合3M NaCl作为溶胶buffer,发现:浓度高于3.2M的，GuSCN很难溶解；浓度低于3M的，GuSCN溶胶时的时间较长。所以3-3.2M的浓度比较适合。
实施例3：常用的溶胶buffer配合Glass milk(也即DNA特异性吸附材料)回收DNA的能力比较
采用该方案制备的Glass milk分别配合AG buffer、Qiagen试剂盒中的溶胶buffer—QG buffer以及6M NaI进行凝胶DNA回收最终使用等体积的无菌水进行洗脱后，取等量的DNA溶液进行1％琼脂糖电泳检测后，结果见图3和4。其中，标注AG buffer表示采用的是本发明的溶胶buffer(3.2M异硫氰酸胍和3M NaCl)、标注QG buffer表示采用的是Qiagen试剂盒中的溶胶buffer、标注6M NaI表示采用的是6M NaI作为溶胶buffer。传统上配合Glass milk使用的溶胶buffer就是6M NaI。每种buffer进行3次独立重复操作。
由图3中AG buffer对应3条泳道可以看出条带的亮度与QG buffer及6M NaI所对应的泳道相同。从图4中可看出AG buffer、QG buffer和6M NaI配合Glass milk使用的回收效率均在55±3％左右，从而说明AG buffer与QG buffer和6M NaI在配合Glass milk回收DNA具有相同的效果，而AG buffer在成本上低于QG buffer。在稳定性方面，由于GuSCN和NaCl为性质相对稳定的物质，而NaI易被空气中的氧氧化而析出，所以AG buffer比6M NaI更稳定。
实施例4：Glass milk配合AG buffer使用与国内商品化凝胶回收试剂盒的比较
目前国内商品化的凝胶试剂盒品牌繁多，质量参差不齐，我们选择其中两款与我们的回收方案进行比较。比较结果见图5和图6。图5中A标记对应的泳道为Glass milk配合溶胶AG buffer使用结果；B和C分别对应国产凝胶回收试剂盒品牌-TransGen和GenStar。图6中AMO代表Glass milk配合溶胶AG buffer使用，TransGen和GenStar分别为一款国产的凝胶回收试剂盒品牌。
通过图5和6可以看出我们的方案与国产TransGen Biotech品牌产品的回收效果相当，回收率均在50％左右并且我们的回收效率略高一些。与国产GenStar品牌产品相比，我们的方案具有明显优势，回收率比其高接近20％。
实施例5：Glass milk配合AG buffer使用与进口商品化凝胶回收试剂盒的比较
QIAGEN作为生物领域的领军企业，在分子方面其产品具有绝对的优势，但由于其产品昂贵的价格，让人望而却步。在该研究中我们对QIAGEN旗下的凝胶DNA回收产品(QIAquick Gel Extraction Kit，货号28704)与我们研制的凝胶DNA回收方案做了对比研究，比较结果见图7和图8；图7中A标记对应的泳道为Glass milk配合溶胶AG buffer使用结果；B标记对应的泳道为进口凝胶回收试剂盒结果。图8中AMO代表Glass milk配合溶胶AGbuffer使用，QIAGEN代表QIAGEN旗下商品化试剂盒。
通过图7中B和C对应的泳道，可以看到该研究的凝胶DNA回收方案与商品化的凝胶DNA回收试剂盒在凝胶DNA回收方面效果相当。通过图8，可以看出我们研制的方案对凝胶DNA的回收率为53.3％，QIAGEN旗下的商品化试剂盒的回收率63.1％，二者相差约10％，从而说明我们的DNA回收方案具有不错的效果，并且比QIAGEN试剂盒相比，仅为QIAGEN同类产品成本的1/40，有极大的价格优势。
实施例6：采用该方案回收到的DNA与测序的兼容性
将PCR后的产物(740bp左右)经过1％琼脂糖胶电泳后，切胶回收后采用该方案回收DNA后，进行测序，结果见图9。通过图9可以看出，回收的DNA与测序有良好的兼容性。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种用于凝胶DNA回收的溶胶buffer，其特征在于，由异硫氰酸胍和NaCl组成；优选的，由3-3.2M异硫氰酸胍和1.5-3M NaCl组成。
2.权利要求1所述用于凝胶DNA回收的溶胶buffer，其特征在于，由3.2M异硫氰酸胍和3M NaCl组成。
3.一种与权利要求1配套使用的DNA特异性吸附材料，其特征在于，制备方法为，称取Silica，加入超纯水A搅拌至混匀，离心，用纯水重悬沉淀，再依次加入超纯水B和浓硝酸后混匀，加热至接近沸腾后冷却至室温，离心弃上清，再用超纯水C重悬，离心弃上清；再重复重悬，离心弃上清步骤1-4次；最后加入超纯水重悬沉淀即可；优选的，按照超纯水和沉淀1：1的体积比加入超纯水重悬沉淀即可。
4.权利要求3所述DNA特异性吸附材料，其特征在于，所述Silica：超纯水A：超纯水B：浓硝酸的用量比例为10g：(50-70)ml：(3-5)ml：(5-15)ml；优选的，用量比例为10g：60ml：4ml：10ml。
5.权利要求3所述DNA特异性吸附材料，其特征在于，所述离心为8000g离心10min；
所述加超纯水B和浓硝酸后混匀，加热至接近沸腾后冷却至室温步骤是在通风橱中进行的。
6.一种用于回收凝胶DNA的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1-2任一项所述的用于凝胶DNA回收的溶胶buffer。
7.权利要求6所述用于回收凝胶DNA的试剂盒，其特征在于，还含有权利要求3-5任一项所述的DNA特异性吸附材料。
8.一种权利要求6-7任一项所述用于回收凝胶DNA的试剂盒的使用方法，其特征在于，
根据切取的DNA凝胶重量，加入权利要求1-2任一项所述溶胶buffer，55-68℃下融化凝胶，优选65℃下融化凝胶；再将融化的凝胶恢复至室温；加入充分混匀的权利要求3-5任一项所述DNA特异性吸附材料进行混匀，第一次室温放置后第一次离心弃上清，沉淀加入洗液buffer，第二次离心弃上清；加入洗液buffer，第三次离心弃上清；开盖第二次室温放置，加入无菌水混匀，第三次放置；第四次离心后将上清转移至新管内，-20℃或-80℃保存即可。
9.权利要求8所述用于回收凝胶DNA的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述洗液buffer为11.7g/L NaCl，0.74g/L EDTA,2.42g/L Tris-HCl，pH7.5；使用前加入2倍体积的无水乙醇。
10.权利要求8所述用于回收凝胶DNA的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述切取的DNA凝胶重量：溶胶buffer：DNA特异性吸附材料：洗液buffer的用量比例为100mg：(250-350)μl：(3-8)μL：(400-1000)μL；优选的，比例为100mg：300μl：5μL；
所述第一次离心为13000rpm离心30s；第二次离心为13000rpm离心10s，第三次离心为13000rpm离心30s，第四次离心为13000rpm离心1min；
所述第一次室温放置为室温下放置5min；第二次室温放置为室温下放置5-10min；第三次放置为放置3min。
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