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CN1858057A - 核酸的纯化方法和核酸的纯化装置 - Google Patents

核酸的纯化方法和核酸的纯化装置 Download PDF

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CN1858057A
CN1858057A CNA2006100749928A CN200610074992A CN1858057A CN 1858057 A CN1858057 A CN 1858057A CN A2006100749928 A CNA2006100749928 A CN A2006100749928A CN 200610074992 A CN200610074992 A CN 200610074992A CN 1858057 A CN1858057 A CN 1858057A
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CN
China
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dna
rna
solid phase
nucleic acid
solution
Prior art date
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Application number
CNA2006100749928A
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山下善宽
樱井智也
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Hitachi Ltd
Original Assignee
Hitachi Ltd
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers

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Abstract

本发明的目的为根据安全且简便的操作，从含有核酸的试样中纯化RNA。本申请的发明人进行了深入研究，结果发现如果在含有DNA和RNA的试样与离液剂的混合液中添加有机溶剂，则DNA不溶解，RNA维持溶解状态。本发明通过将含有核酸的试样、离液剂和有机溶剂混合，使DNA不溶解，从混合液中分离不溶解物，从残液中纯化RNA。此外，即使不在残液中加入试剂等，也可以通过与含二氧化硅固相接触，使RNA与含二氧化硅固相结合。而且，还可以从不溶解物中纯化DNA。根据本发明，可以通过安全又简便的操作从含有DNA和RNA的试样中纯化高纯度的RNA。此外，还可以从单一的试样中同时纯化DNA和RNA。

Description

核酸的纯化方法和核酸的纯化装置
技术领域
本发明涉及从含有核酸的试样中纯化核酸的技术。本发明涉及例如从含有DNA和RNA的生物材料中纯化RNA的技术。
背景技术
作为承载生物的基因信息的物质，有DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)。一般而言DNA是承载生物的全部基因信息的物质，另一方面，RNA是基于DNA的基因信息承担生物体内的蛋白质合成的物质。根据DNA的分析，主要可以获得基因序列信息，此外，根据RNA的分析，主要可以获得基因表达信息。它们是对于分子生物学极为重要的信息。进行DNA分析和RNA分析时，一般而言，从含有DNA和RNA的生物材料等试样中分离、纯化DNA和RNA的前处理操作是不可缺少的。在DNA和RNA的分离纯化中，需要排除阻碍PCR或RT-PCR等分析的物质的混入。尤其是，在RNA的分离纯化中，重要的是要排除会阻碍RNA分析的DNA的混入，这需要分离纯化高纯度的RNA。此外，在有效率地进行DNA和RNA分析时，希望从单一的试样中同时分离纯化DNA和RNA。
作为从生物材料中分离纯化RNA的方法，有Analitycal Biochemistry162，156-159(1989)中记载的方法。该方法是，(1)通过硫氰酸胍溶液溶解生物材料，依次添加酸性缓冲溶液、苯酚溶液、氯仿溶液，并混合；(2)通过离心分离法分离成含有RNA的水相、含有变性蛋白质和不溶解的DNA的有机溶剂相和水相的中间层；(3)在含有RNA的水相中添加乙醇或异丙醇；(4)通过离心分离法选择性沉淀不溶解的RNA。如果将该方法与以往的超离心分离方法比较，优点在于可以有效地分离纯化RNA，但是必须使用有害性强的苯酚、氯仿。而且，还不能够从单一的试样中同时分离纯化DNA和RNA。
作为不使用苯酚、氯仿等物质并且不需要进行乙醇沉淀、异丙醇沉淀等操作的核酸的分离纯化方法，有利用了核酸在离液剂存在下的与含二氧化硅固相的结合特性的B.Vogelstein and D.Gillespie，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76(2)，615-619(1979)或者R.Room等人在J.Clin.Microbiol.28(3)，495-503(1990)中记载的方法，但是通过该方法分离纯化的RNA含有DNA。而且还不能同时分离纯化DNA和RNA。
作为用离液剂溶解生物材料，在溶解液中添加含有盐和缓冲剂等的水溶液，使含有DNA的杂质不溶解，从除去不溶解物的溶液中提取RNA的方法，有特表2002-507121号公报中记载的方法，但是该方法需要在除去不溶解物后，添加乙醇等溶液，以再构建RNA对于含二氧化硅固相的结合条件，因此纯化分离操作变得烦杂。而且，也不能从单一的试样中同时分离纯化DNA和RNA。
作为利用核酸在离液剂存在下与含二氧化硅固相的结合特性，来分离纯化DNA和RNA的方法，有特开2002-187897号公报中记载的方法，但是即使在该方法的RNA的分离纯化中RNA的选择性也不充分，含有DNA。而且，为了同时从单一的试样中分离纯化DNA和RNA，需要分别构建DNA对于含二氧化硅固相的结合条件和RNA对于含二氧化硅固相的结合条件，因此纯化分离操作变得烦杂。
作为从单一的生物试样中同时分离纯化DNA和RNA的方法，有Molecular Cloning Third edition 7.9中记载的A Single-step Method for theSimultaneous Preparation of DNA，RNA，Protein from Cell and Tissue方法。该方法是，(1)用含有苯酚和硫氰酸胍溶液等的溶解液溶解生物试样；(2)混合氯仿；(3)通过离心分离法分离成含有RNA的水相和含有DNA和蛋白质的有机相；(4)通过异丙醇沉淀法从水相中纯化RNA；(5)通过乙醇沉淀法从有机相中纯化DNA的方法。该方法可以从单一的试样中同时分离纯化DNA和RNA，但是使用了有害性强的苯酚和氯仿，而且需要进行水相和有机相的分体分离和多次离心分离操作等复杂的操作。
【专利文献1】特表2002-507121号公报
【专利文献2】特开2002-187897号公报
【非专利文献1】Analytical Biochemistry 162，156-159(1989)
【非专利文献2】B.Vogelstein and D.Gillespie，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76(2)，615-619(1979)
【非专利文献3】R.Room et al，J.Clin.Microbiol.28(3)，495-503(1990)
【非专利文献4】Molecular Cloning Third edition 7.9，A Single-stepMethod for the Simultaneous Preparation of DNA，RNA，Protein from Cell andTissue
发明内容
本发明的目的涉及通过安全又简便的操作，从含有核酸的试样中纯化RNA。
本申请的发明人进行深入研究的结果，发现如果在含有DNA和RNA的试样与离液剂的混合液中添加有机溶剂，则DNA不溶解，RNA维持溶解状态。本发明涉及将含有核酸的试样、离液剂和有机溶剂混合，使DNA不溶解，从混合液中分离不溶解物，从残液中纯化RNA。此外，即使不在残液中加入试剂等，也可以通过与含二氧化硅固相接触，使RNA与含二氧化硅固相结合。此外，还可以从不溶解物中纯化DNA。
根据本发明，可以通过安全又简便的操作从含有DNA和RNA的试样中纯化高纯度的RNA。此外，还可以从单一的试样中同时纯化DNA和RNA。
附图说明
图1：芯片型DNA纯化装置的示意图。
图2：柱型RNA纯化装置的示意图。
图3：芯片型DNA纯化装置的示意图。
图4：柱型RNA纯化装置的示意图。
图5：DNA、RNA纯化装置的示意图。
图中，10为芯片型DNA纯化装置；11、31为开口部；12、32为前端部；13、23、113为过滤不溶解物的过滤器；20为旋转柱型DNA纯化装置；21、41、111为第1开口部；22、42、112为第2开口部；30为芯片型RNA纯化装置；33、43、124为含二氧化硅固相；34、44、123为含二氧化硅固相保持构件；40为旋转柱型RNA纯化装置；100为DNA、RNA纯化装置；110为上部旋转柱；120为下部旋转柱；121为第3开口部；122为第4开口部。
具体实施方式
下面，参照附图对上述和其它本发明的新特征和效果进行说明。
实施例
本实施例中，混合含有核酸的试样、离液剂和有机溶剂，使DNA大部分不溶解，从混合液中分离不溶解物。然后，将分离了不溶解物的混合液与含二氧化硅固相接触，使RNA与含二氧化硅固相结合，从混合液中分离含二氧化硅固相后，通过清洗液除去与含二氧化硅固相结合的杂质，用洗脱液洗脱与含二氧化硅固相结合的RNA。而且，还可以从分离自混合液的不溶解物中纯化DNA。
为了使DNA不溶解，在含有核酸的试样中添加离液剂和有机溶剂而形成的混合液，需要使其有机溶剂的浓度最适化。当有机溶剂的浓度比最适浓度区域还低时DNA无法不溶解，另一方面当有机溶剂的浓度比最适浓度区域还高时DNA和RNA都不溶解。有机溶剂的最适浓度主要是因有机溶剂的种类而异。通过添加有机溶剂后经移液操作或采用搅拌器等混合，来促进不溶解物的形成。
作为提取纯化RNA或DNA的起始材料的含有核酸的试样，有含有DNA和RNA的溶液或生物材料。作为含有DNA和RNA的溶液，可以使用从含有DNA和RNA的生物材料中以DNA和RNA混合存在的状态粗纯化核酸的溶液等。此外，作为含有DNA和RNA的生物材料，可以使用血液、生物体组织、培养细胞、细菌等。
作为添加于含有核酸的试样中，促进核酸与含二氧化硅固相结合的离液剂，可以使用硫氰酸胍、硫氰酸钠、盐酸胍、碘化钠、碘化钾等。作为离液剂的浓度，添加有机溶剂后的混合液中的浓度，可以使用1.0～4.0mol/l的范围。但是，以生物材料为对象时，优选除了离液剂之外，还添加表面活性剂、蛋白质变性剂、蛋白质裂解酶等，进而再用搅拌机器或匀浆器等进行物理处理，促进生物材料的溶解和DNA和RNA的分离。
作为有机溶剂，可以使用选自脂肪醇、脂肪醚、脂肪酸酯、脂肪酮的一种化合物或两种或两种以上化合物的组合。作为脂肪醇，可以使用甲醇、乙醇、2-丙醇、2-丁醇、聚乙二醇等。作为脂肪醚，可以使用二乙二醇二甲醚、二乙二醇二乙醚、乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚、丙二醇二甲醚、丙二醇二乙醚、四氢呋喃等。作为脂肪酸酯，可以使用乳酸乙酯、丙二醇单甲醚乙酸酯等。作为脂肪酮，可以使用丙酮、羟丙酮、甲基酮等。
根据过滤混合物的方法或者离心分离混合液的方法，从混合液中分离不溶解物。为了从混合液中分离不溶解物，所采用的构件具有用来投入含有核酸试样、离液剂和有机溶剂的混合液的混合液投入口；能够从混合液中分离DNA的不溶解物的过滤器；用来排放流经过滤器的混合液的混合液排出口。例如，可以通过流经内置了由具有用于截留不溶解物的粒子保持直径并且不与混合液的RNA结合的含有非二氧化硅的材料构成的过滤器的柱、芯片或注射器，来实施混合液的过滤。作为用于截留不溶解物的粒子保持直径，可以使用0.1μm～500μm的范围。此外，作为不结合混合液的RNA的含有非二氧化硅的材料，可以使用聚丙烯、尼龙、聚酯、聚偏氟乙烯等。
根据在容器内搅拌混合含二氧化硅固相和混合液的方法，或者使混合液流经具备用来投入混合液的溶液投入口、以及被安置成与投入到溶液投入口的溶液可以接触的含二氧化硅固相的构件的方法，使从混合液中分离了不溶解物的混合液与含二氧化硅固相接触。作为具备含二氧化硅固相的构件，可以使用固定了含二氧化硅固相的柱、芯片或注射器等。将混合液与含二氧化硅固相接触后，分离含二氧化硅固相和混合液。作为含二氧化硅固相，可以使用玻璃粒子、二氧化硅粒子、玻璃纤维、二氧化硅纤维、硅藻土、或它们的粉碎物等含有氧化硅的物质。
根据在容器内搅拌混合含二氧化硅固相和清洗液的方法，或者使清洗液通过固定有含二氧化硅固相的柱、芯片或注射器等的方法，使清洗液与含二氧化硅固相接触。在清洗液与含二氧化硅固相接触后，从含二氧化硅固相分离清洗液。作为清洗液，可以使用能够维持RNA对于含二氧化硅固相的结合，并且可以除去与含二氧化硅固相结合的杂质，而且含有80％(v/v)或其以上乙醇的水溶液或者含有80％(v/v)或其以上EtOH的低盐浓度的缓冲液。
根据在容器内搅拌混合含二氧化硅固相和洗脱液的方法，或者使洗脱液通过固定有含二氧化硅固相的柱、芯片或注射器等的方法，使洗脱液与含二氧化硅固相接触。在洗脱液与含二氧化硅固相接触后，从含二氧化硅固相分离回收洗脱液。作为洗脱液，可以使用能够洗脱含二氧化硅固相所吸附的RNA，并且无核酸酶的水溶液或无核酸酶的低盐浓度的缓冲液。
当根据过滤混合液来分离不溶解物时，使清洗液与截留了不溶解物的过滤器接触而除去杂质后，使洗脱液与过滤器接触，来洗脱DNA，这样从不溶解物中纯化DNA。此外，根据混合液的离心分离法分离不溶解物时，通过除去上清，在沉淀的不溶解物中添加清洗液，溶解不溶解物中含有的杂质，再次通过离心分离使不溶解物沉淀，除去上清，在沉淀的不溶解物中添加DNA洗脱液，来洗脱DNA。作为清洗液，可以使用不溶解DNA并且溶解不溶解物中所含杂质，而且含有70％(v/v)或其以上EtOH的水溶液或者含有70％(v/v)或其以上EtOH的低盐浓度的缓冲液等。作为洗脱液，可以使用可溶解DNA的无核酸酶的水溶液或无核酸酶的低盐浓度的缓冲液。而且，为了进一步提高从不溶解物中纯化的DNA的纯度和产量，可以在将不溶解物溶解于无核酸酶的水溶液或无核酸酶的低盐浓度的缓冲液后，通过乙醇沉淀等方法再次纯化。
通过以上说明，在本实施例中，用于使DNA不溶解的混合液的组成与用于使含二氧化硅固相与RNA结合的混合液的组成相同，不需要分别构建DNA的不溶解条件和RNA对于含二氧化硅固相的结合条件，或者DNA对于含二氧化硅固相的结合条件和RNA对于含二氧化硅固相的结合条件。因此，可以通过将分离了DNA的不溶解物的混合液直接与含二氧化硅固相结合，分离纯化RNA。作为具体的例子，通过使不溶解DNA的混合液连续地从能够截留DNA的不溶解物的过滤器、以及可以与RNA结合的含有二氧化硅的过滤器，可以分离纯化DNA和RNA。通过这些方法，大大提高DNA和RNA分离纯化操作的简便性。
(实验)
下面，对本实施例的验证实验进行说明。
A)下面，对本实验中使用的材料，试剂，装置进行说明。
1.含有DNA和RNA的生物材料
1.1白血球
使用以EDTA·2Na作为抗凝固剂用真空采血管采取的人全血中分离的白血球。
1.2培养细胞
使用小鼠骨髓瘤(Sp2/0-Ag14)(大日本制药制造)的培养细胞。
1.3生物体组织
使用小鼠肝脏(ヮナコシ制)。
2.试剂
2.1红血球溶解液
155mM NH4Cl
10mM KHCO3
0.1mM EDTA·2Na
2.2溶解液
4M GuSCN
25mM柠檬酸钠(pH7.5)
1％β硫基乙醇
2.3有机溶剂溶液
(1)40％(v/v)二乙二醇二甲醚水溶液
(2)42.5％(v/v)二乙二醇二甲醚水溶液
(3)45％(v/v)二乙二醇二甲醚水溶液
(4)47.5％(v/v)二乙二醇二甲醚水溶液
(5)50％(v/v)二乙二醇二甲醚水溶液
(6)65％(v/v)2-丙醇水溶液
(7)67.5％(v/v)2-丙醇水溶液
(8)70％(v/v)2-丙醇水溶液
(9)72.5％(v/v)2-丙醇水溶液
(10)75％(v/v)2-丙醇水溶液
(11)77.5％(v/v)乙醇水溶液
(12)70％(v/v)2-丁醇水溶液
(13)50％(v/v)聚乙二醇(平均分子量为300)水溶液
(14)70％(v/v)乳酸乙酯水溶液
2.4清洗液
(1)DNA清洗液
80％(v/v)乙醇水溶液
(2)RNA清洗液
80％(v/v)乙醇水溶液
2.5洗脱液
(1)DNA洗脱液
TE(pH8.0)(和光纯药制)
(2)RNA洗脱液
H2O(无核酸酶)(和光纯药制)
3.DNA纯化装置
(1)不溶解物分离过滤器
使用粒子保持直径为100μm的聚丙烯粒子烧结板(厚度为2mm)。
(2)芯片型DNA纯化装置
图1中表示了芯片型DNA纯化装置的构成例。芯片型DNA纯化装置10是分注用芯片那样的外形，其具有可以投入液体的开口部11，和可以排出液体的前端部12，其内部有不溶解物分离过滤器13。该装置也可以是在压力控制装置上装备开口部，从前端部将液体吸入吐出。在本实验，在内径4mm的芯片内部压入被切割成直径4.2mm的圆柱状的不溶解物分离过滤器来使用。
(3)旋转柱型DNA纯化装置
图2中表示了旋转柱型DNA纯化装置的构成例。旋转柱型DNA纯化装置20是旋转柱那样的外形，其具有用于投入液体的第1开口部21、排出液体的第2开口部22，其内部有不溶解物分离过滤器23。该装置安装于离心分离器中，通过离心分离，可以使被投入的溶液通过不溶解物分离过滤器，排出。在本实验中，在内径7.5mm的旋转柱内部压入被切割成直径7.6mm的圆状不溶解物分离过滤器来使用。
4.RNA纯化装置
(1)含二氧化硅的固相
使用玻璃纤维滤纸(GF/D)(Whatman公司制)。
(2)含二氧化硅的固相保持构件
使用粒子保持直径为100μm的聚丙烯粒子烧结板(厚度为1.5mm)。
(3)芯片型RNA纯化装置
图3中表示了芯片型RNA纯化装置的构成例。芯片型RNA纯化装置30是分注用芯片那样的外形，其具有可以安装于压力控制装置的开口部31、可以吸入和排出液体的前端部32，其内部有含二氧化硅固相33。含二氧化硅固相的两侧安装有圆板状的含二氧化硅固相保持构件34。这些含二氧化硅固相保持构件也可形成液体和气体自由流通的许多小孔。该装置也可以在压力控制装置上装备开口部，从前端部吸引和排出液体。在本实验中，将一块被切割成直径4.2mm的圆状的含二氧化硅固相，以被夹在两块被切割成直径4.1mm的圆状的含二氧化硅固相保持构件之间的状态，压入到内径4mm的中空芯片内部来使用。
(4)旋转柱型DNA纯化装置
图4中表示了旋转柱型RNA纯化装置的构成例。旋转柱型RNA纯化装置40是旋转柱那样的外形，其具有用于投入溶液的第1开口部41、排出溶液的第2开口部42，其内部有在两端安装有含二氧化硅固相保持构件44的含二氧化硅固相43。该装置安装于离心分离器中，通过离心分离，可以使投入的溶液通过含二氧化硅固相，排出。在本实验中，将两块被切割成直径7.7mm的圆状的含二氧化硅固相，以被夹在两块被切割成直径7.6mm的圆状的含二氧化硅固相保持构件之间的状态，压入到内径7.5mm的旋转柱内部来使用。
5.DNA、RNA纯化装置
图5中表示DNA、RNA纯化装置的构成例。DNA、RNA纯化装置100是组合了旋转柱型DNA纯化装置和旋转柱型RNA纯化装置，由作为DNA纯化装置的上部旋转柱110和作为RNA纯化装置的下部旋转柱120构成。上部旋转柱110具有用于投入溶液的第1开口部111、排出溶液的第2开口部112，在其内部有不溶解物分离过滤器113。下部旋转柱120具有与上部旋转柱连接并且用于投入从上部旋转柱排出的溶液的第3开口部121、用于排出溶液的第4开口部122，其内部有在两端安装有含二氧化硅固相保持构件123的含二氧化硅固相124。该装置安装于离心分离器中，通过离心分离，可以使投入的溶液连续地通过不溶解物分离过滤器和含二氧化硅固相，排出。在本实验中组合使用上部旋转柱和下部旋转柱，其中，上部旋转柱是在内径为6.7mm的旋转柱内部压入被切割成直径为6.8mm的圆状的不溶解物分离过滤器而形成，下部旋转柱是将两块被切割成直径7.7mm的圆柱状的玻璃纤维滤纸，以被夹在两块被切割成直径7.6mm的圆状的含二氧化硅固相保持构件之间的状态，压入到内径7.5mm的旋转柱内部而形成。
B)下面显示的是本实验中使用的各种方法。从含有DNA和RNA的生物材料中纯化分离DNA和RNA的方法是通过对以下各种方法适当组合而进行的。
1.从全血中分离白血球的方法
(1)在全血中添加全血容量的5倍容量的红血球溶解液并混合。
(2)在冰上孵育5分钟。
(3)以400×g进行10分钟离心分离。
(4)除去上清。
(5)在沉淀块中添加混合全血添加量的2倍容量的红血球溶解液。
(6)在4℃环境下以400×g进行10分钟离心分离。
(7)除去上清获得白血球的沉淀块。
2.生物材料的溶解方法
2.1白血球的溶解方法
(1)在白血球沉淀块中添加分离了白血球的全血量的一半容量的溶解液并混合。
(2)通过匀浆器(QIA shredder homogenizer)(QAIGEN制)使混合液均匀。
2.2培养细胞的溶解方法
(1)对于细胞数为5×105的细胞块，添加1ml溶解液并混合。
(2)通过匀浆器(T8 ULTRA-TURRAX)(IKA制)使混合液均匀。
2.3生物体组织的溶解方法
(1)对于1mg生物体组织，添加1ml溶解液并混合。
(2)通过匀浆器(T8 ULTRA-TURRAX)(IKA制)使混合液均匀。
3.不溶解物的形成方法
在生物材料中添加与添加的溶解液等量的有机溶剂并充分混合。
4.DNA纯化方法
4.1采用芯片型DNA纯化装置对DNA分离、纯化的方法
(1)从芯片上部将形成了不溶解物的混合液添加到芯片内部。
(2)在芯片上安装注射器，芯片内部的溶液从芯片下部排出。
(3)撤掉注射器，从芯片上部将与混合液等量的DNA清洗液添加到芯片内部。
(4)安装注射器，芯片内部的DNA清洗液从芯片下部排出。
(5)重复操作(3)、(4)两次。
(6)在纯化品容器中添加混合液的1/5容量的DNA洗脱液。
(7)通过芯片下部吸入DNA洗脱液直至通过不溶解物分离过滤器，在室温下孵育3分钟。
(8)DNA洗脱液通过芯片下部排出到纯化品容器中。
(9)通过芯片下部吸入DNA洗脱液直至通过不溶解物分离过滤器，排出到纯化品容器中。
(10)重复操作(9)九次，在纯化品容器中获得DNA纯化溶液。
4.2根据旋转柱型DNA纯化装置对DNA分离、纯化方法
(1)在旋转柱内部添加形成了不溶解物的混合液。
(2)在旋转柱中设置接收溶液的容器，以2000×g离心分离10秒，旋转柱内部的溶液排出到接收溶液的容器中。
(3)在旋转柱内部添加与混合液等量的DNA清洗液。
(4)在旋转柱中设置接收溶液的容器，以2000×g离心分离10秒，旋转柱内部的溶液排出到接收溶液的容器中。
(5)重复操作(3)、(4)两次。
(6)在旋转柱内部添加混合液的1/5容量的DNA洗脱液。
(7)在60℃孵育3分钟。
(8)在旋转柱中设置接收溶液的纯化品容器，以2000×g离心分离1分钟，旋转柱内部的溶液排出到接收溶液的纯化品容器中，获得DNA纯化溶液。
4.3根据离心分离对DNA分离、纯化的方法
(1)以6000×g对形成了不溶解物的混合液离心分离3分钟。
(2)将上清转移到其它容器中。
(3)在沉淀物中添加与混合物等量的DNA清洗液并混合。
(4)以10000×g离心分离5分钟。
(5)弃去上清，在沉淀物中添加与混合物等量的DNA清洗液并混合。
(6)以10000×g离心分离5分钟。
(7)弃去上清，在沉淀物中添加混合物的1/5容量的DNA洗脱液并混合，获得DNA纯化溶液。
5.RNA纯化方法
5.1根据芯片型RNA纯化装置对RNA分离、纯化的方法
(1)在芯片上安装注射器。
(2)从芯片下部吸收流经不溶解物分离过滤器的混合液直至通过含二氧化硅固相，排出到容器中。
(3)重复操作(2)五次。
(4)撤掉注射器，从芯片上部将与混合液等量的RNA清洗液添加到芯片内部。
(5)安装注射器，芯片内部的RNA清洗液从芯片下部排出。
(6)重复操作(4)、(5)两次。
(7)在纯化品容器中添加混合液的1/20容量的RNA洗脱液。
(8)由芯片下部吸入RNA洗脱液直至通过含二氧化硅固相，排出到纯化品容器中。
(9)重复操作(8)十次，在纯化品容器中获得RNA纯化溶液。
5.2根据旋转柱型RNA纯化装置对RNA分离、纯化方法
(1)在旋转柱内部添加流经不溶解物分离过滤器的混合液。
(2)在旋转柱中设置接收溶液的容器，以4000×g离心分离1分钟，旋转柱内部的溶液排出到接收溶液的容器中。
(3)在旋转柱内部添加与混合液等量的RNA清洗液。
(4)在旋转柱中设置接收溶液的容器，以4000×g离心分离1分钟，旋转柱内部的溶液排出到接收溶液的容器中。
(5)重复操作(3)、(4)两次。
(6)在旋转柱内部添加混合液的1/20容量的RNA洗脱液。
(7)在旋转柱中设置接收溶液的纯化品容器，以4000×g离心分离1分钟，旋转柱内部的溶液排出到接收溶液的纯化品容器中，获得RNA纯化溶液。
6.根据DNA、RNA纯化装置对DNA和RNA分离、纯化的方法
(1)在DNA、RNA纯化装置的上部旋转柱内部添加形成了不溶解物的混合液。
(2)在旋转柱中设置接收溶液的容器，以4000×g离心分离1分钟，旋转柱内部的溶液排出到接收溶液的容器中。
(3)分离DNA、RNA连续纯化装置的上部旋转柱和下部旋转柱。
(4)在上部旋转柱内部添加与混合液等量的DNA清洗液。
(5)在下部旋转柱内部添加与混合液等量的RNA清洗液。
(6)在各个旋转柱设置接收溶液的容器，以4000×g离心分离1分钟，旋转柱内部的溶液排出到接收溶液的容器中。
(7)重复操作(3)、(4)两次。
(8)在上部旋转柱内部添加混合液的1/5容量的DNA洗脱液，在65℃孵育3分钟。
(9)在下部旋转柱内部添加混合液的1/20容量的RNA洗脱液。
(10)在各个旋转柱设置接收溶液的容器，以4000×g离心分离1分钟，旋转柱内部的溶液排出到各自接收溶液的纯化品容器中，获得DNA纯化溶液和RNA纯化溶液。
C)下面对在本实验中纯化的DNA和RNA的评价方法进行说明。
1.根据电泳计算DNA和RNA的含量比率
采用1.25％琼脂糖凝胶(Reliant RNA Gel System)(FMC制)对经甲酰胺进行了变性处理的DNA纯化溶液和RNA纯化溶液进行电泳(10V/cm，40分钟)。用溴化乙锭对电泳后的琼脂糖凝胶染色，在UV照射下通过デンシトグラフ(ATTO制)测定含有mRNA和rRNA的RNA组的荧光强度和基因组DNA的荧光强度，基于RNA与DNA的荧光强度比，计算出RNA与DNA的含量比率。
2.DNA和RNA的浓度测定
适量地稀释DNA纯化溶液和RNA纯化溶液，用分光光度计(GeneSpecI)(日立那珂仪器制造)测定260nm的吸光度，基于根据デンシトグラヮ分析计算出的RNA与DNA的含量比率，使RNA和DNA的浓度因子为40μg/ml、50μg/ml，计算出RNA量和DNA量。
D)验证实验1
在含有DNA和RNA的生物材料和离液剂的混合液中添加有机溶剂，使DNA不溶，为了分离纯化DNA和RNA，需要使有机溶液的浓度最适化。在本实验中，为了评价DNA和RNA的分离纯化效果与有机溶剂浓度的关系，使用二乙二醇二甲醚和2-丙醇作为有机溶剂，变化有机溶剂浓度，分离纯化DNA和RNA，对有机溶剂浓度的最适化进行研究。
生物材料：白血球(相当于600μl全血)
有机溶剂：二乙二醇二甲醚水溶液、2-丙醇水溶液
DNA纯化方法：通过芯片型DNA纯化装置对DNA纯化的方法
RNA纯化方法：通过旋转柱型RNA纯化装置对RNA纯化的方法
下面的表1中，显示了DNA纯化溶液的DNA量和RNA含量，以及RNA纯化溶液的RNA量和DNA含量。
在使用二乙二醇二甲醚时，在浓度45％左右，DNA纯化溶液几乎不含RNA，并且，RNA纯化溶液几乎不含DNA，纯化分离出了高纯度的DNA和RNA。另一方面，关于浓度40％，DNA纯化溶液的DNA量降低，可认为RNA纯化溶液的DNA含量有增加的倾向。此外，关于浓度50％，DNA纯化溶液的RNA含量增加，可认为RNA纯化溶液的RNA含量有降低的倾向。
在使用2-丙醇时，在浓度70％左右，DNA纯化溶液几乎不含RNA，此外，RNA纯化溶液几乎不含DNA，纯化分离出了高纯度的DNA和RNA。另一方面，关于浓度65％，DNA纯化溶液的DNA量降低，可认为RNA纯化溶液的DNA含量有增加的倾向。此外，关于浓度75％，DNA纯化溶液的RNA含量增加，可认为RNA纯化溶液的RNA含量有降低的倾向。
一般认为RNA或DNA的含量比率根据有机溶剂浓度而变动的原因在于，有机溶剂浓度比最适浓度域更低时DNA的不溶解变得不充分，溶解状态的DNA和RNA一起与含二氧化硅固相结合，另一方面，有机溶剂浓度比最适浓度域更高时DNA和RNA都不溶解，不溶解的RNA与DNA一起被不溶解物分离过滤器截留。
表1
  有机溶剂   浓度％(v/v)   DNA纯化溶液DNA量μg(RNA量μg)   RNA纯化溶液RNA量μg(DNA量μg)
  二乙二醇二甲醚   40   8.9(0.0)   2.8(3.2)
  42.5   14.8(0.0)   2.6(0.2)
  45   15.2(0.0)   2.5(0.1)
  47.5   15.4(0.3)   2.1(0.0)
  50   15.9(0.5)   0.8(0.0)
  2-丙醇   65   4.1(0.0)   2.9(4.7)
  67.5   15.4(0.0)   2.7(0.2)
  70   15.5(0.0)   2.4(0.1)
  72.5   15.3(0.3)   2.2(0.0)
  75   16.1(0.5)   1.3(0.0)
E)验证实验2
在含有DNA和RNA的生物材料和离液剂的混合液中添加有机溶剂，仅使DNA不溶解，来分离纯化DNA和RNA的方法，可以使用各种有机溶剂实施。在本实验中，为了评价DNA和RNA的分离纯化效果与有机溶剂种类的关系，使用乙醇、2-丙醇、2-丁醇、聚乙二醇、乳酸乙酯、二乙二醇二甲醚，在根据(验证实验1)的方法确定的最适浓度下，分离纯化DNA和RNA。
生物材料：白血球(相当于600μl全血)
DNA纯化方法：通过芯片型DNA纯化装置对DNA纯化的方法
RNA纯化方法：通过旋转柱型RNA纯化装置对RNA纯化的方法
下面的表2中，显示了DNA纯化溶液的DNA量和RNA含量，以及RNA纯化溶液的RNA量和DNA含量。对于各种有机溶剂的给定浓度来说，DNA纯化溶液几乎不含RNA，并且，RNA纯化溶液几乎不含DNA，纯化分离出了高纯度的DNA和RNA。
表2
  有机溶剂   浓度％(v/v)   DNA纯化溶液DNA量μg(RNA量μg)   RNA纯化溶液RNA量μg(DNA量μg)
  乙醇   77.5   13.5(0.0)   1.6(0.2)
  2-丙醇   70   15.5(0.0)   2.4(0.1)
  2-丁醇   70   12.8(0.1)   2.0(0.1)
  聚乙二醇   50   13.7(0.1)   1.8(0.1)
  乳酸乙酯水溶液   70   14.9(0.0)   2.5(0.1)
  二乙二醇二甲醚   45   15.2(0.0)   2.5(0.1)
F)验证实验3
在含有DNA和RNA的生物材料和离液剂的混合液中添加有机溶剂，仅使DNA不溶，来分离纯化DNA和RNA的方法，可以通过使用各种纯化装置实施。在本实验中，为了评价DNA和RNA的分离纯化效果与各种纯化装置的关系，在使用旋转柱型或芯片型的DNA纯化装置和RNA纯化装置的方法中，通过以下的条件分离纯化DNA和RNA。
生物材料：白血球(相当于600μl全血)
有机溶剂：70％(V/V)2-丙醇水溶液
下面的表3中，显示了DNA纯化溶液的DNA量和RNA含有率，以及RNA纯化溶液的RNA量和DNA含有率。在各种方法中，DNA纯化溶液几乎不含RNA，并且，RNA纯化溶液几乎不含DNA，纯化分离出了高纯度的DNA和RNA。
DNA纯化溶液的DNA量是，当采用离心分离法时最多，接下来的顺序是采用芯片型纯化装置的方法、采用旋转柱型纯化装置的方法。一般认为这是由于，尽管在各方法中不溶解DNA的截留效率几乎相同，但是从不溶解的DNA中洗脱DNA的效率不同。此外，采用芯片型纯化装置的方法时，RNA纯化溶液的RNA量要比采用旋转柱型纯化装置的方法时更多。一般认为这是由于，在各方法中对于含二氧化硅固相的RNA结合效率和RNA洗脱效率不同。
另一方面，分离纯化DNA和RNA操作需要的时间是，采用DNA和RNA纯化装置的方法时最短，接下来的顺序是采用旋转柱型纯化装置的方法、采用芯片型纯化装置的方法。这是因为采用柱型纯化装置的方法比采用芯片型纯化装置的方法的操作更简便。
此外，在纯化分离DNA和RNA的操作中简便性最高的使用DNA、RNA纯化装置的方法，由于用来形成DNA不溶解物的混合溶液的组成与用来使RNA和含二氧化硅固相结合的混合溶液的组成相同，因此是可实施的方法。
表3
  DNA纯化装置   RNA纯化装置   DNA纯化溶液DNA量μg(RNA量μg)   RNA纯化溶液RNA量μg(DNA量μg)
  芯片型纯化装置   芯片型纯化装置   14.0(0.1)   2.7(0.1)
  芯片型纯化装置   旋转柱型纯化装置   14.2(0.1)   2.4(0.1)
  旋转柱型纯化装置   芯片型纯化装置   11.2(0.1)   2.7(0.1)
  离心分离机   芯片型纯化装置   16.3(0.2)   2.6(0.1)
  DNA、RNA纯化装置   10.5(0.1)   2.3(0.1)
G)验证实验4
在含有DNA和RNA的生物材料和离液剂的混合液中添加有机溶剂，仅使DNA不溶，来分离纯化DNA和RNA的方法，可以应用于各种含核酸试样。在本实验中，为了评价DNA和RNA的分离纯化效果与含核酸试样的关系，使用各种生物材料，通过以下条件分离纯化DNA和RNA。
生物材料：
(1)白血球(相当于600μl全血)
(2)培养细胞(细胞数5×105)
(3)生物体组织(1mg)
有机溶剂：70％(V/V)乳酸乙酯水溶液
DNA纯化方法：通过芯片型DNA纯化装置对DNA纯化的方法
RNA纯化方法：通过芯片型RNA纯化装置对RNA纯化的方法
下面的表4中，显示了DNA纯化溶液的DNA量和RNA含有率，以及RNA纯化溶液的RNA量和DNA含有率。在各种生物材料中，DNA纯化溶液几乎不含RNA，并且，RNA纯化溶液几乎不含DNA，纯化分离出了高纯度的DNA和RNA。
表4
  生物材料   DNA纯化溶液DNA量μg(RNA量μg)   RNA纯化溶液RNA量μg(DNA量μg)
  白血球   14.7(0.0)   2.7(0.1)
  培养细胞   2.9(0.0)   4.0(0.0)
  生物体组织   1.1(0.0)   3.7(0.0)

Claims (9)

1.一种纯化核酸的方法，其是将含有核酸的试样、离液剂和有机溶剂混合，形成DNA的不溶解物；从混合液中除去不溶解物；将分离了不溶解物的混合液与含二氧化硅固相接触，使RNA与含二氧化硅固相结合；从混合液中分离含二氧化硅固相；清洗含二氧化硅固相；从含二氧化硅固相中洗脱RNA的方法。
2.根据权利要求1记载的纯化核酸的方法，其中，所述有机溶剂是脂肪醇、脂肪醚、脂肪酸酯、或脂肪酮中的化合物，或者它们的组合。
3.根据权利要求1记载的纯化核酸的方法，其中，所述有机溶剂是乙醇、2-丙醇、2-丁醇、聚乙二醇、二乙二醇二甲醚、乳酸乙酯。
4.一种纯化核酸的方法，其是将含有核酸的试样、离液剂和有机溶剂混合，形成DNA的不溶解物；从混合液中分离不溶解物，从不溶解物中纯化DNA；将分离了不溶解物的混合液与含二氧化硅固相接触，使RNA与含二氧化硅固相结合；从混合液中分离含二氧化硅固相；清洗含二氧化硅固相；从含二氧化硅固相洗脱RNA的方法。
5.根据权利要求4记载的纯化核酸的方法，其中，所述有机溶剂是脂肪醇、脂肪醚、脂肪酸酯、或脂肪酮中的化合物，或者它们的组合。
6.根据权利要求4记载的纯化核酸的方法，其中，所述有机溶剂是乙醇、2-丙醇、2-丁醇、聚乙二醇、二乙二醇二甲醚、乳酸乙酯。
7.一种核酸纯化装置，其含有以下构件，
分离构件：具备用来投入含有核酸的试样、离液剂和有机溶剂的混合液的混合液投入口；可以从混合液中分离DNA的不溶解物的过滤器；用来排出流经过滤器的混合液的混合液排出口，
核酸截留构件：具备可以与分离构件的混合液排出口连接的溶液投入口；被安置成可以与投入到溶液投入口的溶液接触的含二氧化硅固相。
8.根据权利要求7记载的核酸纯化装置，其是通过离心力使混合液流经过滤器，与含二氧化硅固相接触的核酸纯化装置。
9.根据权利要求7记载的核酸纯化装置，其是通过压力差使混合液流经过滤器，与含二氧化硅固相接触的核酸纯化装置。
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