CN103789297A - 快速纯化核酸的方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速纯化核酸的方法及试剂盒。具体地，本发明公开了一种可用于从包含核酸的样本中快速纯化核酸的试剂组合，基于该试剂组合制成的试剂盒，以及用该试剂组合或试剂盒快速纯化核酸的方法。本发明方法具有核酸得率高、纯度高、快速、室温操作、无需蛋白酶消化过程等优点，适合用于分析或各种下游实验的核酸的提取和纯化。

Description

快速纯化核酸的方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及一种从含核酸的样本中快速纯化核酸的方法及试剂盒，本方法可快速简便的提取核酸，特别适合从多种样本，如全血、细胞及组织等的核酸物质提取。

背景技术

核酸作为遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础，除了在生物体正常的生长、发育、和繁殖等生命活动中具有十分重要的作用外，它与生命的异常情况，如肿瘤发生、放射损伤、遗传疾病等也有密切关系。因此核酸分离纯化是是分子生物学、医学研究中的非常重要的环节。

按分离原理分类，现有的分离技术包括酚-氯仿法、盐析技术、离子交换法和氧化硅吸附法。

一种常用的核酸分离方法是“电荷-转换(charge-switch)方法，其原理是在第一pH值下通过带正电荷的核酸结合相，与带负电荷的核酸结合，以及在高于核酸结合相的pKs值的第pH，中和正电荷促进结合的核酸与核酸结合相发生分离。某些商品化的试剂盒使用该技术用于全血基因组DNA纯化,然而在使用过程中需要使用蛋白酶K对样品进行消化的过程，因此不利于样品储存及使用。

氧化硅磁性微球也被用于从全血中分离基因组DNA，该试剂盒在含高离液序列的盐(Chaotropic salt)的条件下，使核酸物质结合到氧化硅表面，并在低盐缓冲液和水洗脱下，得到纯化的基因组DNA。然而，该法获得的DNA收率较低，DNA的纯度也不高。

按相分离技术分类，现有的分离技术包括液相和固相的核酸分离技术。

液相核酸分离技术，如酚-氯仿法，包含沉淀，离心等过程，往往步骤繁杂、费时长、收率低，接触有毒试剂，很难实现自动化操作。

固相核酸纯化方法将DNA结合到固相载体上，而杂质被选择性洗脱掉。相应的试剂盒，如硅胶离心柱提取基因组DNA试剂盒，已经在实验室中得到了广泛应用。与酚-氯仿抽提方法相比，固相吸附方法具有操作简便，不使用有毒有害试剂等优点。然而，固液分离时往往仍需要离心或抽滤，操作比较烦琐且不易实现自动化。

综上，现有的核酸分离技术仍存在一些不足：如使用蛋白酶消化过程增加核酸提取的时间，需要在特定温度下存储；细胞样本裂解和与结合相结合分步进行，增加纯化步骤；洗脱后核酸样本含盐量高，不利于下游的分子生物学实验操作；核酸提取效率不高，含蛋白质等杂质较高。因此，本领域迫切需要开发一种高效、快速、自动化的制备高纯度且低杂质的DNA的核酸提取方法。

发明内容

本发明的目的就是提供一种高效、快速、自动化的制备高纯度且低杂质的DNA的核酸提取方法、试剂组合、和试剂盒。

本发明的第一方面，提供了一种可用于从包含核酸的样本中纯化核酸的试剂组合，所述的试剂组合包括：

1)核酸结合相，所述核酸结合相用于吸附和/或结合待纯化的核酸，并且所述核酸结合相是末端羧基修饰的氧化硅表面；和

2)细胞裂解结合液或配制所述细胞裂解结合液的相应组分，所述的细胞裂解结合液用于裂解细胞膜，释放待纯化核酸,并促使待纯化的核酸结合于所述的核酸结合相。

在另一优选例中，在裂解步骤中所用的细胞裂解液和在结合步骤中所用的DNA结合液的组成相同或是同一溶液(细胞裂解结合液)。

在另一优选例中，所述的“末端”可以是直链或支链的末端。

在另一优选例中，所述的核酸结合相为末端羧基修饰的氧化硅微球或末端羧基修饰的氧化硅板。

在另一优选例中，所述的“组成相同”是指细胞裂解液和DNA结合液中除了溶剂(如水或水和醇的混合溶剂)之外的其他各组分的种类90%以上(较佳地95%以上，更佳地100%)相同，并且各相应组分的浓度相差≤10%(较佳地≤5%，更佳地≤2%)。

在另一优选例中，所述的细胞裂解结合液不含蛋白酶(如蛋白酶K)。

在另一优选例中，所述的细胞裂解结合液使得杂质(包括蛋白质、糖类、RNA等)不结合于或基本不结合于(结合的杂质≤1%总杂质，更佳地≤0.1%总杂质)核酸结合相。

在另一优选例中，所述的细胞裂解结合液含有以下组分：

(i)chaotropic盐，通常浓度为3-6M；

(ii)碱金属盐，通常浓度为0.001-1M；

(iii)表面活性剂，通常浓度为2-5%(v/v)；

(iv)螯合剂，通常浓度为0.5mM-100mM；和

(v)醇，通常浓度为20-50%(v/v)。

在另一优选例中，所述的chaotropic盐包括胍盐(如盐酸胍)。

在另一优选例中，所述的碱金属盐包括氯化钾、氯化钠、氯化锂或其组合，优选为氯化钠和/或氯化锂。

在另一优选例中，所述的表面活性剂包括Triton X-100，Tween20或其他非离子型表面活性剂。

在另一优选例中，所述的螯合剂包括EDTA、EGTA、CDTA、柠檬酸盐，或其组合。

在另一优选例中，所述的醇包括乙醇或异丙醇。

在另一优选例中，所述核酸结合相为末端修饰羧基基团的氧化硅磁性微球或末端修饰羧基基团的氧化硅板。

在另一优选例中，所述核酸结合相含质子化基团，且该质子化基团促使核酸结合于核酸结合相；较佳地，该质子化基团为氨基，包括伯、仲或叔胺。

在另一优选例中，该质子化基团为：

R1-N-R2-(COOH)_n；

R1-NH-R2-(COOH)_n；

其中，R1、R2各自独立地为C1-C8直链或支链的烷基、C2-C8直链或支链的烯基、C1-C8烷氧基(如乙氧基)、C6-C15的芳基；且n=1～3。

在另一优选例中，所述的烷基、烯基、烷氧基、芳基包括取代或未取代的基团。所述的取代指具有一个或多个选自下组的取代基：卤素、C1-C4烷基、-OH、苯基。

在另一优选例中，所述的裂解结合液中含碱金属盐，且所述的碱金属盐为钠盐、锂盐、钾盐，或其组合。

在另一优选例中，所述的碱金属盐为氯化锂或氯化钠。

在另一优选例中，碱金属盐浓度为0.1-3.0M，较佳地为0.3-2.5M。

在另一优选例中，所述的核酸结合相中，末端修饰羧基基团的氧化硅表面可共价附着于下列载体：聚合物材料、多糖类化合物、无机载体，或其组合。

在另一优选例中，所述聚合物材料包括聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、纤维素、多元醇如聚乙烯醇及聚乙烯醇缩丁醛及这些材料的共聚物，或其组合。

在另一优选例中，所述多糖类化合物包括葡聚糖、琼脂糖、纤维素及上述任一材料的衍生物，或其组合。

在另一优选例中，所述无机载体包括金属、玻璃、金属氧化物及非金属氧化物、具有金属表面的载体、磁性微球、管、膜、多孔板、芯片及微阵列等，或其组合。

在另一优选例中，所述的试剂组合还包括：

3)洗涤液：洗涤去除非特异吸附的蛋白、多糖、脂类等组分。

4)任选的DNA洗脱液：所述的DNA洗脱液提供了一适合洗脱的环境，包括水或弱碱性溶液，使得结合的核酸与所述核酸结合相发生解离。

任选地，所述的试剂组合还包括其他通用组分，如缓冲盐和螯合剂。

在另一优选例中，所述的缓冲盐为Tris-HCl、磷酸盐、HEPES、MOPS，或其组合；所述螯合剂为EDTA、EGTA、CDTA、柠檬酸盐(如柠檬酸钠)，或其组合。

在另一优选例中，所述的洗脱液为水或生物缓冲液。

在另一优选例中，所述用于DNA洗脱液的弱碱性溶液的pH值为7.5-9。

在另一优选例中，对细胞壁成分进行适当处理后，该核酸提取方法可适用于植物细胞、细菌、真菌、及病毒样本的核酸物质提取和纯化。

本发明的第二方面，提供了一种可用于从包含核酸的样本中纯化核酸的试剂盒，所述的试剂盒包括：(a)一个或多个容器，以及分别位于所述容器中的选自本发明第一方面中所述试剂组合中的一种或多种试剂，和(b)说明书，所述说明书描述了本发明的核酸提取方法。较佳地，说明书还描述了结合裂解液的组成、结合及洗脱条件等信息。

在另一优选例中，本发明的试剂盒也包含其他的任选的通用组分，其中包括(但并不限于)：洗涤试剂、缓冲液、细胞壁裂解液等。

本发明的第三方面，提供了一种如本发明第一方面所述的试剂组合或本发明第二方面所述的试剂盒的用途，它们被用于提取核酸。

本发明的第四方面，提供了一种从包含核酸的样本中纯化核酸的方法，包括步骤：

(a)用细胞裂解结合液处理所述样本，裂解细胞膜并释放待纯化核酸，从而获得经裂解处理的混合物，并且在处理过程中不添加蛋白酶；

(b)将经裂解处理的混合物在适合结合的条件下与核酸结合相混合，从而使得所述核酸结合相吸附和/或结合待纯化的核酸，其中所述核酸结合相是末端羧基修饰的氧化硅磁性微球；

(c)从所述混合物中将磁性微球与液相分离，获得吸附了待纯化核酸的磁性微球；和

(d)用洗涤液洗去未吸附的杂质后，用DNA洗脱液处理所述的吸附了待纯化核酸的磁性微球，从而使得结合的核酸与所述核酸结合相发生解离，从而获得纯化的核酸。

在另一优选例中，所述的核酸纯化方法包括使用如本发明第二方面所述的试剂盒提取核酸。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了实施例3中不同体积小鼠血液样本纯化后DNA含量。

图2显示了实施例3中不同体积血液样本纯化DNA结果的电泳图。

图3显示了实施例5中核酸纯化试剂盒纯化DNA的提取效果。

具体实施方式

本发明人通过长期而深入的研究，意外地发现,采用羧基化氧化硅磁性微球作为核酸结合相，可非常高效、快速、简便地提取核酸，尤其是DNA。具体地，本发明人的实验还表明，与细胞裂解结合液配合使用时，末端羧基化氧化硅磁性微球在DNA分离纯化过程中，能够非常特异地与DNA分子结合而与诸如蛋白、糖类、RNA之类的杂质不结合或几乎不结合，因此分离得到的DNA纯度更高。在此基础上，发明人完成了本发明。

磁性微球

如本文所用，术语“磁性微球”、“磁珠”、“磁性颗粒”可互换使用，均指用于本发明核酸分离的核酸结合相。在本发明中，所述的核酸结合相是用于结合核酸的固相材料。

在本发明中，磁性微球的尺寸没有特别限制，一般其粒径为50纳米-2微米，较佳地为300-1000纳米。

在本发明中，磁性微球的材料没有特别限制，可以含有或由各种磁性材料构成。磁性微球可以是单层结构，也可以是多层结构(如2-6层)。

在本发明中，作为核酸结合相的磁性微球宜为经修饰的磁性微球，如表面经羧基修饰的或表面经末端羧基化氧化硅修饰的磁性微球。一种优选的核酸结合相为末端羧基化氧化硅磁性微球。

一种优选的核酸结合相为可通过磁场进行分离的顺磁性微球或颗粒。

各种不同的磁性微球(包括经修饰的磁性微球)，可通过本领域常规的方法制备，或可通过市售途径购得。代表性的例子包括(但不限于)：无机微球、生物高分子微球、高分子微球。

裂解结合液

细胞裂解液用于裂解细胞膜，释放待纯化核酸,DNA结合液用于提供适合结合的低pH(如pH5.5-7)环境，使得核酸与核酸结合相发生结合，而且杂质(包括蛋白质、糖类、RNA等)则不结合于核酸结合相。

在本发明中，细胞裂解液和DNA结合液采用组成相同或基本相同的溶液，称为细胞裂解-结合液。这样，细胞裂解、核酸与核酸结合相的结合使用同一溶液，或在同一溶液中进行，有助于快速、简便地提取核酸。

所述的“组成相同”是指细胞裂解液和DNA结合液中除了溶剂(如水或水和醇的混合溶剂)之外的其他各组分的种类90%以上(较佳地95%以上，更佳地100%)相同，并且各相应组分的浓度相差≤10%(较佳地≤5%，更佳地≤2%)。

在本发明中，术语“裂解结合液”指既用于裂解细胞膜，释放待纯化核酸,也用于促使待纯化的核酸结合于所述的核酸结合相的溶液。

核酸结合相

在本发明中，核酸结合相用于吸附和/或结合待纯化的核酸，并且所述核酸结合相是末端羧基修饰的氧化硅表面。

较佳地，所述的核酸结合相可以是末端羧基化氧化硅磁性微球，或末端羧基化氧化硅板。

表面带有羧基的磁性微球是一种在DNA提取纯化过程中常用的固相材料,在适宜的DNA吸附条件下(如高分子量的聚乙二醇和高浓度氯化钠作用下),DNA可从水溶液中析出并吸附到羧基化固相材料上。

较佳地，所述核酸结合相含质子化基团，且该质子化基团可促使核酸结合。

核酸提取方法

在本发明中，采用特定的表面经羧基修饰的磁性微球，可通过磁性微球法提取DNA(尤其是基因组DNA)。通常，在低pH值条件下，核酸结合于核酸结合相；在高于结合pH的pH条件下，洗脱核酸。

用本发明方法提取核酸时，一般先通过细胞裂解液裂解细胞，从细胞中游离出来的核酸分子被特异的吸附到本发明磁性微球或磁性颗粒表面，而蛋白质等杂质不被吸附而留在溶液中，然后在磁场作用下分离磁性微球后，用洗脱液洗脱磁性微球即可以得到高纯度的DNA。

在本发明方法中，不需要离心，不需要加入蛋白酶(如蛋白酶K)，也不需要加入多种其他试剂，因此操作简单，特别适合于自动化操作。

一种优选的提取方法是从细胞中提取基因组DNA。

适用于本发明方法的生物材料(如细胞)没有特别限制，代表性例子包括(但并不限于)：病毒、衣原体、细菌、放线菌、酵母、真菌、植物细胞、和动物细胞(如哺乳动物的细胞)等。本发明特别适用于病毒、人类及动物的核酸提取。

当本发明方法用于从含细胞壁成分的生物材料中提取核酸时，可先对生物材料进行适当的处理(破壁)。

由于本发明方法的提取效率高，因此不仅适合从多种样本，如全血、细胞及组织等中提取核酸，还特别适合从少量细胞中提取基因组DNA。在本发明中，少量细胞一般指单个或2-1000个细胞(较佳地1-100个细胞，更佳地(如1-20个细胞)。

用于本发明方法纯化的核酸可以存在于体液如血液、尿液、粪便、唾液、痰液，或存在于组织及器官样本。核酸样本可从棉签、涂片标本等载体材料上获得，也可以从其他液体样本中获得。

使用本发明的裂解结合液，可用于纯化核酸(包括DNA)。代表性的例子包括(但并不限于)基因组DNA，cDNA，总RNA等。

在一优选例中，本发明采用上述的核酸结合相和用于提取核酸的试剂组合，无需蛋白酶K消化过程，细胞膜裂解、核酸及核酸结合相结合使用同一溶液，从而快速、高效、简便地从多种样本中提取核酸。

用于提取核酸的试剂组合和试剂盒

本发明还提供了可用于本发明方法的试剂组合和试剂盒。

在本发明中，所述试剂组合可包括本发明的核酸结合相以及任何能与上述核酸结合相匹配使用的试剂。典型地，试剂组合具有一种或多种以下试剂：

1)核酸结合相：所述核酸结合相是具有羧基基团修饰的氧化硅表面的磁性微球，包括含质子化修饰和未修饰的磁性微球；

2)细胞裂解液：常用的细胞裂解液含有以下组分：chaotropic盐、碱金属盐、表面活性剂、螯合剂、醇(如异丙醇)。

在本发明中，由于本发明的细胞裂解液(或裂解结合液)含有上述特定的各组分，因此在细胞膜裂解之前、之中或之后，无需蛋白酶K消化过程。

3)DNA结合液：DNA结合液提供了一适合结合的低pH(如pH5-7)环境，使得核酸与核酸结合相发生结合，而且杂质(包括蛋白质、糖类、RNA等)则不结合于核酸结合相。

在优选例中，细胞裂解液和DNA结合液采用构成相同或基本相同的溶液，称为细胞裂解-结合液。这样，细胞裂解、核酸与核酸结合相的结合使用同一溶液，或在同一溶液中进行，有助于快速、简便地提取核酸。

4)DNA洗脱液：结合于核酸结合相上的DNA可使用水及弱碱性(如pH7.5-8.5)环境，使得结合的核酸与核酸结合相发生解离。

在本发明中，所述的试剂盒包括(a)一个或多个容器，以及分别位于所述容器中的选自本发明第一方面的试剂组合中的一种或多种试剂，和说明书，所述说明书描述了本发明的核酸提取方法。较佳地，说明书还描述了结合裂解液的组成、结合及洗脱条件等信息。

应理解，本发明的试剂盒也可包含其他的任选的通用组分，其中包括(但并不限于)：洗涤试剂、缓冲液、细胞壁裂解液等。

本发明的主要优点包括：

(1)提取快速、操作简便。采用本发明的方法，细胞裂解结合液一步裂解细胞并特异性的将核酸吸附于核酸结合相，水溶液亦可直接进行核酸与核酸结合相的解离洗脱过程，无需蛋白酶K处理，仅需简单的漂洗步骤后即可将核酸结合相上结合的核酸洗脱下来，方法步骤简单。

(2)条件温和。本发明中，核酸在温和的条件下(pH5-7)与核酸结合相结合，并在水或弱碱性(pH7.5-8.5)条件下进行洗脱。操作在室温下进行。

(3)核酸的收率高。1mg磁性微球可结合高达10ug的基因组DNA，或提取高达90%以上的人全血基因组总DNA。

(4)提取的核酸纯度高。与目前的核酸提取试剂盒及操作方法相比，本试剂盒提取核酸具有纯度高、杂质低等优点，提取的核酸适用于PCR检测、核酸杂交等多种下游实验，无需进一步纯化。

(5)自动化程度高。

下面结合具体图示，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1不同表面修饰磁性微球的制备

1)氨基化氧化硅磁性微球的制备：称取市售硅醇基氧化硅磁性微球适量，加入无水乙醇、水、浓氨水，最后加入3’-氨丙基三乙氧基硅烷，混合后常温搅拌反应3h，将产物依次用无水乙醇和蒸馏水洗涤，得表面键合氨基的磁性微球。

2)羧基化氧化硅磁性微球的制备：称取市售硅醇基氧化硅磁性微球适量，加入无水乙醇、水、浓氨水，最后加入3’-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷，混合后常温搅拌反应3h，将产物依次用无水乙醇和蒸馏水洗涤，得表面键合环氧基的磁性微球。将4-氨基丁酸与表面键合环氧基的磁性微球反应，即得表面羧基化的氧化硅微球。

实施例2用试剂盒纯化核酸

本试剂盒所述提取DNA的试剂盒具体配置实例包括:

磁性微球:上述自制羧基化氧化硅磁性微球

裂解结合液：4M盐酸胍，2%Triton X-100,0.1%SDS，0.01%巯基乙醇，0.1MNaCl，0.6M LiCl，10mM Tris-HCl(pH5.5)，1mM EDTA，25%异丙醇

洗涤液I：200mM NaCl溶液，0.8M LiCl，70%乙醇，50mM Tris缓冲液(pH6.5)

洗涤液II：70%乙醇

洗脱液：1mM EDTA，10mM Tris-HCl(pH8.0)

纯化步骤:

1)取200μL抗凝血于1.5ml离心管中，加入750μL裂解吸附液振荡混和均匀裂解细胞,静置5min；

2)加入1mg磁性微球，温和摇匀10min；

3)用磁分离架吸附磁性微球,弃上清；

4)用850μL洗涤液I洗涤2次，温和摇匀2min,吸附磁性微球,弃上清；

5)用850μL洗涤液II洗涤2次，温和摇匀2min,吸附磁性微球,弃上清；

6)静置5min使残留的乙醇挥发；

7)加入100μL洗脱液，混和均匀后于室温放置5min；

8)磁场吸附磁性微球，回收洗脱液至离心管内，进行DNA检测及后续实验。

实施例3几种表面修饰磁性微球纯化全血基因组DNA的比较

样本:肝素钠处理的小鼠抗凝血

材料:

裂解结合液：4M盐酸胍，2%Triton X-100,0.1%SDS，0.01%巯基乙醇，0.1MNaCl，0.6M LiCl，10mM Tris-HCl(pH5.5)，1mM EGTA，25%异丙醇

洗涤液I：100mM NaCl溶液，0.8M LiCl，70%乙醇，50mM Tris缓冲液(pH6.5)

洗涤液II：70%乙醇

洗脱液：1mM EDTA，10mM Tris-HCl(pH8.0)

磁性微球:

磁性微球A:市售硅醇基氧化硅磁性微球

磁性微球B:氨基化氧化硅磁性微球

磁性微球C:羧基化氧化硅磁性微球

使用实施例2中实验步骤纯化基因组DNA，结果如下表：

A260/A280的比值更接近于1.80，表明提取使用羧基化氧化硅磁性微球提取的DNA纯度更高，更少蛋白质及RNA的污染；使用的羧基化氧化硅磁性微球提取的DNA所测A260/A230的比值在1.50左右，比值高表明提取出的DNA残盐含量相对较少。

上述结果提示，使用的羧基化氧化硅磁性微球时，所提取的核酸总量显著优于硅醇基磁性微球及氨基化磁性微球。

实施例4核酸纯化试剂盒提取小鼠血基因组DNA的结果

样本：肝素抗凝处理的小鼠抗凝血

材料：

磁性微球:末端羧基化氧化硅磁性微球

裂解结合液：4M盐酸胍，2%Triton X-100,0.1%SDS，0.01%巯基乙醇，0.1MNaCl，0.6M LiCl，10mM Tris-HCl(pH5.5)，1mM CDTA，25%异丙醇

洗涤液I：100mM NaCl溶液，0.8M LiCl，70%乙醇，50mM Tris缓冲液(pH6.5)

洗涤液II：70%乙醇

洗脱液：水

实验步骤：

1、使用实施例2中实验步骤纯化基因组DNA：分别取25、50、100、200、300、400μL抗凝血于1.5ml离心管中，加入750μL裂解吸附液振荡混和均匀裂解细胞,静置5min；加入1mg磁性微球，温和摇匀10min；磁场吸附磁性微球,弃上清；850μL洗涤液I洗涤磁性微球两次，吸附磁性微球,弃上清；用850μL洗涤液II洗涤2次，吸附磁性微球,弃上清，室温放置5min挥发乙醇；加入100μL洗脱液，混和均匀后于室温放置5min；磁场吸附磁性微球，回收洗脱液至离心管内，进行DNA含量及纯度检测及核酸电泳检测。

2、纯化后样品的PCR检测：PCR反应体系为：1ul纯化后小鼠基因组DNA，2X PCR master buffer，200I，50pM的3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)上、下游引物，最后补加灭菌超纯水至终体积为50uL。上下游引物序列分别为5’-AGAGTCCATGCCATCACTGCC-3’、5’-GCCTGCTTCACCACCTTCTTG-3’。PCR反应条件为：94°C预变性4min，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸1min，循环30次，72°C延伸10min，反应结束后取PCR产物进行电泳检测。

结果如图1所示，在使用不同体积的血液作为原料时，本发明所述的试剂盒均能以较好的收率提取DNA；使用本发明的试剂盒，1mg磁性微球可结合高达15ug的小鼠基因组DNA。

实施例5核酸纯化试剂盒提取人血基因组DNA的结果

材料：

样本：EDTA抗凝处理的全血样本

磁性微球:末端羧基化氧化硅磁性微球

裂解结合液：4M盐酸胍，2%Triton X-100,0.1%SDS，0.01%巯基乙醇，0.1MNaCl，0.6M LiCl，10mM Tris-HCl(pH5.5)，1mM柠檬酸钠，25%异丙醇

洗涤液I：100mM NaCl溶液，0.8M LiCl，70%乙醇，50mM Tris缓冲液(pH6.5)

洗涤液II：70%乙醇

洗脱液：1mM EDTA，10mM Tris-HCl(pH8.0)

通过白血球细胞计数测得gDNA理论初始值(每个白细胞含6.6pgDNA)。

纯化步骤：

使用实施例2中实验步骤纯化基因组DNA：分别取50、100、200、300、400μL抗凝血于1.5ml离心管中，加入750μL裂解吸附液振荡混和均匀裂解细胞,静置5min；加入1mg磁性微球，温和摇匀10min；磁场吸附磁性微球,弃上清；850μL洗涤液I洗涤磁性微球两次，吸附磁性微球,弃上清；用850μL洗涤液II洗涤2次，吸附磁性微球,弃上清，室温放置5min挥发乙醇；加入100μL洗脱液，混和均匀后于室温放置5min；磁场吸附磁性微球，回收洗脱液至离心管内，进行DNA含量及纯度检测。

核酸纯化试剂盒纯化DNA的提取效果如图3所示，结果显示，使用该发明的试剂盒可提取高达90%以上的基因组总DNA。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种可用于从包含核酸的样本中纯化核酸的试剂组合，其特征在于，所述的试剂组合包括：

1)核酸结合相，所述核酸结合相用于吸附和/或结合待纯化的核酸，并且所述核酸结合相是末端羧基修饰的氧化硅表面；和

2)细胞裂解结合液或配制所述细胞裂解结合液的相应组分，所述的细胞裂解结合液用于裂解细胞膜，释放待纯化核酸，并促使待纯化的核酸结合于所述的核酸结合相。

2.如权利要求1所述的提取核酸的试剂组合，其特征在于，所述的细胞裂解结合液含有以下组分：

(i)chaotropic盐，浓度为3-6M；

(ii)碱金属盐，浓度为0.001-1M；

(iii)表面活性剂，浓度为2-5%(v/v)；

(iv)螯合剂，浓度为0.5mM-100mM；和

(v)醇，浓度为20-50%(v/v)。

3.如权利要求1所述的提取核酸的试剂组合，其特征在于，所述核酸结合相为末端修饰羧基基团的氧化硅磁性微球或末端修饰羧基基团的氧化硅板。

4.如权利要求1所述的提取核酸的试剂组合，其特征在于，所述核酸结合相含质子化基团，且该质子化基团促使核酸结合于核酸结合相；

较佳地，该质子化基团为氨基，包括伯、仲或叔胺。

5.如权利要求1所述的提取核酸的试剂组合，其特征在于，所述的裂解结合液中含碱金属盐，且所述的碱金属盐为钠盐、锂盐、钾盐，或其组合。

6.如权利要求1所述的试剂组合，其特征在于，所述的核酸结合相中，末端修饰羧基基团的氧化硅表面可共价附着于下列载体：聚合物材料、多糖类化合物、无机载体，或其组合。

7.如权利要求1所述的试剂组合，其特征在于，所述的试剂组合还包括：

3)洗涤液：洗涤去除非特异吸附的蛋白、多糖、脂类等组分；

4)任选的DNA洗脱液：所述的DNA洗脱液提供了一适合洗脱的环境，包括水或弱碱性溶液，使得结合的核酸与所述核酸结合相发生解离。

8.一种可用于从包含核酸的样本中纯化核酸的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：(a)一个或多个容器，以及分别位于所述容器中的选自权利要求1所述试剂组合中的一种或多种试剂，和(b)说明书，所述说明书描述了核酸提取方法。

9.如权利要求1所述的试剂组合或权利要求8所述的试剂盒的用途，其特征在于，用于提取核酸。

10.一种从包含核酸的样本中纯化核酸的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)用细胞裂解结合液处理所述样本，裂解细胞膜并释放待纯化核酸，从而获得经裂解处理的混合物，并且在处理过程中不添加蛋白酶；

(b)将经裂解处理的混合物在适合结合的条件下与核酸结合相混合，从而使得所述核酸结合相吸附和/或结合待纯化的核酸，其中所述核酸结合相是末端羧基修饰的氧化硅磁性微球；

(c)从所述混合物中将磁性微球与液相分离，获得吸附了待纯化核酸的磁性微球；和

(d)用洗涤液洗去未吸附的杂质后，用DNA洗脱液处理所述的吸附了待纯化核酸的磁性微球，从而使得结合的核酸与所述核酸结合相发生解离，从而获得纯化的核酸。

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