CN114350649A - 一种核酸提取试剂盒及核酸提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种核酸提取试剂盒及核酸提取方法,所述一种核酸提取试剂盒,其组成成分包括:裂解结合液、第一漂洗液、第二漂洗液、洗脱液和蛋白酶K消化液,其中,所述蛋白酶K消化液在使用前需要用所需溶液溶解蛋白酶K,浓度在10‑40mg/mL。本发明所公开的一种核酸提取试剂盒及核酸提取方法,配方中仍有蛋白酶K,漂洗过后,蛋白酶K不易残留,提取过程简单快捷,最终提取出来的核酸浓度大,纯度高,市场应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明专利涉及核酸提取技术领域,具体来说是一种核酸提取试剂盒及核酸提取方法。
背景技术
核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物,是生命的最基本物质之一。核酸广泛存在于所有动植物细胞、微生物体内,不同的核酸,其化学成分、核苷酸排列顺序也不相同。根据化学组分不同,核酸可分为核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA),在蛋白质的复制和合成中起着储存和传递遗传信息的作用。目前,在分子生物学科的各项研究检测领域都离不开核酸的检测,提取纯化的核酸技术是分子生物学研究和临床检测的基础。
目前分子生物领域常用的核酸提取纯化方法主要包括离心柱膜吸附法、碱裂解法、酚氯仿抽提法、螯合树脂法和磁珠法等。相比较其他核酸提取纯化方法,磁珠法的操作方案简洁,对样品的要求较低,适用于多种样品类型,更为受到分子生物领域研究和应用的欢迎。然而现有的磁珠法在提取纯化核酸时所使用的裂解液通常含有蛋白酶K,蛋白酶K容易残留,提取时间较长且提取纯化过程还需要加热,过程复杂,而且很大程度上会增加核酸污染的机率,不利于检测结果的准确性。
为了解决上述技术问题,业界进行了更为高效准确的磁珠法优化方案的相关研究。如中国发明专利公告第CN 110684764 B号,其公开了一种用于核酸提取的裂解液、核酸提取试剂盒及核酸提取方法,该发明的核酸提取裂解液包括0.5-2M钠盐、2-5M胍盐、1-5mM金属离子络合剂、0.25%-1%非离子表面活性剂和1%-3%PEG,其中PEG的分子量为6000-10000Da,优选为8000Da。该发明的裂解液配比合理,能充分有效地裂解细胞,裂解效率高,使得细胞中的核酸能够充分释放,并且整个发明的裂解液和试剂盒在整个核酸提取过程中不需要借助蛋白酶K进行蛋白质的消化去除,减小了核酸的污染机率,也不需要使用醇类沉淀核酸。虽然该产品虽然避免了蛋白酶K可能造成的核酸污染,但是最终得到的核酸浓度和纯度都有一定程度上的降低。
发明内容
本发明专利的目的在于解决现有技术的不足,提供一种核酸提取试剂盒及核酸提取方法。
为了实现上述目的,本发明设计一种核酸提取试剂盒及核酸提取方法。一种核酸提取试剂盒,其成分包括:裂解结合液、第一漂洗液、第二漂洗液、洗脱液和蛋白酶K消化液;
所述裂解结合液组分:
1M-6M异硫氰酸胍溶液,
10mM-1M,pH6.0-7.2的Tris-HCI缓冲液,
1mM-100Mm EDTA缓冲液,
10%-30%(v/v)的异丙醇,
0.05%-0.2%(w/v)的SDS缓冲液,
1%-10%(v/v)的TritionX-100,
0.5M-1M的氯化钠溶液,
余量的水;
所述第一漂洗液组分:
1M-6M异硫氰酸胍溶液,
10mM-1M,pH6.0-7.2的Tris-HCI缓冲液,
1mM-100mM EDTA缓冲液,
10%-30%(v/v)的异丙醇,
余量的水;
所述第二漂洗液组分:
1mM-100mM的Trizma Base缓冲液,
余量的水;
所述洗脱液组分:
0.01mM-10mM EDTA缓冲液,
1mM-100mM的Trizma Base缓冲液,
余量的水;
所述蛋白酶K消化液组分:
1mM-100mM氯化钙溶液,
30%-60%(v/v)的甘油,
1mM-100mM的海藻糖溶液,
1mM-100mM的Trizma Base缓冲液,
0.01%-1%(v/v)的Proclin-300,
余量的水。
优选地,所述一种核酸提取试剂盒及核酸提取方法,还包括所述第二漂洗液使用前需要添加1-10倍体积的无水乙醇。
优选地,所述一种核酸提取试剂盒及核酸提取方法,还包括所述蛋白酶K消化液在使用前需要用所需溶液溶解蛋白酶K,浓度在10-40mg/mL。
一种采用上述一种核酸提取试剂盒及核酸提取方法,包括如下步骤和工艺条件 :
(1) 将蛋白酶K消化液、裂解结合液、唾液或口拭子样品混合,获得第一混合物;
(2) 将所述第一混合液在50-70℃水浴中孵化30-60min,获得孵化过的混合物;
(3) 将经过孵化后的混合物加入磁珠,振荡混匀后得到第二混合物,静置处理;
(4) 将所述经静置处理的第二混合物置于磁力架上,进行磁吸,直至磁珠完全被吸附后弃去上清液,将吸附有核酸的磁珠取下,对所属吸附有核酸的磁珠,使用第一漂洗液进行第一次漂洗液处理;
(5) 将经过第一次漂洗处理的磁珠置于磁力架上,进行磁吸,直至磁珠完全被吸附后弃去上清液,将磁珠取下后用第二漂洗液处理,所述第二漂洗液处理采用添加了1-10倍无水乙醇,进行第二次漂洗处理;
(6) 将第二次清洗处理的磁珠置于磁力架上,进行磁吸,直至磁珠完全被吸附后弃去上清液,将磁珠取下后用第二漂洗液处理,所述第二漂洗液处理采用添加了1-10倍无水乙醇,进行第三次漂洗处理;
(7) 将第三次清洗处理的磁珠置于磁力架上,进行磁吸,直至磁珠完全被吸附后弃去上清液,并置于室温晾干,将晾干的磁珠与洗脱液混合,对吸附核酸的磁珠进行洗脱处理,50-70℃水浴孵育5-10分钟,同时将完成洗脱的混合液置于磁力架上,进行磁吸,最终获得核酸。
本发明与现有技术相比,具有如下优点:
1.配方中仍有蛋白酶K,漂洗过后,蛋白酶K不易残留,操作更简单便捷;
2.所获得的核酸浓度高,纯度更好。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明,但不以任何形式限制本发明。应当指出的是,对本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。
实施例1~3和对比例1~3的具体核酸提取过程如下:
实施例1:
本实施例以申请人所采集的正常人来源的唾液为样品,提取样品中的核酸,具体提取过程如下:
(1)本产品将蛋白酶K、裂解吸附液、唾液样品混合,获得第一混合物;
(2)将所述第一混合物在50-70℃水浴中孵化30-60min,获得孵化过的
混合物;
(3)将经过孵化后的混合物加入磁珠,振荡混匀后得到的第二混合物,静
置处理;
(4) 将所述静置处理第二混合物置于磁力架上,进行磁吸,直至磁珠完全
被吸附后弃去上清液,将吸附有核酸的磁珠取下,对所属吸附有核酸的磁珠,使用漂洗液A进行第一次漂洗液处理;
(5)将经过第一次漂洗处理的磁珠置于磁力架上,进行磁吸,直至磁珠完
全被吸附后弃去上清液,将磁珠取下后用漂洗液B处理,所述漂洗液B处理采用添加了1-10倍无水乙醇,进行第二次漂洗液处理;
(6) 将第二次清洗处理的磁珠置于磁力架上,进行磁吸,直至磁珠完全被吸附后弃去上清液,将磁珠取下后用漂洗液B处理,所述漂洗液B处理采用添加了1-10倍无水乙醇,进行第三次漂洗处理;
(7) 将第三次清洗处理的磁珠置于磁力架上,进行磁吸,直至磁珠完全被吸附后弃去上清液,并置于室温晾干,将晾干的磁珠与洗脱液混合,对吸附核酸的磁珠进行洗脱处理,50-70℃水浴孵育5-10分钟,以及将完成洗脱的混合液置于磁力架上,进行磁吸,最终获得核酸。
实施例2:
本实施例以申请人所采集的正常人来源的唾液为样品,使用市场上的唾基因组快速提取试剂盒(离心柱型)提取样品中的核酸,具体提取过程如下:
(1)将试剂盒中的蛋白酶K、唾液、缓冲液进行混合,获得第一混合物;
(2)将第一混合物在65℃水浴中放置25min,加入结合液充分得到第二混
合液;
(3) 将第二混合液在70℃水浴锅中放置10min,加入200μL无水乙醇,充分混匀,得到第三混合液;
(4) 将第三混合液放入微量吸附柱中(微量吸附柱放入收集管中),12000rpm离心30秒,弃去管中废液,向微量吸附柱内加入700μL的漂洗液WB,12000rpm离心30秒,弃去管中废液,向微量吸附柱内加入500μL的漂洗液WB,12000rpm离心30秒,弃去管中废液,将微量吸附柱放回收集管中,12000rpm离心2分钟,将微量吸附柱放入新的离心管中,向吸附膜上滴加20-50μL洗脱液,室温静置2-5分钟,12000rpm离心2分钟,得到DNA。
实施例3:
本实施例以申请人所采集的正常人来源的唾液为样品,使用市场上磁珠法唾基金组DNA提取试剂盒提取样品中的核酸,具体提取过程如下:
(1)将试剂盒中的蛋白酶K、裂解液GHL、唾液进行混合获得第一混合液;
(2)将第一混合液放入75℃水浴锅中15分钟,加入300μL异丙醇溶液,
充分混匀得到第二混合液;
(3)向第二混合液中加入15μL磁珠悬浮液CZ,获得第三混合液;
(4)将第三混合液振荡1分钟,静置三分钟,此过程重复三次,随后将第
三混合液放到磁力架上进行磁吸,弃去废液,加入900μL的缓冲液GDZ,振荡混匀2分钟,进行磁吸,弃去废液,加入500μL的缓冲液GDZ,振荡混匀2分钟,进行磁吸,弃废液,随后加入900μL漂洗液PWD,振荡混匀2分钟,进行磁吸,弃废液,再加入300μL漂洗液PWD,振荡混匀2分钟,进行磁吸,弃废液,晾干10-15分钟,最后加入50-100μL洗脱液TB,振荡混匀,置于56℃水浴锅中,孵育10min后,磁吸2分钟获得DNA
将上述实施例1-3所提取的核酸采用eppendorf D30 核酸蛋白测定仪测定其浓度和纯度,其中,核酸纯度为A260与A280的比值,A260表示核酸在波长为260nm下的吸光值,A280表示核酸在波长为280nm下的吸光值,实验结果如下所示:
表1不同实施例所提取的核酸的浓度和纯度测定结果
从实施例1、3和实施例2对比可知,磁珠法提取唾液DNA无论纯度还是浓度都优于离心柱法。
从实施例1和实施例3对比可知,本产品提取唾液的浓度和纯度均优于市场上磁珠法的提取效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种核酸提取试剂盒,其特征在于包括
裂解结合液,裂解结合液包括:1M-6M 异硫氰酸胍溶液,10mM-1M pH 6.0-7.2的Tris-HCl缓冲液,1mM-100mM EDTA缓冲液,10%-30%(v/v)的异丙醇,0.05%-0.2%(w/v)的SDS缓冲液,1%-10%(v/v)的TritionX-100; 0.5M-1M的氯化钠溶液,以及余量的水;
第一漂洗液,第一漂洗液包括:1M-6M 异硫氰酸胍溶液,10mM-1M pH 6.0-7.2的Tris-HCl缓冲液,1mM-100mM EDTA缓冲液,10%-30% (v/v)的异丙醇,以及余量的水;
第二漂洗液,第二漂洗液包括:1mM-100mM的Trizma Base 缓冲液,以及余量的水;
洗脱液,洗脱液包括:0.01mM-10mM EDTA缓冲液,1mM-100mM的Trizma Base 缓冲液,以及余量的水;
蛋白酶K消化液,蛋白酶K消化液包括:1mM-10mM的氯化钙溶液,30%-60%(v/v)的甘油,1mM-100mM的海藻糖溶液,1mM-100mM的Trizma Base 缓冲液,0.01%-1%(v/v)的Proclin-300,以及余量的水。
2.一种采用如权利要求1所述一种核酸提取试剂盒,其特征在于,所述第二漂洗液使用前需要添加1-10倍体积的无水乙醇。
3.一种采用如权利要求1所述一种核酸提取试剂盒,其特征在于,所述蛋白酶K消化液在使用前,需用所述溶液溶解蛋白酶K,浓度在10-40mg/mL。
4.一种采用如权利要求1所述一种核酸提取试剂盒的核酸提取方法,其特征在于,方法具体如下:
S1,将蛋白酶K消化液,裂解结合液、唾液或口拭子样品混合,获得第一混合物;
S2,将所述第一混合物在50-70℃水浴中孵化30-60min,获得孵化过的混合物;
S3,将经过孵化后的混合物加入磁珠,振荡混匀后得到第二混合物,静置处理;
S4,将所述经静置处理的第二混合物置于磁力架上,进行磁吸,直至磁珠完全被吸附后弃去上清液,将吸附有核酸的磁珠取下,对所属吸附有核酸的磁珠,使用第一漂洗液进行第一次漂洗液处理;
S5,将经过第一次漂洗处理的磁珠置于磁力架上,进行磁吸,直至磁珠完全被吸附后弃去上清液,将磁珠取下后用第二漂洗液处理,所述第二漂洗液处理采用添加了1-10倍无水乙醇,进行第二次漂洗处理;
S6,将第二次清洗处理的磁珠置于磁力架上,进行磁吸,直至磁珠完全被吸附后弃去上清液,将磁珠取下后用第二漂洗液处理,所述第二漂洗液处理采用添加了1-10倍无水乙醇,进行第三次漂洗处理;
S7,将第三次清洗处理的磁珠置于磁力架上,进行磁吸,直至磁珠完全被吸附后弃去上清液,并置于室温晾干,将晾干的磁珠与洗脱液混合,对吸附核酸的磁珠进行洗脱处理,50-70℃水浴孵育5-10分钟,以及将完成洗脱的混合液置于磁力架上,进行磁吸,获得核酸。
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