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CN101153282A - 核酸精制方法及核酸精制器具 - Google Patents

核酸精制方法及核酸精制器具 Download PDF

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CN101153282A
CN101153282A CNA2006101600003A CN200610160000A CN101153282A CN 101153282 A CN101153282 A CN 101153282A CN A2006101600003 A CNA2006101600003 A CN A2006101600003A CN 200610160000 A CN200610160000 A CN 200610160000A CN 101153282 A CN101153282 A CN 101153282A
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CN
China
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nucleic acid
silica
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containing solid
liquid
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Application number
CNA2006101600003A
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English (en)
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山下善宽
樱井智也
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hitachi Ltd
Original Assignee
Hitachi Ltd
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Abstract

本发明的课题是，通过安全简便的操作，从含有长链核酸和短链核酸的试样中分离、精制长链核酸和短链核酸。通过向含核酸试样中混合离液剂，将所述混合液在具有规定孔径的通液孔的第1含二氧化硅固相上通液2次以上，接着，在具有比所述第1含二氧化硅固相小的孔径的通液孔的第2含二氧化硅固相上，使所述混合液通液2次以上，然后，对结合在所述第1和第2含二氧化硅固相上的核酸各自进行回收，可以从所述含核酸试样中对长链核酸和短链核酸进行分离、精制。

Description

核酸精制方法及核酸精制器具
技术领域
本发明涉及，通过安全简便的操作，从含有长链核酸和短链核酸的试样中，高效地分离长链核酸和短链核酸，进行精制的技术。本发明可以作为基因组DNA和总RNA(信使RNA、核糖体RNA、转运RNA等)，或者，基因组DNA和质粒DNA的分离精制技术而利用。
背景技术
核酸作为与生物基因信息有关的物质，存在着基因组DNA、质粒DNA、信使RNA、核糖体RNA、转运RNA等功能不同的各种形态。
这些核酸分析可以给出在分子生物学上极其有用的信息。在分析各种核酸时，一般是优选进行前处理，也就是从含有多种核酸的生物试样中，分离和精制目的核酸。例如，以基因表达分析为目的对信使RNA进行分析时，将总RNA从对于信使RNA的分析可能成为阻碍物质的基因组DNA中分离，精制出来。
作为从生物材料中把总RNA从基因组DNA中分离、精制出来的方法，一般已知有酚·氯仿抽提法(非专利文献1)。本方法为，(1)用硫氰酸胍溶液将生物材料溶解，依次添加并混合酸性缓冲溶液、酚溶液、氯仿溶液，(2)通过离心分离，分离成含有RNA的水相、及含有变性蛋白质和不溶DNA的有机溶剂相与水相的中间层，(3)向含有RNA的水相中添加乙醇或异丙醇，(4)通过离心分离，选择性地沉淀不溶RNA。该方法与以前的超离心分离方法相比，可以对RNA进行高效地分离、精制，但是存在着必须使用有害的酚、氯仿的问题。
作为不使用酚、氯仿等，并且不需要乙醇沉淀、异丙醇沉淀等操作的核酸的精制方法，已知利用在离液剂存在下的核酸与含二氧化硅固相的结合特性的方法(非专利文献2和3)。关于后者的方法，还报道了使用其进行RNA和DNA的分离、精制的方法(专利文献1～5)，但是RNA和DNA的分离不充分，精制的RNA中混有较大量的DNA。
专利文献1：特开2004-340839号公报
专利文献2：特开2002-187897号公报
专利文献3：特表2000-505295号公报
专利文献4：特表2002-534080号公报
专利文献5：特开2004-201607号公报
非专利文献1：Analytical Biochemistry，162，156-159(1989)
非专利文献2：B.Vogelstein and D.Gillespie，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76(2)，615-619(1979)
非专利文献3：R.Boom et al，J.Clin.Microbiol.28(3)，495-503(1990)
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的是，通过安全简便的操作，从含有长链核酸和短链核酸的试样中，高效地分离长链核酸和短链核酸，进行精制。
解决问题的方法
本发明人等为了解决上述问题进行潜心研究的结果发现，通过将含有长链核酸和短链核酸的试样与离液剂的混合液，在具有与长链核酸的接触效率高且与短链核酸的接触效率低的孔径的通液孔的含二氧化硅固相上，至少通液2次以上，能够仅使长链核酸高效地结合，与短链核酸的分离，实现精制。
即，本发明涉及核酸精制方法，其特征为，在含有长链核酸和短链核酸的试样中混合离液剂，使所述混合液在具有规定孔径通液孔的第1含二氧化硅固相上通液2次以上，接着，在具有孔径小于所述第1含二氧化硅固相的通液孔的第2含二氧化硅固相上，使所述混合液通液2次以上，然后，对结合在所述第1和第2含二氧化硅固相上的核酸各自进行回收。
在上述方法中，第1和第2含二氧化硅固相上的通液，均优选对于含二氧化硅固相从两个方向(例如，上下两个方向)反复进行2次以上。
本发明的方法中，结合在第1含二氧化硅固相上的核酸为，由20000个以上，优选50000个以上的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸构成的长链核酸，结合在第2含二氧化硅固相上的核酸为，由10000个以下，优选5000个以下的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸构成的短链核酸。
这时，第1含二氧化硅固相的通液孔的孔径为优选20～25μm，并且，第2含二氧化硅固相的通液孔的孔径为优选0.1～10μm。
在有的实施方式中，所述第1含二氧化硅固相上结合的核酸是基因组DNA，所述第2含二氧化硅固相上结合的核酸是RNA。或者，所述第1含二氧化硅固相上结合的核酸是基因组DNA，所述第2含二氧化硅固相上结合的核酸是质粒DNA。这样，可以只把总RNA、质粒DNA或基因组DNA从生物材料中高效地分离，精制出来。
本发明还提供了，本发明的核酸精制方法中使用的核酸精制器具。所述核酸精制器具具有用来吸入排出含核酸试样和离液剂的混合液的通液口、及含二氧化硅固相，利用混合液与核酸精制器具的隔开的空间的压力差，使混合液从所述通液口吸入或排出，使其从被所述含二氧化硅固相隔开的一侧空间向另一侧空间移动，而在所述含二氧化硅固相上通液2次以上。
进一步，本发明提供了核酸精制用试剂盒，其含有本发明的核酸精制器具，以及从离液剂、有机溶剂、清洗液和溶出液中选出的至少1种以上的试剂。
作为所述离液剂，例如可以使用硫氰酸胍、硫氰酸钠、盐酸胍、碘化钠、碘化钾，作为所述有机溶剂，例如可以使用乙醇或二乙二醇二甲醚。
发明的效果
根据本发明，可以通过安全简便的操作，从含有长链核酸和短链核酸的试样中，高效地分离长链核酸和短链核酸，进行精制。因此，例如，可以对基因组DNA和总RNA(信使RNA、核糖体RNA、转运RNA)，或者，基因组DNA和质粒DNA进行高效地分离，精制。
附图说明
图1是核酸精制器具的概略图。
图2是表示核酸精制器具和核酸试样的各种组合的通液次数与核酸回收率的关系。
图3是表示利用长链核酸精制器具和短链核酸精制器具精制的核酸的电泳结果。
符号说明
10：核酸精制器具
11：连接口
12：通液口
13：含二氧化硅固相
14：含二氧化硅固相的支持材料
具体实施方式
以下，对本发明进行详述。
本发明涉及根据核酸的链长(长链核酸和短链核酸)高效地分离，精制核酸的方法。本发明中，首先将作为精制对象的含核酸试样与离液剂混合，将该混合液在具有与长链核酸的接触效率高且与短链核酸的接触效率低的孔径的通液孔的第1含二氧化硅固相上至少通液2次以上，仅使长链核酸高效地结合在第1含二氧化硅固相上。接着，将通过了第1含二氧化硅固相的混合液，在具有与短链核酸的接触效率高的孔径的通液孔的第2含二氧化硅固相上至少通液2次以上，使短链核酸结合在第2含二氧化硅固相上。这样，结合在第1和第2含二氧化硅固相上的核酸，通过各自用溶出液回收，可以高效地将长链核酸和短链核酸分离，精制。
适用于本发明的含核酸试样为，含有链长不同的2种以上核酸(长链核酸和短链核酸)的试样(尤其是生物试样)，例如可以举出血液、生物组织、培养细胞、细菌等。另外，所说的核酸，意思是脱氧核糖核酸或核糖核酸通过磷酸二酯键连接构成的链状高分子化合物，及这些化合物通过氢键等形成的复合物，可以是双链也可以是单链。
本发明中，作为结合在第1含二氧化硅固相上的长链核酸，优选20000个以上，更优选50000个以上的脱氧核糖核酸或核糖核酸所构成的核酸，例如，基因组DNA、基因组RNA、质粒DNA或将它们片段化的核酸是可以适用的。即，基因组DNA的情况下，优选10kb以上，更优选25kb以上的物质作为长链核酸是适宜的，基因组RNA的情况下，优选20kb，更优选50kb以上的物质作为长链核酸是适宜的。
另外，作为结合在第2含二氧化硅固相上的短链核酸，优选10000个以下，更优选5000个以下的脱氧核糖核酸或核糖核酸所构成的核酸，例如，信使RNA、核糖体RNA、转运RNA、cDNA、质粒DNA、或通过PCR扩增的DNA等是可以适用的。即，双链cDNA的情况下，优选5kb以下，更优选2.5kb以下的物质作为短链核酸是适宜的，信使RNA的情况下，优选10kb以下，更优选5kb以下的物质作为短链核酸是适宜的。
作为向含核酸试样中添加的离液剂，可以使用硫氰酸胍、硫氰酸钠、盐酸胍、碘化钠、碘化钾等。添加的离液剂的浓度为，在添加有机溶剂后的混合液中的浓度优选1.0～4.0mol/l的范围(参考R.Boom et al.，J.Clin.Microbiol.28(3)，495-503(1990))。
其中，以生物材料作为试样时，优选除加入离液剂外，还添加表面活性剂、蛋白质变性剂、蛋白质分解酶等，进一步利用搅拌机或匀浆机等对混合液进行物理处理，促进生物材料的溶解和核酸的游离。
对于含有含核酸试样和离液剂的混合液，为了促进核酸和含二氧化硅固相的结合，优选添加有机溶剂。作为有机溶剂，可以使用从脂肪族醇、脂肪族醚、脂肪族酯、脂肪族酮中选出的1种或2种以上组合的物质。
作为脂肪族醇，可以使用甲醇、乙醇、2-丙醇、2-丁醇、聚乙二醇等。作为脂肪族醚，可以使用二乙二醇二甲醚、二乙二醇二乙醚、乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚、丙二醇二甲醚、丙二醇二乙醚、四氢呋喃等。作为脂肪族酯，可以使用乳酸乙酯、丙二醇单甲醚乙酸酯等。作为脂肪族酮，可以使用丙酮、羟基丙酮、甲基酮等。特别是，优选乙醇或而二乙二醇二甲醚等。
本发明中使用的含二氧化硅固相为，由玻璃粒子(微粒子)、二氧化硅粒子(微粒子)、玻璃纤维、二氧化硅纤维、硅藻土或它们的破碎物等含有二氧化硅的二氧化硅系化合物构成，内部具有多个通液孔，能够通液。只要是这样的状态，含二氧化硅固相则可以是粒状物的聚集体，可以是片状，可以是纤维状，其状态没有限定。
第1含二氧化硅固相为，优选其通液孔的孔径为20～25μm的范围，使其与长链核酸的接触效率高且与短链核酸的接触效率低。孔径比该范围更小时，短链核酸与含二氧化硅固相的接触效率增大，短链核酸结合；另一方面，孔径比该范围大时，长链核酸与含二氧化硅固相的接触效率降低，长链核酸的结合量减少。
对于第1含二氧化硅固相，混合液的通液次数必须至少是2次以上。这是因为，如果只是1次，则长链核酸对含二氧化硅固相的结合效率低，不能充分回收长链核酸。并且，如果增加第1含二氧化硅固相上的通液次数，虽然长链核酸的结合量增加，但短链核酸的结合量几乎不增加。因此，通过使混合液在第1含二氧化硅固相上通液2次以上，仅使长链核酸的结合量增加，而可以提高回收率。
另一方面，第2含二氧化硅固相为，优选具有0.1～10μm范围的通液孔孔径，使其与短链核酸的接触效率高。为了使短链核酸对含二氧化硅固相的结合效率提高，优选增加混合液在含二氧化硅固相上的通液次数，将通液孔径在与目的核酸的大小相适应的范围内变得更小。
所述第1和第2含二氧化硅固相，各自固定在另个或同一芯片、注射器、或柱等中空状的部件中。所述部件为，具有用来吸入或排出混合液的通液口、设有中空内部减压加压用加减压器等的连接口、中空内部的含二氧化硅固相等。该设计通过利用该连接口上设置的加减压器使中空内部减压或加压，将混合液从通液口吸入或排出，使混合液从被含二氧化硅固相隔开的一侧空间移动到另一侧空间，在含二氧化硅固相上通液2次以上。
例如，在固定了含二氧化硅固相的芯片上，利用连接口上连接的注射器或吸移管使芯片内部减压，吸入混合液在含二氧化硅固相上通液，接着使芯片内部加压，排出混合液在含二氧化硅固相上通液，反复上述操作，使混合液在含二氧化硅固相上通液2次以上。这里，也可以在没有设置加减压器的状态下，从连接口投入液体，投入液体后连接加减压器，从通液口排出液体。
另外，对于固定了含二氧化硅固相的注射器来说，利用预先设置在连接口的活塞使芯片内部减压，吸入混合液在含二氧化硅固相上通液，接着使芯片内部加压，排出混合液在含二氧化硅固相上通液，反复上述操作，使混合液在含二氧化硅固相上通液2次以上。
同样的工艺，也可以在固定了含二氧化硅固相的自旋柱上进行。例如，在固定了含二氧化硅固相的自旋柱上，按照公知的自旋柱方式，向被含二氧化硅固相隔开的一侧空间投入混合液，通过利用离心力使混合液移向另一侧空间，使混合液在含二氧化硅固相上通液，进一步将通过了该含二氧化硅固相后的混合液再次加在自旋柱上，反复上述的操作，使混合液在含二氧化硅固相上通液2次以上。
结合了核酸的各含二氧化硅固相，通过使清洗液在该含二氧化硅固相上通液，除去杂质。清洗液为，只要是能够维持含二氧化硅固相和核酸的结合，且能够除去含二氧化硅固相上结合的杂质的物质即可，例如，可以使用含80％(v/v)乙醇的水溶液，或含80％(v/v)乙醇的低盐浓度的缓冲液。
接着，通过使溶出液在清洗后的含二氧化硅固相上通液，使结合的核酸从各含二氧化硅固相上溶出。溶出液为，只要是能够使核酸从含二氧化硅固相上溶离的物质即可，例如，可以使用不含核酸酶的水，或不含核酸酶的低盐浓度的缓冲液。
本发明提供上述的核酸精制器具和含有它的核酸精制用试剂盒。试剂盒中，包括核酸精制器具、以及从上述的离液剂、有机溶剂、清洗剂和溶出剂中选出的至少1种以上的试剂。另外，对于试剂盒，在其包装或附加文件中对上述的核酸精制方法(核酸精制器具的使用方法)或试剂的处理方法进行了适当的表示。
实施例
以下，通过实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明不被这些实施例限定。
[A]试样、试剂及器具
1.试样
1.1长链核酸
基因组DNA(利用QIAamp DNA Blood Mini Kit*从人血液中得到的精制物)
*QIAamp DNA Blood Mini Kit(QIAGEN制：最长50kb(主要是20-30kb)的基因组DNA被精制)
1.2短链核酸
pBR322 DNA(链长：4361bp)(MBI Fermentas制)
1.3生物材料
人血液(添加抗凝剂EDTA-2Na)
2.试剂
2.1红血球溶解液
155mM NH4Cl
10mM KHCO3
0.1mM EDTA·2Na
2.2离液剂溶液A
6M盐酸胍
50mM MES
2.3离液剂溶液B
4M硫氰酸胍
25mM柠檬酸钠(pH7.5)
1％β巯基乙醇
2.4有机溶剂A
乙醇
2.5有机溶剂B
40％(v/v)二乙二醇二甲醚水溶液
2.6清洗液
80％(v/v)乙醇水溶液
2.7溶出液A
TE(pH8.0)(和光纯药制)
2.8溶出液B
不含核酸酶的水(和光纯药制)
3.长链核酸精制器具
3.1含二氧化硅固相
玻璃纤维纸(Standard14)(孔径：约23μm)(Whatman社制)
3.2含二氧化硅固相支持材料
聚丙烯粒子烧结板(孔径：约100μm)(厚度1.5mm)
3.3精制器具
图1表示长链精制器具的构成例。核酸精制器具10为，像分注用芯片那样的外形，具有吸入和排出混合液用的通液口12、以及连接使芯片内部减压和加压用的加减压器等的连接口11，其内部有含二氧化硅固相13。在含二氧化硅固相两侧，配置了圆形的含二氧化硅固相支持材料14。这些含二氧化硅固相支持材料也是形成有液体和气体可以自由流通的多个小孔。本器具，通过使通液口的前端部在与液体连接的状态下，利用设置在连接口上的加减压器使中空内部减压或加压，将液体从通液口吸入或排出，可以使液体在含二氧化硅固相上通液。另外，也可以在不设置加减压器的状态下，从连接口投入液体，投入液体后连接加减压器，从通液口排出液体。本实施例中使用的是，将一片剪成圆形的直径4.2mm的含二氧化硅固相夹在两片直径4.1mm的含二氧化硅固相支持材料中间，以此状态将其压入内径4mm的中空芯片内部而得的器具。
4.短链核酸精制器具
4.1含二氧化硅固相
玻璃纤维纸(GF/D)(孔径：约2.7μm)(Whatman社制)
4.2含二氧化硅固相支持材料
聚丙烯粒子烧结板(孔径：约100μm)(厚度1.5mm)
4.3精制器具
具有与长链核酸精制器具相同的结构。
[B]核酸精制方法
1.从核酸溶液中精制核酸的方法
(1)制备含有核酸试样1μg的TE溶液10μl。
(2)添加离液剂溶液A 0.3ml，混合。
(3)添加有机溶剂A 0.3ml，混合。
(4)在核酸精制器具的连接口上安装注射器，将混合液从核酸精制器具的通液口吸入、排出规定次数。但是，通液次数是1次时，是在安装注射器前，将混合液从连接口投入，从通液口排出。
(5)将1ml清洗液从核酸精制器具的通液口吸入、排出1次。
(6)将(5)反复进行3次，将清洗液完全排出。
(7)将0.05ml溶出液A从核酸精制器具的通液口吸入、排出10次。
(8)回收溶出液作为核酸精制溶液。
2.从血液中精制核酸的方法
(1)向0.6ml全血中添加3ml红血球溶解液，混合。
(2)在冰上孵育5分钟。
(3)以400×g进行10分钟离心分离。
(4)除去上清液。
(5)向沉淀物中添加1.2ml红血球溶解液，混合。
(6)以400×g进行10分钟离心分离。
(7)除去上清液，得到白血球的沉淀物。
(8)向白血球沉淀物中添加0.3ml离液剂溶液B，混合。
(9)用匀浆机(QIA shredder匀浆机)(QIAGEN制)将混合液均一化。
(10)添加0.3ml有机溶剂B，混合。
(11)在长链核酸精制器具的连接口上安装注射器，将混合液从核酸精制器具的通液口吸入、排出3次。
(12)将1ml清洗液从核酸精制器具的通液口吸入、排出1次。
(13)将(12)反复进行3次，将清洗液完全排出。
(14)将0.2ml溶出液A从核酸精制器具的通液口吸入、排出10次。
(15)回收溶出液作为长链核酸精制溶液。
(16)在短链核酸精制器具的连接口上安装注射器，将(11)中排出的混合液从核酸精制器具的通液口吸入、排出10次。
(17)将1ml清洗液从核酸精制器具的通液口吸入、排出1次。
(18)将(17)反复进行3次，将清洗液完全排出。
(19)将0.05ml溶出液B从核酸精制器具的通液口吸入、排出10次。
(20)回收溶出液作为短链核酸精制溶液。
[C]精制核酸的评价方法
1.核酸浓度定量
将核酸溶液进行适量稀释，利用分光光度计(GeneSpec I)(日立那珂仪器公司制)测定260nm下的吸光度，以50μg/ml DNA溶液在260nm下的吸光度作为1算出DNA的浓度。
2.核酸电泳
使用1.25％的琼脂糖凝胶(Reliant RNA凝胶系统)(FMC制)对用甲酰胺进行了变性处理的核酸溶液进行电泳(10V/cm，40分钟)。将电泳后的琼脂糖凝胶用溴化乙锭染色，在UV照射下拍照。
[D]验证实验1
使用基因组DNA作为长链核酸试样，使用pBR322DNA作为短链核酸试样，按照上述的从核酸溶液中精制核酸的方法，利用长链核酸精制器具和短链核酸精制器具进行核酸精制。其中，结合工序中的通液方法为，从核酸精制器具的开口部投入、从通液口排出的一个方向1次，及从通液口吸入、排出1、5、10次。
以下的表中表示核酸精制器具、核酸试样及通液次数的各种组合的核酸回收率。另外，图2表示核酸精制器具和核酸试样的各种组合的通液方法与核酸回收率的关系。其中，核酸回收率为精制核酸量相对于投入核酸量的百分率。
表1
  核酸精制器具   核酸试样   通液方法   核酸回收率[％]
长链核酸精制器具 长链核酸   一个方向   42
  吸入、排出1次   60
  吸入、排出5次   78
  吸入、排出10次   81
短链核酸   一个方向   1
  吸入、排出1次   1
  吸入、排出5次   1
  吸入、排出10次   1
短链核酸精制器具 长链核酸   一个方向   63
  吸入、排出1次   78
  吸入、排出5次   84
  吸入、排出10次   87
短链核酸   一个方向   46
  吸入、排出1次   62
  吸入、排出5次   75
  吸入、排出10次   77
长链核酸精制器具中，长链核酸的回收率随着通液次数而增大，但是短链核酸的回收率不依赖于通液次数，是非常低的。另一方面，短链核酸精制器具中，长链核酸和短链核酸都随着通液次数而增大。
该结果表明，长链核酸精制器具只选择性地结合长链核酸，且不结合短链核酸。接着，通过使用短链核酸精制器具，可以结合不与长链核酸精制器具结合的短链核酸，从而能够对长链核酸和短链核酸进行高效地分离，精制。
[E]验证实验2
使用人血液作为生物试样，按照从血液中精制核酸的方法，利用长链核酸精制器具和短链核酸精制器具进行核酸精制。
图3表示用长链核酸精制器具精制的核酸和用短链核酸精制器具精制的核酸的电泳结果。用长链核酸精制器具精制的核酸主要含有基因组DNA(Genomic DNA)，几乎不含有RNA。另一方面，用短链核酸精制器具精制的核酸主要含有约5000b的核糖体RNA(28S rRNA)和约1900b的核糖体RNA(18S rRNA)、及信使RNA，几乎不含有基因组DNA。
该结果表明，通过使用长链核酸精制器具和短链核酸精制器具，能够从含有基因组DNA和总RNA的生物试样中，高效地分离精制基因组DNA和总RNA。

Claims (11)

1.核酸精制方法，其特征为，在含有核酸的试样中混合离液剂，使所述混合液在具有规定孔径通液孔的第1含二氧化硅固相上通液2次以上；接着，在具有孔径小于所述第1含二氧化硅固相的通液孔的第2含二氧化硅固相上，使所述混合液通液2次以上；然后，对结合在所述第1和第2含二氧化硅固相上的核酸各自进行回收。
2.根据权利要求1记载的核酸精制方法，其中，在所述第1和第2含二氧化硅固相上通液时都是对于含二氧化硅固相从两个方向反复进行2次以上。
3.根据权利要求1或2记载的核酸精制方法，其中，所述第1含二氧化硅固相的通液孔的孔径为20～25μm，并且所述第2含二氧化硅固相的通液孔的孔径为0.1～10μm。
4.根据权利要求1至3的任一项记载的核酸精制方法，其中，结合在所述第1含二氧化硅固相上的核酸为，由20000个以上的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸构成的核酸；结合在所述第2含二氧化硅固相上的核酸为，由10000个以下的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸构成的核酸。
5.根据权利要求4记载的核酸精制方法，其中，结合在所述第1含二氧化硅固相上的核酸为，由50000个以上的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸构成的核酸。
6.根据权利要求4或5的任一项记载的核酸精制方法，其中，结合在所述第2含二氧化硅固相上的核酸为，由5000个以下的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸构成的核酸。
7.根据权利要求1至6的任一项记载的核酸精制方法，其中，所述第1含二氧化硅固相上结合的核酸是基因组DNA，所述第2含二氧化硅固相上结合的核酸是RNA。
8.根据权利要求1至6的任一项记载的核酸精制方法，其中，所述第1含二氧化硅固相上结合的核酸是基因组DNA，所述第2含二氧化硅固相上结合的核酸是质粒DNA。
9.核酸精制器具，具有吸入排出含核酸试样和离液剂的混合液的通液口和含二氧化硅固相，其特征为，通过利用压力差将混合液从所述通液口吸入或排出，使其从被所述含二氧化硅固相隔开的一侧空间向另一侧空间移动，在所述含二氧化硅固相上通液2次以上。
10.核酸精制用试剂盒，含有权利要求9记载的核酸精制器具以及从离液剂、有机溶剂、清洗液和溶出液中选出的至少1种以上的试剂。
11.根据权利要求10记载的试剂盒，其中，所述离液剂为从硫氰酸胍、硫氰酸钠、盐酸胍、碘化钠、碘化钾中选出的至少一种以上，所述有机溶剂为乙醇和/或二乙二醇二甲醚。
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