CN103261439B

CN103261439B - 母体血液中的胎儿细胞的富集和识别及这类用途的配体

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Publication number: CN103261439B
Application number: CN201180056239.5A
Authority: CN
Inventors: 安德烈亚斯·埃克尔特; 布里塔·克里斯滕森; 斯蒂恩·克拉韦奥; 玛丽·布林克; 里皮达曼·辛格; 洛特·哈特
Original assignee: Quantibact AS
Current assignee: Carry Holdings Ltd.; FBMC APS
Priority date: 2010-11-09
Filing date: 2011-11-09
Publication date: 2015-04-15
Anticipated expiration: 2031-11-09
Also published as: JP6310540B2; ES2642313T3; CA2817390C; IL226188A; SG190175A1; JP2017060525A; LT2638176T; HUE034937T2; SMT201700509T1; CA2817390A1; US20130331284A1; SI2638176T1; SG10201509230VA; DK2638176T3; IL226188A0; EA027314B1; CY1119526T1; RS56402B1; EA201390638A8; JP6068354B2

Abstract

本发明涉及采用胎儿细胞特异性配体和/或胎儿细胞特异性杂交探针，富集和/或识别母体血液样品中的胎儿细胞；其中，在第一轮富集中，所述配体或探针针对内皮/间充质标记物，例如CD105、CD146或CD141；而在第二轮的富集中，所述配体或探针针对上皮细胞标记物，例如CK7、CK8、CK18或CK19之类的细胞角蛋白。经富集或识别的胎儿细胞可进行检测或诊断的步骤，因此，本发明能够进行非侵入性的产前诊断。

Description

母体血液中的胎儿细胞的富集和识别及这类用途的配体

背景技术

许多孕妇进行了用以早期检测胎儿疾病和遗传异常的胎儿细胞检查，尤其是当母体年龄高（35岁或以上）或已知家庭中有遗传疾病时。可通过从羊膜囊内的羊膜腔取出羊水的羊膜穿刺术或通过从胎盘取得活检的绒毛膜活检，即所谓的侵入性采样，来获得胎儿细胞。

产前非整倍体筛查（prenatal aneuploidy screening）采用传统的染色体分析或者染色体特异性DNA探针，所述染色体特异性DNA探针用于说明在胎儿中最频繁出现异常的染色体，特别是第13号染色体、第18号染色体、第21号染色体、X染色体和Y染色体，的数目畸变（aberration）。

由于上述采样方法的侵入性和流产危险性，通过一种非侵入性的过程，诸如利用母体血液样品，来实施胎儿诊断将是有利的。

怀孕期间，源自胎儿的各种细胞类型流过（cross）胎盘并在母体外周血内循环。只有非常有限数量的胎儿细胞存在于母体血液中的这一事实阻碍了将母体循环中的胎儿细胞用于诊断目的的可行性，报道的数量从每105至108个有核母体细胞中有一个胎儿细胞，或每毫升母体血液中有1至10个胎儿细胞。此外，仅基于形态，大部分胎儿细胞无法与母体细胞区分开来，因此已经在研究胎儿细胞识别的替代方法。

US2007/0015171描述了一种用于胎儿DNA的分离和检测的非侵入性方法。所述方法使用特异性结合母体细胞的抗体和/或特异性结合胎儿细胞的抗体来富集母体血液样品。发明人建议使用几个具体提到的抗体：HLe-1抗体是一种识别存在于成熟的人体白细胞上和非常不成熟的红细胞前体上的抗原的抗体，但所述抗体不识别成熟的有核红细胞。因此，据建议此抗体能够用于识别母体白细胞，但不识别胎儿有核红细胞。抗单核细胞抗体（M3）和抗淋巴细胞抗体（L4）也被建议用于从样品中去除母体细胞。最后，作者建议使用识别胎儿细胞上的转铁蛋白受体（TfR）的单克隆抗体。来自分离的胎儿细胞的DNA之后可用于检测和诊断。

WO2008/132753描述了一种通过在生物样品细胞中检测滋养细胞（trophoblast）标记物的表达来识别滋养细胞的方法，所述滋养细胞标记物选自由膜联蛋白IV、细胞角蛋白-7、细胞角蛋白8和细胞角蛋白-19组成的组。滋养细胞是指来自哺乳动物胚胎或胎儿的胎盘的上皮细胞；滋养细胞通常接触子宫壁。提到三种类型的滋养细胞：绒毛细胞滋养细胞、合体滋养细胞和绒毛外滋养细胞。重要的是，发明人使用抗波形蛋白（Vimentin）的单克隆抗体来估算从妊娠头三个月胎盘中分离的滋养细胞的成纤维细胞污染程度。因此，这些发明人分离的滋养细胞不包含波形蛋白。

Gussin等人在2004年提出假设，即，母体血液中不对造血培养条件响应的胎儿细胞代表内皮细胞。他们研究了源自胎儿的内皮祖细胞（progenitor cell）是否可以基于其CD133或CD105的表达而从母体血液中选择，并在培养基中扩增。作者的结论是从母体血液中分离的CD133+和CD105+细胞能够在内皮细胞条件下体外扩增。这些细胞似乎是源自母体而不是胎儿。

因此，仍然需要从母体血液样品中分离胎儿细胞的改进方法以帮助产前检测和诊断。

发明概述

本发明基于对能够用于识别和/或富集母体血液样品中的胎儿细胞的抗原的识别。特别地，本发明基于令人惊奇的发现，即，在母体血液样品中的胎儿细胞显示内皮细胞和上皮细胞两者的特征。利用这一转化（transition），本发明人提供了一种用于富集和识别母体血液样品中的胎儿细胞的新方法，还公开了用于此目的的新抗原。

在本发明优选的第一实施方式中，将母体血液样品与内皮细胞标记物接触，从而通过选择特异于所述内皮细胞标记物的细胞来富集具内皮细胞表型的细胞。识别在母体血液样品中的胎儿细胞的这种方法包括以下步骤：

a.提供母体血液样品或其一部分（fraction）

b.将所述样品与包含至少10个连续核苷酸且与编码内皮细胞标记物的基因互补的杂交探针接触，或与结合到内皮细胞标记物的配体接触，以及

c.选择特异于所述内皮细胞标记物的细胞

d.将步骤b中选择的显示内皮细胞表型的细胞与包含至少10个连续核苷酸且与编码上皮细胞标记物的基因互补的杂交探针接触，或与针对上皮细胞标记物的配体接触

e.检测具内皮细胞表型的而且还结合了步骤c的上皮细胞标记物的细胞

f.任选地，诊断和/或预测步骤d中检测到的细胞的遗传内容

其中可以以任意顺序实施步骤b至e。

附图说明

图1.由X和Y特异性探针识别的男性胎儿细胞。箭头表示所述胎儿细胞。

图2.每毫升母体血液中胎儿细胞的频率。

图3.示出泛细胞角蛋白染色的胎儿细胞。箭头表示所述胎儿细胞。

图4.示出细胞角蛋白7染色的胎儿细胞。箭头表示所述胎儿细胞。

图5.示出波形蛋白染色的胎儿细胞。箭头表示所述胎儿细胞。

图6.以细胞角蛋白（绿色）和针对第21号染色体的FISH探针（红色）和针对X染色体的FISH探针（蓝色）染色的胎儿细胞。箭头指向胎儿细胞中的第21号染色体的三个拷贝。母体细胞背景含有每个第21号染色体的两个拷贝。

发明内容

本发明基于对能够用于识别和/或富集母体血液样品中的胎儿细胞的抗原的识别。特别地，本发明基于令人惊奇的发现：母体血液样品中的胎儿细胞显示内皮细胞和上皮细胞两者的特征。本发明首次揭示，存在于母体血液样品中的胎儿细胞经历血液中正常母体细胞不经历的一独特转化（transition）。胚胎细胞已经从早期的胚泡期分化成三个胚层，即内胚层、中胚层和外胚层。中胚层代表诸如肌肉、脂肪和血管的软组织细胞。外胚层和内胚层代表覆盖外表面和内表面的上皮细胞。中胚层和外胚层细胞在标记物的表达模式上有明显的差异。

上皮-间质转化（EMT）是上皮细胞失去其上皮细胞特征并获得类似间质细胞表型的过程。已经描述了在早期胚胎形成中的EMT，在所述早期胚胎形成中例如神经管的形成需要胚胎上皮细胞的迁移和瞬时去分化。

EMT也被描述为与癌症有关，所述癌症中几个致癌途径诱导EMT。在近几年，已经特别研究了与转移（metastatic）过程有关的EMT。

本发明涉及由发明人做出的认识，即存在于母体血液中的胎儿细胞经历EMT，并通过利用此特征，本发明提供了一种分离和识别存在于母体血液样品中的胎儿细胞的新方法。通过利用中胚层标记物（即内皮细胞标记物）作为阳性选择标记物，以非常低的数目存在于母体血液样品中的胎儿细胞与一些母体细胞一起被富集。随后，通过将所留下的细胞与上皮细胞标记物接触，从而利用EMT现象，做出胎儿细胞的阳性识别。存在于血液样本中的正常母体细胞不表达任何上皮细胞标记物。

通过利用这种转化，发明人提供了一种用于富集和识别母体血液样品中的胎儿细胞的新方法，还揭示了用于此目的的新抗原。

因此，本发明的方法包括对表达内皮细胞标记物的细胞的分离，接着检测还表达上皮细胞标记物的细胞。

通过检测或定量mRNA或由该mRNA编码的蛋白质（抗原），被识别的抗原可用于识别母体血液样品中胎儿细胞。本文中使用术语“检测”时，它涵盖了检测和定量两者的意思。然而在两个单独的实施方式中，术语“检测”涵盖检测或定量的之一的意思。一般情况下，本领域技术人员将认识到什么时候检测也涵盖定量，即什么时候它是有关量化mRNA水平或该mRNA所编码的蛋白质的水平。这对于例如给定mRNA的检测可能是必要的，所述给定mRNA是在母体细胞中以较低的水平（但并非不存在）表达且在胎儿细胞中相同的mRNA以例如3倍高的水平表达。

当在本文中使用术语“富集”时，它涵盖了一个或多个细胞从存在于样品中的任何其它细胞中的分离。在一种实施方式中，被富集的细胞不从样品中分离，而是在细胞仍存在于样品中时对细胞进行任何诊断。所述样品则可呈现在载玻片上，并可使用显微镜进行诊断，并且在此实施方式中细胞被检测而不被分离。

本发明人获得的另一发现是，固定母体样品的细胞的步骤大大地有助于从样品中识别和富集胎儿细胞。此固定步骤可以与本文描述的富集和/或识别胎儿细胞的方法一起实施，或与现有技术（例如背景技术部分中描述的US2007/0015171）中已经描述的富集和/或识别胎儿细胞的方法一起实施。

对母体血液样品的细胞的固定

在本发明的一种实施方式中，发现固定母体血液样品中的细胞大大提高了母体血液样品中的胎儿细胞的稳定性，同时允许对胎儿细胞的富集和识别，例如，上面本文所进一步描述。在一种实施方式中，固定过程可以在取样（即在第一实施方式中描述的方法中的步骤a）后立即对非富集的血液样品实施，使得母体血液样品中的细胞成分固定。同时，所述固定是很温和的，使得在随后的裂解步骤中可以选择性地裂解母体红细胞。在一种实施方式中，所述固定可在第一实施方式中描述的方法的步骤a至d之间的任何合适的时间点实施。在一种实施方式中，所述固定可在第一实施方式中描述的方法的步骤a之后实施。在另一实施方式中，所述固定可在第一实施方式描述的方法的步骤b之后实施。在另一实施方式中，所述固定可在第一实施方式描述的方法中的步骤c之后实施。在又一实施方式中，所述固定可在第一实施方式描述的方法的步骤d之后实施。

在优选的实施方式中，如在“发明概述”中描述的本发明的第一实施方式的方法包括以下步骤：

a.提供母体血液样品或其一部分

b.固定所述母体血液样品的细胞

c.将所述样品与包含至少10个连续核苷酸且与编码内皮细胞标记物的基因互补的杂交探针接触，或与结合到内皮细胞标记物的配体接触，以及

d.富集特异于所述内皮细胞标记物的细胞

e.将步骤b中选择的显示内皮细胞表型的细胞与包含至少10个连续核苷酸且与编码上皮细胞标记物的基因互补的杂交探针接触，或与针对上皮细胞标记物的配体接触

f.检测具内皮细胞表型并且还结合了步骤c的上皮细胞标记物的细胞

g.任选地，诊断和/或预测步骤d中检测到的所述细胞的遗传内容其中，所述步骤c至e可以以任何顺序实施。

因此，本发明的一种实施方式是一种包括以下步骤的方法：

a.提供母体血液样品或其一部分

b.将所述样品与固定溶液接触

优选地，在获得样品后，立即将所述母体血液样品与所述固定溶液接触。本文中使用的术语“立即”的意思是所述样品在与所述固定溶液接触之前不进行其他任何操作。优选地，在提供样品后不超过24小时将所述样品与所述固定溶液接触。更优选地，在提供样品后不超过12小时，例如8小时、4小时、2小时、1小时、30分钟、15分钟，将所述样品与所述固定溶液接触。最优选的是，在提供样品后不超过1小时将所述样品与所述固定溶液接触。

在另一优选的实施方式中，优选在诸如重力沉积或离心沉积的任选的沉积步骤之前将固定溶液加入全血中。

固定处理优选进行1至60分钟。更优选地，固定处理进行5至30分钟，且最优选地，固定处理进行5至15分钟，例如10分钟。

固定溶液优选包括介于2.5％至7.5％之间的多聚甲醛，更优选介于3％至6％之间的多聚甲醛，最优选介于4％至5％之间的多聚甲醛。

除了多聚甲醛，固定溶液还优选包括浓度介于0.05M至0.3M之间的盐。更优选浓度介于0.1M至0.2M之间的盐，最优选浓度介于0.125M至0.175M之间的盐。所述盐优选的是LiCl、KCl、NaCl或PBS，其中PBS最优选。

当采用以上提及的浓度的固定溶液时，优选向母体血液样品中添加0.2至10体积的固定溶液用于固定，更优选添加0.5至5体积，最优选添加1至3体积。典型地，添加2/3体积。在又一实施方式中，优选添加1/3至3/3体积的固定溶液，例如2/3体积。

本领域技术人员将清楚的是，能够调节固定溶液的各种浓度和稀释倍数，以便在固定溶液添加到母体血液样品后获得期望的最终浓度。优选地，多聚甲醛的最终浓度介于2％至6％之间，更优选地介于3％至5％之间，最优选地介于3.5％至4.5％之间。典型地，最终的浓度是4％。

优选地，所述固定步骤之后是包括以下步骤的裂解步骤：

c.将步骤a的固定好的样品与裂解缓冲液接触

裂解缓冲液典型地包括非离子型洗涤剂，优选的是Triton X-100。洗涤剂的优选浓度介于0.01％（重量/重量）至0.5％之间，更优选介于0.05％至0.3％之间，最优选地是0.1％。

在优选的实施方式中，在固定步骤之后立即实施裂解步骤。也就是说，固定和裂解都在第一实施方式描述的方法的步骤a之后步骤b之前实施。即，裂解溶液直接添加到样品中，例如在固定10分钟之后。裂解典型地进行15分钟至120分钟的一段时间，更优选进行30至60分钟，最优选进行40至45分钟。

如上所述，裂解步骤令人惊奇地允许对母体红细胞的选择性裂解。

本发明的另一实施方式是使用裂解缓冲液来对母体血液样品中的母体红细胞或其一部分选择性的裂解，如上所描述。在优选的实施方式中，裂解缓冲液用于本发明的方法，且所述裂解缓冲液可在第一实施方式描述的方法的步骤a之后添加到所述母体血液样品或其一部分中。

母体血液样品与配体或探针的接触

本发明的一种实施方式提供了一种选择母体血液样品中的胎儿细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

a.提供母体血液样品或其一部分

b.将所述样品与下列物质接触

i.包含至少10个连续核苷酸且与编码内皮细胞标记物的基因互补的杂交探针，或

ii.针对内皮细胞标记物的配体

c.选择与前述步骤的杂交探针或配体结合的细胞，从而针对与前述步骤的杂交探针或配体结合的细胞富集样品

d.将步骤c的（富集后的）样品与下列物质接触

i.包含至少10个连续核苷酸且与编码上皮细胞标记物的基因互补的杂交探针，或

ii.针对上皮细胞标记物的配体。

优选地，所述方法进一步包括识别样品的胎儿细胞的步骤。将清楚的是，识别优选包括检测胎儿细胞中或上针对上皮细胞标记物的配体的存在，或检测胎儿细胞中或上包含至少10个连续核苷酸的且与编码上皮细胞标记物的基因互补的杂交探针的存在。

在优选的实施方式中，母体血液样品与配体或杂交探针接触，所述配体或杂交探针结合内皮细胞标记物或编码所述标记物的基因，具内皮细胞表型的细胞由此通过选择特异于所述内皮细胞标记物的细胞而富集。这种方法包括以下步骤：

a.提供母体血液样品或其一部分

b.将所述样品与包含至少10个连续核苷酸且与编码内皮细胞标记物的基因互补的杂交探针接触，或与针对内皮细胞标记物的配体接触，并且

c.选择特异于所述内皮细胞标记物的细胞，从而针对具内皮细胞表型的细胞富集样品

d.将步骤c中选择的显示内皮细胞表型的细胞与包含至少10个连续核苷酸且与编码上皮细胞的标记物的基因互补的杂交探针接触，或与针对上皮细胞标记物的配体接触

e.检测具内皮细胞表型并且还结合了步骤d的上皮细胞标记物的细胞

f.任选地，诊断和/或预测在步骤e中检测到的细胞的遗传内容

其中可以任意顺序实施步骤b至e。

本领域技术人员将知道，在一种实施方式中，可以任意顺序实施上述步骤b、c、d、e和f，优选的是以上文所述的顺序或者以b、d、c、e和f的顺序，更优选是以上文所述的顺序。因此，在一种实施方式中，在实施选择步骤之前，样品与针对内皮细胞标记物的杂交探针或配体接触，接着将相同的样品与针对上皮细胞标记物的杂交探针或配体接触。

在优选的实施方式中，内皮细胞标记物选自由CD105、CD146或CD141、波形蛋白、VCAM、ICAM、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、ITGA5、ITGB5、CDH11或CDH3组成的组。本发明的内皮细胞标记物是一种主要在内皮细胞中或上表达的标记物。所述内皮细胞标记物在任何其他细胞类型中或上不被特别地表达。最优选的是CD105（SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2）。

在优选的实施方式中，上皮细胞标记物选自由CK1、CK2、CK3、CK4、CK5、CK6、CK7、CK8、CK9、CK10、CK10、CK13、CK14、CK15、CK16、CK17、CK18或CK19组成的组。本发明的上皮细胞标记物是一种主要在上皮细胞上表达的标记物。所述上皮细胞标记物在任何其他细胞类型中或上不被特别地表达。

在优选的实施方式中，所述方法进一步包括：将样品与M30抗体（或针对凋亡CK18的另一配体）接触。在优选的实施方式中，上皮细胞标记物选自由CK4、CK5、CK6A、CK6B、CK7、CK8、CK10、CK13和CK18组成的组。最优选的是CK18（SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13）。

在本发明中使用的抗原和编码基因在表1中标明。

表1：

NCBI登录：	简称	登录号
			人内皮糖蛋白	CD105	AF035753
人波形蛋白	Vim	NM_003380
			人细胞角蛋白1	KRT1	X69725
人细胞角蛋白2	KRT2	NM_000423
			人细胞角蛋白3	KRT3	NM_057088
人细胞角蛋白4	KRT4	NM_002272
			人细胞角蛋白5	KRT5	NM_000424
人细胞角蛋白6	KRT6	NM_080747
			人细胞角蛋白7	KRT7	NM_005556
人细胞角蛋白8	KRT8	NM_002273
			人细胞角蛋白10	KRT10	NM_000421
人细胞角蛋白13	KRT13	NM_153490
			人细胞角蛋白14	KRT14	NM_000526
人细胞角蛋白15	KRT15	NM_002275
			人细胞角蛋白16	KRT16	NM_005557
人细胞角蛋白17	KRT17	NM_000422
			人细胞角蛋白18	KRT18	NM_199187
人细胞角蛋白19	KRT19	NM_002276
			血管细胞粘附分子	VCAM	P19320
细胞间粘附分子1	ICAM	NP_000192
			CD9分子	CD9	NP_001760
血管内皮生长因子受体1（Flt-1）	VEGFR-1	P17948
			血管内皮生长因子受体2	VEGFR-2	P35968
血管内皮生长因子受体3	VEGFR-3	P35916
			整联蛋白，αV	ITGA5	AAI36443

整联蛋白，βV	ITGB5	ABY87537
			钙粘着蛋白11	CDH11	EAW83002
钙粘着蛋白3	CDH3	P22223
			羧肽酶M	CPM	AAH22276
淋巴细胞活化抗原	CD39	AAB32152
			纤溶酶原激活物抑制物1	PAI-1	P05121
CD200分子	CD200	AAH31103
			EPH受体B4	EPHB4	EAL23820
内皮细胞蛋白C受体	EPCR	AAH14451
			蛋白酶激活受体1	PAR-1	P25116

用于第一实施方式中描述的方法的步骤b中的抗原和编码基因优选选自表2。因此，在发明概述中描述的本发明的第一实施方式的方法的步骤b的内皮细胞标记物优选选自由表2的基因所编码的标记物：

表2：

NCBI登录：	简称	登录号
			人内皮糖蛋白	CD105	AF035753
人波形蛋白	Vim	NM_003380
			血管细胞粘附分子	VCAM	P19320
细胞间粘附分子1	ICAM	NP_000192
			血管内皮生长因子受体1（Flt-1）	VEGFR-1	P17948
血管内皮生长因子受体2	VEGFR-2	P35968
			血管内皮生长因子受体3	VEGFR-3	P35916
纤溶酶原激活物抑制物1	PAI-1	P05121
			内皮细胞蛋白C受体	EPCR	AAH14451

用于第一实施方式描述的方法的步骤d中的抗原和编码基因优选选自表3。因此，在发明概述中描述的本发明的第一实施方式的方法的步骤d的上皮细胞标记物优选选自由表3的基因所编码的标记物：

表3：

NCBI登录：	短	登录号
			人细胞角蛋白1	KRT1	X69725

人细胞角蛋白2	KRT2	NM_000423
			人细胞角蛋白3	KRT3	NM_057088
人细胞角蛋白4	KRT4	NM_002272
			人细胞角蛋白5	KRT5	NM_000424
人细胞角蛋白6	KRT6	NM_080747
			人细胞角蛋白7	KRT7	NM_005556
人细胞角蛋白8	KRT8	NM_002273
			人细胞角蛋白10	KRT10	NM_000421
人细胞角蛋白13	KRT13	NM_153490
			人细胞角蛋白14	KRT14	NM_000526
人细胞角蛋白15	KRT15	NM_002275
			人细胞角蛋白16	KRT16	NM_005557
人细胞角蛋白17	KRT17	NM_000422
			人细胞角蛋白18	KRT18	NM_199187
人细胞角蛋白19	KRT19	NM_002276

应当注意的是，在第一实施方式（见“发明概述”）描述的方法的步骤b和d的杂交探针可以是互补于所述基因的编码链或非编码链。优选地，所述探针互补于编码链（非模板链）。在相关的实施方式中，所述探针针对mRNA。如果所述探针将针对mRNA，则它可针对剪接点，这意味着该序列在DNA中断裂。

术语“其一部分”是用来表示母体血液样品可直接与配体或杂交探针接触，或者可对母体血液样品进行预处理，使得当与配体或杂交探针接触时只包括原始母体血液样品的一部分。母体血液样品可以例如，在与配体或杂交探针接触之前进行其细胞浓缩、凝集步骤或富集步骤。

在优选的实施方式中，所述方法包括：

a.提供母体血液样品或其一部分

b.将所述样品与以下物质接触

i.包含至少10个连续核苷酸且与编码人波形蛋白的基因互补的杂交探针，和/或

ii.针对人波形蛋白的配体。

在另一优选的实施方式中，所述方法包括：

a.提供母体血液样品或其一部分

b.将所述样品与以下物质接触

i.包含至少10个连续核苷酸且与编码人细胞角蛋白7的基因互补的杂交探针，和/或

ii.针对人细胞角蛋白7的配体。

在更优选的实施方式中，所述方法包括：

a.提供母体血液样品或其一部分

b.将所述样品与以下物质接触

i.包含至少10个连续核苷酸且与编码CD105的基因互补的杂交探针，和/或

ii.针对CD105的配体（SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2）以及

c.在母体血液样品已经与内皮细胞标记物，优选的实施方式中是CD105，相接触后，将所述样品与以下物质接触

i.包含至少10个连续核苷酸且与编码人细胞角蛋白7(SEQ IDNO:7)的基因互补的杂交探针，和/或

ii.针对人细胞角蛋白7的配体。

在又一优选的实施方式中，所述方法包括：

a.提供母体血液样品或其一部分

b.将所述样品与以下物质接触

i.包含至少10个连续核苷酸且与以下组的基因互补的交叉反应杂交探针：所述组由编码人细胞角蛋白1至6、8、10和13至19的基因组成，和/或

ii.针对人细胞角蛋白1至6、8、10和13至19的交叉反应的配体。

在此实施方式中，所述配体能够与多种细胞角蛋白，即细胞角蛋白1至6、8、10和13至19，相结合。这种交叉反应性可通过将所述配体导向细胞角蛋白的保守（相同）区域而实现。同样地，可通过使所述探针针对编码所述细胞角蛋白的基因的保守（相同）区域来设计交叉反应杂交探针。

在优选的实施方式中，所述方法包括：

a.提供母体血液样品或其一部分

b.将所述样品与以下物质接触

ii.针对CD105的配体,以及

c.将所述样品与以下物质接触

i.包含至少10个连续核苷酸且与以下组的基因互补的交叉反应杂交探针，所述组是由编码人细胞角蛋白1至6、8、10和13至19的基因组成，和/或

ii.针对人细胞角蛋白1至6、8、10和13至19的交叉反应配体。

在还一实施方式中，使用杂交探针或配体的混合物（每种抗原或基因用一种）作为交叉反应杂交探针或交叉反应的配体替代物。

在这样的一种实施方式中，所述方法包括以下步骤：

a.提供母体血液样品或其一部分

b.将所述样品与以下物质接触

ii.针对CD105的配体,以及

c.将所述样品与以下物质接触

i.杂交探针混合物，包括：包含至少10个连续核苷酸且与以下组的基因互补的杂交探针，所述组由编码人细胞角蛋白1至6、8、10和13至19的基因组成；包含至少10个连续核苷酸且与编码人细胞角蛋白7的基因互补的杂交探针；以及包含至少10个连续核苷酸且与编码人波形蛋白的基因互补的杂交探针，和/或

ii.配体混合物，包括：针对人细胞角蛋白1至6、8、10和13至19的交叉反应配体；针对人细胞角蛋白7的配体；以及针对人波形蛋白的配体。

在优选的实施方式中，随后识别和选择与内皮细胞（即CD105）和上皮细胞标记物（即细胞角蛋白7）都反应的细胞用于进一步的分析。

在优选的实施方式中，步骤b优选采用如下文所述的杂交探针，而步骤d采用如下文所述的配体。

全血选择

在一种实施方式中，第一实施方式中描述的方法的步骤a的母体血液样品是全血，即，血液在与针对内皮细胞标记物的配体或针对编码内皮细胞标记物的基因的杂交探针接触之前，没有经过任何分级（fractionation）。

固定和选择性裂解

在本发明的优选实施方式中，如本发明的一种实施方式中所描述地，将母体血液样品的细胞固定。母体细胞的数目大大超过母体血液样品中存在的胎儿细胞的数目，因此，包括富集步骤从而将母体细胞从待分析的样品中去除将是有用的。可以在操作过程中的任何合适的时间点实施富集步骤，最合适的是作为在第一实施方式中描述的方法的步骤a之后的步骤。为了不去除任何胎儿细胞，优选富集步骤不区分不同的胎儿有核细胞类型。血液样品中的母体细胞的大部分是由红细胞组成。已知有几种去除红细胞的方法，最方便的是可由NH₄Cl介导的裂解来实现的红细胞裂解。因而，在优选的实施方式中，在固定之后立即选择性地裂解母体红细胞。因此，识别母体血液样品中的胎儿细胞的方法包括以下步骤：

a.提供母体血液样品或其一部分

b.通过将所述母体血液样品进行红细胞裂解来富集胎儿细胞

c.固定剩余的细胞

d.将所述样品与包含至少10个连续核苷酸且与编码内皮细胞标记物的基因互补的杂交探针接触，或与结合到内皮细胞标记物的配体接触，以及

e.富集特异于所述内皮细胞标记物的细胞

f.将步骤b中选择的显示内皮细胞表型的细胞与包含至少10个连续核苷酸且与编码上皮细胞标记物的基因互补的杂交探针接触，或与针对上皮细胞标记物的配体接触

g.检测具内皮细胞表型并且还与步骤c的上皮细胞标记物结合的细胞

h.任选地，诊断和/或预测在步骤d中检测到的所述细胞的遗传内容其中，可以以任何顺序实施步骤b至e，优选以上面指出的顺序。

渗透

在又一实施方式中，在与如上所述的配体或杂交探针接触之前，母体血液样品的细胞经过渗透步骤。即，在第一实施方式描述的方法的步骤b之前，实施渗透步骤。此步骤优选包括将样品与甲醇、丙酮或皂甙接触。优选地，渗透剂是甲醇。因此，识别母体血液样品中的胎儿细胞的方法包括以下步骤：

a.提供母体血液样品或其一部分

b.渗透所述母体血液样品的细胞

c.将所述样品与包含至少10个连续核苷酸且与编码内皮细胞标记物的基因互补的杂交探针接触，或与结合到内皮细胞的标记物配体接触，以及

d.富集特异于所述内皮细胞的标记物的细胞

e.将步骤b中选择的显示内皮细胞表型细胞与包含至少10个连续核苷酸且与编码上皮细胞标记物的基因互补的杂交探针接触，或与针对上皮细胞标记物的配体接触

f.检测具内皮细胞表型并且还与步骤c的上皮细胞标记物结合的细胞

g.任选地，诊断和/或预测在步骤d中检测到的所述细胞的遗传内容其中，可以任何顺序实施步骤b至e。

阳性选择

优选地，如在实例部分和本发明的一种实施方式中所描述，抗原依赖性的富集包括将母体血液样品与针对CD105的抗体接触。即，在一种实施方式中，第一实施方式描述的方法的步骤b是抗原依赖性的步骤。

在优选的实施方式中，在与针对上皮细胞的配体或与杂交探针接触（即第一实施方式描述的方法的步骤d）之前，将母体血液样品进行固定、裂解并采用针对CD105的抗体富集。

效率

本发明的优选实施方式使胎儿细胞识别在商业上可行，因为它大大减少了用于胎儿细胞识别所必须分析的单个细胞数目。本发明将样品中的细胞数目减少了10至20倍，使得能够采用大约20到30个载玻片的自动扫描来分析它们。即，本发明不仅提供了用于胎儿细胞识别的胎儿细胞特异性抗原。还提供了富集方法，这些富集方法大大减少了用于胎儿细胞识别的待分析细胞的数目。这些方法仅对每10⁶至10⁷个细胞总数20至30个载玻片进行分析，并能够实现对每毫升母体血液样品中0.1至1.1个胎儿细胞的一致性识别。

被细胞覆盖的载玻片面积典型地是15毫米×15毫米，这进一步增强了方法的效率。

杂交探针

在“发明概述”部分中，本发明第一实施方式描述的方法的步骤b和d的杂交探针是本领域通常使用的，且典型地是DNA或RNA，优选DNA。在优选的实施方式中，所述探针用提高结合亲和性和/或结合特异性的非天然核苷酸来修饰。这种非天然的核苷酸的优选实例是LNA（锁核酸）、TINA（扭转嵌入核酸）、PNA（肽核酸）、INA（嵌入核酸）、吗啉代RNA单体和诸如2'氧-甲基RNA的单体和2'氧-（2-甲氧基乙基）RNA的2'氧取代的RNA单体。

探针的长度可以是任意合适的长度，例如在10至200个核苷酸的范围内，优选10至30个核苷酸，更优选15至25个核苷酸，并且优选地，所述探针在探针的整个长度上与编码以下蛋白质的基因完全互补：人细胞角蛋白1、2、3、4（SEQ ID NO：3）、5（SEQ ID NO：4）、6A（SEQ ID NO：5）、6B（SEQID NO：6）、7（SEQ ID NO：7）、8（SEQ ID NO：8）、10（SEQ ID NO：9）、13（SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11）、14、15、16、17、18（SEQID NO：12和SEQ ID NO：13）和19、CD105（SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2）和/或人波形蛋白。

在一种实施方式中，探针在探针的整个长度上至少85％互补于编码表1至3（优选表2）所述的任意蛋白质的基因，例如至少90％互补，例如至少95％互补。探针可以互补于编码所述蛋白的DNA或mRNA。

在一种实施方式中，所述探针在探针的整个长度上至少85％互补于编码以下蛋白的基因：人细胞角蛋白1、2、3、4（SEQ ID NO：3）、5（SEQ ID NO：4）、6A（SEQ ID NO：5）、6B（SEQ ID NO：6）、7（SEQ ID NO：7）、8（SEQ ID NO：8）、10（SEQ ID NO：9）、13（SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11）、14、15、16、17、18（SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13）和19、CD105（SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2）和/或人波形蛋白，例如至少90％互补，例如至少95％互补。探针可以互补于编码所述蛋白的DNA或mRNA。

在一种优选的实施方式中，所述探针在整个探针长度上完全互补于编码CD105的基因（SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2）。在另一优选的实施方式中，所述探针在整个探针长度上完全互补于编码CK18（SEQ ID NO：12和SEQID NO：13）的基因。

在一种实施方式中，“发明概述”部分中本发明第一实施方式描述的方法的步骤b中使用的杂交探针可选自与编码选自以下组的蛋白质的核苷酸杂交的杂交探针：所述组由以下蛋白质组成：CD105、波形蛋白、VCAM、ICAM、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、PAI-1和EPCR。最优选的是CD105（SEQID NO：1和SEQ ID NO：2）。

在一种实施方式中，第一实施方式描述的方法的步骤d中使用的杂交探针可以选自与编码选自以下组的蛋白质的核苷酸杂交的杂交探针：所述组由以下蛋白质组成：CK1、CK2、CK3、CK4、CK5、CK6、CK7、CK8、CK10、CK13、CK14、CK15、CK16、CK17、CK18和CK19。

最优选的是CK18（SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13）。

报告染料

“发明概述”部分中描述的发明第一实施方式所描述的方法的步骤b中，根据本发明使用的杂交探针和配体可包括或优选连接到报告染料（在本文中也称为标记）。所述杂交探针或配体优选共价连接到报告染料。报告染料优选是荧光报告染料。优选地，报告染料选自由FAM^TM、TET^TM、JOE^TM、VIC^TM、6FAM、HEX、TET、TAMRA、JOE、ROX、荧光素、CY3、CY5、CY5.5、德克萨斯红、罗丹明、罗丹明绿、罗丹明红、6-羧基罗丹明6G（6-Carboxy Rhodamine6G）、Alexa Fluor、Oregon Green488、Oregon Green500和Oregon Green514组成的组。

在一种实施方式中，杂交探针还包括猝灭染料。在优选的实施方式中，猝灭染料选自由TAMRA^TM、黑洞猝灭剂^TM（Black Hole Quencher^TM）、DABCYL、BHQ-1、BHQ-2、DDQ I，DDQ II和Eclipse暗淬灭剂（Eclipse Dark Quencher）组成的组。

报告和淬灭染料的使用是合乎需要的，因为除了识别，它们还允许各种的量化。

典型地，报告染料和淬灭染料在杂交探针中位置彼此靠近，使得由报告子发出的光或激光诱导的荧光被淬灭染料淬灭。当寡核苷酸结合到互补的模板链时，报告染料与淬灭染料彼此分离，使得淬灭子不再淬灭来自报告子的信号，即能够检测到杂交。

因此，在一种实施方式中，杂交探针能够形成茎环(stem-loop)结构，其中淬灭染料和报告染料被引入茎附近。在一种实施方式中，所述寡核苷酸是所谓的分子信标。当分子信标碱基与模板链配对时，淬灭子和报告子不再靠近。因此，来自报告染料的激光诱导信号不再被淬灭。

也可采用包括供体荧光团和受体荧光团的所谓FRET（荧光共振能量转移）对来代替使用报告染料和淬灭染料。当供体荧光团被外部光源激发时，它发出具有激发受体荧光团的波长的光，所述受体荧光团继而发出能够被检测和测量的不同波长的光。如果供体荧光团和受体荧光团紧邻，能量仅从供体转移到受体。

优选的FRET对包括BFP-YFP、CFP-YFP、GFP-DsRed、GFP-Cy3、GFP-mOrange、YFP-RFP、FAM-ROX、FAM-CY5、FAM-Hex、FAM-TAMRA和Cy3-CY5。

在本发明的一种实施方式中，第一实施方式描述的方法的步骤b中采用的杂交探针和配体优选连接到报告染料，所述报告染料不同于连接到相同方法的步骤d中使用的杂交探针上的报告染料。

配体

在第一实施方式中描述的方法的步骤b和d中采用的配体优选是抗体、肽或适体（aptamer）。用于本发明的方法的配体主要结合目的的细胞，优选比结合其他细胞具有更高的亲和性。因此，优选地，配体主要结合于所述内皮细胞标记物或所述上皮细胞标记物。

配体可以是适体。适体是基于核酸的结合诸如蛋白质的抗原的高亲和性配体。典型地使用诸如SELEX（指数富集的配体系统进化）的体外进化技术来识别所述适体。在SELEX中，采用来自初始文库的核酸选择和扩增的迭代轮，以识别高亲和性的适体。由于初始文库非常大（例如10¹⁴个不同的序列）并且在迭代轮过程中序列可能突变，所以现在在常规基础上能够做到对高亲和性适体的识别，且技术人员已知这样的方法。优选的适体长度小于50个核苷酸。

可利用噬菌体展示技术产生高亲和性的肽。在噬菌体展示技术中，对照目标选择展示肽的噬菌体文库，并且随后在类似于SELEX的进化过程中扩增。存在各种用于噬菌体展示的系统，并且可选择肽的尺寸以适应特定的需要。在一种实施方式中，用于本发明的方法的肽具有小于50个氨基酸的尺寸。

通常，以骨架（scaffold）形式，例如抗体骨架，来展示文库。因此，噬菌体展示技术可用来识别高亲和性抗体。用于产生抗体的其他体外进化技术包括mRNA展示、核糖体展示和共价DNA展示。

配体也可以是抗体。根据本发明的抗体是能够辨识和结合包括至少一个抗原结合位点的抗原的多肽或蛋白。所述抗原结合位点优选包括至少一个CDR。所述抗体可以是天然存在的抗体、天然存在抗体或合成抗体的片段。

术语“天然存在的抗体”是指能够辨识和结合抗原的异四聚糖蛋白，所述异四聚糖蛋白包括通过二硫键互连的两条相同的重链（H）和两条相同的轻链（L）。每条重链包括重链可变区（本文缩写为V_H）和重链恒定区（本文缩写为C_H）。每条轻链包括轻链可变区（本文缩写为V_L）和轻链恒定区（本文缩写作为C_L）。V_H和V_L区能够被进一步细分成超变区，称为互补决定区（complementarity determining regions，CDR），所述互补决定区穿插着较保守的区域，称之为框架区（FR）。抗体可包括几个相同杂四聚体。

还可利用诸如小鼠、大鼠、羊、兔、马等的合适的动物免疫来产生抗体。

用于本发明的抗体可以是单克隆或多克隆的。产生这两种类型的抗体的方法对于本领域技术人员而言是公知的。除了以上概述的体外进化方法，典型地采用杂交瘤技术制备单克隆抗体。

在优选的实施方式中，配体是辨识和结合选自以下组的抗原的抗体或适体，所述组由下列物质组成：CK1、CK2、CK3、CK4、CK5、CK6、CK7、CK8、CK10、CK13、CK14、CK15、CK16、CK17、CK18、CK19、CD105、波形蛋白、VCAM、ICAM、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、PAI-1、EPCR、CD9、ITGA5、ITGB5、CDH11、CDH3、CPM、CD39、CD200、EPHB4和PAR-1。

在优选的实施方式中，“发明概述”部分中发明的第一实施方式所描述的方法的步骤b中使用的配体选自由下列物质组成的组：CD105、波形蛋白、VCAM、ICAM、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、PAI-1和EPCR。

最优选的是CD105（SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2）。

在优选的实施方式中，“发明概述”部分中发明的第一实施方式所描述的方法的步骤d中使用的配体选自由下列物质组成的组：CK1、CK2、CK3、CK4、CK5、CK6、CK7、CK8、CK10、CK13、CK14、CK15、CK16、CK17、CK18和CK19。

最优选的是CK18（SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13）。

配体的特异性

优选地，用于第一实施方式中描述的方法的步骤b和d的配体特异性地与胎儿细胞结合。当涉及特异性时，其意思是相比于母体细胞，该配体对胎儿细胞有较高的结合亲和性。结合亲和性可用解离常数（kd）表示，特异性是给定配体对于母体细胞的kd与相同配体对于胎儿细胞的kd之间的比率。即，配体对于母体细胞可具有10^-5M的kd而对于胎儿细胞具有10^-9M的kd。在此情况下，特异性将是10,000。然而，由于胎儿细胞和母体细胞不必是均匀的群体，特异性也可用能够以给定的配体实现的富集倍数来表示（如下面进一步描述）。

在优选的实施方式中，由下文中描述的本发明的方法来产生配体。即，优化配体的特异性。

优选地，所述方法进一步包括识别样品的胎儿细胞的步骤和/或富集样品的胎儿细胞的步骤。在优选的实施方式中，富集的步骤在识别的步骤之前实施。

富集和/或识别之后，通常实施检测步骤和预测和/或诊断步骤。

识别

当所述方法包括识别步骤时，一种实施方式包括检测胎儿细胞上或中的配体或杂交探针的存在（第一实施方式描述的方法的步骤e）。

通过用荧光染料或适用于检测的其他染料标记配体或杂交探针，能够进行检测。因此，所述方法可以是例如荧光原位杂交（FISH）。如上所述，探针可包括能够检测与其靶序列结合的杂交探针的淬灭子以及荧光团或FRET对。可替代地或另外地，通过一个或多个洗涤步骤，将与其靶结合的探针从未结合的探针中分离。

也可利用使用诸如抗体的配体的免疫染色来完成识别。

可使用多色FISH或多色免疫染色来进行识别。即，可同时使用具有不同荧光标记的不同杂交探针，或者可同时使用具有不同荧光标记的两种（或更多种）不同抗体。它们可均特异于胎儿细胞，或者可一种特异于胎儿的细胞，而另一种特异于母体细胞。

在一种实施方式中，可将被识别的胎儿细胞进行激光捕获显微切割（LCM）。

富集

在优选的实施方式中，在母体样品已与配体或杂交探针之后，实施配体依赖性或杂交探针依赖性的富集步骤，即“发明概述”中本发明第一实施方式描述的方法的步骤c。在一种实施方式中，也可在第一实施方式描述的方法的步骤d之后实施富集。就富集而言，配体优于杂交探针。

在本发明第一实施方式描述的方法的步骤c中采用的配体优选连接至金属分子，例如磁珠。

当涉及富集时，其意思是提高样品的胎儿细胞与母体细胞的比例。富集倍数优选高于1000倍，甚至更优选高于10,000倍，最优选高于100，000倍。

在另一实施方式中，富集倍数选自由高于10倍、高于100倍、高于1000倍、高于10,000倍、高于100,000倍和高于1,000,000倍组成的组。

富集的基础是在胎儿细胞中优先表达的被识别mRNA和被所述mRNA编码的蛋白质。

本领域技术人员将清楚，现有技术中已知的基于配体（或抗原）的其他抗原依赖性富集步骤也可以实施。这种现有技术中已知的抗原的实例有：CD34、Tra、Oct1、Crypto1、SSEA1、CD29、CD33、CD146和CD166。

如上面涉及例如CD105中所述，也可在母体样品已接触配体或杂交探针之前实施富集步骤，即第一实施方式描述的方法的步骤b之前。

基于流的分选

在优选的实施方式中，使用荧光激活细胞分选（FACS）进行富集。因此，荧光标记配体，以允许FACS。FACS和合适的标记对本领域技术人员而言是公知的，并且上文已经给出了实例。

作为FACS的替代，也可采用微流动装置细胞分选。

固定

在另一优选的实施方式中，采用配体固定来进行富集。“发明概述”中本发明的第一实施方式所描述的方法的步骤b和/或d中采用的配体可例如，固定于诸如磁珠、琼脂糖凝胶（sepharose）珠、琼脂糖（agarose）珠等的珠子上。当配体和与所述配体结合的细胞被固定时，未结合的细胞可从珠子上洗去。可分批或在柱子上实施这种洗涤过程。在富集（分级）之后，使用高或低的盐、可裂解连接物、低或高pH值、变性剂等能够洗脱结合的细胞。更优选地，利用具有可溶性抗原或二次配体的竞争性洗脱来洗脱结合的细胞，所述二次配体结合到胎儿细胞特异性的配体，例如，针对用于固定的配体的固定部分的抗体。

一种优选的富集方法是MACS（免疫磁珠细胞分选），其中在磁珠上固定配体。即，通过利用磁性选择颗粒，能够使与配体结合的细胞从未结合物中分离。

在优选的实施方式中，利用固定在磁珠上的CD105来实施第一实施方式所描述的方法的步骤b中的富集。

使用抗原的阴性选择

在一种实施方式中，也可使用特异性结合母细胞的配体来富集。因此，在优选的实施方式中，所述方法进一步包括以下步骤：将样品与针对母体抗原的母体细胞特异性配体接触。该步骤可在任何适合的时候实施，例如在第一实施方式所描述的方法的步骤b之前。在样品与母体细胞特异性配体接触之后，可使用例如如上所述的FACS、MACS、微流动技术（microfluidics）或固定化来进行富集。

优选地，所述配体选自由与这样抗原结合的配体组成的组：所述抗原由优先在母体细胞中而不在胎儿细胞中表达的mRNA所编码，如本发明人所识别。

本领域技术人员将清楚，也可采用现有技术中已知的基于配体（或抗原）的其他抗原依赖性富集步骤（阴性选择）。因此，在一种实施方式中，当配体选自由与现有技术已知的母体特异性抗原结合的配体，例如CD45、HLA-A、HLA-B组成的组时，或由HLe-1、M3和L4组成的组的抗体时，实施其他的抗原依赖性的富集步骤。

用于阴性选择的优选的细胞型标记物是一种也被称为白细胞共同抗原的CD45。CD45是一种跨膜蛋白，由除红细胞和浆细胞外的所有分化的造血细胞表达。CD45蛋白以不同的形式存在，所有的这些形式都产生于单个复杂基因，所述复杂基因产生八种不同的成熟mRNA且导致8种不同的蛋白质产物。CD45蛋白质在所有白细胞上表达但不在其他细胞上表达，因此用作泛白细胞（panleukocute）标记物，所述泛白细胞包括诸如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞（B和T细胞）、单核细胞和巨噬细胞的不同且多样种类的白细胞（或白血细胞）。

由于CD45在存在于母体血液中的大多数有核细胞上CD45上表达，所以优选利用CD45标记物的阴性选择。在减除（depletion）CD45阳性细胞之后，收集样品的CD45阴性细胞。可通过本领域中已知的任何合适的方法实施这种减除和收集。

在一种实施方式中，在任何合适的时间点使用CD45标记物复染存在于母体血液样品中或其片段中的细胞，从而识别存在于样品中的母体细胞。然后可收集样品的CD45阴性细胞。可使用本领域中已知的任何合适的方法实施这种复染和收集。

HLA

人类白细胞抗原，即人类主要组织相容性复合体（MHC）的一部分，负责细胞表面抗原呈递的蛋白质和许多其他的基因。

存在两类人类白细胞抗原，I类抗原（A、B和C）和Ⅱ类抗原（DR、DP和DQ），它们具有不同的功能。这两类都包括大量的可变等位基因。

不被胎儿细胞表达的HLA基因可用于减除样品中的母体细胞。即，可将第一实施方式所描述的方法的步骤a中存在的母体血液样品或其一部分经受针对HLA基因的抗原。

其他富集方法

也可以采用不使用抗原特异性配体的其他富集方法。

一种优选的其他富集方法是红细胞裂解，例如NH₄Cl介导的裂解，它允许对红细胞选择性的裂解而使有核细胞完好无损。本领域技术人员已知此方法。在优选的实施方式中，红细胞裂解在第一实施方式所描述的方法的步骤b之前实施。对于NH₄Cl介导的裂解，优选使用浓度为0.1至0.2mM的NH₄Cl，例如0.14至0.18mM的NH₄Cl，更优选0.15至0.17mM的NH₄Cl。

此外，本文如上所述的固定和选择性裂解方法也可用于富集。

也可以基于尺寸或密度对样品进行初步分离，如通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心法。这导致产生：含有血小板的上清液层；单核细胞层；以及含有非成核红细胞和粒细胞的凝集颗粒。将单核层与其他层分开，以生产富集了胎儿细胞的母体样品。

也可利用细胞的物理性质来富集，例如但不是排他的，电荷。

沉降

可通过沉降富集存在于血液样品中的细胞，其中存在于样品中的大多数细胞可沉降。可在沉降前用诸如0.15M的氯化钠的合适的溶液稀释血液样品。沉降可持续到已出现全部沉降，例如持续至少5个小时，或优选过夜。

优选地，在低于室温的温度下使样品沉降，例如在低于15°C的温度下，例如低于10°C或8°C或6°C，优选在2至8°C的温度下或约4°C的温度下。

具有低密度的少数细胞群不会沉降，并可通过所描述的温和的预先固定来分离，例如在0.5％多聚甲醛中，然后离心。

结合配体与富集方法

将理解的是，可以将各种配体与富集方法结合。因此，可同时或接续采用1、2、3种或更多种的针对具内皮细胞表型（即内皮细胞标记物）的胎儿细胞特异性配体。同样，可采用使用各胎儿细胞特异性配体和母体特异性配体的迭代富集。

样品

为了增加胎儿细胞的总数，希望获得尽可能多的母体血液样品。因此，在第一实施方式描述的方法的步骤a中的母体血液样品大小优选在0.5至50毫升的范围内，例如在1至40毫升的范围内，例如5至35毫升或10至30毫升。

提供的母体血液样品优选从妊娠5至24周或6至20周的孕妇处获得，更优选妊娠7至16或8至12周。

稀释-浓度

此外，根据本发明，可在方法过程中的任何时候稀释或富集样品。可通过加入等渗缓冲液将样品稀释至少1.5倍，例如两倍，更优选至少三倍，例如五倍，所述等渗缓冲液例如盐溶液、磷酸盐缓冲盐溶液、PBS和/或合适的生长培养基，例如基础培养基、组织生长培养基。方法的步骤可包括通过加入为具体方法步骤而分配的各种成分来稀释样品。

对实施所述方法而言，为了不同方法步骤的可行性，浓缩样品，例如减小体积而不去除任何细胞可能是有利的。样品的体积可减小至小于原始样品体积的80％，例如70或60％或50％，或甚至优选小于原始样品体积的40％，例如25％。浓缩步骤可以是离心。所述方法根据本发明可包括一个或多个浓缩步骤。离心是用于浓缩细胞的优选方法。为了避免损害细胞，优选温和的离心，例如以300g离心10分钟。

检测和诊断

优选地，本发明的方法可用于产前检测和预测和/或诊断（即第一实施方式中描述的方法的步骤e和f）。因此，可对被识别的细胞进行检测和预测和/或诊断，或可对富集了胎儿细胞的母体血液样品进行检测和预测和/或诊断。

在一种实施方式中，使胎儿蛋白质可用于检测，例如，通过免疫印迹法，蛋白质测序或质谱法。

在另一优选的实施方式中，检测和/或诊断包括使胎儿的DNA或RNA可用于检测步骤。

第一实施方式所描述的方法的步骤e的优选检测方法是FISH（荧光原位杂交）、RNA印迹法、DNA印迹法、DNA/RNA测序、微阵列分析和扩增。

可采用这样的方法来检测特定序列的存在，所述特定序列表明某种情况，例如，产前疾病或易患某种疾病。所述方法也可用于检测诸如13三体性、18三体性或21三体性的染色体非整倍体。通过检测Y特定序列，所述检测方法还能够用于确定胎儿性别。

在替代性实施方式中，将样品中的胎儿细胞的数量与标准数量相比。样品中的胎儿细胞的数量增加可表明怀孕存在风险。可使用例如FACS来估计样品中的胎儿细胞的数量（以及对照样品中的数量）。

特定配体的识别

本发明的一种实施方式是一种识别胎儿细胞特异的配体的方法，所述方法包括以下步骤：

a.提供胎儿细胞特异性配体候选物的文库

b.提供母体细胞池（pool）

c.将步骤a的文库与步骤b的母体细胞接触

d.选择没有与母体细胞结合的配体，以生成减除了与母体细胞结合的配体的文库

在优选的实施方式中，该方法进一步包括以下步骤：

e.将步骤a的文库或步骤d的文库与胎儿细胞接触

f.选择与胎儿细胞结合的配体，以生成富集了与胎儿细胞结合但不与母体细胞结合的配体的文库

应该清楚的是，一个细胞足够用于步骤f中的配体的选择，但是显然也可采用更多的胎儿细胞。

在一种实施方式中，选择被识别的特定配体，使得确保所述配体针对来自胎盘的上皮细胞。

可通过以下步骤实施步骤b至f

g.提供母体血液样品

h.将所述文库与母体血液样品接触

i.通过去除单独的胎儿细胞来选择结合到胎儿细胞的配体，并只从这些细胞中收集配体，所述胎儿细胞已由Y染色体的FISH证明识别和/或已由本发明的第五方面的方法识别。

所述母体血液样品可已经富集了胎儿细胞。

在优选的实施方式中，所述方法进一步包括：

j.增殖/扩增所选择的配体，以便制备扩增的文库，用于针对胎儿细胞和/或针对母体细胞的其他选择。

将清楚的是，可实施多轮选择和扩增，以识别最佳配体。

在另一实施方式中，如PCT/DK2010/050002的实例1描述地实施识别胎儿细胞特异性配体的方法。

胎儿细胞特异性配体候选物的文库可以是展示在噬菌体（噬菌体展示）、mRNA（核糖体展示或mRNA展示）或DNA（共价展示或质粒筛选）上的抗体或多肽的文库。所述文库也可以是用于识别适体的DNA或RNA寡核苷酸的文库。

术语“候选物”被用来暗示文库的化合物不一定与胎儿细胞结合。它们将被测试用于识别胎儿细胞特异性配体的结合。

在一种实施方式中，胎儿细胞特异性配体候选物的文库是完全随机的文库。在这种情况下，在实施针对母体细胞的反选择（阴性选择）之前，所述文库可先针对胎儿细胞进行迭代选择和扩增。

在另一实施方式中，胎儿细胞特异性配体候选物的文库是基于已知胎儿细胞的配体。这种文库可例如，通过在噬菌体上展示与胎儿细胞结合的抗体以及使编码创建文库的所述抗体的基因突变来创建。在此情况中，突变可改善特异性，同时保持或甚至提高对胎儿细胞的亲和性。

在一种实施方式中，所述配体与由选自由下列物质组成的组中的基因所编码的抗原结合：人细胞角蛋白1、4至6、8、10、13、18和19、人细胞角蛋白7和人波形蛋白。因此，使用上面列出的方法，优化了配体的亲和性和/或特异性。

胎儿细胞特异性配体和杂交探针

在本发明的一种实施方式中，本发明第一实施方式所描述的方法的步骤b的内皮细胞特异性配体和杂交探针可选自下列物质组成的组：

ⅰ）针对抗原的配体，所述抗原选自由CD105、波形蛋白、VCAM、ICAM、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、PAI-1、EPCR组成的组；和

ii）杂交探针，所述杂交探针针对包含至少10个基因核苷酸的核酸，所述基因选自由编码CD105、波形蛋白、VCAM、ICAM、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、PAI-1、EPCR的基因组成的组。

在本发明的一种实施方式中，本发明第一实施方式描述的方法的步骤d的上皮细胞特异性配体和杂交探针可选自由下列物质组成的组：

i）针对抗原的配体，所述抗原选自由人类CK1CK1、CK2、CK3、CK4、CK5、CK6、CK7、CK8、CK10、CK13、CK14、CK15、CK16、CK17、CK18和CK19组成的组；以及

ii）杂交探针，所述杂交探针针对包含至少10个基因核苷酸的核酸，所述基因选自由编码CK1、CK2、CK3、CK4、CK5、CK6、CK7、CK8、CK10、CK13、CK14、CK15、CK16、CK17、CK18和CK19的基因组成的组。

在一种实施方式中，胎儿细胞特异性配体和杂交探针选自由CD105和CK18组成的组。

在一种实施方式中，所述配体或杂交探针的特征在于，它对包括99.9％的母体细胞和0.1％的胎儿细胞的测试样品能够实现90％的正确细胞选择。即，当提到90％的正确识别时，在本文中的意思是，当用配体和测试样品进行选择时，每10个母体细胞将收集90个胎儿细胞，类似解释也适用更好/更差的正确性。一种优选的选择方法是MACS。更优选的是能够实现95％正确选择的配体，98％正确选择的配体，或者甚至更优选的99％正确细胞选择的配体。由于母体血液样品具有非常低的胎儿细胞的丰度，甚至更优选的是，如上文所述，所述配体能够实现从测试样品99.9％、99.99％或99.999％正确的胞选择。

优选地，所述配体是适体、肽或抗体。最优选的是抗体。

优选使用本文上述的或在PCT/DK2010/050002中所述的方法识别配体，以便具有提高的特异性。

在本发明的一种实施方式中，采用本文上述的或在PCT/DK2010/050002中所述的方法所识别的配体或杂交探针用于富集母体血液样品中的胎儿细胞或用于识别母体血液样品中的胎儿细胞。所述配体或杂交探针的使用优选地如本文以上所述。

此外，提供了一种试剂盒，其包括如本文以上所述的配体或杂交探针以及使用说明。

优选地，所述试剂盒包括用于富集的第一配体，和用于识别的第二配体和/或杂交探针。更优选地，所述试剂盒包括：作为内皮细胞标记物的第一配体以及作为上皮标记物的第二配体和/或杂交探针。内皮细胞标记物用于富集胎儿细胞，而上皮细胞标记物用于识别存在于样品中的含有内皮细胞和上皮细胞两者表型的胎儿细胞。

在优选的实施方式中，所述试剂盒还包括如在上文“固定和选择性裂解”部分中描述的固定缓冲液和裂解缓冲液。

在本发明的一种实施方式中，配体或杂交探针用于进一步的胎儿细胞特异性配体的识别。在此种应用的优选的实施方式中，配体和/或杂交探针用于本文上述的或在PCT/DK2010/050002中描述的方法。

本发明的一方面在于，由本文如上所述的方法识别胎儿细胞。所述细胞特征在于其对选自由下列物质组成的组的标记物的表达：人细胞角蛋白1、2、3、4（SEQ ID NO：3）、5（SEQ ID NO：4）、6A（SEQ ID NO：5）、6B（SEQID NO：6），7（SEQ ID NO：7）、8（SEQ ID NO：8）、10（SEQ ID NO：9）、13（SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11）、14、15、16、17、18（SEQID NO：12和SEQ ID NO：13）、19人波形蛋白和CD105（SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2）；并且所述细胞能够通过CD105或波形蛋白的表达，和/或CD105或波形蛋白与角蛋白的共同表达，从其他细胞中区分开。优选地，胎儿细胞已被分离的或识别，例如在本发明的其他方面所描述，且不存在于人体内。

本发明的一方面在于，由本文以上所述的方法识别的胎儿细胞的使用，用于如上文所述的检测和诊断，或用于例如在“特定配体的识别”部分中所述的产生进一步的胎儿细胞特异性配体。

另一方面在于一种试剂盒，其包含

a.

i.杂交探针，所述杂交探针包含至少10个连续核苷酸且与编码上皮细胞标记物的基因互补，或

ii.针对上皮细胞标记物的配体。

b.

i.杂交探针，所述杂交探针包含至少10个连续核苷酸且与编码内皮细胞标记物的基因互补，或

ii.针对内皮细胞标记物的配体。

以及使用说明。

产前性别确定

根据本发明分离的胎儿细胞还可用于胎儿性别的确定：要么通过使用男性特异性探针，要么通过采用由本文描述的方法识别的抗原结合成分来检测胎儿细胞，然后通过本领域技术人员已知的合适的确定性别的方法。

染色体异常的产前诊断

在确定性别的同时，本发明还涉及通过检测胎儿细胞来确定染色体异常的方法，所述方法基于根据本发明分离或识别的辨识所述胎儿细胞抗原的结合成分或抗原。这种确定染色体异常的方法涉及检测例如：非整倍体、易位、不平衡易位、重排、亚端粒（subtelometic）重排、不平衡染色体重排、不平衡亚端粒重排、缺失、倒置、不平衡倒置、重复和端粒不稳定或缩短。染色体异常可以进一步例如，单核苷酸取代、微删除、微插入、短删除、短插入、多核苷酸变化、DNA甲基化和/或印记损失（LOI）。在优选的实施方式中，染色体非整倍体是完整和/或部分的三体性，例如21三体性、18三体性、13三体性、16三体性和/或XXX和其他性染色体异常。或者，非整倍体是完整和/或部分的单体性（monosomy），诸如X单体性、21单体性、22单体性、16单体性和/或15单体性。

DNA杂交技术可用于确定性别或确定染色体异常。本领域已知的技术包括诸如荧光原位杂交（FISH）、引物原位标记（PRINS）、定量FISH（Q-FISH）和多色带（MCB）的方法。荧光原位杂交（FISH）中的荧光利用如上所述的例如荧光标记的分子探针。采用对应于基因或DNA序列的探针，所述探针在显微镜下显示在细胞核中特定的位点的信号。FISH技术可应用于间期（interphase）细胞，并可确认X染色体、Y染色体、第13号染色体、第15号染色体、第18号染色体、第21号染色体的整倍体或非整倍体的存在。FISH对于识别诸如三体和单体的染色体异常数目是有用的，并且当探针可用于染色体的特定区域时，FISH可用以确定是否存在缺失、易位、或重复。

作为以上提及的杂交技术的一种替代方法，PCR方法可用于确定染色体异常。这将需要少量胎儿细胞的初始分离。根据本发明的PCR方法包括本领域中已知的合适方法，能够检测出如三体等的异常，如上所述。可进一步采用PCR方法以确定微小的异常，如在特定基因中突变的小缺失。定量荧光PCR（QF-PCR）是适合于检测例如13三体性、18三体性、21三体性、三体、双三体，以及X和Y的非整倍体的这种方法的实例（V.Cirigliano，2004）。通过设计针对微小但依然严重的染色体异常的合适的引物，PCR方法可用于确定诸如囊性纤维化的疾病，所述囊性纤维化往往是由于囊性纤维化基因中3bp的缺失导致缺乏关键的苯丙氨酸的蛋白质所造成的。

如上所述，胎儿细胞可以是干细胞。干细胞有不同的变体（variety），这些变体与发展过程中它们何时何处产生、以及它们具有怎样的多样性有关。被检测到的胎儿干细胞可以是任何类型，例如胚胎细胞、或体细胞，多能（pluripotent）或多潜能的(multipotent)。

干细胞的利用

通过应用本文所描述的技术，利用识别根据本发明的所述胎儿细胞抗原的结合成分、抗体或抗体片段，可将胎儿干细胞从母体血液样品中分离。干细胞可以产生更多的干细胞，并且它们可以用来生成专门的细胞类型，例如神经，血液或肝细胞。根据分离的干细胞的类型，所述细胞在特定的细胞类型或组织的细胞发展中可具有不同的应用。多能干细胞可产生任何细胞类型，而多潜能干细胞可产生更有限数目的细胞类型。例如，血液形成（造血）干细胞可能够形成所有类型的血细胞，而间充质干细胞能够形成间充质细胞。

干细胞，尤其是多能干细胞可用于治疗各种疾病。多能干细胞传统地是胚胎干细胞，其由于伦理方面的考虑而具有有限的可用性。利用从母体血液样品中分离干细胞的可能性是有吸引力的替代方案。多能干细胞可用于常规方法没有提供适合治疗的多种疾病的治疗。

参考文献

Gussin HA,Sharma AK,Elias S.“Culture of endothelial cells isolated frommaternal blood using anti-CD105and CD133（使用抗CD105和CD133从母体血液中分离的内皮细胞的培养）”Prenat Diagn2004年：3月24（3）：189-93。

实例

实例1

血液样品的制备

从妊娠11至14周的孕妇处获得24毫升外周血样品。该血样是在非侵入性过程前且征得同意后抽取。所有的血液样品被采集在肝素化管中，并在它们被采集后立即进行处理。

除了肝素血液，将5毫升血液抽至EDTA管中。此血液用于胎儿性别分析。利用Y染色体特异性基因通过游离的胎儿DNA的实时PCR来确定胎儿的性别。仅对怀男胎（male pregnancy）的血液样品进行进一步处理。

固定

使用预涂覆的移液管（预涂覆缓冲液为2％BSA的PBS，w/oCa²⁺和Mg²⁺），将每个样品3毫升的全血等分进预涂覆的50毫升离心试管中（每个样品8个试管）。使用预涂覆的移液管将两毫升10％甲醛的PBS加入到每个试管中。小心混合后，在室温下固定血液10分钟。

选择性裂解

固定后，将30毫升0.12％的Triton X-100的PBS（w/o Ca²⁺和Mg²⁺）加入每个试管中。将试管倒置3次，在室温下裂解红血细胞45分钟。裂解后，将15毫升冷（4°C）的2％BSA的PBS（w/o Ca²⁺和Mg²⁺）加入每个试管中。在通过倒置试管两次混合后，通过在4°C下500g离心15分钟使未裂解的细胞形成颗粒。去除上清液之后，将细胞重新悬浮于10ml的4°C冷PBS（w/o Ca²⁺和Mg²⁺）中，储存在4°C下过夜。

渗透

通过加入10ml冷（-20°C）的甲醇，随后在4°C下孵育10分钟，使样品渗透。在500g离心10分钟后，使用预涂覆的移液管，将细胞颗粒汇集至2个试管中。用1ml冷的MASC缓冲液（PBS、0.5％BSA、2mMEDTA）冲洗空试管。然后将汇集的细胞转移到两个预涂覆的15ml的试管中，并500g离心10分钟。去除上清液之后，将每个试管中的细胞重悬于500μl的MACS缓冲液中。

使用CD105微珠和MACS的阳性选择

向500μl的细胞悬浮液加入130μl的CD105微珠（Miltenyi公司），并将细胞悬浮液在4°C下孵育60分钟。然后通过加入6毫升冷的MACS缓冲液，接着500g离心10分钟来洗涤细胞。去除上清液，将细胞重悬在2毫升冷的MACS缓冲液中。

将CD105标记的细胞悬浮液施加到预洗涤的LD柱（Miltenyi公司）上，所述LD柱放在在磁体上适当的位置，并堆叠在预洗涤的MS柱（Miltenyi公司）的顶部。当细胞流经所述LD柱时，用2ml冷的MACS缓冲液洗涤两次。用1毫升冷的MACS缓冲液洗涤MS柱。然后将所述LD柱从磁体上移除，并放置在预涂覆的15毫升试管上，再通过施加5毫升冷的MACS缓冲液2次来洗脱细胞。使第一个5ml缓冲液流经该柱而不施加柱塞。第二个5毫升的缓冲液通过施加柱塞而被迫使经过该柱。然后将MS柱从磁体上移除，并放置在收集管上。以相同的方式对LD柱洗脱细胞，但是用1毫升冷的MACS缓冲液洗脱2次代替5毫升的缓冲液洗脱2次。将收集管以500g离心10分钟。弃去上清液，将细胞颗粒重悬在冷的MACS缓冲液中。然后将细胞悬浮液放置在多聚赖氨酸涂覆的载玻片上，在进一步分析之前，将载玻片风干（过夜）。

通过X和Y染色体特异性FISH和自动扫描对男性胎儿细胞的识别

杂交前，在PBS中清洗载玻片5分钟，并分别在60％，80％和99.9％的乙醇中分别脱水3分钟。将光谱绿（spectrum green）标记的染色体特异性重复DXZ1探针CEP X alpha卫星DNA以及用光谱橙（spectrum orange）标记的DYZ1的探针CEP Y卫星III（Abbott分子公司）用于此分析。通过混合1份X探针、1份Y探针、1份蒸馏水和7份杂交缓冲液，制备含有两种探针的杂交混合物。添加15μl的杂交混合物，并用24×24毫米的盖玻片覆盖。用橡胶粘合剂密封该盖玻片，并在83.5°C下在热板上变性DNA7分钟，在42°C加湿气氛下杂交过夜。杂交后的载玻片在73°C下在0.3％Tween20的0.4×SSC中洗涤2分钟，并在室温下在0.1％Tween20的2×SSC中洗涤1分钟。然后用有DAPI的Vectashield覆盖载玻片。

使用两种不同类型的扫描仪通过自动扫描识别包含位于DAPI染色的细胞核中的红色FISH信号的细胞。MDS（5.8.0版）载玻片扫描系统最初由应用成像（Applied Imaging）公司开发，而MetaCyte扫描系统由Metasystems公司开发。利用MDS扫描系统，使用扫描功能5以20×放大率扫描载玻片。利用MetaCyte，采用内部开发和优化的分类器，以10×放大率扫描载玻片用于检测真正的光谱橙色FISH信号。扫描后，由扫描仪识别的细胞通过自动重定位（relocation）而目视检查。具有一个绿色X信号和一个明显大于X信号的橙色Y信号的细胞归为男性胎儿细胞。

男性胎儿细胞的抗体染色

胎儿细胞用与下列单独使用的抗体染色。泛细胞角蛋白（产品编号C2562，Sigma-Aldrich公司）、细胞角蛋白7（产品编号M7018，DAKO Cytomation公司）和波形蛋白（产品编号V2258，Sigma-Aldrich公司）。抗泛细胞角蛋白抗体识别人细胞角蛋白1、4至6、8、10、13、18和19。抗细胞角蛋白7抗体识别人细胞角蛋白7，而抗波形蛋白抗体识别未在人类淋巴细胞中检测到的人波形蛋白的表位。所有这三种抗体都是小鼠单克隆抗体同种型IgGl、IgG2（角蛋白）或IgM（波形蛋白）。

经风干后，载玻片在4×SSC中重新水合10分钟，然后与100μl由包含10％正常羊血清的4×SSC、1％BSA和0.5％封闭剂（Roche公司）组成的封闭缓冲液，或100μl影像增强剂（Molecular Probe公司）一起，在室温下预孵育30分钟。然后与100μl在封闭缓冲液中以1：50稀释的初级抗体一起，在室温下孵育60分钟。抗体孵育之后，将载玻片在4×SSC中洗涤3次，每次5分钟。为了检测，将载玻片与100μl在封闭缓冲液中以1：200稀释的AlexaFluor-488缀合的兔抗小鼠IgG（细胞角蛋白）或IgM（波形蛋白）（Molecular Probes公司）一起，在室温下孵育30分钟，将载玻片在4×SSC中洗涤3次，每次5分钟，然后与100μl在封闭缓冲液中以1：200稀释的AlexaFluor-488缀合的羊抗兔Ig（Molecular Probes公司）一起，在室温下孵育30分钟。在4×SSC中洗涤载玻片两次，每次5分钟，再在2×SSC中洗涤5分钟，之后，用有DAPI的Vectashield（Vector Laboratories公司）封盖载玻片。

泛细胞角蛋白染色之后的波形蛋白抗体染色

通过在4×SSC中洗涤10分钟，去除盖玻片。然后将载玻片在4×SSC中漂洗5分钟，并与100μl如上所述的封闭缓冲液或影像增强剂一起孵育30分钟。然后将载玻片与100μl在封闭缓冲液中以1：50稀释的抗波形蛋白抗体一起，在室温下孵育60分钟。抗体孵育后，将载玻片在4×SSC中洗涤3次，每次保持5分钟。为了检测，将载玻片与100μl在封闭缓冲液中以1：200稀释的AlexaFluor-555缀合的兔抗小鼠IgM抗体一起，在室温下孵育30分钟。在4×SSC中洗涤载玻片两次，每次5分钟，再在2×SSC中洗涤5分钟，之后，用有DAPI的Vectashield（Vector Laboratories公司）封盖载玻片。

将抗体染色的载玻片放置在扫描显微镜中，且通过自动重定位目视检查胎儿细胞的阳性或阴性染色结果。

实例1的实验结果

在来自怀有男性胎儿的孕妇的32个血液样品中，测试通过用CD105方案的磁性细胞分选（MACS）而富集的源自胎儿的细胞。用X和Y染色体特异性探针进行FISH，表现出一个X信号和一个比X信号显著更大的Y信号的细胞被认为是胎儿细胞（图1）。在母体血液样品中检测到每毫升血液有0.1至1.1个胎儿细胞（图2）。97％的样品呈胎儿细胞阳性。在一个血液样品中没有检测到胎儿细胞。

二十一个男性胎儿细胞使用上文描述的方案，通过以抗细胞角蛋白7、抗泛细胞角蛋白和抗波形蛋白抗体染色来表征。21个胎儿细胞中的三个用抗角蛋白7抗体染色呈阳性，14个细胞角蛋白7阴性细胞中的10个用抗泛角蛋白抗体染色呈阳性，而4个角蛋白染色呈阴性的胎儿细胞中的3个用抗波形蛋白抗体染色呈阳性。此外，4个泛角蛋白阳性细胞中的4个也表现出用抗波形蛋白抗体染色呈阳性。这些结果表明，母体血液样品基于CD105的磁性细胞分选（MACS）揭示了在母体血液中表达细胞角蛋白和/或波形蛋白的一种新的胎儿细胞类型，从而将此细胞类型与胎儿滋养细胞区别开来。

实例2

全血选择与柱内染色

采血

从妊娠11到14周的孕妇处获得30毫升外周血样品。该血样是在非侵入性过程前且征得同意后抽取。所有血液样品被采集在肝素化管或EDTA试管，并在它们被采集后4小时内进行处理。

除了肝素血液，将5毫升血液抽入EDTA管。此血液用于胎儿性别分析。采用Y染色体特异性基因，通过游离的胎儿DNA的实时PCR来确定胎儿的性别。

制备血液样品-CD105选择

向每毫升血液中加入20至50μl的CD105微珠（Miltenyi公司），并在混合样品之后，在室温下孵育30分钟。孵育之后，将血液样品等分到6个预涂覆的50毫升试管（预涂覆缓冲液是2％BSA的PBS w/oCa²⁺和Mg²⁺）中，并且在4°C下以445g离心12分钟之前，将20毫升的MACS缓冲液添加到每个试管中。去除上清液，添加MACS缓冲液至最终体积为7.5毫升。使用预涂覆移液管小心混合之后，将CD105标记的全血以3毫升血液为一等份施加至2个预清洗的全血柱上。当血液流经所述柱后，所述柱用4ml的MACS缓冲液洗涤两次，从磁体上移除所述柱，并放置在预涂覆的15毫升的试管上，使用5ml全血柱洗脱缓冲液（Miltenyi公司）通过柱塞从所述柱上洗脱细胞。在4°C下以445g离心12分钟之后，弃去上清液，并使用预涂覆的移液管将细胞颗粒重悬于500μl的PBS中。

固定和渗透

在加入500μl的inside fix（Miltenyi公司）之后，固定细胞20分钟。在固定之后，加入10毫升的MACS缓冲液，并将试管在4°C下以500g离心10分钟。然后弃去上清液，将细胞颗粒重悬于500μl的MACS缓冲液中。用500μl的冰冷的甲醇渗透细胞，并在4°C下孵育10分钟。然后将细胞施加至已放置在磁体中的预清洗的MS柱（Miltenyi公司）上。在细胞悬浮液完全进入所述柱后，通过对所述柱施加500μl的MACS缓冲液来洗涤细胞。

MS柱内的细胞染色

用以下抗体的鸡尾酒染色胎儿细胞。泛细胞角蛋白（产品编号C2562，Sigma-Aldrich公司）、细胞角蛋白7（产品编号M7018，DAKO Cytomation公司）和细胞角蛋白8/18（产品18.0213，Invitrogen公司）。抗泛细胞角蛋白抗体识别人类细胞角蛋白1、4至6、8、10、13、18和19。抗细胞角蛋白7抗体识别人细胞角蛋白7，而抗细胞角蛋白8/18识别细胞角蛋白8/18。所有这三种抗体都是小鼠单克隆抗体同种型IgGl、IgG2。

在抗体染色之前，在施加了500μl的影像增强剂（Molecular probe公司）之后，在室温下预孵育柱10分钟，然后通过施加500μl的MACS缓冲液洗涤一次。然后在施加了200μl在封闭缓冲液中以1：50稀释的细胞角蛋白的鸡尾酒之后，在室温下孵育柱30分钟，所述封闭缓冲液由含10％正常羊血清的4×SSC、1％BSA和0.5％的封闭剂（Roche公司）组成。在抗体孵育后，用500μl的MACS缓冲液洗涤所述柱3次。为了检测，柱与用200μl在封闭缓冲液中以1：50稀释的AlexaFluor-488缀合的羊抗小鼠IgG F(ab)2片段（Invitrogen公司）一起，在室温下孵育30分钟，用500μl的MACS缓冲液洗涤3次，然后与用200μl在封闭缓冲液中以1：50稀释的AlexaFluor-488缀合的兔抗羊IgG抗体F(ab）2片段（Invitrogen公司），在室温下孵育30分钟。孵育后，用500μl的MACS缓冲液洗涤所述柱一次，并用500μl的w/oCa²⁺和Mg²⁺的PBS洗涤所述柱两次。然后将所述柱从磁体转移至15毫升的试管，通过施加500μl的MACS缓冲液两次且在第二次施加MACS缓冲液时使用柱塞来回收细胞。在通过在4°C下以500g离心10分钟来颗粒化这些细胞之后，将细胞颗粒重悬在PBS w/o Ca²⁺和Mg²⁺中，将细胞涂到载玻片上，并在暗处将载玻片风干过夜，然后用有DAPI的Vectashield（Vector Laboratories的）封盖载玻片。

细胞角蛋白染色的载玻片分析

细胞角蛋白染色的细胞识别

用Metasystems公司开发的MetaCyte扫描系统，通过自动扫描识别用抗细胞角蛋白抗体鸡尾酒染色的胎儿细胞。使用为检测细胞角蛋白染色的细胞而内部开发和优化的分类器，以10×放大率扫描载玻片。扫描后，通过自动重定位（relocation）目视检查由扫描仪识别的细胞。

FISH识别/验证（男性）胎儿细胞

在怀男性胎儿的情况下，通过XY FISH证实抗体染色的特异性。在杂交之前，去除盖玻片，并将载玻片在PBS中漂洗5分钟，然后分别在60％、80％和99.9％的乙醇中各脱水3分钟。此分析采用用光谱aqua（spectrum aqua）标记的染色体特异性重复DXZ1探针CEP X alpha卫星DNA，以及用光谱橙（spectrum orange）标记的DYZ1的探针CEP Y卫星III（Abbott分子公司）。通过混合1份X探针、1份Y探针、1份蒸馏水和7份杂交缓冲液，制备含有两种探针的杂交混合物。加入15μl的杂交混合物并用24×24毫米的盖玻片覆盖。用橡胶粘合剂密封所述盖玻片，并在83.5°C下的热板上变性DNA7分钟，再在42°C加湿的气氛下杂交过夜。将杂交后的载玻片在73°C下在0.3％Tween20的0.4×SSC中洗涤2分钟，并在室温下在0.1％Tween20的2×SSC中洗涤1分钟。然后用有DAPI的Vectashield封盖载玻片。

21三体性分析

在高风险怀孕（1：50或更高）的情况下，用光谱橙（Abbott公司）标记的第21号染色体特异性LSI21探针，分析细胞角蛋白染色的胎儿细胞存不存在21三体性（唐氏综合征）。用光谱aqua标记的CEP X探针与LSI21探针一起使用作为内对照。通过混合1份X探针、1份LSI21探针、1份蒸馏水和7份杂交缓冲液，制备含有这两种探针的杂交混合物。

在FISH之前，通过将载玻片在2％多聚甲醛（PFA）的PBS中洗涤10分钟，去除盖玻片。然后通过以下步骤后固定（post-fix）载玻片：在4％多聚甲醛中孵育10分钟，在PBS中洗涤2分钟，并在60％、80％和99.9％EtOH中各脱水3分钟。风干后，用不含探针的杂交混合物，按以下方式使载玻片预变性。加入18μl的杂交混合物，并用24×24毫米盖玻片覆盖。然后将载玻片放置在90°C下的热板上10分钟。去除盖玻片，将载玻片在PBS中洗涤5分钟，然后在冰冷的99.9％EtOH中洗涤10分钟。在风干之后，加入18μl包含LSI21探针和CEP X探针的杂交混合物，并用24×24毫米盖玻片覆盖。用橡胶粘合剂密封所述盖玻片，并在90°C下的热板上变性DNA10分钟，再在42°C的加湿气氛下杂交过夜。将杂交后的载玻片在73°C下在0.3％Tween20的0.4×SSC中洗涤2分钟，并在室温下在0.1％Tween20的2×SSC中洗涤1分钟。然后用有DAPI的Vectashield封盖载玻片。使用原始的扫描文件，通过重定位（re-location）进行染色胎儿细胞中第21号染色体FISH信号的点查（enumerationg）。图6示出非侵入性产前诊断21三体性（唐氏综合征）的情况。

Claims

1.一种分离母体血液样品中的胎儿细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

a.提供母体血液样品或其一部分，

b.将所述样品与包含至少10个连续核苷酸且与编码内皮细胞标记物的基因互补的杂交探针接触，或与针对内皮细胞标记物的配体接触，

c.选择特异于所述内皮细胞标记物的细胞，从而富集样品中具内皮细胞表型的细胞，

d.将在步骤c中选择的显示内皮细胞表型的细胞与包含至少10个连续核苷酸且与编码上皮细胞标记物的基因互补的杂交探针接触，或与针对上皮细胞标记物的配体接触，以及

e.检测具内皮细胞表型而且还结合步骤d的所述上皮细胞标记物的细胞，

其中步骤b至e以任意顺序实施，并且其中所述内皮细胞标记物选自由CD105、CD146或CD141、波形蛋白、VCAM、ICAM、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、ITGA5、ITGB5、CDH11或CDH3组成的组，所述上皮细胞标记物选自由CK1、CK2、CK3、CK4、CK5、CK6、CK7、CK8、CK9、CK10、CK10、CK13、CK14、CK15、CK16、CK17、CK18或CK19组成的组。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述内皮细胞标记物的靶位于待识别的细胞的表面。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述上皮细胞标记物的靶位于待识别的细胞的细胞内。

4.一种包括以下步骤的方法：

a.提供母体血液样品或其一部分，

b.将所述样品与下列物质接触

i包括至少10个连续核苷酸且与编码内皮细胞标记物的基因互补的杂交探针，或

ii针对内皮细胞标记物的配体，

c.选择与之前步骤的所述杂交探针或配体结合的细胞，由此富集样品中的与之前步骤的所述杂交探针或配体结合的细胞，以及

d.将经富集的所述样品与下列物质接触

ii针对上皮细胞标记物的配体，

其中所述内皮细胞标记物选自由CD105、CD146或CD141、波形蛋白、VCAM、ICAM、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、ITGA5、ITGB5、CDH11或CDH3组成的组，所述上皮细胞标记物选自由CK1、CK2、CK3、CK4、CK5、CK6、CK7、CK8、CK9、CK10、CK10、CK13、CK14、CK15、CK16、CK17、CK18或CK19组成的组。

5.如权利要求4所述的方法，进一步包括识别所述样品中的胎儿细胞的步骤。

6.如权利要求5所述的方法，其中识别包括检测在所述胎儿细胞上或内所述针对上皮细胞标记物的配体或针对上皮细胞标记物的杂交探针的存在。

7.如前述权利要求的任一项所述的方法，其中所述母体血液样品是全血。

8.如前述权利要求1-6的任一项所述的方法，其中在所述选择/富集步骤之后，对所述样品中的细胞进行固定步骤。

9.如前述权利要求8的任一项所述的方法，其中在所述固定步骤之后，并在所述样品中的细胞与针对所述上皮细胞标记物的配体或杂交探针接触之前对所述样品中的细胞进行渗透。

10.如前述权利要求1-6的任一项所述的方法，其中所述内皮细胞标记物选自由CD105、CD146或CD141组成的组。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述内皮细胞标记物是CD105。

12.如前述权利要求1-6的任一项所述的方法，其中所述上皮细胞标记物选自由CK8、CK18、CK19或CK7组成的组。

13.如前述权利要求1-6的任一项所述的方法，进一步包括将所述样品与M30抗体接触。

14.一种试剂盒，包括：

a.

i.杂交探针，所述杂交探针包含至少10个连续的核苷酸且与编码上皮细胞标记物的基因互补，或

ii.针对上皮细胞标记物的配体，

b.

i.杂交探针，所述杂交探针包含至少10个连续的核苷酸且与编码内皮细胞标记物的基因互补，或

ii.针对内皮细胞标记物的配体，和

c.使用说明，