CN111122520A - 一种胚胎植入检测试剂盒及其应用和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种胚胎植入检测试剂盒及其应用和使用方法。公开了子宫蜕膜NK细胞Siglec‑7为检测指标在胚胎检测试剂盒中的应用，通过检测子宫蜕膜样本中子宫蜕膜NK细胞Siglec‑7作为检测指标。所述试剂盒包括缓冲液、固定剂、脱水剂、包埋剂、脱蜡剂、抗原修复剂、荧光试剂、一抗、二抗、复染液和封片剂。使用本发明所述检测工具对胚胎植入能力进行检测，能够对子宫内膜胚胎植入能力做进一步的评估。为临床不明原因性自然流产女性患者提供可能的检测及临床诊断方式，为探讨不明原因性自然流产患者未揭示的影响因素提供了有力的参考。
Description
技术领域
本发明涉及试剂盒及其应用，尤其涉及以子宫蜕膜NK细胞Siglec-7为检测指标的胚胎植入检测试剂盒及其应用和使用方法。
背景技术
反复性自然流产发病率在妊娠中的发病率在1%-5%，病因复杂。除了染色体异常，内分泌疾病，生殖道异常等原因外，仍有70%反复自然流产原因不明。常规影像学和形态学检测无法揭示子宫内膜的功能性状态。
国家知识产权局于2017年09月22日公开了申请号为CN201710649484.6，名称为一种用于胚胎植入前染色体异常检测的方法及试剂盒的发明专利，具体的，通过改进单细胞扩增方法，优化传统的文库构建的步骤，提高检测准确度，降低了染色体核型和CNV的假阳性率。
国家知识产权局于2017年10月20日公开了申请号为CN201710569713.3，名称为胚胎植入前染色体异常检测试剂盒的发明专利，公开了一种胚胎植入前染色体异常检测试剂盒，由单细胞扩增试剂、片段化试剂、文库构建试剂、DNA纯化试剂和阴阳性质控品组成。本发明还公开了前述试剂盒的检测方法。与现有技术相比，本发明建立了一种利用胚胎囊胚期细胞进行植入前染色体检测的方法，采用了创新型的单细胞扩增技术，提高了单细胞扩增均一性(≥97％)和覆盖度(≥92％)，具有检测快速、覆盖度广、分辨率高、精准度高和通量适中的优势。
目前研究发现，反复性不明原因流产主要与母胎面免疫耐受异常有关。针对母胎面免疫耐受异常的检测，目前没有高效、准确的检测方式。
发明内容
本发明旨在解决现有技术没有针对母胎面免疫耐受异常如何检测的问题，提出了以子宫蜕膜NK细胞Siglec-7为检测指标的胚胎植入检测试剂盒及其应用和使用方法，通过Siglec-7的表达检测，该试剂盒能够快速地对母胎面免疫耐受异常进行检测。
为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
本发明首次将子宫蜕膜NK细胞Siglec-7作为检测指标，特定的应用到胚胎植入检测试剂盒中，得到胚胎植入检测试剂盒通过检测子宫蜕膜组织样本中Siglec-7活性作为判断胚胎植入能力的依据。
该试剂盒通过检测子宫蜕膜样本中子宫蜕膜NK细胞Siglec-7作为检测指标。
该胚胎植入检测试剂盒包括对子宫蜕膜NK细胞Siglec-7表达进行检测的试剂。
本发明所述试剂盒包括阳性对照、阴性对照、缓冲液、固定剂、脱水剂、包埋剂、脱蜡剂、抗原修复剂、荧光试剂、一抗、二抗、复染液和封片剂。
本发明所述阳性对照为阳性对照为Siglec-7高表达的异常子宫蜕膜组织，所述阴性对照为Siglec-7低水平的正常子宫蜕膜组织。
本发明所述的低水平是指近乎没有阳性表达，或有少量可忽略的阳性表达。
本发明所述试剂盒包括PBS缓冲液、PBST缓冲液 、PBT缓冲液、4%多聚甲醛、四氢呋喃、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、柠檬酸钠、柠檬酸、30%H2O2、牛血清白蛋白和DAPI。
上述试剂的配制方法为：柠檬酸钠 3g,柠檬酸 0.4g加入1000ml蒸馏水；H2O2常规保存浓度为30%，密封避光保存，使用时需自行配制：2ml 30% H2O2 加入18ml蒸馏水中，现配现用；牛血清白蛋白为粉末，4℃保存，使用时需自行配制：PBT溶解0.3g BSA，最终用PBT定容到10ml， PBT=0.1% Triton X-100 in PBS；DAPI-20℃保存，使用时需1:50，in PBS配置。
本发明还提出了胚胎植入检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
X1.样本预处理；
X2.脱水；
X3.包埋；
X4.石蜡切片；
X5.烘片和烤片；
X6.脱蜡复水；
X7.抗原修复；
X8.去除内源性酶；
X9.封闭；
X10.一抗孵育和二抗孵育；
X11.复染；
X12.封片，并与阳性对照和阴性对照比较。
本发明所述样本预处理为：取子宫蜕膜组织样本5～15g，弃去子宫蜕膜表面的绒毛；再用PBS缓冲液洗2～3次后，置于4%多聚甲醛中固定8～12h。
本发明所述脱水为：将X1中处理得到的样本依次经过纯水2h、50%乙醇2h和75%乙醇进行脱水。
本发明所述包埋为：采用体积比为1:1的75%乙醇和四氢呋喃对X2中处理得到的样本进行脱水处理后,常规包埋。
本发明所述石蜡切片为：将X3得到的样本切成3～6μm厚度的薄片。
本发明所述烘片和烤片为：将X4中得到的3～6μm厚度的薄片依次在37℃和65℃的体系中各放置8～12h。
本发明所述脱蜡复水：将X5中的薄片依次经过二甲苯Ⅰ脱蜡10～15min、二甲苯Ⅱ脱蜡10～15min；然后再依次经过100%乙醇Ⅰ复水2～5min、100%乙醇Ⅱ2～5复水min、90%乙醇Ⅰ复水2～5min、90%乙醇Ⅱ复水2～5min、70％乙醇复水2～5min；最后在蒸馏水复水两次，每次2～5min。
本发明所述抗原修复为：取抗原修复盒，并向抗原修复盒中加入0.01mol/L柠檬酸钠，其pH为6.0；作抗原修复。
本发明所述去除内源性酶为：将X6处理得到的薄片放入湿盒，加3%H2O2，室温孵育10分钟，PBS缓冲液洗3～5次，每次5～10min， 0.1%Triton X-100通透10min，PBST缓冲液洗3～5次，每次5～10min。
本发明所述封闭为：向湿盒中加3%BSA，室温孵育封闭30～45min。
本发明所述一抗孵育和二抗孵育为：Purified anti-human CD3284℃中保持8～12h，然后取出复温45分钟，PBST缓冲液洗3～5次，每次5～10min； Mouse594室温或4℃孵育1～2h； PBST缓冲液洗3次，每次5～10min。
本发明所述复染为：用荧光试剂对细胞核进行染色，室温5分钟；PBST缓冲液洗3～5次，每次5～10min。
本发明所述封片观察为：封片后进行观察，观察染色程度，再结合阳性对照和阴性对照的结果，判断待测样本是否母胎面免疫耐受异常。
本发明带来的有益效果有：
（一）本发明为检测胚胎植入能力提供了一种新型检测工具，提供新的用于评价胚胎植入能力的检测方法。不明原因性流产患者子宫内膜样本组织切片荧光染色Siglec-7阳性率较正常水平明显增高，提示该患者内膜状态不利于胚胎植入。
（二）本发明为检测胚胎植入能力提供了一种新的检测指标，提出了将siglec-7作为检测指标在胚胎植入检测试剂盒中的应用。通过对siglec-7表达的检测，能够对子宫内膜胚胎植入能力做进一步的评估。为临床不明原因性自然流产女性患者提供可能的检测及临床诊断方式，为探讨不明原因性自然流产患者未揭示的影响因素提供了有力的参考。
（三）本发明通过检测子宫蜕膜样本中子宫蜕膜NK细胞Siglec-7的是否有活性，从而来判断子宫蜕膜样本是否正常，如有活性，带荧光基团分离能产生荧光，其对应的子宫蜕膜样本异常；即内膜状态不利于胚胎植入。如没有活性，带荧光集团不能分离产生荧光，其对应的子宫蜕膜样本正常，即内膜状态利于胚胎植入。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
目前研究发现，反复性不明原因流产主要与母胎面免疫耐受异常有关。自然杀伤细胞，即NK细胞是占子宫淋巴细胞的80%，在子宫妊娠免疫中发挥重要作用。Siglec-7，即唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素-7，主要分布于外周血NK细胞，是NK细胞表面的重要抑制性受体。
我们发现：Siglec-7表达于人子宫蜕膜NK细胞，异常表达将导致胚胎滋养层细胞与内膜之间的平衡收到破坏。但目前尚欠缺子宫NK细胞功能的相应诊断指标，同时，子宫内膜胚胎植入能力的评估存在局限。因此，Siglec-7可作为分子标志物对内膜胚胎植入能力进行评估。
本发明提出了以子宫蜕膜NK细胞Siglec-7作为检测指标在胚胎植入检测试剂盒中的应用。
不明原因性流产患者子宫内膜样本组织切片荧光染色Siglec-7阳性率较正常水平明显增高，提示该患者内膜状态不利于胚胎植入。
实施例2
本发明提出了一种胚胎植入检测试剂盒，该试剂盒通过检测子宫蜕膜样本中子宫蜕膜NK细胞Siglec-7的表达程度作为检测指标。
进一步地，胚胎植入检测试剂盒包括对子宫蜕膜NK细胞Siglec-7表达进行检测的试剂。
具体地，该胚胎植入检测试剂盒包括：PBS缓冲液、PBST缓冲液 、PBT缓冲液、4%多聚甲醛、四氢呋喃、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、柠檬酸钠、柠檬酸、30%H2O2、牛血清白蛋白和DAPI。
上述试剂的配制方法为：柠檬酸钠 3g,柠檬酸 0.4g加入1000ml蒸馏水；H2O2常规保存浓度为30%，密封避光保存，使用时需自行配制：2ml 30% H2O2 加入18ml蒸馏水中，现配现用；牛血清白蛋白为粉末，4℃保存，使用时需自行配制：PBT溶解0.3g BSA，最终用PBT定容到10ml， PBT=0.1% Triton X-100 in PBS；DAPI-20℃保存，使用时需1:50，in PBS配置。
实施例3
本发明还提出了胚胎检测试剂盒的检测方法，具体包括以下步骤：
X1.样本预处理
取子宫蜕膜组织样本5～15g，弃去子宫蜕膜表面的绒毛；再用PBS缓冲液洗2～3次后，置于4%多聚甲醛中固定8～12h。
X2.脱水
将X1中处理得到的样本依次经过纯水2h、50%乙醇2h和75%乙醇进行脱水。
X3.包埋
采用体积比为1:1的75%乙醇和四氢呋喃对X2中处理得到的样本进行脱水处理后,常规包埋。
X4.石蜡切片
将X3得到的样本切成3～6μm厚度的薄片。
X5.烘片和烤片
将X4中得到的3～6μm厚度的薄片依次在37℃和65℃的体系中各放置8～12h。
X6.脱蜡复水
将X5中的薄片依次经过二甲苯Ⅰ脱蜡10～15min、二甲苯Ⅱ脱蜡10～15min；然后再依次经过100%乙醇Ⅰ复水2～5min、100%乙醇Ⅱ2～5复水min、90%乙醇Ⅰ复水2～5min、90%乙醇Ⅱ复水2～5min、70％乙醇复水2～5min；最后在蒸馏水复水两次，每次2～5min。
X7.抗原修复
取抗原修复盒，并向抗原修复盒中加入0.01mol/L柠檬酸钠，其pH为6.0；作抗原修复。
X8.去除内源性酶
将X6处理得到的薄片放入湿盒，加3%H2O2，室温孵育10分钟，PBS缓冲液洗3～5次，每次5～10min， 0.1%Triton X-100通透10min，PBST缓冲液洗3～5次，每次5～10min。
X8.封闭
向湿盒中加3%BSA，室温孵育封闭30～45min。
X9.一抗孵育和二抗孵育
Purified anti-human CD3284℃中保持8～12h，然后取出复温45分钟，PBST缓冲液洗3～5次，每次5～10min； Mouse594室温或4℃孵育1～2h； PBST缓冲液洗3次，每次5～10min。
X10.复染
用荧光试剂对细胞核进行染色，室温5分钟；PBST缓冲液洗3～5次，每次5～10min。
X11.封片
封片后进行观察，观察染色程度，再结合阳性对照和阴性对照的结果，判断待测样本是否母胎面免疫耐受异常。
如有活性，带荧光基团分离能产生荧光，其对应的子宫蜕膜样本异常；即内膜状态不利于胚胎植入。如没有活性，带荧光集团不能分离产生荧光，其对应的子宫蜕膜样本正常，即内膜状态利于胚胎植入。
实施例4～实施例8
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.子宫蜕膜NK细胞Siglec-7作为检测指标在胚胎植入检测试剂盒中的应用。
2.一种权利要求1所述的胚胎植入检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒通过检测子宫蜕膜样本中子宫蜕膜NK细胞Siglec-7作为检测指标。
3.如权利要求2所述的胚胎植入检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括对子宫蜕膜NK细胞Siglec-7表达进行检测的试剂。
4.如权利要求2或3所述的胚胎植入检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括阳性对照、阴性对照、缓冲液、固定剂、脱水剂、包埋剂、脱蜡剂、抗原修复剂、荧光试剂、一抗、二抗、复染液和封片剂。
5.如权利要求4所述的胚胎植入检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照为阳性对照为Siglec-7高表达的异常子宫蜕膜组织，所述阴性对照为Siglec-7低水平的正常子宫蜕膜组织。
6.如权利要求2或3所述的胚胎植入检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括PBS缓冲液、PBST缓冲液 、PBT缓冲液、4%多聚甲醛、四氢呋喃、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、柠檬酸钠、柠檬酸、30%H2O2、牛血清白蛋白和DAPI。
7.如权利要求4所述的胚胎植入检测试剂盒的使用方法，其特征在于：包括以下步骤：
X1.样本预处理；
X2.脱水；
X3.包埋；
X4.石蜡切片；
X5.烘片和烤片；
X6.脱蜡复水；
X7.抗原修复；
X8.去除内源性酶；
X9.封闭；
X10.一抗孵育和二抗孵育；
X11.复染；
X12.封片，并与阳性对照和阴性对照比较。
8.如权利要求7所述的胚胎植入检测试剂盒的使用方法，其特征在于：
所述样本预处理为：取子宫蜕膜组织样本5～15g，弃去子宫蜕膜表面的绒毛；再用PBS缓冲液洗2～3次后，置于4%多聚甲醛中固定8～12h；
所述脱水为：将X1中处理得到的样本依次经过纯水2h、50%乙醇2h和75%乙醇进行脱水；
所述包埋为：采用体积比为1:1的75%乙醇和四氢呋喃对X2中处理得到的样本进行脱水处理后,常规包埋；
所述石蜡切片为：将X3得到的样本切成3～6μm厚度的薄片；
所述烘片和烤片为：将X4中得到的3～6μm厚度的薄片依次在37℃和65℃的体系中各放置8～12h；
所述脱蜡复水：将X5中的薄片依次经过二甲苯Ⅰ脱蜡10～15min、二甲苯Ⅱ脱蜡10～15min；然后再依次经过100%乙醇Ⅰ复水2～5min、100%乙醇Ⅱ2～5复水min、90%乙醇Ⅰ复水2～5min、90%乙醇Ⅱ复水2～5min、70％乙醇复水2～5min；最后在蒸馏水复水两次，每次2～5min；
所述抗原修复为：取抗原修复盒，并向抗原修复盒中加入0.01mol/L柠檬酸钠，其pH为6.0；作抗原修复；
所述去除内源性酶为：将X6处理得到的薄片放入湿盒，加3%H2O2，室温孵育10分钟，PBS缓冲液洗3～5次，每次5～10min， 0.1%Triton X-100通透10min，PBST缓冲液洗3～5次，每次5～10min；
所述封闭为：向湿盒中加3%BSA，室温孵育封闭30～45min；
所述一抗孵育和二抗孵育为：Purified anti-human CD3284℃中保持8～12h，然后取出复温45分钟，PBST缓冲液洗3～5次，每次5～10min； Mouse594室温或4℃孵育1～2h；PBST缓冲液洗3次，每次5～10min；
所述复染为：用荧光试剂对细胞核进行染色，室温5分钟；PBST缓冲液洗3～5次，每次5～10min；
所述封片观察为：封片后进行观察，观察荧光程度，再结合阳性对照和阴性对照的结果，判断待测样本是否母胎面免疫耐受异常。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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