CN107475354A - 前列腺癌组织溯源ctc分型鉴定试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种前列腺癌组织溯源CTC分型鉴定试剂盒，其包括针对检测目标基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统，所述目标基因包括有前列腺癌特异性基因、上皮细胞标志基因、和间质细胞标志基因，所述前列腺癌特异性基因选自PSA、PSMA、PSAP、NKX3.1、P501S；所述上皮细胞标志基因选自EPCAM、CDH1、CK8、CK18；所述间质细胞标志基因选自SURVIVIN、VIMENTIN、AKT2、TWIST1。本发明目标基因的选取，除了能实现单个目标基因的检测外，还可与其它目标基因一起使用，从而能够最全面地检测出结列腺组织溯源CTCs，避免了假阴性和假阳性结果的出现，进一步提高检测的准确性。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种前列腺癌组织溯源CTC分型鉴定试剂盒。
背景技术
原发灶不明的肿瘤(carcinoma of unknown primary,CUP)是指在治疗前评估中，病理证实为转移性肿瘤，但是经过详细的病史和体检，实验室检查和影像学检查，均不能确定其原发部位的肿瘤。早期播散，侵袭性强，转移方式不可预测是这类肿瘤的特征性表现。
原发灶不明转移癌约占癌症病人中的5-10％，病理来源腺癌占40％，未分化癌占40％，鳞癌占13％，其它类型的肿瘤占7％。由于病灶较小、部位隐匿或位于黏膜下等原因而不易发现；且肿瘤的生物学行为又较恶劣，较早发生转移，给临床医生带来了诊断和治疗方面非常大的难题。因为后续的治疗，不管是手术还是放疗、化疗，原发灶不同，治疗方式也会不同。转移灶虽然在别的器官上，但是它的生物学行为是和原发灶的基本相同的，所以治疗方法也要根据原发灶的不同而异。因此，确定原发病灶尤为重要，只有找到原发病灶，标本兼治，临床治愈率才能改善。
循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)是因自发或诊疗操作从实体肿瘤病灶(原发灶、转移灶)脱落，进入外周血中的各类肿瘤细胞的统称，目前认为CTCs可能是肿瘤转移的早期阶段。肿瘤细胞侵入到原发病灶的周围组织中，进入血液和淋巴管系统，形成CTCs，并转运到远端组织，再渗出，适应新的微环境，最终“播种”、“增殖”、“定植”、形成转移灶。肿瘤细胞在进入外周血循环的过程中可能发生上皮-间质转变(ETM，Epithelial-mesenchymal Transition)，EMT过程中，除了细胞形态和移动性发生改变外，细胞基因表达谱特别是上皮、间质分子标志物及其转录因子的表达也发生改变，发生EMT的肿瘤细胞间黏附改变，迁移和侵袭能力增强。根据CTCs抗原标志物的差异，目前CTCs主要可分为上皮标志物阳性表型(简称上皮细胞型)、间质标志物阳性表型(简称间质细胞型)和上皮与间质混合表型(简称上皮-间质细胞型)等。不同类型CTCs具有不同的迁移和侵袭能力。因此组织溯源CTC的分型和检测，对于原发灶不明的肿瘤患者原发病灶的确定、治疗方案设计以及预后评估具有重要的意义。
临床上肿瘤治疗的关键是早期诊断和准确分期，主要措施是去除原发病灶及阻断和控制转移病灶，所以CUP的原发灶寻找是临床医生面临的棘手问题之一，极大程度的限制了医生对疾病的诊断和治疗。由于原发病灶不明确，往往不能采取针对性的治疗方案，造成治疗效果不佳和病人预后不良。然而，目前传统的诊断方法，包括CT扫描、PET-CT检查和血清肿瘤标记物检测等往往费时、费力，需要拉网式筛查，而其检测率仅有20-50％。因此，继续一种灵敏度高、特异性强、准确性好的检测试剂盒以及检测方法，用于肿瘤原发灶的确定，帮助医生对患者的诊断和治疗。
发明内容
本发明的目的在于提供一种灵敏度高、特异性强、准确性好的前列腺癌组织溯源CTC分型鉴定试剂盒，用于判断患者原发病灶是否为前列腺癌。
实现上述目的的技术方案如下。
一种前列腺癌组织溯源CTC分型鉴定试剂盒，包括针对检测目标基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统；所述目标基因包括有前列腺癌特异性基因、上皮细胞标志基因、和间质细胞标志基因，所述前列腺癌特异性基因选自PSA、PSMA、PSAP、NKX3.1、P501S中至少两种；所述上皮细胞标志基因选自EPCAM、CDH1、CK8、CK18中的至少两种；所述间质细胞标志基因选自SURVIVIN、VIMENTIN、AKT2、TWIST1中至少两种；所述信号放大系统包括末端修饰有荧光基团的扩增探针，或包括有扩增探针和末端修饰有荧光基团的标记探针，不同种类目标基因的荧光基团互不相同；其中，
所述扩增探针连接捕获探针与荧光基团，或连接捕获探针与标记探针，所述捕获探针连接目标基因mRNA与扩增探针，每条捕获探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：与待检测的目标基因mRNA结合的特异性序列P1、间隔臂序列、P2序列，所述P2序列为不存在发夹结构、探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P4和目标基因mRNA之间均不存在特异性结合的序列，针对同一类别目标基因mRNA的捕获探针的P2序列相同；
每条扩增探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与相应捕获探针的P2序列互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述P4序列为不存在发夹结构、探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、P3和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
所述标记探针连接扩增探针与荧光基团，每条标记探针具有与相应扩增探针P4序列互补配对的P5序列。
在其中一个实施例中，所述目标基因还包括排除基因，所述排除基因选自CK7、CK20、CD45中至少两种。
在其中一个实施例中，所述前列腺癌特异性基因的捕获探针中：针对PSA基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10中的2条或2条以上，针对PSMA基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.20中的2条或2条以上，针对PSAP基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.21～SEQ ID NO.30中的2条或2条以上，针对NKX3.1基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.31～SEQ ID NO.40中的2条或2条以上，针对P501S基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.41～SEQ ID NO.50中的2条或2条以上；针对前列腺癌特异性基因的捕获探针的特异性序列P2为SEQ ID NO.161；所述前列腺癌特异性基因的扩增探针中，P3序列为SEQID NO.165，P4序列为SEQ ID NO.169。
在其中一个实施例中，所述上皮细胞标志基因的捕获探针中：针对EPCAM基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.51～SEQ ID NO.60中的2条或2条以上，针对CDH1基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.61～SEQ ID NO.70中的2条或2条以上，针对CK8基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.71～SEQ ID NO.80中的2条或2条以上，针对CK18基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.81～SEQ ID NO.90中的2条或2条以上；针对上皮细胞标志基因的捕获探针的特异性序列P2为SEQ ID NO.162；所述上皮细胞标志基因的扩增探针中，P3序列为SEQ IDNO.166，P4序列为SEQ ID NO.170。
在其中一个实施例中，所述间质细胞标志基因的捕获探针中：针对SURVIVIN基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.91～SEQ ID NO.100中的2条或2条以上，针对VIMENTIN基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.101～SEQ ID NO.110中的2条或2条以上，针对AKT2基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO111～SEQ ID NO.120中的2条或2条以上，针对TWIST1基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.121～SEQ ID NO.130中的2条或2条以上；针对间质细胞标志基因的捕获探针的特异性序列P2为SEQ ID NO.163；所述间质细胞标志基因的扩增探针中，P3序列为SEQ ID NO.167，P4序列为SEQ ID NO.171。
在其中一个实施例中，所述前排除基因的捕获探针中：针对CK7基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.131～SEQ ID NO.140中的2条或2条以上，针对CK20基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.141～SEQ ID NO.150中的2条或2条以上，针对CD45基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.151～SEQ ID NO.160中的2条或2条以上；针对排除基因的捕获探针的特异性序列P2为SEQ ID NO.164；所述间质细胞标志基因的扩增探针中，P3序列为SEQ ID NO.168，P4序列为SEQ ID NO.172。
在其中一个实施例中，所述间隔臂序列为5－10个T。
在其中一个实施例中，所述荧光信号放大系统中的荧光基团选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640、Cy5、LC RED705、Alexa Fluor 488和AlexaFluor 750，且针对不同种类目标基因的荧光基团互不相同。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明试剂盒经过发明人巧妙的构思和设计，通过溯源CTCs的检测实现了原发灶不明肿瘤患者原发病灶的确定，进一步拓展了CTCs检测在临床上的应用，开创了CTCs检测新的临床价值。本发明所选择的前列腺癌特异性基因、上皮细胞标志基因、间质细胞标志基因和排除基因，是发明人经过大量试验进行综合评估、统计分析筛选得出的在前列腺癌组织溯源CTCs上特异表达的基因。本发明目标基因的选取，除了能实现单个目标基因的检测外，更与其它目标基因一起使用，从而能够最全面地检测出前列腺癌组织溯源CTCs，区分其与其他原发病灶来源的组织溯源CTCs，避免了假阴性和假阳性结果的出现，进一步提高检测的准确性。
(2)本发明通过前列腺癌组织溯源CTCs的检测，可以直观准确的判断原发灶不明肿瘤患者原发病灶是否为前列腺癌，并根据组织CTCs的检测和分型结果，帮助医生制定最合适最有效的治疗方案，及时去除原发病灶并阻断和控制转移病灶。
(3)本发明提供了分子标志物：前列腺癌特异性基因、上皮细胞标志基因、和间质细胞标志基因对原发灶不明肿瘤患者外周血中的CTCs进行检测，判断其是否为前列腺癌组织溯源CTCs，从而判断患者原发病灶是否为前列腺癌，同时能对前列腺癌组织溯源CTCs进行分型，更精确的评估患者体内组织溯源CTCs转移潜能，帮助医生制定下一步的治疗计划。本发明标志物的选择具有很好的特异性，能有效区分前列腺癌组织溯源CTCs与其他原发病灶来源的组织溯源CTCs及转移病灶产生的CTCs。同时，本发明还包括排除基因，进一步排除其他原发病灶的可能，提高了检测结果的特异性和准确性，避免造成误诊。
(4)本发明所述鉴定方法采用针对目标mRNA的多重捕获探针，能够同时标记多种前列腺癌特异性基因、上皮细胞标志基因、和间质细胞标志基因，进一步提高了检测结果的准确性。本发明所设计的与目标基因mRNA特异性结合的捕获探针，能够在均一的反应条件下进行杂交反应，且探针之间基本不存在非特异性结合；所设计的探针在检测中特异性好、信噪比高。同时，多种探针的组合使用使鉴定试剂盒和检测方法形成一个检测效果完好的系统。
附图说明
图1是本发明前列腺癌组织溯源循环肿瘤细胞阳性鉴定结果示意图；
图2是本发明前列腺癌组织溯源循环肿瘤细胞分型鉴定结果示意图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语―和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1
本实施例所述的前列腺癌组织溯源CTC分型鉴定试剂盒，主要包括有针对检测目标基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统，所述信号放大系统包括末端修饰有荧光基团的扩增探针，或包括有扩增探针和末端修饰有荧光基团的标记探针，不同种类目标基因的荧光基团互不相同，具体的，本实施例所述的前列腺癌组织溯源CTC分型鉴定试剂盒，有两种类型，其分别为信号放大系统具有标记探针与不具有标记探针而只具有末端修饰有荧光基团的扩增探针。
其中，具有标记探针的前列腺癌组织溯源CTC分型鉴定试剂盒A，主要包括有：
一、捕获探针
捕获探针用于连接目标基因mRNA与荧光信号放大系统，其由三部分组成，5’端至3’端依次是能与对应的目标基因的mRNA互补配对的P1序列，间隔臂序列，与对应的扩增探针P3序列互补配对的P2序列，同一类别的目标基因其捕获探针中的P2序列相同。所述间隔臂为用于将捕获探针P2序列与目标mRNA间隔开来，通过在探针内部设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。本发明捕获探针的间隔臂优选为5－10个T，本实施例优选为5个T。每个目标基因分别设计10条捕获探针，以提高检测的特异性。(具体使用时，针对每种目标基因，选择2条或2条以上捕获探针即可完成检测，特异性和稳定性都很好，可参考实施例5)，本实施例优选为使用10条捕获探针，以使特异性达到最好。针对相应的目标基因捕获探针的特异性P1序列见表1，不同类型的目标基因的捕获探针的P2序列见表2。
表1 目标基因捕获探针的P1序列
表2 捕获探针的P2序列
二、扩增探针
扩增探针是连接捕获探针与信号检测组分之间的序列，扩增探针由三部分组成，5’端是能与捕获探针P2序列互补配对的P3序列，间隔臂序列，3’端是能与标记探针互补配对的序列P4(如不运用标记探针检测时，则P4序列的3’端修饰有荧光基团，如试剂盒B)，中间是5个寡聚核苷酸T的间隔臂序列(本发明的扩增延伸探针间隔臂优选为5－10个T，本实施例优选为5个T)。所述目标基因的扩增探针的P4序列内部不存在发夹结构，探针内部和探针间都不形成二聚体、不存在错配，与P1、P2、P3和总mRNA之间均不存在非特异性结合的序列。
表3 扩增探针的P3序列
表4 目标基因的扩增探针的P4序列
三、标记探针
标记探针由两部分组成，其5’端是能与扩增探针序列P4互补结合的P5序列，3’端带有荧光基团标记，通过与扩增探针P4序列的结合实现目标mRNA信号的级联放大。(当检测体系中使用标记探针时，扩增探针的P4序列3’端不带有荧光基团标记，而由标记探针的3’端带有荧光基团标记，如试剂盒A)标记探针的荧光基团可以选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640、Cy5、LC RED705、Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 750，标记探针的FL1、FL2和FL3选择的荧光基团互不相同，且所选择的荧光基团的颜色互不相同或发射波长互不相同，以便于区分不同类型的目标基因。
表5 标记探针
本实施例所述不具有标记探针的前列腺癌组织溯源CTC分型鉴定试剂盒B，主要包括有：
一、捕获探针：与上述具有标记探针的前列腺癌组织溯源CTC分型鉴定试剂盒A中的捕获探针相同。
二、扩增探针：与上述具有标记探针的前列腺癌组织溯源CTC分型鉴定试剂盒A中的扩增探针的序列相同，但P4序列的3’端修饰有荧光基团。所述扩增探针P4序列的3’端优选的荧光基团标记中：针对前列腺癌特异性基因PSA、PSMA、PSAP、NKX3.1和P501S的荧光基团为Cy5(紫色荧光信号)，针对上皮细胞标志基因EPCAM、CDH1、CK8和CK18的荧光基团为Cy3(红色荧光信号)，针对间质细胞标志基因SURVIVIN、VIMENTIN、AKT2和TWIST1的荧光基团为Alexa Fluor488(绿色荧光信号)，针对排除基因CK7、CK20和CD45的荧光基团为AlexaFluor 750(白色荧光信号)。
实施例2运用实施例1中的试剂盒对原发灶不明肿瘤患者临床样本进行检测
所述各种溶液的配方如下：
本实施例中的探针混合液、扩增混合液和显色混合液为实施例1前列腺癌组织溯源CTC分型鉴定试剂盒A相应基因列表中的全部探针。
一、样本预处理，将CTCs过滤至滤膜上
1.在样本保存管中使用保存液保存血液样本，600×g水平离心5min，弃上清，去除红细胞。
2.加入4mL PBS和1mL固定剂，涡旋混匀，室温静置8min。
3.样本过滤：将样本保存管中的液体转移至过滤器中，打开真空抽滤泵抽尽液体；在本保存管中加入4mL PBS，洗涤管壁后抽滤液体。
4.将滤膜转移至24孔板中，加入400μl 4％甲醛溶液，室温固定1h。
5.去除液体，每孔加入1mL PBS洗涤三次，每次浸泡2min。
二、透化处理
1.在新的24孔板中每孔加入50μl透化剂，将滤膜从PBS中取出，滤膜片边缘接触吸水纸，去除多余的液体，将滤膜倒扣在透化剂上，即滤膜铁圈刻有编码的一面向下贴近液体。室温孵育5min。
2.去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤两次，每次浸泡2min。将滤膜保持在PBS中至下一步实验操作。
三、消化细胞，暴露mRNA，使其与探针杂交
1.配制相应浓度的消化酶工作液：对于每个样本，消化酶工作液组成如下：48.75ul的PBS、1.25ul的消化酶，总体积50ul。
2.按实验需要配制一定体积的消化酶工作液，涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl。
3.将滤膜取出，倒扣至24孔板中消化酶工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在。室温静置1h。
4.去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤三次，每次浸泡2min。将滤膜保持在PBS缓冲液中至下一步实验操作。
四、探针杂交，探针特异性序列与目标mRNA序列结合
1.探针缓冲液、扩增缓冲液和显色缓冲液使用前需40℃水浴预热20min。
2.配制探针工作液：对于每个样本，探针工作液组成如下：8ul探针混合液、42ul探针缓冲液(40℃预热)，总体积50ul。按实验需要配制一定体积的探针工作液，涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl。
3.将滤膜取出，倒扣至24孔板中探针工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在。
4.盖上24孔板盖，40±1℃孵育3小时。
5.去除液体，每孔加入1ml洗涤液洗涤三次，每次浸泡2min。将滤膜保持在洗涤液中至下一步实验操作，样本在洗涤液中浸泡时间不能超过30min。
五、扩增杂交，目标mRNA序列信号放大
1.配制扩增工作液：对于每个样本，扩增工作液组成如下：2ul扩增混合液、48ul扩增缓冲液(40℃预热)，总体积50ul。按实验需要配制一定体积的扩增工作液，涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl
2.将滤膜取出，倒扣至24孔板中扩增工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在。
3.盖上24孔板盖，40±1℃孵育30min。
4.去除液体，每孔加入1ml洗涤液洗涤三次，每次浸泡2min。将滤膜保持在洗涤液中至下一步实验操作，样本在洗涤液中浸泡时间不能超过30min。
六、显色，荧光标记目标信号
1.配制显色工作液：对于每个样本，显色工作液组成如下：2ul显色混合液、48ul显色缓冲液(40℃预热)，总体积50ul。按实验需要配制一定体积的显色工作液，避光涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl。
2.将滤膜取出，倒扣至24孔板中显色工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在。
3.盖上24孔板盖，40±1℃孵育30min。
4.去除液体，每孔加入1ml洗涤液洗涤三次，每次浸泡2min。将滤膜保持在洗涤液中至下一步实验操作，样本在洗涤液中浸泡时间不能超过30min。
七、荧光显微镜观察CTCs
本发明的对照品使用DAPI作为细胞核荧光基团，其发射蓝色荧光信号。
1.将滤膜细胞面朝上置于载玻片上，沿铁圈内环将滤膜割下，加10μl含DAPI的抗淬灭剂，盖上18mm×18mm的盖玻片，直接镜检或置于-20℃保存。
2.通过20倍物镜计数CTC异性核数量。
3.根据10倍物镜定位异性核位置，滴油，用油镜观察实验结果，并拍照记录结果。
4.然后再根据10倍物镜定位下一个异性核位置，滴油，用油镜观察实验结果并视野拍照记录结果。
5.重复操作至拍完所有的异性核，数量与20倍物镜计数结果一致。
显微镜使用通道如下：
表3 荧光基团的激发波长和发射波长
八、检测结果判断及分析
1.阳性前列腺癌组织溯源CTCs鉴定标准
在滤膜上，富集有少量的前列腺癌组织溯源CTCs以及残留的少数白细胞，前列腺癌组织溯源CTCs阳性的判定标准为(参见图1)：
1)具有前列腺癌特异性标识物和循环肿瘤细胞特异性标识物，在本试剂盒中表现为在Cy5通道、Cy3通道和Alexa Fluor 488通道下能够显示紫色荧光信号点和红色荧光信号点和/或绿色荧光信号点。
2)不具有排除细胞特异性标识物，在本试剂盒中表现为在Alexa Fluor 750通道下不显示荧光信号点。
3)细胞核DAPI染色阳性。
4)前列腺癌组织溯源CTCs核形状不规则，直径大于10μm，明显大于滤膜孔径，滤膜孔径为7μm。白细胞大小与滤膜孔大小相近。
2.阳性前列腺癌组织溯源CTCs分型标准：
本试剂盒采用针对目标mRNA的多重捕获探针，分别针对多种前列腺癌组织溯源CTCs特异性基因，通过不同颜色荧光信号，可进一步将前列腺癌组织溯源CTCs分型。其中Ⅰ型(上皮型)前列腺癌组织溯源CTCs携带Cy5荧光基团(显示为紫色荧光信号点)和Cy3荧光基团(显示为红色荧光信号点)，Ⅲ型(间质型)前列腺癌组织溯源CTCs携带Cy5荧光基团(显示为紫色荧光信号点)和Alexa Fluor 488荧光基团(显示为绿色荧光信号点)，同时表达Ⅰ型和Ⅲ型特异性基因的前列腺癌组织溯源CTCs为Ⅱ型(上皮-间质混合型，同时显示紫色荧光信号点、红色荧光及绿色荧光信号点)。参见图2。前列腺癌组织溯源CTCs分型标准如下：
表4 阳性前列腺癌组织溯源CTCs分型标准
3.本发明对20例临床已确诊原发灶的男性肿瘤患者外周血样本进行检测和观察，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的细胞，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果如下表所示(表中数据为CTCs数目；P表示患者原发病灶为前列腺癌；N表示患者原发病灶不是前列腺癌)：
表5 样品检测结果
由上述检测结果可知，本发明前列腺癌组织CTC溯源试剂盒具有很好的灵敏度和特异性，能实现临床样品的检测，并对前列腺癌组织CTCs进行分型。本发明试剂盒与临床检测结果具有100％的吻合率，说明并发明试剂盒所选用的标志基因及设计的探针组成检测体系能对患者原发病灶进行精准判断，具有很高的准确率。
实施例3目标检测基因数量和种类的选择
一、试剂盒制备的设计(目标检测基因数量和种类的选择)
本发明试剂盒前列腺癌特异性基因选自PSA、PSMA、PSAP、NKX3.1、P501S根据实验组做相应的选择；上皮细胞标志基因使用：EPCAM、CDH1、CK8、CK18；间质细胞标志基因使用：SURVIVIN、VIMENTIN、AKT2、TWIST1；排除基因使用：CK7、CK20、CD45。
前列腺癌特异性基因的选择参见实验组1-4，分别选取一种、两种、三种及五种的目标基因，对比其检测效果，而上皮细胞标志基因、间质细胞标志基因和排除基因使用全部的目标基因，具体设计如表6所示。
本实施例每组相应目标基因的所述捕获探针、扩增探针与标记探针的组成和数量、检测方法等如实施例1试剂盒A和实施例2所述。
表6 前列腺癌特异性基因基因的选择
二、样本检测
本实施例选用前列腺癌细胞株PC3、DU145和LNCap进行实验，本领域技术人员只要知道细胞株的名称即可通过购买得到。分别各取约1000个PC3、DU145和LNCap细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本各均分为5份，依次编号21-25、26-30和31-35。采用表6目标基因制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样本21-35进行检测。读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取，针对目标检测标志基因的荧光信号强度，分别读取这50个细胞的相应颜色的荧光点数量，并计算平均点数。具体检测结果如下(表7中数据为细胞数目，表8中数据为平均荧光点数)：
表7 使用不同数量前列腺癌特异性基因检测效果的比较
表8 使用不同数量前列腺癌特异性基因平均荧光信号点数检测效果的比较
对比实验组1-4的实验结果可知，当前列腺癌特异性基因分别选取一种、两种、三种及五种，上皮细胞标志基因、间质细胞标志基因和排除基因使用全部基因时，上皮细胞标志基因、间质细胞标志基因和排除基因检测结果稳定，而前列腺癌特异性基因检测结果有差异：由于不同前列腺癌组织溯源CTCs标志基因表达的差异，只选用一种目标基因进行检测时，会造成一定程度的漏检，使用2种或2种以上时，检测效果达到稳定，且红色荧光信号点从实验组1到实验组4随着前列腺癌特异性基因数量的增加而逐渐增加，检测效果更优，其中，选用全部的前列腺癌特异性基因时，检测信号最强最稳定，效果最优，同时，前列腺癌特异性基因的增加并不影响上皮细胞标志基因、间质细胞标志基因和排除基因的检测结果，由此可知，本发明试剂盒所设计的各种类型探针之间基本不存在非特异性结合，特异性好。上皮细胞标志基因、间质细胞标志基因和排除基因基因数量的选择实验结果与前列腺癌特异性基因基因一致。其它针对使用不同数量和种类的前列腺癌特异性基因、上皮细胞标志基因、间质细胞标志基因和排除基因的试剂盒，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。
实施例4：标记探针的运用
一、试剂盒制备的设计(信号检测组分)
本发明试剂盒信号检测组分有两种选择，1)扩增探针P4序列的3’端修饰有荧光基团；2)扩增探针3’端P4序列与标记探针的P5序列通过碱基互补配对结合，同时标记探针的3’端带有荧光基团。这两种信号检测组分均能实现信号放大，检测到正常信号。其中，使用荧光基团修饰的标记探针，检测信号更加稳定，效果较优。
以所述试剂盒的检测前列腺癌特异性基因的两种信号检测组分为例，具体设计如表9所示。即所述试剂盒的组成为：
实验组5：相应捕获探针和扩增探针组成和数量同实施例1试剂盒A，但扩增探针3’端修饰有荧光基团Cy5；没有标记探针，如试剂盒B；
实验组6：相应捕获探针、扩增探针和标记探针组成和数量同实施例1试剂盒A，扩增探针不具有荧光基团，但配置有标记探针，标记探针的P5序列3’端修饰有荧光基团Cy5。
表9 信号检测组分
二、样本检测
本实施例选用前列腺癌细胞株PC3、DU145和LNCap进行实验，本领域技术人员只要知道细胞株的名称即可通过购买得到。分别各取约1000个PC3、DU145和LNCap细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本各均分为5份，依次编号36-40、41-45和46-50。。采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样本36-50进行检测，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取，针对目标检测标志物的荧光信号强度，分别读取这50个前列腺癌细胞的相应颜色的荧光点数量，并计算平均点数，具体实验结果如下：
2个实验组中使用不同信号组分的试剂盒均能将三种细胞株样本中含有的50个细胞全部检出，对细胞数目的检测结果没有差异，因此，这两种信号检测组分对信号的检测是等效的。但是使用标记探针的试剂盒(实验组6)检测到的前列腺癌特异性基因平均荧光点数更多，信号更加稳定，效果较优，具体荧光点数检测结果见表10：
表10 前列腺癌特异性基因使用不同信号检测探针平均荧光点数检测结果比较
其他针对上皮细胞标志基因、间质细胞标志基因和排除基因标记探针的运用检测结果与前列腺癌特异性基因检测结果一致，具体数据省略。
实施例5目标基因的捕获探针的数量选择
一、试剂盒制备的设计(捕获探针数量的选择)
本发明前列腺癌组织溯源CTC分型鉴定试剂盒，针对不同种类的每个目标基因分别设计了10条捕获探针，且同一种类的目标基因的捕获探针中的P2序列相同。在实际使用时，可以针对每种目标基因，选择对应的至少2条捕获探针即可完成检测，特异性和稳定性都能达到需求。
为考察捕获探针数量的选择对试剂盒检测效果的影响，以前列腺癌特异性基因PSA的捕获探针数量选择为例，参见实验组7-9，分别选取1条、2条及10条的捕获探针，对比其检测效果。在该对比实验中，前列腺癌特异性基因仅使用PSA(参见表11)，而上皮细胞标志基因、间质细胞标志基因和排除基因使用如实施例1所述试剂盒A所列出的全部的基因和探针。
表11 前列腺癌特异性基因PSA的捕获探针的选择
二、样本检测
本实施例选用前列腺癌细胞株PC3、DU145和LNCap进行实验，本领域技术人员只要知道细胞株的名称即可通过购买得到。分别各取约1000个PC3、DU145和LNCap细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本各均分为5份，依次编号51-55、56-60和61-65。采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样本52-65进行检测。读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取，针对目标检测标志基因的荧光信号强度，分别读取这50个细胞的相应颜色的荧光点数量，并计算平均点数。具体检测结果如下(表12中数据为细胞数目，表13中数据为平均荧光点数)：
表12 前列腺癌特异性基因PSA使用不同数量捕获探针的检测结果比较
表13 前列腺癌特异性基因PSA使用不同数量捕获探针平均荧光点数检测结果比较
通过三组实验对比可知，当仅选用前列腺癌特异性基因PSA，使用1条、2条和10条的捕获探针均可完成检测，将当捕获探针使用2条或以上时，其特异性和稳定性都很好。其中，当使用全部10条的捕获探针时，前列腺癌特异性基因检测到的荧光信号点数更多，信号更强更稳定，检测效果最佳。
其它针对前列腺癌特异性基因、上皮细胞标志基因、间质细胞标志基因和排除基因的使用不同数量捕获探针的试剂盒，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。
实施例6目标检测基因类型的选择
一、试剂盒制备的设计(目标检测基因类型的选择)
本发明试剂盒提供4种类型的目标检测基因，包括前列腺癌特异性基因(PSA、PSMA、PSAP、NKX3.1、P501S)、上皮细胞标志基因(EPCAM、CDH1、CK8、CK18)、间质细胞标志基因(SURVIVIN、VIMENTIN、AKT2、TWIST1)和排除基因(CK7、CK20、CD45)其它组成参照实施例1所述试剂盒A。
本发明提供的前列腺癌特异性基因、上皮细胞标志基因和间质细胞标志基因，即可与排除基因联合四者一起使用，也可三者联合使用实现患者原发病灶的诊断。设计实验组10-11，其中实验组10选用全部类型的标志基因，实验组11只选用前列腺癌特异性基因、上皮细胞标志基因和间质细胞标志基因，对比其检测效果，具体设计如表14所示。
表14 目标检测基因类型的选择
二、样本检测
采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对20例临床已确诊原发灶的男性肿瘤患者外周血样本，样本编号66-85进行检测，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的细胞，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果如下表所示(表中数据为CTCs数目；P表示患者原发病灶为前列腺癌；N表示患者原发病灶不是前列腺癌)：
表15 试剂盒选择不同类型检测基因的检测结果比较
通过上述检测结果可知，本发明试剂盒提供的前列腺癌特异性基因、上皮细胞标志基因和间质细胞标志基因，既可三者联合使用，也可与排除基因一起四者联合使用，均能判定患者原发病灶是否为前列腺癌，说明试剂盒所选用的前列腺癌特异性基因、上皮细胞标志基因和间质细胞标志基因具有很好的特异性。前列腺癌特异性基因、上皮细胞标志基因和间质细胞标志基因与排除基因四者联合使用，有利于排除白细胞以及来源于其他原发灶循环肿瘤细胞(实验组10)，进一步提高检测结果的准确性，但仅使用前列腺癌特异性基因、上皮细胞标志基因和间质细胞标志基因也可完成检测和分型(实验组11)，判断患者原发病灶是否为前列腺癌，且两者检测结果没有显著差异。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (12)
1.一种前列腺癌组织溯源CTC分型鉴定试剂盒，其特征在于，其包括针对检测目标基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统；所述目标基因包括有前列腺癌特异性基因、上皮细胞标志基因、和间质细胞标志基因，所述前列腺癌特异性基因选自PSA、PSMA、PSAP、NKX3.1、P501S中至少两种；所述上皮细胞标志基因选自EPCAM、CDH1、CK8、CK18中的至少两种；所述间质细胞标志基因选自SURVIVIN、VIMENTIN、AKT2、TWIST1中至少两种；所述信号放大系统包括有末端修饰有荧光基团的扩增探针，或包括有扩增探针和末端修饰有荧光基团的标记探针，不同种类目标基因的荧光基团互不相同；其中，
所述捕获探针用于连接目标基因mRNA与扩增探针，每条捕获探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：可与待检测的目标基因mRNA结合的特异性序列P1、间隔臂序列、P2序列，所述P2序列为不存在发夹结构、探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P4和目标基因mRNA之间均不存在特异性结合的序列，针对同一类别目标基因的捕获探针的P2序列相同；
每条扩增探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与相应捕获探针的P2序列互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述P4序列为不存在发夹结构、探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、P3和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
每条标记探针具有与相应扩增探针P4序列互补配对的P5序列。
2.根据权利要求1所述的前列腺癌组织溯源CTC分型鉴定试剂盒，其特征在于，所述目标基因还包括排除基因，所述排除基因选自CK7、CK20、CD45中至少两种。
3.根据权利要求1或2所述的前列腺癌组织溯源CTC分型鉴定试剂盒，其特征在于，所述前列腺癌特异性基因的捕获探针中：针对PSA基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.1～SEQID NO.10中的2条或2条以上，针对PSMA基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.11～SEQ IDNO.20中的2条或2条以上，针对PSAP基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.21～SEQ IDNO.30中的2条或2条以上，针对NKX3.1基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.31～SEQ IDNO.40中的2条或2条以上，针对P501S基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.41～SEQ IDNO.50中的2条或2条以上。
4.根据权利要求1或3所述的前列腺癌组织溯源CTC分型鉴定试剂盒，其特征在于，针对前列腺癌特异性基因的捕获探针的特异性序列P2为SEQ ID NO.161；所述前列腺癌特异性基因的扩增探针中，P3序列为SEQ ID NO.165，P4序列为SEQ ID NO.169。
5.根据权利要求1所述的前列腺癌组织溯源CTC分型鉴定试剂盒，其特征在于，所述上皮细胞标志基因的捕获探针中：针对EPCAM基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.51～SEQID NO.60中的2条或2条以上，针对CDH1基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.61～SEQ IDNO.70中的2条或2条以上，针对CK8基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.71～SEQ ID NO.80中的2条或2条以上，针对CK18基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.81～SEQ ID NO.90中的2条或2条以上。
6.根据权利要求1或5所述的前列腺癌组织溯源CTC分型鉴定试剂盒，其特征在于，针对上皮细胞标志基因的捕获探针的特异性序列P2为SEQ ID NO.162；所述上皮细胞标志基因的扩增探针中，P3序列为SEQ ID NO.166，P4序列为SEQ ID NO.170。
7.根据权利要求1所述的前列腺癌组织溯源CTC分型鉴定试剂盒，其特征在于，所述间质细胞标志基因的捕获探针中：针对SURVIVIN基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.91～SEQ ID NO.100中的2条或2条以上，针对VIMENTIN基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.101～SEQ ID NO.110中的2条或2条以上，针对AKT2基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO111～SEQ ID NO.120中的2条或2条以上，针对TWIST1基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.121～SEQ ID NO.130中的2条或2条以上。
8.根据权利要求1或7所述的前列腺癌组织溯源CTC分型鉴定试剂盒，其特征在于，针对间质细胞标志基因的捕获探针的特异性序列P2为SEQ ID NO.163；所述间质细胞标志基因的扩增探针中，P3序列为SEQ ID NO.167，P4序列为SEQ ID NO.171。
9.根据权利要求2所述的前列腺癌组织溯源CTC分型鉴定试剂盒，其特征在于，所述前排除基因的捕获探针中：针对CK7基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.131～SEQ IDNO.140中的2条或2条以上，针对CK20基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.141～SEQ IDNO.150中的2条或2条以上，针对CD45基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.151～SEQ IDNO.160中的2条或2条以上。
10.根据权利要求2或9所述的前列腺癌组织溯源CTC分型鉴定试剂盒，其特征在于，针对排除基因的捕获探针的特异性序列P2为SEQ ID NO.164；所述排除基因的扩增探针中，P3序列为SEQ ID NO.168，P4序列为SEQ ID NO.172。
11.根据权利要求1-10任一项所述的前列腺癌组织溯源CTC分型鉴定试剂盒，其特征在于，所述目标基因包括有前列腺癌特异性基因、上皮细胞标志基因、间质细胞标志基因和排除基因，所述前列腺癌特异性基因有PSA、PSMA、PSAP、NKX3.1、P501S；所述上皮细胞标志基因有EPCAM、CDH1、CK8、CK18；所述间质细胞标志基因有SURVIVIN、VIMENTIN、AKT2、TWIST1，所述排除基因有CK7、CK20、CD45；其中，
所述前列腺癌特异性基因的捕获探针中：针对PSA基因的特异性序列P1有SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10，针对PSMA基因的特异性序列P1有SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.20，针对PSAP基因的特异性序列P1有SEQ ID NO.21～SEQ ID NO.30，针对NKX3.1基因的特异性序列P1有SEQ ID NO.31～SEQ ID NO.40，针对P501S基因的特异性序列P1有SEQ ID NO.41～SEQID NO.50；
所述上皮细胞标志基因的捕获探针中：针对EPCAM基因的特异性序列P1有SEQ IDNO.51～SEQ ID NO.60，针对CDH1基因的特异性序列P1有SEQ ID NO.61～SEQ ID NO.70，针对CK8基因的特异性序列P1有SEQ ID NO.71～SEQ ID NO.80，针对CK18基因的特异性序列P1有SEQ ID NO.81～SEQ ID NO.90；
所述间质细胞标志基因的捕获探针中：针对SURVIVIN基因的特异性序列P1有SEQ IDNO.91～SEQ ID NO.100，针对VIMENTIN基因的特异性序列P1有SEQ ID NO.101～SEQ IDNO.110，针对AKT2基因的特异性序列P1有SEQ ID NO111～SEQ ID NO.120，针对TWIST1基因的特异性序列P1有SEQ ID NO.121～SEQ ID NO.130；
所述前排除基因的捕获探针中：针对CK7基因的特异性序列P1有SEQ ID NO.131～SEQID NO.140，针对CK20基因的特异性序列P1有SEQ ID NO.141～SEQ ID NO.150，针对CD45基因的特异性序列P1有SEQ ID NO.151～SEQ ID NO.160。
12.根据权利要求1-10任一项所述的前列腺组织溯源CTC分型鉴定试剂盒，其特征在于，所述间隔臂序列为5－10个T；所述荧光信号放大系统中的荧光基团选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640、Cy5、LC RED705、Alexa Fluor 488和AlexaFluor 750，且针对不同种类目标基因的荧光基团互不相同。
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