CN104977284B - 一种胎儿有核红细胞的捕获及鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种胎儿有核红细胞的捕获及鉴定方法，包括以下步骤：步骤一：制备生物素标记的抗体，所述抗体为识别一种或多种胎儿有核红细胞表面特异性蛋白的抗体；步骤二：将步骤一所得抗体亲和到化学修饰后的纳米基底膜上，再加入胎儿有核红细胞悬浮液，在恒温细胞培养箱中静置，使胎儿有核红细胞被纳米基底膜上的抗体捕获；步骤三：以激发波长不同的荧光染料分别标记的胎儿红细胞血红蛋白抗体和胎儿有核红细胞膜蛋白抗体作为双抗体，采用“双阳性”免疫荧光染色法鉴定经步骤二捕获的胎儿有核红细胞。本发明提供的方法灵敏度高、特异性强、操作简便。

Description

一种胎儿有核红细胞的捕获及鉴定方法

技术领域

本发明涉及一种胎儿有核红细胞的捕获及鉴定方法。

背景技术

胎儿有核红细胞是胎儿造血系统及胎儿外周血液循环的一个特征性标志，它不仅存在于胎儿的血液循环中，而且可以通过胎盘屏障进入母体外周血液。胎儿有核红细胞具有多种特征：①正常人外周血中不存在有核红细胞，若出现则属于病理现象；②属单个核细胞，含胎儿全部基因组；③表面具有较多的相对特异的抗原成份如CD71，CD36 和血型糖蛋白(GPA)等；④妊娠妇女外周血中含量较少，在1∶105～1∶109 之间；⑤生命周期短，约90天产后在母血中很快消失，用于诊断时不受前次妊娠影响。有核红细胞的特殊性质，为某些病理妊娠的预测和诊断提供了新思路，其中，产前利用母血中的胎儿有核红细胞筛查胎儿遗传性疾病, 已经成为近年新发展起来的一项无创性产前诊断技术。

正常人血液中，有核红细胞和白细胞同属于单核细胞，白细胞直径约为7-20um，有核红细胞直径约为10-20um，且形态相差不大，但是，白细胞的数目大约为4-10 *10⁶/ml，而有核红细胞的数目仅为几颗到几百颗，数量上相差巨大，因此，如何实现高效率和高纯度的从数百万颗白细胞中分选出所需要的几颗到几百颗有核红细胞，即从血液中捕获到有核红细胞并对其进行鉴定，是一个重要的研究课题。

目前，常用的细胞分选技术是流式细胞术，但是该技术使用的设备昂贵、体积庞大、需要专业人员进行操作，而且细胞的用量较大，难以在实验室和医院普及推广。磁激活细胞分选法操作相对简单，费用相对低廉，用时短，其原理是在外加磁场的作用下，将结合磁性微粒的单克隆抗体标记的细胞分离出来。所使用的抗体可以分为阳性选择标记和阴性选择标记，阳性标记包含胎儿有核红细胞表面一些特异性的抗原标志物如转铁蛋白受体(transferrin receptor, CD71)、血型糖蛋白A (glycophorin A, GPA )、血栓敏感素受体(thromboxane receptor, CD36)；阴性选择标记包括CD45，CD14，CD32等。但该方法分离的纯度不高，除需要分离的靶细胞外，淋巴细胞和一些单核细胞也可能被激活，所以，分选时抗体的选择显得至关重要。单细胞显微操作分离法是在显微镜下从形态学上识别靶细胞，并用微操作器将其逐一挑取出，然后进行分析。该技术分选纯度高，但是技术难度大，仪器设备要求高，不易推广。

另外，对有核红细胞进行鉴定所采用方法包括：免疫化学法，免疫荧光蛋白标记法。免疫化学法主要观察细胞核与细胞质的比例判断细胞类型，但是工作费时且误判率较高；免疫荧光蛋白标记法使用带有荧光基团的抗体标记细胞，例如转铁蛋白受体CD71或者γ珠蛋白（gamma-hemoglobin-chain）等，但是抗体特异性不高，检测效果不好；另外还有对男性胎儿细胞中Y染色体特异序列进行PCR扩增或用Y染色体特异序列的探针进行荧光原位杂交( FISH )，若检测出Y 染色体考虑为胎源性的有核红细胞，这种方法简单但受性别限制。因此，本领域迫切需要一种新型的高灵敏度、高特异性的有核红细胞捕获及鉴定的方法。

发明内容

为了克服现有技术存在的缺陷，本发明提供了一种灵敏度高、特异性强、操作简便的胎儿有核红细胞的捕获及鉴定方法。

具体地，所述方法包括以下步骤：

步骤一：制备生物素标记的抗体，所述抗体为识别一种或多种胎儿有核红细胞表面特异性蛋白的抗体；

步骤二：将步骤一所得抗体亲和到化学修饰后的纳米基底膜上，再加入胎儿有核红细胞悬浮液，在恒温细胞培养箱中静置，使胎儿有核红细胞被纳米基底膜上的抗体捕获；

步骤三：以激发波长不同的荧光染料分别标记的胎儿红细胞血红蛋白抗体和胎儿有核红细胞膜蛋白抗体作为双抗体，采用“双阳性”免疫荧光染色法鉴定经步骤二捕获的胎儿有核红细胞。

本发明所述步骤一中：

所述抗体是胎儿有核红细胞表面特异性蛋白的抗体，所述特异性蛋白作为抗原标志物，包括CD14、CD32、CD35、CD36、CD45、CD47、CD71、CD147、GPA或EPO-r，上述特异性蛋白除可在有核红细胞表达外，在活化的淋巴细胞、网织红细胞、血小板表面也有一定程度的表达。在使用单一的抗体时，分选所得的胎儿有核红细胞保持较高纯度，所述抗体优选为CD147抗体蛋白；联合使用CD36与GPA或CD71与GPA抗体蛋白可以实现有核红细胞捕获的富集效果。

所述抗体可由市场购买的抗体蛋白按照常规方法与生物素进行结合后得到；或直接购买生物素标记后的抗体蛋白母液经稀释后得到，具体步骤为：取生物素标记的抗体蛋白母液，使用无菌PBS将抗体的浓度稀释10倍，在-20℃条件下保存备用。

本发明所述步骤二中：

所述纳米基底膜以纳米颗粒为原料，在玻璃衬底上制备而成，所述玻璃底衬表面应光滑、平整、干净，使纳米颗粒能够在其表面成膜。具体的，制备纳米基底膜的步骤为：使用钛酸四丁酯在去离子水中水解合成粒径为300~500nm纳米颗粒，将合成的纳米颗粒分散到有机溶剂中，优选有机溶剂的组成为0.05g月桂酸、0.2g乙基纤维素、10ml松油醇和10ml乙醇，均匀涂覆到干净玻璃表面，450~550℃高温退火10~20分钟，优选为500℃高温退火15分钟，即得表面粗糙度为40~100nm的纳米基底膜。本发明提供的纳米材料捕获基底能够增强与细胞表面化合物的相互作用，提高捕获的效果，这是其他荧光活化法和免疫磁珠法捕获有核红细胞所不具备的优势。本发明可以通过改变制备条件合成不同粒径的纳米颗粒以及控制纳米基底膜表面的粗糙度来达到有核红细胞的最佳捕获效果，作为最优选方案，本发明所使用的纳米颗粒粒径为400nm，纳米基底膜的表面粗糙度为85nm。

所述纳米基底膜的化学修饰具体包括以下步骤：使用无水乙醇清洗纳米基底膜表面；将纳米基底膜浸泡到浓度为4%的3-巯基丙基三甲氧基硅烷（MPTM）溶液中1~1.5小时，使用无水乙醇清洗3次，再使用二甲基亚砜（DMSO）清洗3次；将纳米基底膜浸泡到浓度为1mg/ml的N-马来酰亚胺琥珀酰亚胺酯（GMBS）溶液中45~60分钟，使用DMSO清洗3次，再使用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗3次；在纳米基底膜表面覆盖上50ug/ml的链霉亲和素（SA），在4℃放置过夜，即得化学修饰后的纳米基底膜。

所述抗体亲和到纳米基底膜上的方法为静置，静置时间为1~3小时，优选为2小时。

所述胎儿有核红细胞悬浮液的制备方法为常规的密度梯度离心法，其中，分离液的密度优选为1.097-1.099，离心力优选为400g。

所述在恒温细胞培养箱中静置的时间优选为1~1.5小时。

所述步骤二还包括：用PBS洗掉纳米基底膜上未被捕获的胎儿有核红细胞细胞。

本发明所述步骤三中：

“双阳性”免疫荧光染色法采用激发波长不同的荧光染料分别标记的胎儿红细胞血红蛋白抗体和胎儿有核红细胞膜蛋白抗体作为双抗体，对胎儿有核红细胞进行识别，以双抗体同时标记为阳性作为胎儿有核红细胞鉴定的标准；在众多的胎儿有核红细胞的膜蛋白中，结合使用膜蛋白CD71和细胞质蛋白ε-HbF鉴定胎儿有核红细胞特异性较高。

具体的，步骤三包括以下步骤：对胎儿有核红细胞进行预处理，用4%多聚甲醛溶液固定，固定时间优选为10分钟；用0.1%的Triton X-100 溶液打孔，打孔时间优选为10分钟；使用封闭液封闭，封闭时间优选为10分钟；加入含有激发波长不同的荧光染料分别标记的CD71抗体和ε-HbF抗体的混合液，所述混合液的配制比例为ε-HbF抗体: CD71抗体: 封闭液(w%) =0.5-1.5：0.5-1.5：6-10，优选所述混合液的配置比例为ε-HbF: CD71: 封闭液(w%)=1: 1: 8，在4℃下避光保存过夜；使用浓度为0.1ug/ml的细胞核染料DAPI复染细胞核，复染时间优选为10分钟；用去离子水清洗后置于荧光显微镜下观察，并使用CCD拍摄结果。

本发明所述磷酸盐缓冲液的浓度优选0.09~0.11mol/L。

本发明所述胎儿有核红细胞的鉴定标准为：胎儿有核红细胞荧光结果为anti-ε-HbF亮/ anti-CD71亮/DAPI亮，并且anti-ε-HbF 和 DAPI 荧光亮度形成互补，细胞尺寸为10-30um；白细胞的荧光结果为anti-ε-HbF不亮/ anti- CD71稍亮/DAPI亮，细胞尺寸小于15um。

与现有技术相比，本发明提供的方法具有显著优点，主要表现在：（1）使用新型抗体蛋白实现对特殊细胞的识别捕获对于新型抗体蛋白的相关研究有重要意义；（2）利用新型抗体对胎儿有核红细胞进行特异性识别捕获，可以有效提高目标细胞的识别捕获效率，对于胎儿有核红细胞的相关研究有重要意义；（3）运用“双阳性”免疫荧光蛋白对胎儿有核红细胞进行鉴定分析，可以提高鉴别的可靠性和灵敏度，有助于胎儿有核红细胞的相关研究。

附图说明

图1示出了本发明所述方法的流程图。

图2示出了纳米基底膜的实物图。

图3示出了新型抗体对胎儿有核红细胞捕获的示意图，其中，100为玻璃衬底，200为纳米颗粒，胎儿有核红细胞300的表面抗原被特异性抗体201识别捕获。

图4示出了特异性识别捕获的明场效果图；其中200表示纳米基底膜，300表示捕获到基底上的细胞。

图5示出了方法利用“双阳性”免疫荧光蛋白染色鉴定胎儿有核红细胞的荧光效果图；其中a、e为血红蛋白荧光（红色）,b、f为转铁蛋白荧光（绿色），c、g为细胞核（蓝色），d、h为荧光合成图，a、b、c均有荧光表示为胎儿有核红细胞；而e、f不亮，仅g有荧光表示为白细胞。

图6示出了根据本发明方法利用“双阳性”免疫荧光蛋白染色鉴定胎儿有核红细胞的荧光合成图；根据“双阳性”鉴定标准，其中白色圆圈中标示出为胎儿有核红细胞，其他亮点为白细胞。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明利用新型抗体蛋白用于胎儿有核红细胞特异性识别捕获以及利用“双阳性”免疫荧光染色法鉴定胎儿有核红细胞的方法涉及参数较多，因此具体的实施例仅作为对本发明实现方式的示例性说明，而不构成对本发明保护范围的限制。下面将以本发明提供的利用新型抗体蛋白用于胎儿有核红细胞特异性识别捕获以及利用“双阳性”免疫荧光染色法鉴定胎儿有核红细胞方法的具体操作过程作为实施例进行进一步描述。

其中，PBS表示磷酸盐缓冲液，pH=7.4，与人体血液等渗，主要成分为磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠以及氯化钾；

生物素标记的CD147抗体（biotinylatedanti-CD147）购买自Sino BiologicalInc公司；

3-巯基丙基三甲氧基硅烷（MPTMS）和N-马来酰亚胺琥珀酰亚胺酯（GMBS）均购自Sigma公司，链霉亲和素（SA）购自Invitrogen公司；

封闭液由3% 牛血清白蛋白（BSA） + 5% 羊血清 + 0.1% 吐温-20配制而成；

红色荧光ε-HbF抗体为藻红蛋白（PE）标记的抗ε-HbF抗体，0.2mg/ml，购自BDBiosciences公司，绿色荧光CD71抗体为异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗CD71抗体，购自BDBiosciences公司。

实施例1：纳米基底膜的制备及修饰

1）纳米基底膜的制备：使用的钛酸四丁酯在去离子水中水解合成粒径400nm的纳米颗粒，将合成的纳米颗粒分散到由0.05g月桂酸、0.2g乙基纤维素、10ml松油醇和10ml乙醇组成的有机溶剂中，均匀涂覆到干净玻璃表面，500℃高温退火15分钟，得到表面粗糙度为85nm的纳米基底膜；所得纳米基底膜实物图如图2所示；

2）纳米基底膜的修饰：使用无水乙醇清洗步骤1）所得纳米基底膜的表面；将纳米基底膜浸泡到浓度为4%的MPTMS溶液中1小时，使用无水乙醇清洗3次，再使用DMSO清洗3次；将纳米基底膜浸泡到浓度为1mg/ml的GMBS溶液中45分钟，使用DMSO清洗3次，再使用PBS清洗3次；在纳米基底膜表面覆盖上20ul浓度为50ug/ml的SA，并在4℃放置6小时，即得化学修饰后的纳米基底膜。

实施例2：含有胎儿有核红细胞的悬浮液的制备

取脐带血，采用常规密度梯度离心法进行分离，即得含有胎儿有核红细胞的悬浮液；其中，分离液的密度为1.098，离心力为400g。

实施例3：胎儿有核红细胞的捕获及识别

1、根据图1示出的本发明一个实施方式利用新型抗体蛋白用于胎儿有核红细胞特异性识别捕获以及利用“双阳性”免疫荧光染色法鉴定胎儿有核红细胞的方法，具体步骤为：

S1100：使用无菌PBS将生物素标记的CD147抗体蛋白母液稀释至浓度为100ug/ml，并用灭菌后的离心管保存在-20℃下；

S1200：滴加S1100所得抗体10ul到实施例1所得修饰后的纳米基底膜上，静置2小时，用PBS清洗掉多余的抗体；加入实施例2所得含有胎儿有核红细胞的悬浮液，在37℃恒温细胞培养箱中放置1小时，使胎儿有核红细胞被纳米基底膜上的抗体捕获；使用PBS轻轻清洗3遍，以去除未捕获或者非特异性吸附的胎儿有核红细胞；该步骤所述捕获的示意图如图3所示；

S1300：在S1200所得捕获后的胎儿有核红细胞中，加入4%多聚甲醛溶液1ml，静置10分钟后，用PBS清洗；再加入0.1%的Triton X-100溶液1ml，静置10分钟后，用PBS清洗；再加入封闭液1ml，静置10分钟；加入荧光蛋白抗体混合液，所述混合液的组成为：红色荧光ε-HbF抗体2ul+绿色荧光CD71抗体2ul+封闭液16ul，在4℃下避光保存8小时；用PBS洗去多余染料后，滴加浓度为0.1ug/ml的DAPI 100ul，复染细胞核10分钟，用去离子水清洗，避光自然干燥；放置到荧光显微镜下观察细胞免疫荧光染色结果，并分析和记录；

胎儿有核红细胞的鉴定标准为：胎儿有核红细胞荧光结果为anti-ε-HbF亮（红色）/ anti-CD71亮（绿色）/DAPI亮（蓝色），并且anti-ε-HbF 和 DAPI 荧光亮度形成互补，细胞尺寸为10-30um；白细胞的荧光结果为anti-ε-HbF不亮/ anti- CD71稍亮/DAPI亮，细胞尺寸小于15um；

S1400：观测完成后用去离子水和乙醇对基底进行冲洗，至此步骤S1400结束。

2、捕获及鉴定结果：

1）操作S1200所述捕获的显微镜明场效果图结果如图4所示，该图可以看出新型抗体能够有效实现胎儿有核红细胞的识别捕获；

2）操作S1300所述鉴定的荧光显微镜效果图如图5和6所示；其中，图5示出利用“双阳性”免疫荧光染色法鉴定胎儿有核红细胞的荧光图，可以看出胎儿有核红细胞与白细胞的区别，通过图6示出利用“双阳性”免疫荧光染色法鉴定胎儿有核红细胞的合成荧光图，可以看出有本发明方法可以实现胎儿有核红细胞的高效识别和鉴定。

上述实施例对本发明进行说明而不是对本发明进行限制，并且本领域技术人员在不脱离所附权利要求范围的情况下可设计出替换实施例。在权利要求中，不应将位于括号之间的任何参考符号构造成对权利要求的限制。单词“包含”不排除存在未列在权利要求中的元件或步骤。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种胎儿有核红细胞的捕获及鉴定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤一:制备生物素标记的抗体，所述抗体为识别一种或多种胎儿有核红细胞表面特异性蛋白的抗体；

步骤二：将步骤一所得抗体亲和到化学修饰后的纳米基底膜上，再加入胎儿有核红细胞悬浮液，在恒温细胞培养箱中静置，使胎儿有核红细胞被纳米基底膜上的抗体捕获；

所述化学修饰的纳米基底膜的制备包括两个步骤：(1)纳米基底膜的制备；(2)纳米基底膜的化学修饰；其中，在纳米基底膜的制备步骤，以纳米颗粒为原料，在玻璃衬底上制备而成，所述玻璃底衬表面光滑、平整、干净，从而使纳米颗粒能够在其表面成膜；所述纳米颗粒粒径为400nm，所得纳米基底膜的粗糙度为85nm；制备得到纳米基底膜后，对其进行化学修饰，得到经化学修饰的纳米基底膜；

其中，所述抗体亲和的方法为静置，所述静置时间为1～3小时；

步骤三：以激发波长不同的荧光染料分别标记的胎儿红细胞血红蛋白抗体和胎儿有核红细胞膜蛋白抗体作为双抗体，采用“双阳性”免疫荧光染色法鉴定经步骤二捕获的胎儿有核红细胞；

其中，步骤三具体包括：在步骤二所得捕获后的胎儿有核红细胞中，加入4％多聚甲醛溶液固定，用PBS清洗；再加入0.1％的TritonX-100溶液打孔，用PBS清洗；再加入封闭液封闭；加入荧光蛋白抗体混合液，所述混合液由以下重量比的成分配置而成：ε-HbF抗体:CD71抗体:封闭液＝0.5-1.5：0.5-1.5：6-10，在4℃下避光保存过夜；用PBS清洗，使用细胞核染料DAPI复染细胞核，用去离子水清洗，避光自然干燥；放置到荧光显微镜下观察细胞免疫荧光染色结果，并分析和记录，ε-HbF抗体和CD71抗体均标记为阳性且细胞核染色呈阳性的细胞为胎儿有核红细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一所述胎儿有核红细胞表面特异性蛋白为CD147。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤二所述纳米基底膜由以下步骤制备而成：采用钛酸四丁酯水解合成粒径300-500nm的纳米颗粒，然后将其分散到有机溶剂中，均匀涂覆在干净玻璃表面，450～550℃高温退火10～20分钟，即得表面粗糙度为40～100nm的纳米基底膜。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，制备纳米基底膜的步骤为：使用钛酸四丁酯在去离子水中水解合成粒径为300～500nm纳米颗粒，将合成的纳米颗粒分散到有机溶剂中，有机溶剂的组成为0.05g月桂酸、0.2g乙基纤维素、10ml松油醇和10ml乙醇，均匀涂覆到干净玻璃表面，500℃高温退火15分钟，即得表面粗糙度为40～100nm的纳米基底膜。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤二所述纳米基底膜化学修饰的步骤为：使用无水乙醇清洗纳米基底膜表面；将纳米基底膜浸泡到浓度为4％的MPTM溶液中1～1.5小时，使用无水乙醇清洗，再使用DMSO清洗；将纳米基底膜浸泡到浓度为1mg/ml的GMBS溶液中45～60分钟，使用DMSO清洗，再使用PBS清洗；在纳米基底膜表面覆盖上50ug/ml的SA，在4℃放置过夜，即得化学修饰后的纳米基底膜。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤二所述抗体亲和的方法为静置，所述静置时间为2小时。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤二所述在恒温细胞培养箱中静置的时间为1～1.5小时。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤三所述双抗体为CD71的抗体和ε-HbF的抗体。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤三中对步骤二所得捕获后的胎儿有核红细胞进行预处理，用4％多聚甲醛溶液固定，固定时间为10分钟；用PBS清洗；

用0.1％的Triton X-100溶液打孔，打孔时间为10分钟，用PBS清洗；

使用封闭液封闭，封闭时间为10分钟；

加入含有激发波长不同的荧光染料分别标记的CD71抗体和ε-HbF抗体的混合液，所述混合液的配制比例为ε-HbF:CD71:封闭液(w％)＝1:1:8，在4℃下避光保存过夜；

使用浓度为0.1ug/ml的细胞核染料DAPI复染细胞核，复染时间为10分钟；用去离子水清洗后，避光自然干燥；而后置于荧光显微镜下观察，并使用CCD拍摄结果，分析和记录，ε-HbF抗体和CD71抗体均标记为阳性且细胞核染色呈阳性的细胞为胎儿有核红细胞。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合液由以下重量比的成分配置而成：红色荧光ε-HbF抗体:绿色荧光CD71抗体:封闭液＝1:1:8。