CN115109780B - 一种特异性识别并结合循环胎儿有核红细胞的核酸适体、互补序列及它们的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种特异性识别并结合循环胎儿有核红细胞的核酸适体、互补序列及它们的应用；利用核酸适体与外周血中胎儿细胞的特异性结合实现稀有细胞的分离富集。本发明方法具有以下显著优势：1)发展了新型胎儿细胞捕获及无损释放方法，具有重要临床意义；2)基于临床样本筛选的特异性探针，具有更强的临床适用性；3)核酸适体在识别过程中对循环胎儿有核红细胞特异性强、亲和力高，准确性和灵敏度好；4)核酸适体探针生产制备简单、重复性好，稳定性好、易存储运输。为产前疾病筛查与诊断提供了新的方法与途径。
Description
技术领域
本发明属于稀有细胞分离富集技术领域，具体涉及一种识别富集外周血中循环胎儿有核红细胞的核酸适体、无损分离互补释放序列及它们的应用。
背景技术
循环胎儿有核红细胞是指在妊娠期间经母体-胎盘物质交换进入母亲血液循环中的胎儿有核红细胞。循环胎儿有核红细胞直接来源于胎儿血液组织且包含胎儿完整的遗传信息，理论上可实现胎儿遗传性疾病的全基因组分析和诊断；此外，其具有生命周期短，分娩后快速从母体外周血中消失，不受既往妊娠影响等优势，是目前公认最理想的无创产前诊断材料之一。然而，母体外周血中的循环胎儿有核红细胞含量极低，每毫升血液中仅6-10个胎儿有核红细胞。因此，特异性分离富集母体外周血中循环胎儿有核红细胞是实现全面、准确无创产前诊断的关键技术瓶颈。
目前，循环胎儿有核红细胞的分离富集方法主要包括两大类：一类是基于有核红细胞物理化学性质的分离方法，包括有密度梯度离心法、微孔过滤法和介电泳分离法，使用这类方法分离富集后的胎儿有核红细胞纯度较低，后续遗传分析过程中受大量母体细胞的干扰；另一类是基于有核红细胞表面特异性抗原的分离方法，包括有免疫磁珠分离法、流式细胞分选等。目前抗体是最常见的用于有核红细胞表面特异性抗原识别分子探针，单克隆抗体分子复杂的生产过程、生产批次间差异、苛刻的保存及运输条件，成为导致其较低富集效率的关键因素，导致基于抗原-抗体相互作用的有核红细胞捕获技术应用于外周血中微量有核红细胞捕获时，均无法满足临床应用的需求。因此，开发新型分子识别探针是该技术领域突破临床转化技术瓶颈的关键核心。
核酸适体(Aptamer)是利用指数富集配体系统进化技术(System Evolution ofLigands by Exponential Enrichment；SELEX)从核酸文库中筛选得到的一类能高特异性、高亲和力结合靶标的单链DNA/RNA序列。核酸适体与其靶标分子的识别和结合具有类似抗原-抗体相互作用的特异性和亲和力，被形象的称为“化学家的抗体”。此外，核酸适体并具有靶标范围广、易于精准制备及修饰标记、设计灵活可控、制造成本低等突出优点，在化学传感、分子医学等领域具有广泛的应用与独特的优势。
本发明直接以临床有核红细胞样本为筛选靶标，通过活细胞核酸适体筛选技术开发的核酸适体可特异性识别并高亲和结合有核红细胞，而与外周血中的母体细胞作用较弱。该核酸适体可以作为高效的分子识别探针，特异性识别和标记母体外周血中的循环胎儿有核红细胞，实现稀有循环胎儿有核红细胞的高效捕获，从而实现基于循环胎儿有核红细胞的疾病筛查与诊断。
发明内容
本发明的首要目的是提供一种高特异性、高亲和力的循环胎儿有核红细胞特异性核酸适体分子探针。
本发明的核酸适体获取方式如下：
1)采用临床新生儿脐带血中有核红细胞作为筛选靶标，有效排除细胞系与临床实际样本间的差异，增强筛选核酸适体探针的临床适用性。
2)以临床新生儿脐带血中单个核细胞进行竞争筛选(1～2轮)，通过富集复杂样本中特异性结合有核红细胞的序列，提高筛选序列的特异性。
3)以纯化的有核红细胞作为正筛细胞，以其它血液细胞混合样本作为负筛细胞，完成14轮特异性序列富集与扩增。
通过高通量测序及生物信息学分析，成功获得有核红细胞特异性核酸适体探针LXD-11，
核酸适体探针序列、结构优化及表征，成功获得特异性高、亲和力强、结构稳定的有核红细胞特异性核酸适体探针LXD-11b。
本发明的特异性识别并结合循环胎儿有核红细胞的核酸适体，能特异性识别并结合孕妇外周血中的循环胎儿有核红细胞，所述的核酸适体LXD-11序列如下：
5’-ATCCAGAGTGACGCAGCAAAGTCGTCTTTGCCAAATACCGGTCTGTCGGTGGGTATTGTGGACACGGTGGCTTAGT-3’，见SEQ ID NO.1。
进一步地，通过对所述的核酸适体LXD-11部分增加或者删减碱基，或者碱基替换获得具有相同功能的核酸适体LXD-11b序列如下：
5’-TCCAGAGTGACGCAGCAAAGTCGTCTTTGCCAAATACCGGTCTGTCGGTGGGTATTGTGGACACTCTGGC-3’，见SEQ ID NO.2。
更进一步地，所述的核酸适体标记上荧光物质、放射性物质、治疗性物质、生物素、或酶标记物质，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体衍生物。
本发明的第二个目的是提供上述的核酸适体在制备特异性识别并结合循环胎儿有核红细胞制剂中的应用。
本发明的第三个目的是提供基于上述核酸适体的循环胎儿有核红细胞识别与富集方法。
本发明的第四个目的是提供基于互补核酸序列无损释放循环胎儿有核红细胞的方法；具体是利用互补释放序列释放被上述的核酸适体识别与富集的循环胎儿有核红细胞，
针对所述的核酸适体LXD-11的互补释放序列RA1和/或RA2如下：
RA1：
5’-ACTAAGCCACCGTGTCCACAATACCCACCGACAGACCGGTAT-3’，见SEQ ID NO.3。
RA2：
5’-ACCGGTATTTGGCAAAGACGACTTTGCTGCGTCACTCTGGAT-3’，见SEQ ID NO.4；
针对所述的核酸适体LXD-11b的互补释放序列RA3和/或RA4如下：
RA3：
5’-GCCAGAGTGTCCACAATACCCACCGACAGACCGGTATTTGGC-3’，见SEQ ID NO.5；
RA4：
5’-GACCGGTATTTGGCAAAGACGACTTTGCTGCGTCACTCTGGA-3’，见SEQ ID NO.6。
具体操作如下：
外周血采集与预处理
(1)采用EDTA-K2抗凝真空采血管采集孕妇外周血10mL，12h内送达实验室。
(2)通过密度梯度离心或红细胞选择性裂解去除大量母体成熟红细胞，获得单个核细胞群(PBMCs)。
(3)核酸适体合成及修饰
通过自动化固相合成技术合成5’-末端生物素修饰的核酸适体序列(命名为LXD-11b-biotin)。
(4)循环胎儿有核红细胞富集
1)取适量的LXD-11b-biotin核酸适体，95℃加热5min，置于4℃冷却10min；
2)将PBMCs细胞用Binding Buffer(含有5mmol/L的Mg2+，4.5mg/mL的葡萄糖，0.1mg/mL的tRNA，1mg/mL的BSA)重悬，加入适量预备好的LXD-11b-biotin核酸适体，4℃振荡孵育30min，使核酸适体与循环胎儿有核红细胞充分结合；
3)离心去除过量未结合的核酸适体，加入Washing Buffer(含有5mmol/L的Mg2+，4.5mg/mL的葡萄糖)离心洗涤两次；
4)加入Anti-biotin antibody标记的磁珠进行孵育，使得核酸适体结合的细胞标记上磁珠，通过磁分选分离富集PBMCs中的循环胎儿有核红细胞。
(5)捕获的循环胎儿有核红细胞无损释放
磁分选富集的细胞中加入适量(体系中浓度2.5μM)互补释放序列，静置反应30min，通过核酸分子间的互补配对作用，破坏核酸适体的二级结构，从而实现捕获的循环胎儿有核红细胞的无损释放。
(6)捕获胎儿细胞的分析与表征
采用多靶标免疫荧光标记，通过激光共聚焦荧光显微镜观察与鉴别胎儿有核红细胞(CD71+/GPA+/Hochest+/CD45-)。
(7)对于捕获分离的胎儿有核红细胞通过荧光原位杂交技术(FISH)分析胎儿染色体。
本发明的第五个目的是提供所述的互补释放序列在制备上述的核酸适体识别与富集的循环胎儿有核红细胞无损释放制剂中的应用。
本发明的第六个目的是提供无损释放循环胎儿有核红细胞的互补释放序列，其特征在于，所述的互补释放序列RA1和/或RA2如下：
RA1：5’-ACTAAGCCACCGTGTCCACAATACCCACCGACAGACCGGTAT-3’；
RA2：5’-ACCGGTATTTGGCAAAGACGACTTTGCTGCGTCACTCTGGAT-3’；
互补释放序列RA3和/或RA4如下：
RA3：5’-GCCAGAGTGTCCACAATACCCACCGACAGACCGGTATTTGGC-3’；
RA4：5’-GACCGGTATTTGGCAAAGACGACTTTGCTGCGTCACTCTGGA-3’。
本发明的第七个目的是提供无损释放循环胎儿有核红细胞的制剂，包括所述的互补释放序列RA1和/或RA2如下：
RA1：5’-ACTAAGCCACCGTGTCCACAATACCCACCGACAGACCGGTAT-3’；
RA2：5’-ACCGGTATTTGGCAAAGACGACTTTGCTGCGTCACTCTGGAT-3’。
互补释放序列RA3和/或RA4如下：
RA3：5’-GCCAGAGTGTCCACAATACCCACCGACAGACCGGTATTTGGC-3’；
RA4：5’-GACCGGTATTTGGCAAAGACGACTTTGCTGCGTCACTCTGGA-3’。
本发明相对现有技术的优势：1)提供了一种性能优异的循环胎儿有核红细胞捕获核酸适体探针，并建立了基于核酸适体的新型循环胎儿有核红细胞的捕获或富集方法，具有广泛的应用潜力；2)采用临床样本作为筛选靶标并引入竞争筛选，大大提高了所获得的核酸适体的特异性和临床适用性；3)利用核酸适体对有核红细胞进行特异性识别捕获，可以有效提高目标细胞的识别捕获效率和纯度，对于有核红细胞的相关研究有重要意义；4)核酸适体具有易精准合成及修饰、质量可控，批次间差异小、性质稳定，易存储运输、制备成本低，可规模化生产等应用优势；5)发展了基于互补核酸序列的无损细胞释放方法，大大降低了捕获过程对于细胞的损伤和对下游分析的影响；6)为发展基于循环胎儿细胞的无创产前诊断提供了新的方法与途径，具有重要的临床意义。
附图说明
图1基于临床样本的核酸适体筛选过程示意图；
图1a为第1至2轮竞争性正筛示意图；
图1b为第3至14轮正筛与负筛示意图。
图2核酸适体LDX-11和LXD-11b结合有核红细胞的流式表征；
图2a为核酸适体LDX-11和LXD-11b与正筛细胞(有核红细胞)结合情况；
图2b为核酸适体LDX-11和LXD-11b与负筛细胞(白细胞)结合情况。
图3核酸适体LDX-11和LXD-11b结合有核红细胞的共聚焦表征；
图3a为共聚焦表征核酸适体LDX-11和LXD-11b与正筛细胞(有核红细胞)结合情况；
图3b为共聚焦表征核酸适体LDX-11和LXD-11b与负筛细胞(白细胞)结合情况。
图4核酸适体LDX-11和LXD-11b结合有核红细胞的表观解离常数(Kd)计算；
图4a为核酸适体LDX-11结合有核红细胞的表观解离常数分析；
图4b为核酸适体LDX-11b结合有核红细胞的表观解离常数分析。
图5核酸适体LDX-11、LXD-11b与核酸适体TY8结合有核红细胞位点差异性分析。
图6核酸适体LXD-11的临床样本分析结果重现性。
图6a为核酸适体LXD-11与临床样本中有核红细胞和白细胞结合情况分析；
图6b为核酸适体LXD-11结合多例临床样本中有核红细胞统计分析；
图6c为核酸适体LXD-11结合多例临床样本中白细胞统计分析。
图7核酸适体LXD-11b捕获胎儿有核红细胞的效率与纯度。
图7a为核酸适体LXD-11b捕获胎儿有核红细胞的效率分析；
图7b为核酸适体LXD-11b捕获胎儿有核红细胞的纯度分析。
图8核酸适体LXD-11的互补序列无损释放所捕获胎儿有核红细胞的效率；
图8a为互补序列竞争核酸适体LXD-11结合有核红细胞分析；
图8b为互补序列竞争释放核酸适体LXD-11效率分析；
图8c互补序列无损释放LXD-11所捕获胎儿有核红细胞的效率分析。
图9核酸适体LXD-11b的互补序列无损释放所捕获胎儿有核红细胞的效率；
图9a为互补序列竞争核酸适体LXD-11b结合有核红细胞分析；
图9b为互补序列竞争释放核酸适体LXD-11b效率分析；
图9c互补序列无损释放LXD-11b所捕获胎儿有核红细胞的效率分析。
图10核酸适体LXD-11b捕获母体外周血中循环胎儿有核红细胞和染色体分析(荧光原位杂交法)。
具体实施方式
以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
本发明中所用试剂：
SEPMATETM TUBE(STEMCELL)、Lymphoprep,500mL(STEMCELL)、CD71Microbeads,human(Miltenyi)、LS Separation columns(Miltenyi)、Taq PCR酶(TaKaRa)、Streptavidin SepharoseTM(GE)、GE illustra NAP-5Sephadex G-25(GE)、Anti-BiotinMicrobeads(Miltenyi)、PE Mouse Anti-Human Fetal Hemoglobin(BD)、APC Mouse Anti-Human CD45(BD)、Hoechst 33342(Beyotime)、XA AneuScore II Probe Kit(Metasystems)。
本发明中所用仪器：
AL204电子天平(Mettler Toledo)、Centrifuge 5418R台式离心机(Eppendorf)、Mastercycler nexus PCR仪(Eppendorf)、DxP AthenaTM流式细胞仪(Cytek)、Nikon共聚焦双光子显微镜(Nikon)、TDH-500原位杂交仪(奥盛)、显微镜玻片扫描仪PANNORAMIC MIDIII(3DHISTECH)。
实施例1：基于临床样本筛选胎儿有核红细胞核酸适体。
1).第1、2轮的竞争性正筛方法如图1a所示，从脐带血中分离富集脐带血单个核细胞(CBMCs)，加入初始文库轻柔震荡混匀，置于冰盒中避光孵育。之后，分离出有核红细胞，收集结合于胎儿有核红细胞表面的核酸适体进行PCR扩增，并制备ssDNA用于开展下一轮筛选。
2).从第3轮筛选开始引入负筛，以进一步筛选获得特异性结合胎儿有核细胞的核酸适体。负筛与正筛方法如图1b所示，首先从胎儿脐带血中分离富集单个核细胞(CBMCs)中分离出白细胞进行负筛，之后收集未结合的ssDNA，再以有核红细胞进行正筛，共进行14轮筛选。最后，通过高通量测序挑选富集文库中的候选序列。
实施例2：核酸适体LDX-11和LXD-11b结合有核红细胞的流式表征。
1).将第14轮筛选文库进行高通量测序之后，对文库中序列的同源性和丰度进行分析，挑选出候选核酸适体LXD-11，进行合成并标记FAM荧光，用于流式验证与胎儿有核红细胞的结合能力。
2).核酸适体LXD-11序列的截短、优化是基于其折叠形成的二级结构，并对两端的引物序列进行适当的截短和优化。这里将LXD-11 5’端1个碱基和3’端5个碱基截短，同时将65,66的GG碱基优化为TC碱基获得核酸适体LXD-11b(70nt,2-71,G65G66→T65C66)，进行合成并标记FAM荧光，用于验证与胎儿有核红细胞的结合能力。
3).采集新鲜脐带血，分离出其中的有核红细胞，之后使用Binding buffer重悬细胞并计数。
4).设置样品分组，每个样品细胞数量为4×105个，体系为200μL。
5).分别向每组细胞样品中加入100nM浓度的LXD-11(FAM)和LXD-11b(FAM)，轻柔震荡混匀，置于冰盒中，200rpm水平摇床，孵育60min，期间每隔20min，轻柔震荡混匀细胞。
6).孵育结束之后，再加入200μL Washing buffer洗涤1次，300g，25℃，5min离心弃上清。再加入400μL Washing buffer重悬细胞转移至流式管中，通过流式检测细胞的荧光强度。
流式结果图2表明核酸适体LDX-11和LXD-11b特异性结合胎儿有核红细胞，而不结合负筛细胞(白细胞)。
实施例3：核酸适体LDX-11和LXD-11b结合有核红细胞的共聚焦表征。
1).采集临床脐带血，分离出其中的有核红细胞和白细胞，之后使用Bindingbuffer重悬细胞并计数。
2).加入200μL Fixation/Permeabilization solution，轻柔重悬细胞。冰上，避光固定、穿膜30min。
3).300g、25℃、5min离心，弃尽上清，加入200μL 1×BD Perm/WashTM buffer，轻柔重悬细胞，洗涤1次。再加入100μL 1×BD Perm/WashTM buffer和100μL Binding buffer重悬细胞，分装成3组样品分别为：Library、LXD-11、LXD-11b。
4).向每组样品中依次加入10μL Hochest 33342、50pmol FAM-aptamer、2.5μLHbF和10μL CD45，其中Hochest 33342用于标记有核红细胞的细胞核，HbF用于标记有核红细胞内胎儿血红蛋白，CD45为有核红细胞的阴性标志物，用于标记白细胞，即Hochest+/HbF+/CD45-的细胞为胎儿有核红细胞，Hochest+/HbF-CD45+的细胞为白细胞，而FAM-aptamer用于表征LXD-11、LXD-11b是否特异性结合胎儿有核红细胞。轻柔混匀细胞，置于冰上，80rpm/min，避光孵育60min。
5).300g、25℃、5min离心，弃尽上清，加入200μL Washing buffer，轻柔重悬细胞，洗涤1次。
6).300g、25℃、5min离心，弃尽上清，加入200μL Washing buffer，轻柔重悬细胞，并转移至共聚焦光学皿，通过共聚焦表征核酸适体LDX-11和LXD-11b与有核红细胞的结合情况。
图3共聚焦结果表明核酸适体LDX-11和LXD-11b特异性结合Hochest+/HbF+/CD45-的胎儿有核红细胞，而不结合Hochest+/HbF-/CD45+的白细胞。
实施例4：核酸适体LDX-11和LXD-11b结合有核红细胞的表观解离常数(Kd)计算。
1).采集新鲜脐带血，分离出其中的有核红细胞，之后使用Binding buffer重悬细胞并计数。
2).设置样品分组，每组样品设置核酸适体的浓度梯度为0、25、50、100、150、250、400、600nM，而且每个浓度梯度设置3个样品，每个样品细胞数量为4×105个，体系为200μL。
3).分别向每组细胞样品中加入相应的浓度的LXD-11和LXD-11b，轻柔震荡混匀，置于冰盒中，200rpm水平摇床，孵育60min，期间每隔20min，轻柔震荡混匀细胞。
4).孵育结束之后，再加入200μL Washing buffer洗涤1次，300g，25℃，5min离心弃上清。再加入400μL Washing buffer重悬细胞转移至流式管中，通过流式检測细胞的荧光强度并计算Kd值。
图4结果表明核酸适体LDX-11与胎儿有核红细胞具有相当高的亲和力，其Kd值为46.70±5.67nM；而且LXD-11b序列经截短优化后，获得了更强的亲和力，Kd值为40.55±4.58nM。
实施例5：核酸适体LDX-11、LXD-11b与核酸适体TY8结合有核红细胞位点差异性分析。
1).采集新鲜脐带血，分离出其中的有核红细胞，之后使用Binding buffer重悬细胞并计数。
2).设置样品分组分别为：Cell control、Library、TY8-FAM、TY8-FAM+1.5μΜLibrary、TY8-FAM+1.5μΜ LXD-11、TY8-FAM+1.5μΜ LXD-11b，其中TY8-FAM终浓度为200nM，加入的竞争核酸适体LXD-11和LXD-11b不带修饰，每个样品细胞数量为4×105个，体系为200μL。
3).将每组样品轻柔震荡混匀，置于冰盒中，200rpm水平摇床，孵育60min，期间每隔20min，轻柔震荡混匀细胞。
4).孵育结束之后，再加入200μL Washing buffer洗涤1次，300g，25℃，5min离心弃上清。再加入400μL Washing buffer重悬细胞转移至流式管中，通过流式检测细胞的荧光强度并分析核酸适体LDX-11、LXD-11b与核酸适体TY8结合有核红细胞位点是否存在差异。若核酸适体之间不存在竞争，那么LDX-11、LXD-11b与TY8结合有核红细胞不同位点。
图5流式结果表明，核酸适体LDX-11、LXD-11b与TY8之间并不存在竞争，即核酸适体LDX-11、LXD-11b与TY8结合于有核红细胞膜表面不同的位点。实施例6：核酸适体LXD-11的临床样本分析结果重现性。
1).在确认核酸适体LXD-11能够特异性结合胎儿有核红细胞之后，随机采集多例临床脐带血，分离出其中的有核红细胞和白细胞，之后使用Binding buffer重悬细胞并计数。
2).设置样品分组分别为：Cell control、Library、LXD-11；之后向各样品中加入终浓度为200nM的核酸适体。
3).将每组样品轻柔震荡混匀，置于冰盒中，200rpm水平摇床，孵育60min，期间每隔20min，轻柔震荡混匀细胞。
4).孵育结束之后，再加入200μL Washing buffer洗涤1次，300g，25℃，5min离心弃上清。再加入400μL Washing buffer重悬细胞转移至流式管中，通过流式检测细胞的荧光强度并统计分析核酸适体LDX-11是否稳定结合不同临床样本中的胎儿有核红细胞。
图6流式结果表明，核酸适体LDX-11能够特异性结合不同临床样本中的胎儿有核红细胞，而不结合白细胞，具有临床普适性。
实施例7：核酸适体LXD-11b捕获胎儿有核红细胞的效率与纯度。
1).采集新鲜脐带血，通过密度梯度离心获得CBMCs，之后使用Binding buffer重悬富集的CBMCs并计数。设置样品分组，分别为Library-biotin和LXD-11b-biotin，每个样品2-4×107个细胞，体系为180μL。
2).分别向每组细胞样品中加入相应的核酸适体至终浓度为1000nM，轻柔震荡混匀，置于冰盒中，200rpm水平摇床，孵育60min，期间每隔20min，轻柔震荡混匀细胞。
3).孵育结束之后，25℃，300g；5min离心，弃尽上清，并洗涤细胞1次，之后加入Anti-biotin MicroBeads，轻柔震荡混匀，置于冰盒中，200rpm水平摇床，孵育30min，期间每隔15min，轻柔震荡混匀细胞。
4).孵育结束之后，通过磁分选获得aptamer捕获分离的各部分细胞，同时进行多标志物免疫荧光特异性标记其中的胎儿有核红细胞，并分析捕获效率、捕获纯度。
图7结果表明，核酸适体LXD-11b可以实现高效率、高纯度捕获分离胎儿有核红细胞，其捕获效率高达94.1％，而且捕获分离的胎儿有核红细胞纯度达92.2％。
实施例8：核酸适体LXD-11的互补序列无损释放所捕获胎儿有核红细胞的效率。
1).采集新鲜脐带血，通过密度梯度离心获得CBMCs，之后使用Binding buffer重悬富集的CBMCs并计数。
2).向每组细胞样品中加入LXD-11至终浓度为500nM，轻柔震荡混匀，置于冰盒中，200rpm水平摇床，孵育60min，期间每隔20min，轻柔震荡混匀细胞。
3).孵育结束之后，25℃，300g；5min离心，弃尽上清，并洗涤细胞1次，之后加入Anti-biotin MicroBeads，轻柔震荡混匀，置于冰盒中，200rpm水平摇床，孵育30min，期间每隔15min，轻柔震荡混匀细胞。
4).孵育结束之后，通过磁分选富集LXD-11捕获的有核红细胞。之后，向分选柱中加入50倍浓度的互补序列RA1或RA2(500μL)，室温孵育45min。向分选柱中加入6mL Washingbuffer，3mL/次，洗涤互补序列竞争释放的有核细胞，收集分选柱保留和流出的细胞，并计数分析无损释放所捕获胎儿有核红细胞的效率。
图8结果表明，互补序列RA1和RA2可以有效地竞争LXD-11与有核红细胞的结合，而且在LXD-11捕获有核红细胞之后，加入互补序列RA1或RA2可以实现有核红细胞的无损释放，其释放效率分别达64.2％、60.4％。
实施例9：核酸适体LXD-11b的互补序列无损释放所捕获胎儿有核红细胞的效率。
1).采集新鲜脐带血，通过密度梯度离心获得CBMCs，之后使用Binding buffer重悬富集的CBMCs并计数。
2).向每组细胞样品中加入LXD-11b至终浓度为500nM，轻柔震荡混匀，置于冰盒中，200rpm水平摇床，孵育60min，期间每隔20min，轻柔震荡混匀细胞。
3).孵育结束之后，25℃，300g；5min离心，弃尽上清，并洗涤细胞1次，之后加入Anti-biotin MicroBeads，轻柔震荡混匀，置于冰盒中，200rpm水平摇床，孵育30min，期间每隔15min，轻柔震荡混匀细胞。
4).孵育结束之后，通过磁分选富集LXD-11b捕获的有核红细胞。之后，向分选柱中加入50倍浓度的互补序列RA3或RA4(500μL)，室温孵育45min。向分选柱中加入6mL Washingbuffer，3mL/次，洗涤互补序列竞争释放的有核细胞，收集分选柱保留和流出的细胞，并计数分析无损释放所捕获胎儿有核红细胞的效率。
图9结果表明，互补序列RA3和RA4可以有效地竞争LXD-11b与有核红细胞的结合，而且在LXD-11b捕获有核红细胞之后，加入互补序列RA3或RA4可以实现有核红细胞的无损释放，其释放效率分别达67.8％、61.2％。
实施例10：核酸适体LXD-11b捕获母体外周血中循环胎儿有核红细胞和染色体分析(荧光原位杂交法)。
1).核酸适体LXD-11b捕获分离孕妇外周血中胎儿有核红细胞方法与实施例6一致，区别在于这里采集的是孕妇外周血。对于LXD-11b捕获分离的细胞通过多标志物免疫荧光技术特异性标记，并使用共聚焦分析其中的有核红细胞。
2).胎儿有核红细胞染色体分析：采集经临床羊水穿刺确诊为男胎、21三体的孕妇外周血样本，并使用LXD-11b捕获分离其中的胎儿有核红细胞，并通过荧光原位杂交技术(FISH)分析胎儿的染色体。
图10共聚焦结果表明，核酸适体LXD-11b可以从孕妇外周血中分离富集Hochest+/GPA+/CD71+/CD45-的胎儿有核红细胞；而且经羊水穿刺确认为男胎的孕妇，核酸适体LXD-11b也可以从该孕妇外周血中分离富集含有Y染色体信号的胎儿有核红细胞；最后，经羊水穿刺确诊胎儿为21三体综合征的孕妇，核酸适体LXD-11b依然可以从该孕妇外周血中分离富集含有21三体染色体信号的胎儿有核红细胞，因此核酸适体LXD-11b可成功用于分离富集孕妇外周血中的胎儿有核红细胞，并实现对胎儿染色体异倍体疾病的筛查。
序列表
<110> 湖南大学
<120> 一种特异性识别并结合循环胎儿有核红细胞的核酸适体、互补序列及它们的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atccagagtg acgcagcaaa gtcgtctttg ccaaataccg gtctgtcggt gggtattgtg 60
gacacggtgg cttagt 76
<210> 2
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tccagagtga cgcagcaaag tcgtctttgc caaataccgg tctgtcggtg ggtattgtgg 60
acactctggc 70
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
actaagccac cgtgtccaca atacccaccg acagaccggt at 42
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
accggtattt ggcaaagacg actttgctgc gtcactctgg at 42
<210> 5
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gccagagtgt ccacaatacc caccgacaga ccggtatttg gc 42
<210> 6
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaccggtatt tggcaaagac gactttgctg cgtcactctg ga 42
Claims (7)
1.一种特异性识别并结合循环胎儿有核红细胞的核酸适体，其特征在于，能特异性识别并结合孕妇外周血中的循环胎儿有核红细胞，所述的核酸适体LXD-11序列如下：5’-ATCCAGAGTGACGCAGCAAAGTCGTCTTTGCCAAATACCGGTCTGTCGGTGGGTATTGTGGACACGGTGGCTTAGT-3’。
2.根据权利要求1所述的特异性识别并结合循环胎儿有核红细胞的核酸适体，其特征在于，通过对所述的核酸适体LXD-11部分增加或者删减碱基，或者碱基替换获得具有相同功能的核酸适体LXD-11b序列如下：5’-TCCAGAGTGACGCAGCAAAGTCGTCTTTGCCAAATACCGGTCTGTCGGTGGGTATTGTGGACACTCTGGC-3’。
3.根据权利要求1或2所述的特异性识别并结合循环胎儿有核红细胞的核酸适体，其特征在于，所述的核酸适体标记上荧光物质、放射性物质、治疗性物质、生物素、或酶标记物质，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体衍生物。
4.权利要求1-3任一项所述的核酸适体在制备特异性识别并结合循环胎儿有核红细胞制剂中的应用。
5.一种基于核酸适体的循环胎儿有核红细胞识别与富集方法，其特征在于，所述核酸适体包括权利要求1-3任一项所述的核酸适体。
6.一种基于互补核酸序列无损释放循环胎儿有核红细胞的方法，其特征在于，利用互补释放序列释放被权利要求1-3任一项所述的核酸适体识别与富集的循环胎儿有核红细胞，针对所述的核酸适体LXD-11的互补释放序列RA1和/或RA2如下：
RA1：5’-ACTAAGCCACCGTGTCCACAATACCCACCGACAGACCGGTAT-3’；
RA2：5’-ACCGGTATTTGGCAAAGACGACTTTGCTGCGTCACTCTGGAT-3’；
针对所述的核酸适体LXD-11b的互补释放序列RA3和/或RA4如下：
RA3：5’-GCCAGAGTGTCCACAATACCCACCGACAGACCGGTATTTGGC-3’；
RA4：5’-GACCGGTATTTGGCAAAGACGACTTTGCTGCGTCACTCTGGA-3’。
7.权利要求6中所述的互补释放序列在制备被权利要求1-3任一项所述的核酸适体识别与富集的循环胎儿有核红细胞无损释放制剂中的应用。
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2022
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Non-Patent Citations (1)
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| Aptamer-Mediated Enrichment of Rare Circulating Fetal Nucleated Red Blood Cells for Noninvasive Prenatal Diagnosis;Li Xiaodong等;Analytical Chemistry;20230315;第95卷;第5419-5427页 * |
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