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CN103154036B - 天然人蛋白片段的融合蛋白以产生有序多聚化免疫球蛋白fc组合物 - Google Patents

天然人蛋白片段的融合蛋白以产生有序多聚化免疫球蛋白fc组合物 Download PDF

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CN103154036B CN201180046311.6A CN201180046311A CN103154036B CN 103154036 B CN103154036 B CN 103154036B CN 201180046311 A CN201180046311 A CN 201180046311A CN 103154036 B CN103154036 B CN 103154036B
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Abstract

本发明涉及免疫球蛋白Fc的一系列完全重组的多聚化形式，所述多聚化形式因此向免疫细胞受体提供多价免疫球蛋白Fc。所述融合蛋白作为同型二聚体级分和高度有序的多聚体级分存在，称作斯塔都聚体。与同型二聚体级分相比，纯化的多聚体斯塔都聚体对Fc？Rs具有更高的亲和力和亲合力，同时解离更慢，并且用于治疗和预防疾病。本发明显示，将IgG1？Fc区直接连接于多聚化结构域导致增强的多聚化和生物学活性。

Description

天然人蛋白片段的融合蛋白以产生有序多聚化免疫球蛋白FC组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年7月28日提交的美国临时申请No.:61/368,465的优先权，该申请的内容以引用的方式整体并入。
电子方式提交的文本文件的描述
随本文以电子方式提交的文本文件的内容以引用方式整体并入本文：序列表的计算机可读格式副本(文件名：GLIK_006_01US_SeqList_ST25.txt，记录日期：2011年7月26日，文件大小61千比特)。
发明领域
本发明一般地涉及免疫学、自身免疫性、炎症和肿瘤免疫学领域。更具体地，本发明涉及包含天然连接的免疫球蛋白Fc结构域的生物活性的生物模拟物分子、包含这类生物模拟物的组合物和制造及使用这类生物模拟物的方法。
本发明还涉及治疗和预防由淋巴细胞、NK细胞、单核细胞源性细胞和与单核细胞源性细胞相互作用的免疫细胞介导的病理学病状，并且更具体地涉及连接的IgGFc片段的稳定化功能部分用于这类治疗和预防的用途。
自20世纪50年代早期以来，已经使用来自人血浆的免疫球蛋白产品来治疗免疫缺损病症，并且最近且更常见地，用于治疗自身免疫疾病和炎性疾病。
最初，通过肌内注射施用免疫球蛋白产品。最近，已经使用静脉内用免疫球蛋白(IVIG)并且起初显示它有效治疗自身免疫性疾病-特发性血小板减少性紫癜(ITP)(ImbachP,BarandunS,d'ApuzzoV,等人:High-doseintravenousgammaglobulinforidiopathicthrombocytopenicpurpurainchildhood.Lancet1981年6月6日;1(8232):1228-31)。人IVIG(在本文中称作“hIVIG”)是从汇集的人血浆中制造的无菌、纯化免疫球蛋白G(IgG)产物的制剂，其一般含有多于95%未修饰的IgG，仅具有微小和可变量的免疫球蛋白A(IgA)或免疫球蛋白M(IgM)(见，例如，RutterA,LugerTA:High-doseintravenousimmunoglobulins:anapproachtotreatsevereimmune-mediatedandautoimmunediseasesoftheskin.JAmAcadDermatol2001年6月;44(6):1010-24)。如今，hIVIG的单一最常见临床用途是治疗慢性炎性脱髓鞘多发性神经病。
尽管hIVIG已经是一种有效的临床疗法，hIVIG疗法存在几项缺点，包括不充分灭菌的可能、存在杂质或感染介质(包括病毒和朊病毒)、缺少这种汇集的人血液产品的可获得性、批次间变异、高昂花费、影响肾功能的巨大蛋白质负担和施用时间长，通常经过多个小时和有时每月连续两日。具体而言，hIVIG制品可以在它们的免疫球蛋白A(IgA)含量方面大幅变动，这可能令人担忧，因为IgA可能在缺乏IgA的受体中引起变应性和过敏性反应。鉴于hIVIG的不利方面，需要治疗自身免疫疾病和炎性疾病的改良手段并且尤其需要多样来源的重组产生的产品，所述产品具有至少等同的功效、更大的效力、较短的施用时间和更高的纯度。
此外，多种类型的多种病理学病由源自单核细胞、淋巴细胞和NK细胞的细胞介导。在许多(若非全部)这类病状中使用的治疗性和/或预防性新药物将满足重要的未满足的医疗需要并且有商业价值。
hIVIG的许多免疫调节特性存在于IgG分子的Fc结构域中。例如，在ITP的鼠模型中，未修饰hIVIG和单独的Fc片段两者在恢复血小板计数方面显示治疗功效，而分离的hIVIGFab片段没有治疗性(Samuelsson,A.,Towers,T.L.和Ravetch,J.V.Anti-inflammatoryActivityofhIVIGMediatedThroughtheInhibitoryFcReceptor.Science291,484-486(2001))。另外，hIVIG的Fc，但非Fab片段，在治疗儿童和成人特发性血小板减少性紫癜方面也是治疗有效的(Follea,G.等人,Intravenousplasmin-treatedgammaglobulintherapyinidiopathicthrombocytopenicpurpura.NouvRevFrHematol27,5-10(1985)；Solal-Celigny,P.,Bernard,J.,Herrera,A.和Biovin,P.Treatmentofadultautoimmunethrombocytopenicpurpurawithhigh-doseintravenousplasmin-cleavedgammaglobulins.ScandJHaematol31,39-44(1983)；Debre,M.和Bonnet,M.-C.InfusionofFcgammafragmentsfortreatmentofchildrenwithacuteimmunethrombocytopenicpurpura.Lancet342,945-49(1993)；Burdach,S.E.,Evers,K.和Geurson,R.TreatmentofacuteidiopathicthrombocytopenicpurpuraofchildhoodwithintravenousimmunoglobulinG:Comparativeefficacyof7Sand5Spreparations.JPediatr109,770-775(1986))。
除了可以区分成活化性和抑制性成员的经典Fcγ-受体家族外，属于主要组织相容性I类(MHC-I)分子家族的新生儿Fc-受体(FcRn)和属于C型凝集素家族的SignR1/DC-SIGN可以与IgGFc-片段结合(Nimmerjahn和Ravetch,Antibody-mediatedmodulationofimmuneresponses,ImmunologicalReviews,236:265-275(2010)。另外，存在免疫球蛋白Fc分子与之结合并且产生生理效应的Fcγ受体样受体(DavisRS.“FcReceptor-likemolecules”Annu.Rev.Immunol.2007.25:525-60)。hIVIG的治疗作用起初由Fcγ受体(FcγR)介导并且对其长期致耐受性作用而言，依赖于树突状细胞(DC)-巨噬细胞交互作用。在ITP的鼠模型中，FcγRIIIa在引发阶段发挥必要作用并且FcγRIIb是效应阶段要求的(Samuelsson,A.,Towers,T.L.和Ravetch,J.V.Anti-inflammatoryActivityofhIVIGMediatedThroughtheInhibitoryFcReceptor.Science291,484-486(2001)；Siragam,V.等人,IntravenousimmunoglobulinamelioratesITPviaactivatingFcγreceptorsondendriticcells.NatMed12,688(2006))。类似地，人类研究显示，抗Fcγ受体抗体有效治疗耐受性ITP(Clarkson,S.等人,Treatmentofrefractoryimmunethrombocytopenicpurpurawithananti-Fcgamma-receptorantibody.NEnglJMed314,1236-1239(1986))。重要地，长期致耐受作用由细胞-细胞相互作用介导，原因是过继转移hIVIG处理的DC有效治疗ITP的鼠模型(Siragam,V.等人,IntravenousimmunoglobulinamelioratesITPviaactivatingFcγreceptorsondendriticcells.NatMed12,688(2006))。
hIVIG的免疫调节作用要求FcγR的聚集。FcγR的聚集由hIVIG中存在的IgG“二聚体”(5-15%的总hIVIG)介导(Bleeker,W.K.等人,Vasoactivesideeffectsofintravenousimmunoglobulinpreparationsinaratmodelandtheirtreatmentwithrecombinantplatelet-activatingfactoracetylhydrolase.Blood95,1856-1861(2000))。例如，已知的IVIG免疫循环性临床降血压作用与IVIG中存在“二聚体”相关(KroezM等人,HypotensionwithIntravenousImmunoglobulinTherapy:importanceofpHanddimerformation.Biologicals31(2003)277-286)。例如，在ITP的鼠模型中，用“二聚体”(完整同型二聚免疫球蛋白分子的二聚体)含量高的hIVIG治疗增强了血小板计数，而hIVIG“单体”(完整同型二聚免疫球蛋白分子)无效(Teeling,J.L.等人,TherapeuticefficacyofintravenousimmunoglobulinpreparationsdependsontheimmunoglobulinGdimers:studiesinexperimentalimmunethrombocytopenia.Blood98,1095-1099(2001))。另外，尽管存在以下事实：在hIVIG的制造中例行使用离子交换树脂和聚乙二醇分级移除IgG聚集物，但是hIVIG的临床功效与患者血清中存在聚集物相关(Augener,W.,Friedman,B.和Brittinger,G.AreaggregatesofIgGtheeffectivepartofhigh-doseimmunoglobulintherapyinadultidiopathicthrombocytopenicpurpura(ITP)?Blut50,249-252(1985))。重要地，二聚体的百分比也与血管活性副作用相关，所述血管活性副作用是用乙酰水解酶可治疗的(Bleeker,W.K.等人,Vasoactivesideeffectsofintravenousimmunoglobulinpreparationsinaratmodelandtheirtreatmentwithrecombinantplatelet-activatingfactoracetylhydrolase.Blood95,1856-1861(2000))。
发明简述
需要IVIG的替代品，其解决高蛋白质负担、患者服用不便、感染风险、IgA过敏反应和可获得性受限的问题，同时维持和增强IVIG的聚集物部分的功效。本发明涉及生物活性的融合蛋白生物模拟物分子，其包含人免疫球蛋白Fc和单个天然存在的多聚化结构域、包含这些分子的组合物和使用它们的方法。这些生物模拟物具有治疗免疫疾病和炎性病症的广泛用途，所述疾病包括但不限于自身免疫疾病，如这些生物模拟物以其作为模型的hIVIG。另外，这些生物模拟物的某些还用作实验室试剂，如用于检验免疫细胞功能的免疫学测定法中、用于诊断疾病和用于基于抗体的免疫测定法中阻断Fc的非特异性结合。另外，本发明的生物模拟物和组合物具有以下优点：克服上文所列的hIVIG局限性以及前体生物模拟物斯塔都聚体(stradomer)的多聚化局限性。
WO2008/151088公开了使用连接的免疫球蛋白Fc结构域以产生hIVIG的有序多聚化的免疫球蛋白Fc生物模拟物(生物活性的高度有序的多聚体称作斯塔都聚体)用于治疗病理学病状，包括自身免疫疾病和其他炎性病状。见以引用的方式整体并入的WO2008/151088。公开的分子设计成在免疫球蛋白Fc单体中相对于天然免疫球蛋白Fc含有外部序列，所述外部序列包含限制性位点和亲和力标签。这些外部序列总共占据斯塔都聚体的总氨基酸组成的小部分(总共大约16个氨基酸)并且位于具有可分开和不同的功能(即FcR结合功能和多聚化功能)的结构域之间。通常而言，常见做法是在具有独立结构和/或功能的结构域之间包括小的连接序列，以便避免任何位阻约束或削弱侧翼结构域的独立功能。然而，如本文中公开，移除这些短区段可以提供多聚体形成、受体结合作用和/或总体生物学活性的大幅度增强。
在一个实施方案中，本发明涉及一种斯塔都聚体单元，其包含前导序列、IgG1Fc结构域和多聚化结构域。在本发明的又一个实施方案中，前导序列与IgG1Fc结构域直接连接并且IgG1Fc结构域与多聚化结构域直接连接。
在另一个实施方案中，本发明涉及其中IgG1Fc结构域的氨基酸序列与SEQIDNO:2具有至少80%同源性的斯塔都聚体单元。在又一个实施方案中，IgG1Fc结构域的氨基酸序列与SEQIDNO:2具有至少90%同源性。在又一个实施方案中，IgG1Fc结构域的氨基酸序列与SEQIDNO:2具有至少95%同源性。在又一个实施方案中，IgG1Fc结构域的氨基酸序列与SEQIDNO:2具有至少99%同源性。在又一个实施方案中，SEQIDNO:2的IgG1Fc结构域的氨基酸序列与前导序列和/或多聚化结构域直接连接。在一些实施方案中，当多聚化时，本发明的斯塔都聚体单元结合FcγRIIIa或DC-SIGN/SIGN-R1。
在另一个实施方案中，本发明涉及其中多聚化结构域的氨基酸序列与SEQIDNO:3具有至少80%同源性的斯塔都聚体单元。在又一个实施方案中，多聚化结构域与SEQIDNO:3具有至少90%同源性。在又一个实施方案中，提供本发明的斯塔都聚体单元，其中多聚化结构域的氨基酸序列与SEQIDNO:3具有至少95%同源性。在又一个实施方案中，提供本发明的斯塔都聚体单元，其中多聚化结构域的氨基酸序列与SEQIDNO:3具有至少99%同源性。在另一个实施方案中，多聚化结构域能够使斯塔都聚体单元多聚化。在又一个实施方案中，多聚化结构域与IgG1Fc结构域的羧基端直接连接。在一些实施方案中，多聚化结构域与IgG1Fc结构域的氨基端直接连接。
在另一个实施方案中，本发明涉及其中多聚化结构域的氨基酸序列与SEQIDNO:5具有至少80%同源性的斯塔都聚体单元。在又一个实施方案中，多聚化结构域与SEQIDNO:5具有至少90%同源性。在又一个实施方案中，提供本发明的斯塔都聚体单元，其中多聚化结构域的氨基酸序列与SEQIDNO:5具有至少95%同源性。在又一个实施方案中，提供本发明的斯塔都聚体单元，其中多聚化结构域的氨基酸序列与SEQIDNO:5具有至少99%同源性。在另一个实施方案中，多聚化结构域能够使斯塔都聚体单元多聚化。在又一个实施方案中，多聚化结构域与IgG1Fc结构域的羧基端直接连接。在一些实施方案中，多聚化结构域与IgG1Fc结构域的氨基端直接连接。
在另一个实施方案中，本发明涉及其中多聚化结构域的氨基酸序列与SEQIDNO:26具有至少80%同源性的斯塔都聚体单元。在又一个实施方案中，多聚化结构域与SEQIDNO:26具有至少90%同源性。在又一个实施方案中，提供本发明的斯塔都聚体单元，其中多聚化结构域的氨基酸序列与SEQIDNO:26具有至少95%同源性。在又一个实施方案中，提供本发明的斯塔都聚体单元，其中多聚化结构域的氨基酸序列与SEQIDNO:26具有至少99%同源性。在另一个实施方案中，多聚化结构域能够使斯塔都聚体单元多聚化。在又一个实施方案中，多聚化结构域与IgG1Fc结构域的羧基端直接连接。在一些实施方案中，多聚化结构域与IgG1Fc结构域的氨基端直接连接。
在一个实施方案中，本发明涉及一种斯塔都聚体单元，其包含与IgG1Fc结构域直接连接的前导序列，所述IgG1Fc结构域与IgG2铰链区多聚化结构域直接连接，其中所述IgG2铰链区产生斯塔都聚体单元的多聚体。在一个实施方案中，斯塔都聚体单元的氨基酸序列与SEQIDNO:4具有至少80%同源性。在又一个实施方案中，斯塔都聚体单元的氨基酸序列与SEQIDNO:4具有至少90%同源性。在又一个实施方案中，斯塔都聚体单元的氨基酸序列与SEQIDNO:4具有至少95%同源性。在又一个实施方案中，斯塔都聚体单元的氨基酸序列与SEQIDNO:4具有至少99%同源性。在又一个实施方案中，前导序列(SEQIDNO:1)从成熟蛋白中切除。
在一个实施方案中，本发明涉及一种斯塔都聚体单元，其包含与IgG1Fc结构域直接连接的前导序列，所述IgG1Fc结构域与异亮氨酸拉链多聚化结构域直接连接，其中所述异亮氨酸拉链产生斯塔都聚体单元的多聚体。在一个实施方案中，斯塔都聚体单元的氨基酸序列与SEQIDNO:10具有至少80%同源性。在又一个实施方案中，斯塔都聚体单元的氨基酸序列与SEQIDNO:10具有至少90%同源性。在又一个实施方案中，斯塔都聚体单元的氨基酸序列与SEQIDNO:10具有至少95%同源性。在又一个实施方案中，斯塔都聚体单元的氨基酸序列与SEQIDNO:10具有至少99%同源性。在又一个实施方案中，前导序列(SEQIDNO:1)从成熟蛋白中切除。
在一个实施方案中，本发明涉及一种斯塔都聚体单元，其包含与IgG1Fc结构域直接连接的前导序列，所述IgG1Fc结构域与GPP多聚化结构域直接连接，其中所述GPP多聚化结构域产生斯塔都聚体单元的多聚体。在一个实施方案中，斯塔都聚体单元的氨基酸序列与SEQIDNO:27具有至少80%同源性。在又一个实施方案中，斯塔都聚体单元的氨基酸序列与SEQIDNO:27具有至少90%同源性。在又一个实施方案中，斯塔都聚体单元的氨基酸序列与SEQIDNO:27具有至少95%同源性。在又一个实施方案中，斯塔都聚体单元的氨基酸序列与SEQIDNO:27具有至少99%同源性。在又一个实施方案中，前导序列(SEQIDNO:1)从成熟蛋白中切除。
在一个实施方案中，本发明涉及一种斯塔都聚体单元，其包含与IgG2铰链区多聚化结构域直接连接的前导序列，所述IgG2铰链区多聚化结构域转而与IgG1Fc结构域直接连接，其中所述IgG2铰链区产生斯塔都聚体单元的多聚体。在一个实施方案中，斯塔都聚体单元的氨基酸序列与SEQIDNO:8具有至少80%同源性。在又一个实施方案中，斯塔都聚体单元的氨基酸序列与SEQIDNO:8具有至少90%同源性。在又一个实施方案中，斯塔都聚体单元的氨基酸序列与SEQIDNO:8具有至少95%同源性。在又一个实施方案中，斯塔都聚体单元的氨基酸序列与SEQIDNO:8具有至少99%同源性。在又一个实施方案中，前导序列(SEQIDNO:1)从成熟蛋白中切除。
在一个实施方案中，本发明涉及一种斯塔都聚体单元，其包含与异亮氨酸拉链多聚化结构域直接连接的前导序列，所述异亮氨酸拉链多聚化结构域转而与IgG1Fc结构域直接连接，其中所述异亮氨酸拉链产生斯塔都聚体单元的多聚体。在一个实施方案中，斯塔都聚体单元的氨基酸序列与SEQIDNO:9具有至少80%同源性。在又一个实施方案中，斯塔都聚体单元的氨基酸序列与SEQIDNO:9具有至少90%同源性。在又一个实施方案中，斯塔都聚体单元的氨基酸序列与SEQIDNO:9具有至少95%同源性。在又一个实施方案中，斯塔都聚体单元的氨基酸序列与SEQIDNO:9具有至少99%同源性。在又一个实施方案中，前导序列(SEQIDNO:1)从成熟蛋白中切除。
在一个实施方案中，本发明涉及一种斯塔都聚体单元，其包含与GPP多聚化结构域直接连接的前导序列，所述GPP多聚化结构域转而与IgG1Fc结构域直接连接，其中所述GPP多聚化结构域产生斯塔都聚体单元的多聚体。在一个实施方案中，斯塔都聚体单元的氨基酸序列与SEQIDNO:28具有至少80%同源性。在又一个实施方案中，斯塔都聚体单元的氨基酸序列与SEQIDNO:28具有至少90%同源。在又一个实施方案中，斯塔都聚体单元的氨基酸序列与SEQIDNO:28具有至少95%同源。在又一个实施方案中，斯塔都聚体单元的氨基酸序列与SEQIDNO:28具有至少99%同源。在又一个实施方案中，前导序列(SEQIDNO:1)从成熟蛋白中切除。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种斯塔都聚体单元，其包含与IgG1Fc结构域直接连接的前导序列，所述IgG1Fc结构域转而与多聚化结构域直接连接，其中所述多聚化结构域产生斯塔都聚体单元的多聚体。在又一个实施方案中，多聚化结构域产生斯塔都聚体单元的高阶多聚体。在又一个实施方案中，至少约35%所得到的斯塔都聚体组合物含有斯塔都聚体单元的多聚体。在又一个实施方案中，至少约55%所得到的斯塔都聚体组合物含有斯塔都聚体单元的多聚体。在又一个实施方案中，至少约65%所得到的斯塔都聚体组合物含有斯塔都聚体单元的多聚体。在又一个实施方案中，至少约70%所得到的斯塔都聚体组合物含有斯塔都聚体单元的多聚体。在又一个实施方案中，至少约75%所得到的斯塔都聚体组合物含有斯塔都聚体单元的多聚体。
在又一个实施方案中，在一个实施方案中，本发明涉及一种斯塔都聚体单元，其包含前导序列、带有一个或多个突变的IgG1Fc结构域和多聚化结构域。在本发明的又一个实施方案中，前导序列与带有一个或多个突变的IgG1Fc结构域直接连接并且带有一个或多个突变的IgG1Fc结构域与多聚化结构域直接连接。
在一个实施方案中，本发明涉及其中斯塔都聚体单元的氨基酸序列包含SEQIDNO:20的斯塔都聚体单元。在又一个实施方案中，本发明涉及簇斯塔都聚体，其包含至少两个包含SEQIDNO:20的斯塔都聚体单元。在又一个实施方案中，前导序列(SEQIDNO:1)从成熟蛋白中切除。
在一个实施方案中，本发明涉及其中斯塔都聚体单元的氨基酸序列包含SEQIDNO:24的斯塔都聚体单元。在又一个实施方案中，本发明涉及簇斯塔都聚体，其包含至少两个包含SEQIDNO:24的斯塔都聚体单元。在又一个实施方案中，前导序列(SEQIDNO:1)从成熟蛋白中切除。
在一个实施方案中，本发明涉及其中斯塔都聚体单元的氨基酸序列包含SEQIDNO:21的斯塔都聚体单元。在又一个实施方案中，本发明涉及簇斯塔都聚体，其包含至少两个包含SEQIDNO:21的斯塔都聚体单元。在又一个实施方案中，前导序列(SEQIDNO:1)从成熟蛋白中切除。
在一个实施方案中，本发明涉及一种斯塔都聚体单元，其包含与多聚化结构域直接连接的前导序列，其中所述多聚化结构域与缺少IgG1铰链结构域的IgG1Fc结构域直接连接，其中所述多聚化结构域产生斯塔都聚体单元的多聚体。在另一个实施方案中，本发明涉及一种斯塔都聚体单元，其包含与多聚化结构域直接连接的前导序列，其中所述多聚化结构域与能够结合FcR的IgG1Fc部分直接连接或其中与所述IgG1Fc部分直接连接的多聚化结构域一起能够结合FcR。
在一个实施方案中，本发明涉及一种斯塔都聚体单元，其包含与多聚化结构域直接连接的前导序列，所述多聚化结构域转而与由IgG1铰链区、CH2和CH3结构域组成的IgG1Fc结构域直接连接，其中所述多聚化结构域产生斯塔都聚体单元的多聚体。
在一个实施方案中，本发明涉及一种斯塔都聚体单元，其包含与多聚化结构域直接连接的前导序列，所述多聚化结构域转而与由IgG1CH2和CH3结构域组成的IgG1Fc结构域直接连接，其中所述多聚化结构域产生斯塔都聚体单元的多聚体。
在一个实施方案中，本发明涉及一种斯塔都聚体单元，其包含与包含IgG2铰链区的Fc结构域直接连接的前导序列，所述Fc结构域与IgG1CH2和IgG1CH3结构域直接连接，其中所述IgG2铰链区产生斯塔都聚体单元的多聚体。在一个实施方案中，斯塔都聚体单元的氨基酸序列与SEQIDNO:18具有至少80%同源性。在又一个实施方案中，斯塔都聚体单元的氨基酸序列与SEQIDNO:18具有至少90%同源。在又一个实施方案中，斯塔都聚体单元的氨基酸序列与SEQIDNO:18具有至少95%同源。在又一个实施方案中，斯塔都聚体单元的氨基酸序列与SEQIDNO:18具有至少99%同源。在又一个实施方案中，前导序列(SEQIDNO:1)从成熟蛋白中切除。
在一个实施方案中，本发明涉及一种斯塔都聚体单元，其包含与多聚化结构域直接连接的IgG1Fc结构域。在一个实施方案中，IgG1Fc结构域与SEQIDNO:2具有至少约80%、或至少约90%或至少约95%或至少约99%同源性。在另一个实施方案中，IgG1Fc结构域与SEQIDNO:19具有至少约80%、或至少约90%或至少约95%或至少约99%同源性。在又一个实施方案中，IgG1Fc结构域含有一个或多个突变。在一个实施方案中，多聚化结构域与SEQIDNO:3具有至少约80%、或至少约90%或至少约95%或至少约99%同源性。在另一个实施方案中，多聚化结构域与SEQIDNO:5具有至少约80%、或至少约90%或至少约95%或至少约99%同源性。在又一个实施方案中，多聚化结构域与SEQIDNO:26具有至少约80%、或至少约90%或至少约95%或至少约99%同源性。在一个实施方案中，多聚化结构域与IgG1Fc结构域的N端直接连接。在另一个实施方案中，多聚化结构域与IgG1Fc结构域的C端直接连接。
在一个实施方案中，本发明涉及一种簇斯塔都聚体单元，其包含至少两个斯塔都聚体单体，所述斯塔都聚体单体分别包含与IgG1Fc结构域直接连接的前导序列，所述IgG1Fc结构域转而与多聚化结构域直接连接。在又一个实施方案中，簇斯塔都聚体与FcγRIIIa结合。在又一个实施方案中，簇斯塔都聚体与FcγRIIb结合。
在另一个实施方案中，本发明涉及调节受试者的免疫反应的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的包含至少两个斯塔都聚体单体的簇斯塔都聚体，所述斯塔都聚体单体分别包含与IgG1Fc结构域直接连接的前导序列，所述IgG1Fc结构域转而与多聚化结构域直接连接。在又一个实施方案中，簇斯塔都聚体与FcγRIIIa结合。在又一个实施方案中，簇斯塔都聚体与FcγRIIb结合。在又一个实施方案中，免疫反应的调节包括诱导不成熟树突状细胞上的CD86。
在又一个实施方案中，免疫反应的调节与某些记忆B细胞的选择性凋亡相关，伴随抗体产生的下降。在又一个实施方案中，调节与活化的记忆B细胞的选择性凋亡相关，伴随抗体产生的下降。在另一个实施方案中，免疫调节可以是调节NK细胞，导致抗体依赖性细胞毒作用增加。在又一个实施方案中，免疫反应的调节可以导致表达CD8β和CD11c的细胞群体增加。在又一个实施方案中，免疫调节可以导致在自身免疫疾病中常见升高的促炎细胞因子或细胞因子(如IL-6和IL-8)降低。在另一个实施方案中，免疫调节可以导致NKT细胞的活化和TGF-β的分泌及切割。
在额外的实施方案中，本发明涉及在有需求的受试者中治疗炎性或自身免疫疾病的方法，所述方法包括施用有效量的包含至少两个斯塔都聚体单元的斯塔都聚体，所述斯塔都聚体单元各自包含与IgG1Fc结构域直接连接的前导序列，所述IgG1Fc结构域转而与多聚化结构域直接连接，或可选地分别包含与多聚化结构域直接连接的前导序列，所述多聚化结构域转而与IgG1Fc结构域直接连接。在又一个实施方案中，炎性疾病是自身免疫疾病。在又一个实施方案中，自身免疫疾病选自类风湿性关节炎、多发性硬化、I型糖尿病、自身免疫性甲状腺炎、特发性血小板减少症紫癜、自身免疫贫血、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、硬皮病、系统性红斑狼疮、银屑病、炎性肠病、自身免疫性葡萄膜炎、ANCA阳性血管炎、乳糜泻、天疱疮、皮肤多发性肌炎、Goodpastur病、重症肌无力、格雷夫病、川崎病、镰状细胞危象和异位性皮炎。在又一个实施方案中，自身免疫疾病与器官从供体移植至受体相关。在又一个实施方案中，自身免疫疾病是没有经典地表征为自身免疫疾病但是其中免疫系统细胞发挥重要作用的疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、骨量减少和骨质疏松症。
在又一个实施方案中，静脉内、皮下、经口、经鼻、腹膜内、舌下、经颊、透皮、通过皮下或皮下植入或肌内施用斯塔都聚体。在一个实施方案中，静脉内施用簇斯塔都聚体。因为本发明斯塔都聚体的增强功效，在一些实施方案中，与先前分子和/或IVIG相比，斯塔都聚体可以按较低剂量静脉内施用。在一个实施方案中，以约0.01mg/Kg至约1000mg/KgIV的剂量静脉内施用簇斯塔都聚体。在又一个实施方案中，以约0.1mg/Kg至约100mg/KgIV施用簇斯塔都聚体。在又一个实施方案中，以约0.5mg/Kg至约50mg/KgIV施用簇斯塔都聚体。在又一个实施方案中，以约1mg/Kg至约25mg/KgIV施用簇斯塔都聚体。在又一个实施方案中，以约5mg/Kg至约15mg/KgIV施用簇斯塔都聚体。在一个实施方案中，皮下施用簇斯塔都聚体。因为本发明斯塔都聚体的增强功效，在一些实施方案中，与先前分子和/或IVIG相比，斯塔都聚体可以按较低剂量皮下施用。在一个实施方案中，以约0.01mg/Kg至约1000mg/KgSQ的剂量皮下施用簇斯塔都聚体。在又一个实施方案中，以约0.2mg/Kg至约150mg/KgSQ施用簇斯塔都聚体。在又一个实施方案中，以约0.5mg/Kg至约80mg/KgSQ施用簇斯塔都聚体。在又一个实施方案中，以约2mg/kg至约50mg/KgSQ施用簇斯塔都聚体。在又一个实施方案中，以约5mg/Kg至约30mg/KgSQ施用簇斯塔都聚体。
在一个实施方案中，施用与可植入器械共价固定的簇斯塔都聚体。在一个实施方案中，将簇斯塔都聚体固定至缝线。在另一个实施方案中，将簇斯塔都聚体固定至移植体或支架。在另一个实施方案中，簇斯塔都聚体固定至心脏瓣膜、矫形关节替换物或植入的电子导联。在另一个实施方案中，将簇斯塔都聚体固定至并且包埋于可植入基质内部。在一个优选实施方案中，将簇斯塔都聚体固定至并且包埋于可植入水凝胶内部。在一个实施方案中，水凝胶由葡聚糖、聚乙烯醇、聚丙烯酸酯钠或丙烯酸酯聚合物组成。在又一个实施方案中，施用固定在水凝胶中的簇斯塔都聚体，所述水凝胶具有大到足以允许免疫细胞进入与固定的簇相互作用并随后返回循环的孔径。在又一个实施方案中，水凝胶的孔径是5至50微米。在一个优选实施方案中，水凝胶的孔径是25-30微米。
在又一个实施方案中，斯塔都聚体在施用一种或多种额外药物和/或治疗剂之前、期间或在之后施用。在又一个实施方案中，额外的药物活性剂包含类固醇；生物性抗自身免疫药物如单克隆抗体、融合蛋白或抗细胞因子；非生物性抗自身免疫药物；免疫抑制剂；抗生素；和抗病毒剂；细胞因子；或能够以其他方式作为免疫调节物发挥作用的药物。在又一个实施方案中，类固醇是泼尼松、泼尼松龙、可的松、地塞米松、莫米松、睾酮、雌激素、氧雄龙、氟替卡松、布地奈德、倍氯米松、沙丁胺醇或左旋沙丁胺醇。在又一个实施方案中，单克隆抗体是英夫利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、利妥昔单抗、托珠单抗(tocilizumab)、戈利木单抗(golimumab)、ofatumumab、LY2127399、贝利木单抗(belimumab)、维妥珠单抗或赛妥珠单抗(certolizumab)。在又一个实施方案中，融合蛋白是依那西普(etanercept)或阿巴西普(abatacept)。在又一个实施方案中，抗细胞因子生物物质是阿那白滞素。在又一个实施方案中，抗风湿性非生物药物是环磷酰胺、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、羟氯喹、来福米特(leflunomide)、米诺环素、有机金化合物、福他替尼(fostamatinib)、托法替尼(tofacitinib)、依托昔布(etoricoxib)或柳氮磺吡啶(sulfasalazine)。在又一个实施方案中，免疫抑制剂是环孢菌素A、他克莫司、西罗莫司(sirolimus)、麦考酚酸酯、依维莫司、OKT3、抗胸腺细胞球蛋白、巴利昔单抗(basiliximab)、达利珠单抗(daclizumumab)或阿伦珠单抗。在又一个实施方案中，斯塔都聚体在施用化疗剂之前、期间或在之后施用。在又一个实施方案中，当一起施用时，斯塔都聚体和额外的治疗剂显示治疗性协同作用。在一个实施方案中，斯塔都聚体在施用额外的治疗剂之前施用。在另一个实施方案中，斯塔都聚体与施用额外的治疗剂同时施用。在又一个实施方案中，斯塔都聚体在施用额外的治疗剂后施用。
在又一个实施方案中，本发明涉及在有需求的受试者中治疗传染病的方法，所述方法包括施用有效量的包含至少两个斯塔都聚体单元的斯塔都聚体，所述斯塔都聚体单元各自包含与IgG1Fc结构域直接连接的前导序列，所述IgG1Fc结构域转而与多聚化结构域直接连接，或可选地分别包含与多聚化结构域直接连接的前导序列，所述多聚化结构域转而与IgG1Fc结构域直接连接。在又一个实施方案中，传染病是细菌性感染。在又一个实施方案中，传染病是病毒性感染。在又一个实施方案中，传染病是细菌性或病毒性败血症。在又一个实施方案中，静脉内、皮下、经口、腹膜内、舌下、经颊、透皮、通过皮下或皮下植入或肌内施用簇斯塔都聚体。在一个实施方案中，静脉内施用簇斯塔都聚体。在一个实施方案中，静脉内施用簇斯塔都聚体。在一个实施方案中，以约0.01mg/Kg至约1000mg/Kg的剂量施用簇斯塔都聚体。在又一个实施方案中，以约0.1mg/Kg至约100mg/Kg施用簇斯塔都聚体。在又一个实施方案中，以约0.5mg/Kg至约50mg/Kg施用簇斯塔都聚体。在又一个实施方案中，以约1mg/Kg至约25mg/Kg施用簇斯塔都聚体。在又一个实施方案中，以约5mg/Kg至约15mg/Kg施用簇斯塔都聚体。
在另一个实施方案中，将簇斯塔都聚体与物种特异性或嵌合斯塔都聚体分子一起施用以治疗人、非人灵长类(例如，猴、狒狒和黑猩猩)、小鼠、大鼠、牛、马、猫、犬、猪、兔、山羊、鹿、绵羊、雪貂、沙鼠、豚鼠、仓鼠、蝙蝠、鸟(例如，鸡、火鸡和鸭)、鱼类和爬行类。在又一个实施方案中，人是成人或儿童。在又一个实施方案中，施用簇斯塔都聚体以预防自身免疫疾病。在又一个实施方案中，施用簇斯塔都聚体以预防伴侣动物和家畜中疫苗相关的自身免疫病状。
在又一个实施方案中，本发明涉及一种用于体外或离体测定法中阻断抗体的非特异性结合的方法，所述方法包括将组合物与靶组织或靶细胞孵育，所述组合物包含有效量的包含至少两个斯塔都聚体单元的斯塔都聚体，所述斯塔都聚体单元各自包含与IgG1Fc结构域直接连接的前导序列，所述IgG1Fc结构域转而与多聚化结构域直接连接，或可选地分别包含与多聚化结构域直接连接的前导序列，所述多聚化结构域转而与IgG1Fc结构域直接连接。在一个实施方案中，抗体是单克隆抗体。在另一个实施方案中，抗体是多克隆抗体。在一个实施方案中，体外或离体测定法是免疫组织化学、流式细胞术、蛋白质印迹法或免疫荧光测定法。在又一个实施方案中，簇斯塔都聚体对靶组织或细胞的物种是物种特异的。
在又一个实施方案中，本发明涉及一种用有效量的簇斯塔都聚体降低组合物中内毒素水平的方法，所述簇斯塔都聚体包含至少两个斯塔都聚体单元，所述斯塔都聚体单元各自包含与IgG1Fc结构域直接连接的前导序列，所述IgG1Fc结构域转而与多聚化结构域直接连接，或可选地分别包含与多聚化结构域直接连接的前导序列，所述多聚化结构域转而与IgG1Fc结构域直接连接。在又一个实施方案中，簇斯塔都聚体与组合物中的内毒素复合。在又一个实施方案中，所述方法包括从组合物中移除斯塔都聚体-复合的内毒素。在一个实施方案中，通过过滤从组合物中移除斯塔都聚体复合的内毒素。在一个实施方案中，组合物是药物组合物。
在一个实施方案中，本发明涉及一种产生簇斯塔都聚体的方法，所述方法包括表达斯塔都聚体单元，所述斯塔都聚体单元包含与IgG1Fc结构域直接连接的前导序列，所述IgG1Fc结构域转而与多聚化结构域直接连接，或直接连接至多聚化结构域的前导序列，所述多聚化结构域与IgG1Fc结构域直接连接，其中所述多聚化结构域从转染的细胞中产生斯塔都聚体单元的多聚体，包括将编码SEQIDNO:4、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10或SEQIDNO:18的斯塔都聚体的DNA序列克隆至表达载体中，将表达载体转染至细菌宿主中，从细菌培养物中分离质粒DNA，所述质粒DNA含有编码SEQIDNO:4、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10或SEQIDNO:18的斯塔都聚体的DNA，将质粒DNA线性化，所述质粒DNA含有编码SEQIDNO:4、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10或SEQIDNO:18的斯塔都聚体的DNA，将线性化的DNA转染至哺乳动物细胞中，扩增阳性转染的细胞以获得稳定转染的细胞的汇集物，从培养基中收获斯塔都聚体蛋白，并且纯化斯塔都聚体蛋白，其中所述斯塔都聚体蛋白不含外部序列。在一个实施方案中，表达载体含有选择标记。在又一个实施方案中，选择标记是抗生素抗性基因。在又一个实施方案中，抗生素抗性基因是新霉素抗性基因。在一个实施方案中，哺乳动物细胞是CHO细胞、HEK293细胞、PER.C6细胞、CAP细胞或用于蛋白质产生的其他商业相关性哺乳动物细胞。在一个实施方案中，通过亲和层析纯化斯塔都聚体蛋白。在又一个实施方案中，通过凝胶过滤进一步纯化蛋白质。在又一个实施方案中，通过离子交换层析进一步纯化蛋白质。在又一个实施方案中，通过疏水相互作用层析进一步纯化蛋白质。
本发明还涉及如下各项内容：
1.一种斯塔都聚体单元，其包含：
(a)前导序列；
(b)IgG1Fc结构域；和
(c)多聚化结构域；其中所述前导序列与所述IgG1Fc结构域直接连接并且其中所述IgG1Fc结构域与所述多聚化结构域直接连接或其中所述前导序列与所述多聚化结构域直接连接并且所述多聚化结构域与IgG1Fc结构域直接连接。
2.根据项1所述的斯塔都聚体单元，其中所述IgG1Fc结构域的氨基酸序列与SEQIDNO:2具有至少80%同源性。
3.根据项1所述的斯塔都聚体单元，其中所述IgG1Fc结构域的氨基酸序列与SEQIDNO:2具有至少90%同源性。
4.根据项1所述的斯塔都聚体单元，其中所述IgG1Fc结构域的氨基酸序列与SEQIDNO:2具有至少95%同源性。
5.根据项1所述的斯塔都聚体单元，其中所述IgG1Fc结构域的氨基酸序列与SEQIDNO:2具有至少99%同源性。
6.根据项1所述的斯塔都聚体单元，其中所述多聚化结构域选自IgG2a铰链区、异亮氨酸拉链和GPP结构域并且能够使所述斯塔都聚体单元多聚化。
7.根据项6所述的斯塔都聚体单元，其中所述多聚化结构域的氨基酸序列与SEQIDNO:3具有至少80%同源性并且能够使所述斯塔都聚体单元多聚化。
8.根据项6所述的斯塔都聚体单元，其中所述多聚化结构域的氨基酸序列与SEQIDNO:3具有至少90%同源性并且能够使所述斯塔都聚体单元多聚化。
9.根据项6所述的斯塔都聚体单元，其中所述多聚化结构域的氨基酸序列与SEQIDNO:3具有至少95%同源性并且能够使所述st多聚化。
10.根据项6所述的斯塔都聚体单元，其中所述多聚化结构域的氨基酸序列与SEQIDNO:3具有至少99%同源性并且能够使所述斯塔都聚体单元多聚化。
11.根据项6所述的斯塔都聚体单元，其中所述多聚化结构域的氨基酸序列与SEQIDNO:3具有至少80%同源性并且能够使所述斯塔都聚体单元多聚化。
12.根据项6所述的斯塔都聚体单元，其中所述多聚化结构域的氨基酸序列与SEQIDNO:5具有至少90%同源性并且能够使所述斯塔都聚体单元多聚化。
13.根据项6所述的斯塔都聚体单元，其中所述多聚化结构域的氨基酸序列与SEQIDNO:5具有至少95%同源性并且能够使所述斯塔都聚体单元多聚化。
14.根据项6所述的斯塔都聚体单元，其中所述多聚化结构域的氨基酸序列与SEQIDNO:5具有至少99%同源性并且能够使所述斯塔都聚体单元多聚化。
15.根据项6所述的斯塔都聚体单元，其中所述多聚化结构域的氨基酸序列与SEQIDNO:26具有至少80%同源性并且能够使所述斯塔都聚体单元多聚化。
16.根据项6所述的斯塔都聚体单元，其中所述多聚化结构域的氨基酸序列与SEQIDNO:26具有至少90%同源性并且能够使所述斯塔都聚体单元多聚化。
17.根据项6所述的斯塔都聚体单元，其中所述多聚化结构域的氨基酸序列与SEQIDNO:26具有至少95%同源性并且能够使所述斯塔都聚体单元多聚化。
18.根据项6所述的斯塔都聚体单元，其中所述多聚化结构域的氨基酸序列与SEQIDNO:26具有至少99%同源性并且能够使所述斯塔都聚体单元多聚化。
19.根据项1所述的斯塔都聚体单元，其中所述多聚化结构域与所述IgG1Fc结构域的羧基端直接连接。
20.根据项1所述的斯塔都聚体单元，其中所述多聚化结构域与所述IgG1Fc结构域的氨基端直接连接。
21.根据项1所述的斯塔都聚体单元，其中所述斯塔都聚体单元包含SEQIDNO:4、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9SEQIDNO:10、SEQIDNO:27或SEQIDNO:28。
22.根据项1所述的斯塔都聚体单元，其中所述多聚化结构域产生所述斯塔都聚体单元的多聚体。
23.根据项22所述的斯塔都聚体单元，其中所述斯塔都聚体单元的多聚体是高阶多聚体。
24.一种包含根据项23所述的斯塔都聚体单元的斯塔都聚体组合物，其中所述多聚体以总斯塔都聚体组合物的至少约45%百分比存在。
25.一种包含根据项23所述的斯塔都聚体单元的斯塔都聚体组合物，其中所述多聚体以总斯塔都聚体组合物的至少约55%百分比存在。
26.一种包含根据项23所述的斯塔都聚体单元的斯塔都聚体组合物，其中所述多聚体以总斯塔都聚体组合物的至少约65%百分比存在。
27.一种包含根据项23所述的斯塔都聚体单元的斯塔都聚体组合物，其中所述多聚体以总斯塔都聚体组合物的至少约70%百分比存在。
28.一种包含根据项23所述的斯塔都聚体单元的斯塔都聚体组合物，其中所述多聚体以总斯塔都聚体组合物的至少约73%百分比存在。
29.根据项1所述的斯塔都聚体单元，其中所述IgG1Fc结构域能够结合FcRn、DC-SIGN、SIGN-R1或FcγR。
30.根据项1所述的斯塔都聚体单元，其中所述FcγR是FcγRIIIa。
31.一种簇斯塔都聚体，其包含至少两个根据项1所述的斯塔都聚体单元。
32.根据项31所述的簇斯塔都聚体，其中所述斯塔都聚体与FcγRIIIa结合。
33.一种调节受试者中免疫反应的方法，其包括向所述受试者施用有效量的根据项31所述的簇斯塔都聚体。
34.根据项33所述的方法，其中所述调节包括在树突状细胞上诱导CD86。
35.根据项33所述的方法，其中所述调节包括抑制树突状细胞上的CD1a表达。
36.一种在有需求的受试者中治疗炎性疾病的方法，其包括施用有效量的根据项31所述的簇斯塔都聚体。
37.根据项36所述的方法，其中所述炎性疾病是自身免疫疾病。
38.根据项37所述的方法，其中所述自身免疫疾病选自关节炎、多发性硬化、I型糖尿病、自身免疫性甲状腺炎、特发性血小板减少性紫癜、慢性炎性多发性神经病、硬皮病、自身免疫性葡萄膜炎、系统性红斑狼疮、重症肌无力和异位性皮炎。
39.根据项37所述的方法，其中所述自身免疫疾病与器官从供体移植至受体相关。
40.根据项36所述的方法，其中所述炎性疾病是传染病。
41.根据项36所述的方法，其中所述传染病是细菌性感染。
42.根据项36所述的方法，其中所述传染病是病毒性感染。
43.根据项36所述的方法，其中静脉内、皮下、经口、腹膜内、舌下、经颊、透皮、通过皮下植入物或肌内施用所述簇斯塔都聚体。
44.根据项36所述的方法，其中静脉内施用所述簇斯塔都聚体。
45.根据项36所述的方法，其中所述簇斯塔都聚体以约0.1mg/kg至约1000mg/kg的剂量施用。
46.根据项36所述的方法，其中所述簇斯塔都聚体以约1mg/kg至约25mg/kg的剂量施用。
47.一种用于体外或离体测定法中阻断抗体的非特异性结合的方法，其包括将靶组织或靶细胞与组合物一起孵育，所述组合物包含有效量的根据项31所述的簇斯塔都聚体。
48.根据项47所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
49.根据项47所述的方法，其中所述抗体是多克隆抗体。
50.根据项47所述的方法，其中所述体外或离体测定法是免疫组织化学、流式细胞术、蛋白质印迹法或免疫荧光测定法。
51.一种用于降低组合物中内毒素水平的方法，其包括用有效量的根据项31所述的簇斯塔都聚体处理所述组合物。
52.根据项51所述的方法，其中所述簇斯塔都聚体与组合物中的所述内毒素复合。
53.根据项51所述的方法，还包括从所述组合物移除斯塔都聚体复合的内毒素。
54.根据项53所述的方法，其中通过过滤从所述组合物移除所述斯塔都聚体复合的内毒素。
55.根据项53所述的方法，其中所述组合物是药物组合物。
56.一种用于产生簇斯塔都聚体的方法，其包括在宿主中表达选自SEQIDNO:4、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:28、SEQIDNO:24和SEQIDNO:27的序列。
57.根据项56所述的方法，还包括
(将编码选自SEQIDNO:4、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:28、SEQIDNO:24、SEQIDNO:27的DNA克隆至表达载体中；
(b)将所述表达载体转染至细菌宿主中；
(c)从细菌培养物中分离含有克隆的DNA的质粒DNA；
(d)线性化含有克隆的DNA的质粒DNA；
(e)转染线性化的DNA至哺乳动物细胞中；
(f)扩增阳性转染的细胞以获得稳定转染细胞的汇集物；
(g)从培养基收获所述斯塔都聚体蛋白；
(h)纯化斯塔都聚体蛋白，其中所述斯塔都聚体蛋白不含外部序列。
58.根据项57所述的方法，其中所述表达载体含有选择标记。
59.根据项58所述的方法，其中所述选择标记是抗生素抗性基因。
60.根据项59所述的方法，其中所述抗生素抗性基因是新霉素抗性基因。
61.根据项57所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是CHO细胞或HEK293细胞。
62.根据项57所述的方法，其中通过亲和层析纯化所述斯塔都聚体蛋白。
63.根据项62所述的方法，还通过离子交换层析纯化所述斯塔都聚体。
64.根据项36所述的方法，还包括施用额外的药物活性剂。
65.根据项64所述的方法，其中所述的额外药物活性剂包括类固醇、单克隆抗体、抗生素和抗病毒剂、细胞因子或能够以其他方式作为免疫调节物发挥作用的药物。
66.根据项65所述的方法，其中所述类固醇是泼尼松龙、可的松、莫米松、睾酮、雌激素、氧雄龙、氟替卡松、布地奈德、倍氯米松、沙丁胺醇或左旋沙丁胺醇。
67.根据项64-66中任一项所述的方法，其中所述的额外药物活性剂和簇斯塔都聚体显示治疗性协同作用。
68.根据项1所述的斯塔都聚体单元，其中所述IgG1Fc结构域缺少IgG1铰链结构域。
69.根据项1所述的斯塔都聚体单元，其中所述IgG1Fc由SEQIDNO:19的IgG1CH2和IgG1CH3结构域组成。
70.一种斯塔都聚体单元，其包含：
(a)前导序列；和
(b)Fc结构域，其包含
(1)SEQIDNO:3的IgG2铰链结构域；和
(2)SEQIDNO:19的IgG1的CH2和CH3结构域。
71.根据项70所述的斯塔都聚体单元，其中所述IgG2铰链结构域产生所述斯塔都聚体单元的多聚体。
72.根据项70所述的斯塔都聚体单元，其中所述斯塔都聚体单元与SEQIDNO:18具有至少80%同源性。
73.根据项70所述的斯塔都聚体单元，其中所述斯塔都聚体单元与SEQIDNO:18具有至少90%同源性。
74.根据项70所述的斯塔都聚体单元，其中所述斯塔都聚体单元与SEQIDNO:18具有至少95%同源性。
75.根据项70所述的斯塔都聚体单元，其中所述斯塔都聚体单元与SEQIDNO:18具有至少99%同源性。
76.根据项69所述的斯塔都聚体单元，其中所述IgG1Fc结构域能够结合FcRn、DC-SIGN、SIGN-R1或FcγR。
77.根据项76所述的斯塔都聚体单元，其中所述FcγR是FcγRIIIa。
78.一种簇斯塔都聚体，其包含至少两个根据项70所述的斯塔都聚体单元。
79.根据项78所述的簇斯塔都聚体，其中所述斯塔都聚体与FcγRIIIa结合。
80.一种调节受试者中免疫反应的方法，其包括向所述受试者施用有效量的根据项78所述的簇斯塔都聚体。
81.根据项80所述的方法，其中所述调节包括在树突状细胞上诱导CD86。
82.根据项80所述的方法，其中所述调节包括抑制树突状细胞上的CD1a表达。
83.一种在有需求的受试者中治疗炎性疾病的方法，其包括施用有效量的根据项31所述的簇斯塔都聚体。
84.根据项83所述的方法，其中所述炎性疾病是自身免疫疾病。
85.根据项84所述的方法，其中所述自身免疫疾病选自关节炎、多发性硬化、I型糖尿病、自身免疫性甲状腺炎、特发性血小板减少性紫癜、慢性炎性多发性神经病、硬皮病、自身免疫性葡萄膜炎、系统性红斑狼疮、重症肌无力和异位性皮炎。
86.根据项84所述的方法，其中所述自身免疫疾病与器官从供体移植至受体相关。
87.根据项83所述的方法，其中所述炎性疾病是传染病。
88.根据项83所述的方法，其中所述传染病是细菌性感染。
89.根据项83所述的方法，其中所述传染病是病毒性感染。
90.根据项83所述的方法，其中静脉内、皮下、经口、腹膜内、舌下、经颊、透皮、通过皮下植入物或肌内施用所述簇斯塔都聚体。
91.根据项83所述的方法，其中静脉内施用所述簇斯塔都聚体。
92.根据项83所述的方法，其中所述簇斯塔都聚体以约0.1mg/kg至约1000mg/kg的剂量施用。
93.根据项83所述的方法，其中所述簇斯塔都聚体以约1mg/kg至约25mg/kg的剂量施用。
94.一种用于体外或离体测定法中阻断抗体的非特异性结合的方法，其包括将靶组织或靶细胞与组合物一起孵育，所述组合物包含有效量的根据项78所述的簇斯塔都聚体。
95.根据项94所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
96.根据项94所述的方法，其中所述抗体是多克隆抗体。
97.根据项94所述的方法，其中所述体外或离体测定法是免疫组织化学、流式细胞术、蛋白质印迹法或免疫荧光测定法。
98.一种用于降低组合物中内毒素水平的方法，其包括用有效量的根据项78所述的簇斯塔都聚体处理所述组合物。
99.根据项98所述的方法，其中所述簇斯塔都聚体与组合物中的所述内毒素复合。
100.根据项98所述的方法，还包括从所述组合物移除斯塔都聚体复合的内毒素。
101.根据项100所述的方法，其中通过过滤从所述组合物移除所述斯塔都聚体复合的内毒素。
102.根据项100所述的方法，其中所述组合物是药物组合物。
103.根据项83所述的方法，还包括施用额外的药物活性剂。
104.根据项103所述的方法，其中所述的额外药物活性剂包括类固醇、单克隆抗体、抗生素和抗病毒剂、细胞因子或能够以其他方式作为免疫调节物发挥作用的药物。
105.根据项104所述的方法，其中所述类固醇是泼尼松龙、可的松、莫米松、睾酮、雌激素、氧雄龙、氟替卡松、布地奈德、倍氯米松、沙丁胺醇或左旋沙丁胺醇。
106.根据项1所述的斯塔都聚体单元，其中所述IgG1Fc结构域含有一个或多个突变。
107.根据项106所述的斯塔都聚体单元，其中所述斯塔都聚体单元包含选自SEQIDNO:20、SEQIDNO:21或SEQIDNO:24的氨基酸序列。
108.根据项107所述的斯塔都聚体单元，其中所述斯塔都聚体单元与SEQIDNO:20具有至少约80%同源性。
109.根据项107所述的斯塔都聚体单元，其中所述斯塔都聚体单元与SEQIDNO:20具有至少约90%同源性。
110.根据项107所述的斯塔都聚体单元，其中所述斯塔都聚体单元与SEQIDNO:20具有至少约95%同源性。
111.根据项107所述的斯塔都聚体单元，其中所述斯塔都聚体单元与SEQIDNO:20具有至少约99%同源性。
112.根据项107所述的斯塔都聚体单元，其中所述斯塔都聚体单元与SEQIDNO:21具有至少约80%同源性。
113.根据项107所述的斯塔都聚体单元，其中所述斯塔都聚体单元与SEQIDNO:21具有至少约90%同源性。
114.根据项107所述的斯塔都聚体单元，其中所述斯塔都聚体单元与SEQIDNO:21具有至少约95%同源性。
115.根据项107所述的斯塔都聚体单元，其中所述斯塔都聚体单元与SEQIDNO:21具有至少约99%同源性。
116.根据项107所述的斯塔都聚体单元，其中所述斯塔都聚体单元与SEQIDNO:24具有至少约80%同源性。
117.根据项107所述的斯塔都聚体单元，其中所述斯塔都聚体单元与SEQIDNO:24具有至少约90%同源性。
118.根据项107所述的斯塔都聚体单元，其中所述斯塔都聚体单元与SEQIDNO:24具有至少约95%同源性。
119.根据项107所述的斯塔都聚体单元，其中所述斯塔都聚体单元与SEQIDNO:24具有至少约99%同源性。
120.根据项107所述的斯塔都聚体单元，其中所述IgG1Fc结构域能够结合FcRn、DC-SIGN、SIGN-R1或FcγR。
121.根据项120所述的斯塔都聚体单元，其中所述FcγR是FcγRIIIa。
122.一种簇斯塔都聚体，其包含至少两个根据项107所述的斯塔都聚体单元。
123.根据项122所述的簇斯塔都聚体，其中所述斯塔都聚体与FcγRIIIa结合。
124.一种调节受试者中免疫反应的方法，其包括向所述受试者施用有效量的根据项122所述的簇斯塔都聚体。
125.根据项124所述的方法，其中所述调节包括在树突状细胞上诱导CD86。
126.根据项124所述的方法，其中所述调节包括抑制树突状细胞上的CD1a表达。
127.一种在有需求的受试者中治疗炎性疾病的方法，其包括施用有效量的根据项122所述的簇斯塔都聚体。
128.根据项127所述的方法，其中所述炎性疾病是自身免疫疾病。
129.根据项128所述的方法，其中所述自身免疫疾病选自关节炎、多发性硬化、I型糖尿病、自身免疫性甲状腺炎、特发性血小板减少性紫癜、慢性炎性多发性神经病、硬皮病、自身免疫性葡萄膜炎、系统性红斑狼疮、重症肌无力和异位性皮炎。
130.根据项128所述的方法，其中所述自身免疫疾病与器官从供体移植至受体相关。
131.根据项127所述的方法，其中所述炎性疾病是传染病。
132.根据项127所述的方法，其中所述传染病是细菌性感染。
133.根据项127所述的方法，其中所述传染病是病毒性感染。
134.根据项127所述的方法，其中静脉内、皮下、经口、腹膜内、舌下、经颊、透皮、通过皮下植入物或肌内施用所述簇斯塔都聚体。
135.根据项127所述的方法，其中静脉内施用所述簇斯塔都聚体。
136.根据项127所述的方法，其中所述簇斯塔都聚体以约0.1mg/kg至约1000mg/kg的剂量施用。
137.根据项127所述的方法，其中所述簇斯塔都聚体以约1mg/kg至约25mg/kg的剂量施用。
138.一种用于体外或离体测定法中阻断抗体的非特异性结合的方法，其包括将靶组织或靶细胞与组合物一起孵育，所述组合物包含有效量的根据项122所述的簇斯塔都聚体。
139.根据项138所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
140.根据项138所述的方法，其中所述抗体是多克隆抗体。
141.根据项138所述的方法，其中所述体外或离体测定法是免疫组织化学、流式细胞术、蛋白质印迹法或免疫荧光测定法。
142.一种用于降低组合物中内毒素水平的方法，其包括用有效量的根据项122所述的簇斯塔都聚体处理所述组合物。
143.根据项142所述的方法，其中所述簇斯塔都聚体与组合物中的所述内毒素复合。
144.根据项142所述的方法，还包括从所述组合物移除斯塔都聚体复合的内毒素。
145.根据项144所述的方法，其中通过过滤从所述组合物移除所述斯塔都聚体复合的内毒素。
146.根据项144所述的方法，其中所述组合物是药物组合物。
147.根据项127所述的方法，还包括施用额外的药物活性剂。
148.根据项147所述的方法，其中所述的额外药物活性剂包括类固醇、单克隆抗体、抗生素和抗病毒剂、细胞因子或能够以其他方式作为免疫调节物发挥作用的药物。
149.根据项148所述的方法，其中所述类固醇是泼尼松龙、可的松、莫米松、睾酮、雌激素、氧雄龙、氟替卡松、布地奈德、倍氯米松、沙丁胺醇或左旋沙丁胺醇。
150.根据项1、69或106中任一项所述的斯塔都聚体单元，其中所述前导序列被切去。
151.一种斯塔都聚体单元，其包含：
(a)IgG1Fc结构域；和
(b)多聚化结构域，其中所述IgG1Fc结构域与所述多聚化结构域直接连接。
152.根据项151所述的斯塔都聚体单元，其中所述IgG1Fc结构域包含SEQIDNO:2或SEQIDNO:19。
153.根据项151所述的斯塔都聚体单元，其中所述IgG1Fc结构域包含至少一个氨基酸突变。
154.根据项151所述的斯塔都聚体单元，其中所述多聚化结构域选自SEQIDNO:3、SEQIDNO:5和SEQIDNO:26。
155.一种簇斯塔都聚体，其包含至少2个根据项151-154中任一项所述的斯塔都聚体单元。
156.一种核酸，其编码SEQIDNO:4、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:28、SEQIDNO:24、SEQID和NO:27的斯塔都聚体单元。
附图简述
图1是优选的本发明斯塔都聚体的示意图。图1a是G045c斯塔都聚体的示意图；图1b是G045old斯塔都聚体的示意图；图1c是G046斯塔都聚体的示意图；图1d是G019斯塔都聚体的示意图；图1e是G028斯塔都聚体的示意图；图1f是G051斯塔都聚体的示意图；图1g是G089斯塔都聚体的示意图；和图1h是G096斯塔都聚体的示意图。
图2A)是蛋白质凝胶，其显示本发明的第一代斯塔都聚体复合物和天然连接的直接斯塔都聚体复合物之间的多聚化能力的差异。B)是本发明的第一代斯塔都聚体复合物和天然连接的直接斯塔都聚体复合物之间在多聚体/单体形成之间的比较结果。
图3显示与含有外部序列的先前斯塔都聚体复合物(M045old)相比，本发明天然连接的直接斯塔都聚体(M045c)更大地影响胶原蛋白诱导的关节炎的严重性。
图4显示在胶原蛋白诱导的关节炎中，与泼尼松龙一起施用时本发明天然连接的直接斯塔都聚体复合物具有协同效应。
图5显示与IgG2a对照相比，本发明的M046、M045、M019和M028复合物对FcγRIIIa、FcγRIIb和SIGN-R1的结合亲和力增强。
图6显示本发明的复合物对(a)FcγRIIb和FcγRIIIa和(b)SIGN-R1的结合亲和力增强。M045F1是斯塔都聚体的分子量较高的多聚体级分，而M045F2是斯塔都聚体的分子量较低的多聚体级分。M045F3是斯塔都聚体的同型二聚体级分。
图7显示天然连接的直接斯塔都聚体M045c影响特发性血小板减少症紫癜(ITP)的严重性。
图8显示相对于IgG1Fc对照，斯塔都聚体更有效地阻断抗FcγR抗体与FcγR结合。
图9显示天然连接的斯塔都聚体M045c、M019、M028、M046和M051影响胶原蛋白诱导的关节炎小鼠模型的严重性。
图10A显示G075斯塔都聚体对FcγRIIIa的结合增加和G075斯塔都聚体对FcγRIIa和FcγRIIb的结合减少。B显示G076斯塔都聚体对FcγRIIa和FcγRIIb的结合亲和力增加和G076斯塔都聚体对FcγRIIIa的结合减少。
图11显示与IVIg和白蛋白对照相比，M051影响(A)与大鼠(EAN)中实验性自身免疫神经炎相关的体重减轻；(B)EAN大鼠中的临床评分；(C)EAN大鼠中的髋关节幅值(hipamplitude)；(D)EAN大鼠中的踝关节幅值(ankleamplitude)；和(E)EAN大鼠中的运动神经传导速度。
图12显示与IVIg和白蛋白对照相比，M045c影响(A)与大鼠(EAN)中实验性自身免疫神经炎相关的体重减轻；(B)EAN大鼠中的临床评分；(C)EAN大鼠中的髋关节幅值；(D)EAN大鼠中的踝关节幅值；和(E)EAN大鼠中的运动神经传导速度。
图13显示与媒介物对照和M045c阳性对照相比，本发明天然连接的斯塔都聚体M075(A)、M096(B)和M098(C)但不是M076(A)更大地影响胶原蛋白诱导的关节炎的严重性。
发明详述
本文所述的理性分子设计hIVIG替换复合物的方法包括重组和/或生物化学地产生的免疫活性生物模拟物，所述生物模拟物令人惊讶地在多聚化方面并且因此在与Fcγ受体结合方面比先前描述的旨在实现这个目标的分子更高效。替换复合物具有治疗例如自身免疫疾病、炎性疾病、癌症和败血症的用途。因为与天然免疫球蛋白相比与Fcγ受体的结合亲和力优越，所述组合物还作为Fc阻断试剂用于基于抗体的免疫测定法中和从药物和实验室组合物中移除内毒素。下文详细描述每种实施方案连同具体的示例性实施方案。
如本文所用，在权利要求和/或本说明书中与术语“包含”联合使用时，词“一个(a)”或“一种(an)”的用途可以意指“一个(one)”，但是它还符合以下意思：“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”。
如本文所用，术语“生物模拟物”、“生物模拟物分子”、“生物模拟物复合物”和相关的术语，指模拟另一种复合物(如汇集的hIVIG、单克隆抗体或抗体的Fc片段)的功能的人造复合物。“生物活性的”生物模拟物是拥有与其天然存在对应物相同或相似的生物学活性的复合物。“天然存在的”意指在生物中正常找到的分子或其部分。天然存在还意指基本上天然存在。“免疫活性的”生物模拟物是显示与天然存在的免疫活性分子相同或相似的免疫活性的生物模拟物，如抗体、细胞因子、白介素和本领域已知的其他免疫分子。在优选的实施方案中，本发明的生物模拟物是如本文定义的斯塔都聚体。
“直接连接”意指彼此连接而无间插序列或外部序列例如，限制性酶识别位点或克隆片段的两个序列。本领域普通技术人员将理解“直接连接”包括添加或移除氨基酸，只要多聚化能力基本上不受影响。
“同源的”意指在给定的核酸或氨基酸序列的整个序列范围内的同一性。例如，“80%同源”意指给定的序列与要求保护的序列共有约80%同一性并且可以包括插入、缺失、置换和移码。本领域普通技术人员将理解，可以进行序列比对以便考虑插入和缺失，以确定整个序列长度范围内的同一性。
将本发明的免疫活性生物模拟物设计成拥有IgGFc结构域的一种或多种免疫调节活性并且至少具有(i)能够结合FcRn、DC-SIGN、SIGN-R1和/或FcγR(包括FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcγRIV)的第一Fc结构域，和(ii)能够结合FcRn、DC-SIGN、SIGN-R1和/或FcγR(包括FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcγRIV)的第二Fc结构域。具体而言，本发明的免疫活性复合物是同型二聚体的多聚体。每个同型二聚体拥有与FcRn、DC-SIGN、SIGN-R1和/或和FCγR结合的能力。因此，在多聚化时，免疫活性生物模拟物含有至少两个同型二聚体，每个同型二聚体拥有与FcRn、DC-SIGN、SIGN-R1和/或和FCγR结合的能力。
以下段落在结构和功能方面限定本发明生物模拟物的结构单元并且随后限定生物模拟物本身。然而，首先有益的是提到，如上文所示，本发明的每个生物模拟物具有至少两个Fc结构域。至少，Fc结构域是二聚体多肽(或较大多肽的二聚体区域)，其包含缔合以形成有功能的Fcγ受体结合位点的两条肽链或臂(单体)。因此，本文中讨论的各个片段和结构域的功能形式通常以二聚体(或多聚体)形式存在。本文中讨论的各个片段和结构域的单体是必须与第二链或臂缔合以形成有功能的二聚体结构的单链或臂。
Fc片段
“Fc片段”是技术术语，它用来描述在免疫球蛋白羧基端常规存在的蛋白质区域或蛋白质折叠结构。Fc片段可以通过使用酶消化法(例如木瓜蛋白酶消化法)从单克隆抗体的Fab片段中分离，所述酶消化法是一种不完整和不完善的方法(见MihaescoC和SeligmannM.PapainDigestionFragmentsOfHumanIgMGlobulins.JournalofExperimentalMedicine,第127卷,431-453(1968))。连同Fab片段(含有抗原结合结构域)，Fc片段构成全抗体，这里意指完整抗体。Fc片段由抗体重链的羧基端部分组成。Fc片段中的每条链具有约220-265个氨基酸长度并且这些链经常通过二硫键连接。Fc片段经常含有一个或多个独立的结构折叠或有功能的亚结构域。具体而言，Fc片段包括Fc结构域，在本文中定义为结合Fcγ受体的最小结构。分离的Fc片段由发生二聚化的两个Fc片段单体(例如，抗体重链的两个羧基端部分；本文中进一步限定)组成。当两个Fc片段单体缔合时，所得到的Fc片段具有Fcγ受体结合活性。
Fc局部片段
“Fc局部片段”是一种结构域，其包含小于抗体的整个Fc片段，却仍保留与Fc片段具有相同活性(包括Fcγ受体结合活性)的足够结构。因此，取决于源自其中的Fc局部结构域的抗体的同种型，Fc局部片段可以缺少部分或全部的铰链区、部分或全部的CH2结构域、部分或全部的CH3结构域和/或部分或全部的CH4结构域。Fc局部片段的实例包括了包含IgG3的上铰链区、核心铰链区和下铰链区外加CH2结构域的分子(Tan,LK,Shopes,RJ,Oi,VT和Morrison,SL,Influenceofthehingeregiononcomplementactivation,CIqbinding,andsegmentalflexibilityinchimerichumanimmunoglobulins,ProcNatlAcadSciUSA.1990年1月;87(1):162-166)。因此，在这个实例中，Fc局部片段缺少在IgG3的Fc片段中存在的CH3结构域。Fc局部片段的另一个实例包括了包含IgG1的CH2和CH3结构域的分子。在这个实例中，Fc局部片段缺少在IgG1中存在的铰链结构域。Fc局部片段由两个Fc局部片段单体组成。如本文中进一步限定，当两个这样的Fc局部片段单体缔合时，所得到的Fc局部片段具有Fcγ受体结合活性。
Fc结构域
如本文所用，“Fc结构域”描述了可以与Fc受体(FcR)结合或由其结合的最小区域(在较大多肽的背景下)或最小蛋白质折叠结构(在分离的蛋白质的背景下)。在Fc片段和Fc局部片段中，Fc结构域是允许分子与Fc受体结合的最小结合区。尽管Fc结构域可以限于由Fc受体结合的分离多肽，但是还将清楚的是，Fc结构域可以是Fc片段的部分或全部以及Fc局部片段的部分或全部。当本发明中使用术语“Fc结构域”时，它将由技术人员视为意指多于一个Fc结构域。Fc结构域由两个Fc结构域单体组成。如本文中进一步限定，当两个这样的Fc结构域单体缔合时，所得到的Fc结构域具有Fc受体结合活性。因此Fc结构域是可以结合Fc受体的二聚体结构。
Fc局部结构域
如本文所用，“Fc局部结构域”描述了Fc结构域的一部分。Fc局部结构域包括不同免疫球蛋白类别和亚类的各个重链恒定区结构域(例如，CH1、CH2、CH3和CH4结构域)和铰链区。因此，本发明的人Fc局部结构域包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE的CH1结构域；IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE的CH2结构域；IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE的CH3结构域；IgM和IgE的CH4结构域以及IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE的铰链区。其他物种中相应的Fc局部结构域将取决于这个物种中存在的免疫球蛋白和其命名。优选地，本发明的Fc局部结构域包括CH1、CH2和IgG1的铰链结构域及IgG2的铰链结构域。本发明的Fc局部结构域还可包含这些结构域和铰链区中多于一个的组合。然而，本发明的各个Fc局部结构域及其组合缺少结合FcγR的能力。因此，Fc局部结构域及其组合构成小于Fc的结构域。Fc局部结构域可以连接在一起以形成具有Fcγ受体结合活性的肽，因此形成Fc结构域。在本发明中，将Fc局部结构域与Fc结构域一起用作结构单元以产生如本文定义的本发明的生物模拟物。每个Fc局部结构域由两个Fc局部结构域单体组成。当两个这样的Fc局部结构域单体缔合时，Fc局部结构域形成。
如上文所示，Fc片段、Fc局部片段、Fc结构域和Fc局部结构域的每一个是二聚体蛋白或结构域。因此，这些分子的每一个由缔合以形成二聚体蛋白或结构域的两个单体组成。尽管上文讨论了同型二聚体形式的特征和活性，如下讨论单体肽。
Fc片段单体
如本文所用，“Fc片段单体”是与另一个Fc片段单体缔合时包含Fc片段的单链蛋白质。这种Fc片段单体因此是抗体重链之一的羧基端部分，其补足全抗体的Fc片段(例如，包括IgG的铰链区、CH2结构域和CH3结构域的重链连续部分)。在一个实施方案中，Fc片段单体至少包含一条铰链区链(铰链区单体)、一条CH2结构域链(CH2结构域单体)和一条CH3结构域链(CH3结构域单体)，它们连续地连接以形成肽。在另一个实施方案中，Fc片段单体包含至少一条铰链区链、一条CH2结构域链、一条CH3结构域链和一条CH4结构域链(CH4结构域单体)，它们连续地连接以形成肽。在一个实施方案中，CH2、CH3和铰链结构域来自不同的同种型。在具体实施方案中，Fc片段单体含有IgG2铰链结构域和IgG1CH2和CH3结构域。
Fc结构域单体
如本文所用，“Fc结构域单体”描述了单链蛋白质，与另一个Fc结构域单体缔合时，所述单链蛋白质包含可以与Fcγ受体结合的Fc结构域。两个Fc结构域单体的缔合产生一个Fc结构域。单独的Fc结构域单体(仅包含Fc结构域的一侧)不能结合Fcγ受体。本发明的Fc结构域单体不含外部序列，如先前描述的Fc结构域单体那样(见，例如，WO2008/151088，图17和图18)。相反，本发明的Fc结构域单体(SEQIDNO:2)在一个末端(例如，Fc单体的N末端)上与前导序列(SEQIDNO:1)直接连接并且在另一个末端(例如，Fc单体的C末端)上与多聚化结构域(SEQIDNO:3)直接连接。所得到的斯塔都聚体单体SEQIDNO:4在本文中称作G045c。在另一个实施方案中，Fc结构域单体包含IgG2铰链结构域和在N末端上与前导序列(SEQIDNO:1)直接连接的IgG1CH2和CH3结构域。所得到的斯塔都聚体单体SEQIDNO:18在本文中称作G051。可选地，多聚化结构域(SEQIDNO:3)可以位于Fc结构域单体(SEQIDNO:2)的氨基端处。所得到的斯塔都聚体单体SEQIDNO:8在本文中称作G019。可选地，多聚化结构域可以包含SEQIDNO:5而非SEQIDNO:3，并且可以位于Fc结构域单体的羧基端处，产生SEQIDNO:10，或它可以位于Fc结构域单体的氨基端处，产生SEQIDNO:9。这些斯塔都聚体在本文中分别称作G046和G028。
Fc局部结构域单体
如本文所用，“Fc局部结构域单体”描述了与另一个Fc局部结构域单体缔合时包含Fc局部结构域的单链蛋白质。两个Fc局部结构域单体的缔合产生一个Fc局部结构域。
斯塔都聚体
在特定的实施方案中，本发明的生物模拟物包括斯塔都聚体。斯塔都聚体是生物模拟物复合物，所述生物模拟物复合物能够结合两个或更多个Fc受体，优选地两个或更多个Fcγ受体，并且更优选地相对于Fc结构域显示显著改善的结合并且最优选地显示亲合力的缓慢解离特征。在一个优选实施方案中，本发明的斯塔都聚体用来结合在效应细胞如NK细胞和不成熟树突状细胞和其他单核细胞源性细胞上FcRn、DC-SIGN、SIGN-R1和/或Fcγ受体。在一个实施方案中，Fcγ受体是低亲和力Fcγ受体。斯塔都聚体可以具有4不同的物理构象：串联、簇集、核心或Fc片段。本发明的斯塔都聚体优选地是簇斯塔都聚体。如将显而易见，上文讨论的Fc片段、Fc局部片段、Fc结构域和Fc局部结构域用于多种斯塔都聚体构象的构建中。另外，也如上文讨论，正是首先产生各个Fc结构域单体和Fc局部结构域单体且随后它们自我缔合以形成作为本发明斯塔都聚体的二聚体结构。
如本文所用，“斯塔都聚体二聚体”是仅由两个斯塔都聚体单体组成的斯塔都聚体的特定形式。在一个实施方案中，斯塔都聚体二聚体是通过相关斯塔都聚体单体的自我聚集形成的分子。在另一个实施方案中，斯塔都聚体二聚体中的斯塔都聚体单体借助如本文定义的斯塔都聚体单体间连接物理连接。“多聚体斯塔都聚体”由3个或更多个斯塔都聚体组成，通过相关斯塔都聚体单体的自我聚集或借助如本文定义的斯塔都聚体单体间连接形成。
斯塔都聚体单体
如本文所用，术语“斯塔都聚体单体”或“斯塔都聚体单元”指单一的连续肽分子，其中与至少第二个斯塔都聚体单体缔合时，所述肽分子形成包含至少两个Fc结构域的多肽。尽管在优选的实施方案中，簇斯塔都聚体由两个缔合的斯塔都聚体单体组成，但是簇斯塔都聚体也可以含有3个或更多个斯塔都聚体单体。斯塔都聚体单体可以通过斯塔都聚体单体间连接缔合以形成斯塔都聚体或它们可以借助自我聚集形成斯塔都聚体。
与另一个斯塔都聚体单体缔合以形成斯塔都聚体时，斯塔都聚体单体可以具有形成1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或更多个Fc结构域的氨基酸序列。与另一个斯塔都聚体单体缔合以形成斯塔都聚体时，斯塔都聚体单体还可以具有形成1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或更多个Fc局部结构域的氨基酸序列。
将在斯塔都聚体的背景下形成Fc结构域和Fc局部结构域的斯塔都聚体单体的区域可以简单地从斯塔都聚体单体分子的连续区域的羧基端至氨基端布置。构成斯塔都聚体单体的具体Fc结构域单体和Fc局部结构域单体的排列不是重要的。然而，这种排列必须允许在两个斯塔都聚体单体缔合时形成两个有功能的Fc结构域。在一个优选实施方案中，本发明的斯塔都聚体含有在IgG1Fc单体(SEQIDNO:2)的N末端和前导肽(SEQIDNO:1)的C末端以及IgG1Fc(SEQIDNO:2)的C末端和多聚化结构域IgG2铰链区(SEQIDNO:3)的N末端或者异亮氨酸拉链(SEQIDNO:5)或GPP结构域(SEQIDNO:26)之间的直接连接以分别形成SEQIDNO:4的G045c斯塔都聚体、SEQIDNO:10的G046斯塔都聚体或SEQIDNO:27的G089斯塔都聚体(表1)。在另一个优选实施方案中，本发明的斯塔都聚体含有在前导肽(SEQIDNO:1)的C末端和多聚化结构域IgG2铰链区(SEQIDNO:3)、异亮氨酸拉链(SEQIDNO:5)或GPP结构域(SEQIDNO:26)的N末端之间的直接连接和在多聚化结构域(SEQIDNO:3、5或26)的C末端和IgG1Fc的N末端之间的直接连接以分别形成SEQIDNO:8的G019斯塔都聚体、SEQIDNO:9的G028斯塔都聚体或SEQIDNO:28的G096斯塔都聚体(表1)或在前导肽(SEQIDNO:1)和多聚化结构域(SEQIDNO:3)的N末端之间的直接连接和在聚化结构域(SEQIDNO:3)的C末端和含有IgG1CH2和CH3部分的IgG1Fc局部结构域的N末端之间的直接连接以形成SEQIDNO:18的G051斯塔都聚体(表1)。
表1
作为阐释性实例，技术人员将理解，可以通过制备编码Fc结构域单体和Fc局部结构域单体的多种组合的多核苷酸分子构建本发明的斯塔都聚体分子，所述组合各自具有或没有选择的点突变，但是具有将形成最少两个Fc结构域单体的组合。可以将这种多核苷酸分子，例如编码SEQIDNO:4、8、9、10或18的斯塔都聚体的多核苷酸，插入表达载体中，所述表达载体可以用来转化细菌群体或转染哺乳动物细胞群体。随后可以通过在适宜的培养条件下培养转化的细菌或转染的哺乳动物细胞来产生斯塔都聚体单体。例如，可以通过用genetecin/G418选择细胞，实现克隆细胞系持续成为稳定转染细胞的汇集物。可选地，细胞可以用CMV启动子控制下的编码本发明斯塔都聚体即G045c(SEQIDNO:4)、G019(SEQIDNO:8)、G028(SEQIDNO:9)、G046(SEQIDNO:10)或G051(SEQIDNO:18)的DNA瞬时转染。表达的斯塔都聚体单体可以随后在斯塔都聚体单体自我聚集或斯塔都聚体单体利用斯塔都聚体单体间连接缔合时形成有功能的斯塔都聚体。表达的斯塔都聚体随后可以通过亲和层析，使用例如蛋白A柱或蛋白质G柱从细胞培养基中纯化出来。本发明包括通过缔合具有相同氨基酸序列的斯塔都聚体单体、具基本上相似氨基酸序列的斯塔都聚体单体或缔合具不相似序列的斯塔都聚体单体所形成的斯塔都聚体。在后一种实施方案中，构成斯塔都聚体的斯塔都聚体单体的氨基酸序列仅需要具有这样的相似性，从而两个或更多个有功能的FcγR结合位点形成。
令人惊讶地，由本发明方法产生的G045c(SEQIDNO:4)导致比随同先前分子(如SEQIDNO:6和7中所示)所观察更高阶的多聚体形成，其中所述G045c含有要求保护的与IgG1Fc(SEQIDNO:2)的N末端直接连接的前导序列(SEQIDNO:1)，所述IgG1Fc转而经其末端直接连接至IgG2铰链区多聚化结构域(SEQIDNO:3)；所述先前分子在IgG1Fc单体中含有先前认为没有功能重要性的外部序列(如限制性位点)。实际上，几乎74%所得到的G045c斯塔都聚体制备物含有多聚体，而仅约26%的组成含有单体。对于含有带外部序列的分子的制备物，情况相反。这些制备物仅含有约27%的多聚体并且72%的组成物作为单体存在。另外，与先前描述的含有外部序列的旧斯塔都聚体相比时，由SEQIDNO:4产生的更高阶多聚体具有令人惊讶优越的功效。因此，在本发明的一个实施方案中，多聚化结构域产生斯塔都聚体单元的高阶多聚体。在又一个实施方案中，至少约35%所得到的斯塔都聚体组合物含有斯塔都聚体单元的多聚体。在又一个实施方案中，至少约55%所得到的斯塔都聚体组合物含有斯塔都聚体单元的多聚体。在又一个实施方案中，至少约65%所得到的斯塔都聚体组合物含有斯塔都聚体单元的多聚体。在又一个实施方案中，至少约70%所得到的斯塔都聚体组合物含有斯塔都聚体单元的多聚体。在又一个实施方案中，至少约75%所得到的斯塔都聚体组合物含有斯塔都聚体单元的多聚体。
如上文所示，Fc结构域可以由其结合FcRn、DC-SIGN、SIGN-R1和/或Fcγ受体的能力在功能上定义。本发明的复合物以比IgG2a对照(图5和图6)高得多的亲和力与同族受体(包括FcγRIIIa、FcγRIIb和/或SIGN-R1)结合。因此，Fc结构域的具体氨基酸序列将基于构成Fc结构域的Fc局部结构域变动。然而，在本发明的一个实施方案中，Fc结构域包含免疫球蛋白分子的铰链区和CH2结构域。在又一个优选的实施方案中，Fc结构域包含免疫球蛋白分子的铰链区、CH2结构域和CH3结构域。在又一个实施方案中，Fc结构域包含免疫球蛋白分子的铰链区、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域。在又一个实施方案中，Fc结构域包含免疫球蛋白分子的铰链区、CH2结构域和CH4结构域。在又一个优选的实施方案中，Fc结构域包含CH2结构域和CH3结构域。在又一个优选的实施方案中，Fc结构域含有IgG1的铰链区、CH2和CH3结构域(SEQIDNO:2)。在另一个优选实施方案中，Fc结构域含有IgG1的CH2和CH3结构域(SEQIDNO:19)。
斯塔都聚体单体间连接
本发明的生物模拟物复合物中存在的独立连接是在构成本发明斯塔都聚体的两个或更多个独立斯塔都聚体单体之间出现的“斯塔都聚体单体间连接”。尽管结构域连接是起到使构成生物模拟物复合物的独立斯塔都聚体单体的Fc结构域单体和局部Fc结构域单体彼此连接作用的短氨基酸序列，但是斯塔都聚体单体间连接起到接合构成生物模拟物复合物的两个或更多个独立斯塔都聚体单体的作用。这种斯塔都聚体单体间连接可以是能够使独立斯塔都聚体单体稳定缔合的任何连接。在一些实施方案中，斯塔都聚体单体间连接可以是斯塔都聚体单体之间的共价连接。可选地，斯塔都聚体单体之间的斯塔都聚体单体间连接可以借助直接化学交联形成。在优选的实施方案中，斯塔都聚体单体结构利用Fc结构域单体之间的天然自我聚集特性以产生自我聚集性斯塔都聚体。在这类实施方案的某些中，自我聚集在缺少自然界中通常存在的共价硫键连接的情况下发生。不受受理论约束，例如，完整IgG1在铰链区中具有2个半胱氨酸键(DoraiH.Roleofinter-heavyandlightchaindisulfidebondsintheeffectorfunctionsofhumanimmunoglobulinIgG1.MolecularImmunology.29;12,1992,1487-1491；MeulenbroekAJ和ZeijlemakerWP.HumanIgGSubclasses:Usefuldiagnosticmarkersforimmunocompetence.ISBN90-5267-011-0)，然而G045的IgG1铰链区、IgG1CH2和IgG1CH3结构域显示没有单体间连接；在G045中全部单体间连接在IgG2铰链结构域C端出现。在其他的这类实施方案中，二硫键在形成斯塔都聚体的独立斯塔都聚体单体之间形成。二硫键在构成生物模拟物分子的Fc结构域单体的半胱氨酸残基之间，使用天然Fc结构域单体序列中存在的半胱氨酸残基或通过位点定向诱变向Fc结构域单体中掺入的半胱氨酸残基形成。这类天然自我聚集特性也可以用来在斯塔都聚体多聚体中的独立斯塔都聚体单体之间形成斯塔都聚体单体间连接。在一个优选实施方案中，形成斯塔都聚体单体间连接的半胱氨酸残基处于G045的成熟蛋白的IgG2铰链结构域的第236、237、240和243位置。在一个优选实施方案中，形成斯塔都聚体单体间连接的半胱氨酸残基处于G051的成熟蛋白的IgG2铰链结构域的第4、5、8和11位置。可选实施方案包括其中二硫键在通过位点定向诱变引入构成独立斯塔都聚体单体的氨基酸序列内的半胱氨酸残基之间形成的单体间连接。
如上文讨论，在优选的实施方式中，形成斯塔都聚体的斯塔都聚体单体间连接是因斯塔都聚体单体的自我聚集而产生的连接。在一个实施方案中，构成斯塔都聚体的两个斯塔都聚体单体是相同的肽，从而构成斯塔都聚体的两个独立斯塔都聚体单体在序列上是相同的。然而，技术人员将理解其他实施方案包括其中氨基酸序列上彼此不同的斯塔都聚体单体。
两个斯塔都聚体单体可以例如通过平行对齐形成斯塔都聚体，从而在斯塔都聚体单体中的相同Fc局部结构域单体之间发生配对。然而，本发明也包括其中配对在不相同的Fc局部结构域单体之间发生的实施方案和其中配对在相同的Fc局部结构域单体之间发生，但是这两个斯塔都聚体单体的比对偏移的实施方案。
簇斯塔都聚体
“簇斯塔都聚体”是一种生物模拟物，其具有带中央部分“头部”和两条或更多条“腿”的放射状形式，其中每条腿包含能够结合至少一个Fcγ受体的一个或多个Fc结构域，因此产生能够结合两个或更多个Fcγ受体的生物模拟物。每种簇斯塔都聚体由多于一个二聚体蛋白组成，每种二聚体蛋白称作“簇斯塔都聚体单元”。每个簇斯塔都聚体单元由发生多聚化的区域和包含至少一个功能性Fc结构域的“腿”区域组成。一旦与另一个簇斯塔都聚体单元多聚化，则多聚化区域产生簇斯塔都聚体“头部”。腿区域能够结合与每个腿区域中存在Fc结构域一样多的Fcγ受体。因此，一种簇斯塔都聚体是能够结合两个或更多个Fcγ受体的生物模拟物复合物，从而增加结合亲和力和亲合力。
多聚化区域可以是引起二聚体蛋白进一步多聚化的肽序列或可选地，多聚化区域可以是增强二聚体蛋白多聚化的糖基化作用。肽多聚化区域的实例包括IgG2铰链区、IgECH2结构域、异亮氨酸拉链、胶原蛋白甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸重复序列(“GPP”)和锌指。糖基化对肽多聚化的影响是本领域充分描述的(例如，RoleofCarbohydrateinMultimericStructureofFactorVIII/VonWillebrandFactorProtein.HarveyR.Gralnick,SybilB.Williams和MargaretE.Rick.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,第80卷,第9期[第1部分：生物科学](1983年5月1日),第2771-277'4页；Multimerizationandcollagenbindingofvitronectinismodulatedbyitsglycosylation.KimieAsanuma,FumioArisaka和HarukoOgawa.InternationalCongressSeries第1223卷,2001年12月,第97-101页)。
多聚化区域可以是引起肽二聚化或多聚化的肽序列并且包括IgG2铰链区、IgECH2结构域、异亮氨酸拉链、胶原蛋白GPP和锌指。如本领域已知，人IgG2的铰链区可以形成共价二聚体(Yoo,E.M.等人,J.Immunol.170,3134-3138(2003)；SalfeldNatureBiotech.25,1369-1372(2007))。IgG2的二聚体形成潜在地借助IgG2铰链区结构由C-C键介导(Yoo等人,2003)，表明单独的铰链区结构可以介导二聚体形成。然而，人血清中存在的IgG2二聚体的量是有限的。据估计，作为同型二聚体的二聚体存在的IgG2的量少于10%的总IgG2(Yoo等人,2003)。另外，除同型二聚体的二聚体之外，不存在IgG2的多聚化结构域的定量性证据(Yoo等人,2003)。即，没有发现天然IgG2在人血清中形成更高阶多聚体。因此，本文中提出的结果是特别令人惊讶的，在于含有IgG2铰链区的斯塔都聚体(即G045c、G019和G051)以高阶多聚体存在，并且不同于人血清中IgG2铰链区相互作用可变且不定的天然IgG2，其中，已经显示G045c形成高度稳定的多聚体，通过非还原性SDS-PAGE凝胶上、通过分析性超速离心和通过在100%湿度在37℃的3个月稳定性研究所佐证。另外，还令人惊讶的是，多聚体在含有IgG2铰链区斯塔都聚体制备物中的量显著高于人血清中对IgG2所观察到的10%。例如，多聚体(包括G045c制备物中的同型二聚体的二聚体)的量是大约67%。
人IgG2铰链区单体的氨基酸序列如下：ERKCCVECPPCP(SEQIDNO:3)。SEQIDNO:3中4个半胱氨酸的任一个的突变可以与大幅度削弱的斯塔都聚体多聚化相关。存在IgG2铰链区单体的两个C-X-X-C部分。因此，本发明的斯塔都聚体单体可以包含IgG2铰链区单体的完整12个氨基酸序列，或任意一个或两个4氨基酸核心，连同Fc结构域单体。尽管核心结构的X-X可以是任意氨基酸，但是在优选的实施方式中，X-X序列是V-E或P-P。技术人员将理解，IgG2铰链区单体可以由除核心的4个氨基酸结构之外的铰链区序列的任意部分组成，所述部分包括IgG2铰链区序列的全部和IgG2CH2和CH3结构域单体序列的一些或全部。不受理论约束，IgG2铰链区多聚化结构域可以通过与斯塔都聚体单体的任何部分相互作用形成多聚体。即，一个斯塔都聚体单体的IgG2铰链区可以结合另一个斯塔都聚体单体的IgG2铰链区，从而形成同型二聚体的二聚体或更高阶多聚体，同时相对于天然IgG1Fc，保留增加的与Fc受体功能性结合作用。可选地，一个斯塔都聚体单体的IgG2铰链区结构域可以结合另一个斯塔都聚体单体的IgG1铰链区，从而形成同型二聚体的二聚体或更高阶多聚体，同时相对于天然IgG1Fc，保留增加的与Fc受体功能性结合作用。还可能的是，一个斯塔都聚体单体的IgG2铰链区结构域与IgG1Fc结构域的另一个部分(即，另一个斯塔都聚体单体的CH2或CH3结构域)结合以形成同型二聚体的二聚体或更高阶多聚体，同时相对于天然IgG1Fc，保留增加的与Fc受体功能性结合作用。
也可以使用亮氨酸拉链和异亮氨酸拉链作为多聚化区域。亮氨酸拉链和异亮氨酸拉链(卷曲螺旋结构域)已知促进蛋白质二聚体、三聚体和四聚体的形成(Harbury等人,Science262:1401-1407(1993)；O'Shea等人,Science243:538(1989))。通过利用异亮氨酸拉链形成三聚体的天然倾向性，可以产生簇斯塔都聚体。
尽管技术人员将理解，可以在优选实施方案中使用不同类型的亮氨酸拉链和异亮氨酸拉链，但是使用来自如所述那样修饰的GCN4转录调节物的异亮氨酸拉链(Morris等人,Mol.Immunol.44:3112-3121(2007)；Harbury等人,Science262:1401-1407(1993))：GGGSIKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGERGHGGG(SEQIDNO:5)。这种异亮氨酸拉链序列仅是可以用于Fc结构域单体的多聚化的几种可能序列之一。尽管可以使用SEQIDNO:5中所显示的整个序列，但是加下划线的序列部分代表可以用于本发明的簇斯塔都聚体中的异亮氨酸拉链的核心序列。因此，本发明的斯塔都聚体单体可以包含异亮氨酸拉链的完整氨基酸序列，或28个氨基酸核心，连同一个或多个Fc结构域单体。技术人员还将理解，除核心28个氨基酸结构之外，异亮氨酸拉链可以由拉链的任何部分组成，并且因此可以由多于28个氨基酸但是小于整个序列的氨基酸组成。
GPP是在人胶原蛋白中找到的引起胶原蛋白:蛋白质结合的氨基酸序列。尽管技术人员将理解，可以使用不同类型的GPP重复序列作为多聚化结构域，但是在优选的实施方式中，使用如所述那样的甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸重复序列(Fan等人,FASEBJournal3796第22卷2008)：(SEQIDNO:26)。这种甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸重复序列仅是可以用于Fc结构域单体的多聚化的几种可能序列之一。尽管可以使用SEQIDNO:26中所显示的整个序列，但是不同长度的重复序列也可能可以用来使Fc结构域单体多聚化。同样，也可以置换含有GPP内部不同氨基酸的重复序列。
可以理解，本文中公开的斯塔都聚体和其他生物模拟物分子可以源自多个物种的任一种。实际上，在本发明的任一个生物模拟物分子中的Fc结构域或Fc局部结构域可以源自多于一个(例如，来自2个、3个、4个、5个或更多个)物种的免疫球蛋白。然而，它们将常见地源自单一物种。此外，可以理解，本文中公开的任何方法(例如，治疗方法)可以适用于任何物种。总体上，适用于目的物种的生物模拟物的组分将全部源自这个物种。然而，也可以使用其中全部组分来自不同物种或来自多于一个物种(包括或不包括相关方法适用的物种)的生物模拟物。
可以就免疫球蛋白亚类以及源自它们的生物方面，独立地选择包含本发明的斯塔都聚体和其他生物模拟物的Fc结构域和Fc局部结构域的特定CH1、CH2、CH3和CH4结构域和铰链区。因此，本文中公开的斯塔都聚体和其他生物模拟物可以包含独立来自多个免疫球蛋白类型如人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA1、IgD、IgE和IgM、小鼠IgG2a或犬IgA或IgB的Fc结构域和局部Fc结构域。优选地，对于人用治疗剂，本发明的Fc结构域具有人IgG1同种型。类似地，每个Fc结构域和局部Fc结构域可以源自多个物种，优选地是哺乳动物物种，包括非人灵长类(例如，猴、狒狒和黑猩猩)、人、鼠、家鼠、牛、猪、猫、犬、猪、兔、山羊、鹿、绵羊、雪貂、沙鼠、豚鼠、仓鼠、蝙蝠、鸟(例如，鸡、火鸡和鸭)、鱼类和爬行类，以产生物种特异性或嵌合斯塔都聚体分子。
各个Fc结构域和局部Fc结构域也可以是人源化的。本领域技术人员将认识到，不同的Fc结构域和局部Fc结构域将提供不同类型的功能性。例如，FcγR与IgG免疫球蛋白特异性结合并且并不良好地与其他类别的免疫球蛋白结合。因此，意图设计具有多个Fcγ受体结合能力的斯塔都聚体，本领域技术人员将设计斯塔都聚体Fc结构域，其至少并入IgG的充分表征的Fcγ受体结合序列，包括在下部IgG铰链区和/或IgGCH2及CH3结构域中的那些序列。本领域普通技术人员还将理解多种有害结果可以与特定Ig结构域的使用相关，如与IgA输注相关的过敏反应。本文中公开的生物模拟物通常应当设计成避免这类作用，虽然在特定环境下，这类作用可能是合乎需要的。
本发明还包括了包含Fc结构域和Fc局部结构域的斯塔都聚体，所述Fc结构域和Fc局部结构域具有与Fc结构域或Fc局部结构域的天然存在的氨基酸序列不同的氨基酸。用于纳入本发明生物模拟物复合物的优选Fc结构域对全Fcγ受体或FcγR的可溶性胞外结构域部分具有可测量的特异性结合亲和力。众多Fc结构域和Fc结构域单体的一级氨基酸序列和X射线结晶学结构是本领域可获得的。见，例如，WoofJM,BurtonDR.Humanantibody-Fcreceptorinteractionsilluminatedbycrystalstructures.NatRevImmunol.2004年2月;4(2):89-99。具有Fcγ受体结合能力的代表性Fc结构域包括来自人IgG1的Fc结构域(SEQIDNO:2)。这些天然序列已经经历广泛的结构-功能分析，包括功能性序列的位点定向诱变定位。基于先前的这些结构-功能研究和可用的结晶学数据，本领域技术人员可以设计有功能的Fc结构域序列变体，同时保留Fc结构域的FcγR受体结合能力。例如，可以添加半胱氨酸残基以增强单体之间的硫化键合作用或可以缺失之以改变斯塔都聚体同型二聚体之间的相互作用。
氨基酸变化可以遍及Fc结构域的整个序列存在或隔离至构成Fc结构域的特定Fc局部结构域。用于本发明的斯塔都聚体和其他生物模拟物中的Fc结构域的功能性变体将与天然Fc结构域具有至少约50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性。类似地，用于本发明的斯塔都聚体和其他生物模拟物中的Fc局部结构域的功能性变体将与天然Fc局部结构域具有至少约50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性。
技术人员将理解，本发明还包括Fc结构域单体的功能性变体在构建本发明的Fc片段单体、Fc局部片段单体、斯塔都聚体单体和其他单体中的用途。Fc结构域单体的功能性变体将与天然Fc结构域单体序列具有至少约50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性。
类似地，本发明还包括Fc局部结构域单体的功能性变体在构建本发明的Fc片段单体、Fc局部片段单体、Fc结构域单体、斯塔都聚体单体和其他单体中的用途。Fc局部结构域单体的功能性变体将与天然Fc局部结构域单体序列具有至少约50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性。
氨基酸变化可以减少、增加或不改变斯塔都聚体对Fcγ受体的结合亲和力。优选地这种氨基酸变化将是保守性氨基酸置换，然而，这类变化包括缺失、添加和其他置换。保守性氨基酸置换一般包括在以下组内部的变化：甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸、组氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。此外，氨基酸变化可以增强多聚化强度，例如通过添加半胱氨酸残基。
氨基酸变化可以是导致Fc结构域多态性的天然存在的氨基酸变化，或氨基酸变化可以例如由位点定向诱变引入。氨基酸变化可以在Fc结构域内部任何位置出现，只要Fc结构域保留其受体结合功能和生物学活性。在一个优选实施方案中，多态性或突变导致增强的受体结合作用和/或增强的多聚化或生物学功能。多态性/突变优选地在按照如Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991)中EU索引的氨基酸位置233-435中的一个或多个位置处出现。这些氨基酸位置中的具体多态性/突变是本领域熟知的并且可以例如在Shields等人,(2001)"HighResolutionMappingoftheBindingSiteonHumanIgG1forFcγRI,FcγRII,FcγRIIIandFcRnandDesignofIgG1VariantswithImprovedBindingtotheFcγR,"J.Biol.Chem.,276(9):6591-6601中找到，所述文献以引用的方式整体并入本文。
在一个优选实施方案中，多态性/突变含有IgG1Fc的位置233、234、235、236、237、238、239、253、254、255、256、258、264、265、267、268、269、270、272、276、280、285、286、288、290、293、295、296、297、298、301、303、305、307、309、311、312、315、317、322、326、327、329、330、331、332、333、334、337、338、339、360、362、376、378、380、382、392、414、415、424、430、433、434、435和/或436的一个或多个氨基酸置换。在又一个优选实施方案中，多态性/突变含有IgG1Fc的位置233、234、235、236、237、238、239、253、254、255、256、258、264、265、267、268、269、270、272、276、280、285、286、288、290、293、295、296、297、298、301、303、305、307、309、311、312、315、317、322、326、327、329、330、331、332、333、334、337、338、339、360、362、376、378、380、382、392、414、415、424、430、433、434、435和/或436的两个或更多个氨基酸置换。在又一个优选实施方案中，多态性/突变含有IgG1Fc的位置233、234、235、236、237、238、239、253、254、255、256、258、264、265、267、268、269、270、272、276、280、285、286、288、290、293、295、296、297、298、301、303、305、307、309、311、312、315、317、322、326、327、329、330、331、332、333、334、337、338、339、360、362、376、378、380、382、392、414、415、424、430、433、434、435和/或436的三个或更多个氨基酸置换。在又一个优选实施方案中，多态性/突变含有IgG1Fc的位置233、234、235、236、237、238、239、253、254、255、256、258、264、265、267、268、269、270、272、276、280、285、286、288、290、293、295、296、297、298、301、303、305、307、309、311、312、315、317、322、326、327、329、330、331、332、333、334、337、338、339、360、362、376、378、380、382、392、414、415、424、430、433、434、435和/或436的多于三个氨基酸置换。
如本文所用的术语“功能性变体”指因与参考序列的同源性而相关的序列，所述序列能够介导与参考序列(在它是多肽时)相同的生物学效应或编码多肽，所述多肽能够介导与参考序列(在它是多核苷酸时)编码的多肽相同的生物学效应。例如，本文中所述的任意生物模拟物的功能性变体将具有所述的同源性或同一性并且将能够免疫调节单核细胞或DC。功能性序列变体包括多核苷酸和多肽。通常使用按以下默认参数运行的BLAST2.0(基本局部比对检索工具)评估序列同一性：过滤-开启，评分矩阵-BLOSUM62，字大小-3，E值-10，空位代价-11,1和比对-50。
从上文中，可以理解，本发明的斯塔都聚体包括这样的斯塔都聚体，其(a)仅具有天然存在的Fc结构域；(b)具有天然存在的Fc结构域和氨基酸序列改变的Fc结构域的混合物；和(c)仅具有氨基酸序列改变的Fc结构域。全部要求是，含有改变的氨基酸序列的斯塔都聚体具有至少25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%或甚至更多的相应斯塔都聚体与两个或更多个FcγR受体结合的能力，其中所述的相应斯塔都聚体包含具有天然存在序列的Fc结构域。
在本发明斯塔都聚体中出现的前述Fc.γ受体结合位点可以通过基因工程在序列上改变，以便可预测地获得相对于天然序列具有改变的结合能力和亲和力的结合位点。例如，可以改变特定残基，从而减少生物模拟物复合物与FcγRIIb的Fc结构域结合作用，同时增加与FcγRIIIa的结合。基于hIgGFcγ受体结合序列的结构-功能分析的广泛诱变实例是RobertL.Shields等人，HighResolutionMappingoftheBindingSiteonHumanIgG1forFcγRI,FcγRII,FcγRIIIandFcRnandDesignofIgG1VariantswithImprovedBindingtotheFcγR.J.Biol.Chem.,2001年2月;276:6591-6604。已经对鼠IgGFc(mIgGFc)进行相似的研究。基于天然IgGFc结构域跨物种的结构同源性和一级序列同源性，本领域技术人员可以将人IgGFc和小鼠IgGFc的广泛结构-功能知识转换成在本发明的生物模拟物复合物中理性诱变全部天然Fcγ受体结合位点序列，以便设计出具有特定Fcγ受体特异性和结合亲和力的结合位点。
除天然Fc结构域的氨基酸序列组成之外，Fc结构域的糖含量是已知在Fc结构域结构和与FcγR的结合性相互作用方面发挥重要作用。见，例如，RobertL.Shields,等人,LackofFucoseonHumanIgGlN-LinkedOligosaccharideImprovesBindingtoHumanFcγRIIIandAntibody-dependentCellularToxicity.J.Biol.Chem.,2002年7月;277:26733-26740(doi:10.1074/jbc.M202069200)；AnnWright和SherieL.Morrison.EffectofC2-AssociatedCarbohydrateStructureonIgEffectorFunction:StudieswithChimericMouse-HumanIgGlAntibodiesinGlycosylationMutantsofChineseHamsterOvaryCells.J.Immunol,1998年4月;160:3393-3402。可以使用例如特定蛋白质表达系统(包括特定细胞系)或体外酶修饰作用控制糖含量。因此，本发明包括包含Fc结构域的斯塔都聚体，所述Fc结构域具有从中获得所述结构域的全抗体的天然糖含量，以及具有改变的糖含量的那些生物模拟物复合物。在另一个实施方案中，与相同斯塔都聚体的同型二聚体组分相比，斯塔都聚体的多聚体组分以不同的糖基化模式为特征。在一个优选实施方案中，斯塔都聚体富含多聚体，所述多聚体包含增强Fc受体结合的糖基化模式。
添加至Fc局部结构域、多聚化区域的多肽链或糖基化变化可以在Fc结构域中产生构象变化，从而引起Fc结构域对Fcγ受体的结合增强。因此，似乎非常小地改变多肽也可以产生能够增强与多个Fcγ受体结合的斯塔都聚体或与多个Fcγ受体结合的能力降低的斯塔都聚体。
局部结构域和局部片段
技术人员将进一步认识到，用于本发明实施方案中的Fc结构域和Fc局部结构域不需要是全长形式。即，本发明包括使用从构成本发明的斯塔都聚体和其他生物模拟物的特定Fc结构域单体和Fc局部结构域单体的氨基端、羧基端或中部缺少氨基酸的Fc结构域单体和Fc局部结构域单体。
例如，已经描述了Fcγ受体的人IgG免疫球蛋白上的结合位点(例如，Radaev,S.,Sun,P.,2001.RecognitionofImmunoglobulinsbyFcγReceptors.MolecularImmunology38,1073-1083；Shields,R.L.等人,2001.HighResolutionMappingoftheBindingSiteonHumanIgG1forFcγRI,FcγRII,FcγRIIIandFcRnandDesignofIgG1VariantswithImprovedBindingtotheFcγR.J.Biol.Chem.276(9),6591-6604)。基于这种知识，可以从这些免疫球蛋白的Fc结构域中移除氨基酸并且确定对Fc结构域和受体之间结合性相互作用的影响。因此，本发明包括IgGFc结构域，其具有至少约90%涵盖如Radaev,S.,Sun,P.,2001所定义的下部铰链区和CH2的位置233至338的氨基酸。
本发明的IgG免疫球蛋白的Fc局部结构域包括铰链区的全部或部分、CH2结构域的全部或部分和CH3结构域的全部或部分。
从Fc局部结构域单体中构建仅具有部分铰链区、部分CH2结构域或部分CH3结构域的IgGFc局部结构域。因此，本发明包括源自铰链区的N末端或铰链区的C-末端的IgG铰链区单体。它们可以因此含有例如5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个或62个(对于IgG1，直至15个；对于IgG2，直至12个；对于IgG3，直至62个；对于IgG4，直至12个)铰链区的氨基酸。
本发明也包括源自CH2结构域的N末端或CH2结构域的C-末端的IgGCH2结构域单体。它们因此可以含有例如5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、101个、102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个、109个或110个(对于IgG1和IgG3，直至110个；对于IgG2和IgG4，直至109个)CH2结构域的氨基酸。
本发明还包括源自CH3结构域的N末端或CH3结构域的C-末端的IgGCH3结构域单体。它们因此可以含有例如5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、101个、102个、103个、104个、105个、106个或107个(对于IgG1和IgG3，直至106个；对于IgG2和IgG4，直至107个)CH3结构域的氨基酸。
从上文中，可以理解，本发明的不同实施方案包括这样的斯塔都聚体，其含有(a)全长Fc结构域；(b)全长Fc结构域和Fc局部结构域的混合物；和(c)Fc局部结构域。在这些实施方案的每一个中，斯塔都聚体还可以包含CH1结构域。如本文中讨论，在本发明斯塔都聚体的每个实施方案中，所述斯塔都聚体具有结合两个或更多个Fcγ受体的能力。
斯塔都聚体和斯塔都聚体单体的优选实施方案
如本文所用的术语“FcγR”和“Fcγ受体”包括在免疫细胞表面上表达的Fcγ受体蛋白质家族的每个成员，如NimmerjahnF和RavetchJV.Fcγreceptors:oldfriendsandnewfamilymembers.Immunity.2006年1月;24(1):19-28中所述，或如稍后可以定义。本文中所述的术语“FcγR”意在包括FcγRI、RII和RIII家族的全部成员。Fcγ受体包括低亲和力和高亲和力Fcγ受体，在人类中包括但不限于FcγRI(CD64)；FcγRII(CD32)及其同种型和同种异型FcγRIIaLR、FcγRIIaHR、FcγRIIb和FcγRIIc；FcγRIII(CD16)及其同种型FcγRIIIa和FcγRIIIb。技术人员会认识到，包括与FcγR和FcγR同源物结合的复合物(如Davis等人,(2004)“DifferentialBcellexpressionofmouseFcreceptorhomologs,”Int.Immunol.,16(9):1343-1353中描述那些)的本发明将适用于可能仍未发现的未来FcγR和相关的同种型和同种异型。
已经描述，hIVIG结合并充分饱和新生儿Fc受体(“FcRn”)，并且FcRn的这类竞争性抑制可以在hIVIG的生物学活性方面发挥重要作用(例如，MechanismsofIntravenousImmunoglobulinActioninImmuneThrombocytopenicPurpura.F.Jin,J.Balthasar.HumanImmunology,2005,第66卷,第4期,第403-410页)。由于与Fcγ受体强烈结合的免疫球蛋白也至少某种程度地与FcRn结合，技术人员将认识到，能够与多于一个Fcγ受体结合的斯塔都聚体也将结合并充分饱和FcRn。
如本文所用，“能够与FcγRx特异性结合”指与FcγR(如FcγRIII)结合。特异性结合通常定义为结合分析中由后续过量的未标记配体可替换的标记配体的量。然而，这不排除本领域充分建立的评估特异性结合的其他手段(例如，MendelCM,MendelDB,'Non-specific'binding.Theproblem,andasolution.BiochemJ.1985年5月15日;228(1):269-72)。可以按本领域熟知的多种方式如表面等离子体共振(SPR)技术(通过可商业获得)或生物双层干涉测量(通过可商业获得)测量特异性结合，以表征免疫活性生物模拟物的缔合常数和解离常数(AsianK,LakowiczJR,GeddesC.Plasmonlightscatteringinbiologyandmedicine:newsensingapproaches,visionsandperspectives.CurrentOpinioninChemicalBiology2005,9:538-544)。
“聚集的天然IgG的免疫活性”指当免疫系统暴露于IgG聚集物时影响免疫系统发挥作用的多聚化IgG的特性。天然多聚化IgG的具体特性包括改变的FcγR特异性结合作用、在免疫细胞表面上交联FcγR或多聚化IgG的效应子功能如抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)、吞噬(ADCP)或补体固定(见，例如，NimmerjahnF,RavetchJV.Theanti-inflammatoryactivityofIgG:theintravenousIgGparadox.JExpMed.2007;204:11-15;AugenerW,FriedmanB,BrittingerG.AreaggregatesofIgGtheeffectivepartofhigh-doseimmunoglobulintherapyinadultidiopathicthrombocytopenicpurpura(ITP)?Blut.1985;50:249-252;AraseN,AraseH,ParkSY,OhnoH,RaC,SaitoT.AssociationwithFcRgammaisessentialforactivationsignalthroughNKR-P1(CD161)innaturalkiller(NK)cellsandNK1.1+Tcells.JExpMed.1997;186:1957-1963;TeelingJL,Jansen-HendriksT,KuijpersTW,等人,TherapeuticefficacyofintravenousimmunoglobulinpreparationsdependsontheimmunoglobulinGdimers:studiesinexperimentalimmunethrombocytopenia.Blood.2001;98:1095-1099;AndersonCF,MosserDM.Cuttingedge:biasingimmuneresponsesbydirectingantigentomacrophageFcgammareceptors.JImmunol.2002;168:3697-3701;JefferisR,LundJ.InteractionsitesonhumanIgG-FcforFcγR:currentmodels.ImmunologyLetters.2002;82:57;BankiZ,KacaniL,MullauerB等人,Cross-LinkingofCD32InducesMaturationofHumanMonocyte-DerivedDendriticCellsViaNF-{kappa}BSignalingPathway.JImmunol.2003;170:3963-3970;SiragamV,BrineD,CrowAR,SongS,FreedmanJ,LazarusAH.CanantibodieswithspecificityforsolubleantigensmimicthetherapeuticeffectsofintravenousIgGinthetreatmentofautoimmunedisease?JClinInvest.2005;115:155-160)。这些特性总体上通过与同型二聚体IgG的特性比较进行评估。
如本文所用，“可相当于或优于多种天然存在的聚集IgG免疫球蛋白的Fcγ受体交联或效应子功能”意指斯塔都聚体产生的Fcγ受体交联分析值是使用相似剂量或浓度的hIVIG所实现值的约70%或更大。在一些实施方案中，分析值至少处于使用hIVIG实现的分析值的标准误范围内。在其他实施方案中，分析值是相同剂量下hIVIG的分析值的110%或更高。用于Fcγ交联作用的测定法是本领域普通技术人员熟知的(见，例如，Nimmerjahn和Ravetch,(2008)“Fcγreceptorsasregulatorsofimmuneresponses,”NatureReviewsImmunology,8:34-47)。
尽管已经发现更高阶多聚体有效调节免疫反应，我们令人惊讶地发现同型二聚体也是有效的免疫调节物。不受理论约束，认为同型二聚体能够在体内形成更高阶多聚体。通过多聚化实验，我们已经发现纯的同型二聚体群体能够在低水平的血液或胎牛血清存在下多聚化。因此，尽管更高阶多聚体比同型二聚体级分在调节免疫反应方面更有效，但是部分地通过同型二聚体在低水平血液或血清存在下多聚化，本发明天然连接的斯塔都聚体的同型二聚体级分也可以是有效的免疫调节物。因此，“更高阶多聚体”意指除注射入受试者之前在溶液中形成的同型二聚体之外的多聚体以及除在体内形成的同型二聚体之外的多聚体。
“免疫调节活性”、“调节免疫反应”、“调节免疫系统”和“免疫调节”意指通过改变一个或多个免疫细胞的活性、能力和相对数目而改变免疫系统，包括某个细胞类型成熟为其细胞类型或成熟为其他细胞类型。例如，对不成熟单核细胞的免疫调节可以导致更成熟单核细胞、树突状细胞、巨噬细胞或破骨细胞的更大群体，所述细胞均源自不成熟的单核细胞。作为另一个实例，对记忆型B细胞的免疫调节可以导致某些记忆型B细胞的选择性凋亡，同时特定抗体的产生下降。作为另一个实例，对NK细胞的免疫调节可以导致增强的抗体依赖性细胞毒作用。作为另一个实例，免疫调节活性可以导致具有否则可能不以高水平表达的表型的细胞群体增加，如CD8β+/CD11c+细胞。作为另一个实例，免疫调节活性可以导致在自身免疫疾病中常见升高的促炎细胞因子或细胞因子(如IL-6和IL-8)降低。作为另一个实例，免疫调节活性可以导致NKT细胞的活化和随后TGF-β的分泌及切割。例如，免疫细胞受体可以由免疫活性生物模拟物结合并且激活胞内信号传导以诱导多种免疫细胞变化，单独地称作“活化性免疫调节”。阻断免疫细胞受体以防止受体活化也包含于“免疫调节”内并且可以单独地称作“抑制性免疫调节”。
对树突状细胞的调节可以促进或抑制抗原呈递至T细胞，例如通过诱导CD86和/或CD1a在树突状细胞的表面上表达。CD1a是在抗原呈递细胞、尤其树突状细胞的表面上表达的I类MHC结合糖蛋白。CD1a参与呈递脂类抗原至T细胞。CD86还在抗原呈递细胞的表面上表达并且向T细胞提供共刺激作用。CD86是T细胞表面上分别发送活化信号和抑制性信号的CD28和CTLA-4的配体。因此，CD86及其同族受体的表达水平决定是否将诱导耐受性或特异性免疫反应。在一个优选实施方案中，本发明的斯塔都聚体能够调节免疫反应，部分地通过诱导CD86和CD1a在抗原呈递细胞、尤其树突状细胞的表面上表达调节免疫反应。
对单核细胞成熟的调节指单核细胞分化为成熟DC、巨噬细胞或破骨细胞。可以调节分化以便加快成熟的速率或方向和/或以便增加正在经历分化的单核细胞的数目。可选地，可以就分化的速率和/或正在经历分化的细胞的数目方面减少分化。
如本文所用的术语“分离的”多肽或肽指没有天然存在的对应物或已经从天然伴随之的组分中(例如，在组织如胰组织、肝组织、脾组织、卵巢组织、睾丸组织、肌肉组织、关节组织、神经组织、胃肠道组织或乳腺组织或肿瘤组织(例如，乳腺癌组织)或体液如血液、血清或尿中)分离或纯化的多肽或肽。一般地而言，当多肽或肽按干重不含至少70%与其天然结合的蛋白质和其他天然存在的有机分子时，将它视为“分离的”。优选地，本发明的多肽(或肽)制备物按干重分别占本发明多肽(肽)的至少80%、更优选地至少90%和最优选地至少99%。由于化学合成的多肽或肽天然地与天然伴随它的组分分隔，所以合成多肽或肽是“分离的”。
本发明的分离多肽(或肽)可以例如通过从天然来源(例如，从组织或体液)中提取；通过表达编码多肽或肽的重组核酸；或通过化学合成来获得。在与天然衍生所述多肽或肽的来源不同的细胞系统中产生的多肽或肽是“分离的”，因为它必然将不含天然伴随它的组分。在一个优选实施方案中，本发明的分离多肽仅含有与前导肽(SEQIDNO:1)、IgG1Fc单体(SEQIDNO:2)或(SEQIDNO:19)和IgG2铰链区多聚化结构域(SEQIDNO:3)、异亮氨酸多聚化结构域(SEQIDNO:5)或GPP多聚化结构域(SEQIDNO:26)对应的序列并且不含可能有助于克隆或纯化蛋白质的其他序列(即，引入的限制性酶识别位点或纯化标签)。可以通过任何适宜的方法(例如柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析)测量分离或纯度的程度。
药物组合物
将借助任何常见的途径、经口、肠胃外地或局部施用本文所述的斯塔都聚体组合物。示例性途径包括但不限于经口、经鼻、颊部、经直肠、经阴道、经眼、皮下、肌内、腹膜内、静脉内、动脉内、肿瘤内、脊髓、鞘内、关节内、动脉内、蛛网膜下、舌下、口腔粘膜、支气管、淋巴液、子宫内、皮下、肿瘤内、整合于可植入器械(如缝线)上或可植入器械(如可植入聚合物)内、硬膜内、皮质内或皮肤途径。这类组合物正常将作为如本文所述的可药用组合物施用。在一个优选实施方案中，静脉内或皮下施用分离的斯塔都聚体。
如本文所用的术语“可药用载体”包括任何和全部溶剂、分散介质、包衣、抗菌药和抗真菌药、等渗剂和吸收延迟剂等。用于药学活性剂的此类介质和试剂的用途是本领域熟知的。除了任何常规培养基或试剂与本发明的载体或细胞不相容的情况下之外，包括了它在治疗性组合物中的用途。补充性有效成分也可以并入组合物中。
本发明的斯塔都聚体组合物可以按中性或盐形式配制。可药用盐包括与无机酸例如氢氯酸或磷酸或这类有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成的酸性加成盐(用蛋白质的游离氨基形成)。用游离羧基形成的盐也可以源自无机碱例如，氢氧化钠、钾、铵、钙或铁和这类有机碱如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。
通过以下方式制备无菌可注射溶液剂：将斯塔都聚体以要求的量连同上文列举的多种其他成分一起并入适宜的溶剂中，根据需要，随后过滤消毒。通常，通过将多种消毒的有效成分并入无菌媒介物中来制备分散体，所述无菌媒介物含有基础分散介质和来自上文所列举那些成分中所要求的其他成分。在用于现场制备无菌可注射溶液剂的无菌粉末情况下，优选的制备方法是真空干燥技术和冷冻干燥技术，所述技术产生有效成分的粉末，外加来自其先前无菌过滤的溶液中的任何额外的所需成分。
另外，一个实施方案是适于口服施用的斯塔都聚体组合物并且在具有或没有惰性稀释剂的可药用载体中提供。载体应当是可吸收或可食用的并且包括液体、半固体即糊膏或固体载体。除了任何常规培养基、试剂、稀释剂或载体有害于受体或有害于其中所含斯塔都聚体制备物的治疗作用情况下之外，其在用于实施本发明方法的可经口施用的斯塔都聚体组合物中使用是适宜的。载体或稀释剂的实例包括脂肪、油、水、盐水溶液、脂类、脂质体、树脂、粘合剂、填料等或其组合。如本文所用的术语“经口施用”包括口服、颊部、肠内或胃内施用。
在一个实施方案中，斯塔都聚体组合物与载体以任何便利和实用的方式即通过溶解、混悬、乳化、混合、包囊化、微包囊化、吸收等组合。这类方法对于本领域技术人员是常规的。
在具体实施方案中，将处于粉末形式的斯塔都聚体组合物与半固体或固体载体充分地合并或混合。混合可以按任何便利的方式(如碾磨)实施。还可以在混合过程中添加稳定剂，以便保护组合物免于经过胃时丧失治疗活性，即在胃中变性。用于可经口施用的组合物中的稳定剂的实例包括缓冲剂、针对胃酸分泌的拮抗药、氨基酸如甘氨酸和赖氨酸、糖如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、山梨醇、甘露醇等、蛋白水解酶抑制剂等。更优选地，对于经口施用的组合物，稳定剂也可以包括针对胃酸分泌的拮抗药。
另外，与半固体或固体载体组合的用于口服施用的斯塔都聚体组合物可以进一步配制成硬壳或软壳明胶胶囊剂、片剂或丸剂。更优选地，明胶胶囊剂、片剂或丸剂包肠衣。肠衣防止组合物在pH为酸性的胃或上肠道中变性。即，见美国专利No.5,629,001。当抵达小肠时，此处碱性pH溶解包衣并且允许组合物释放以与肠道细胞(例如，Peyer结M细胞)相互作用。
在具体实施方案中，将处于粉末形式的斯塔都聚体组合物与产生纳米粒子的材料充分地合并或混合，所述纳米粒子包囊免疫活性生物模拟物或与免疫活性生物模拟物连接。每个纳米粒子将具有小于或等于100微米的尺寸。纳米粒子可以具有允许胃肠道吸收免疫活性生物模拟物的黏膜黏附特性，其中所述免疫活性生物模拟物否则将不是可口服生物利用的。
在另一个实施方案中，粉状组合物与具有或没有稳定剂的液体载体(即，例如水或盐水溶液)组合。
可以使用的具体斯塔都聚体制剂是免疫活性生物模拟物蛋白质在不含钾的基于磷酸盐的低渗缓冲液中的溶液剂，其中缓冲液的组成组合物如下：6mM一水合磷酸二氢钠，9mM七水合磷酸氢二钠，50mM氯化钠，pH7.0.+/-0.1。免疫活性生物模拟物蛋白质在低渗缓冲液中的浓度范围可以是10微克/ml至100毫克/ml。这种制剂可以通过任何施用途径施用，例如，但不限于静脉内施用。
另外，与半固体载体组合的用于局部施用的斯塔都聚体组合物可以进一步配制成乳膏剂或凝胶油膏剂。用于形成凝胶油膏剂的优选载体是凝胶聚合物。用来制造本发明的凝胶组合物的优选聚合物包括但不限于卡波普、羧甲基纤维素和普卢兰尼克聚合物(pluronicpolymer)。特别地，粉状Fc多聚体组合物与含有浓度在0.5%和5%wt/体积之间的聚合剂(如卡波普980)的水凝胶组合，以便施加于皮肤以治疗皮肤上或皮肤下的疾病。如本文所用的术语“局部施用”包括施加至皮肤、表皮、皮下或粘膜表面。
另外，斯塔都聚体组合物可以配制成用于皮下或真皮下植入的聚合物。用于药物输注的可植入聚合物的优选制剂是总体上认为安全的药物并且可以例如包括交联葡聚糖(SamanthaHart,MasterofScienceThesis,“ElutionofAntibioticsfromaNovelCross-LinkedDextranGel:Quantification”VirginialPolytechnicInsituteandStateUniversity,2009年6月8日)、葡聚糖-酪胺(Jin等人,(2010)TissueEng.PartA.16(8):2429-40)、葡聚糖-聚乙二醇(Jukes等人,(2010)TissueEng.PartA.,16(2):565-73)或葡聚糖-戊二醛(Brondsted等人,(1998)J.ControlledRelease,53:7-13)。本领域技术人员将知道，可以形成许多相似的聚合物和水凝胶，从而并入在聚合物或水凝胶内部固定的斯塔都聚体并且控制孔径至所需的直径。
当配制时，溶液以相容于剂型的方式和以治疗有效的量施用，以便导致症状的改善或纠正。制剂容易地以多种剂型如可摄取的溶液剂、药物释放胶囊剂等施用。取决于正在接受治疗的患者的状况，剂量的一些变动可以出现。在任何情况下，负责施用的人可以决定各位受试者的适宜剂量。另外，对于人类施用，制品满足如FDA生物制品评价和研究中心标准所要求的无菌性、总体安全性和纯度标准。
施用途径将天然地随正在治疗的疾病的位置和本质变动，并且可以包括例如皮内、透皮、皮下、肠胃外、经鼻、静脉内、肌内、鼻内、皮下、透皮(percutaneous)、气管内、腹膜内、肿瘤内、灌注、灌洗、直接注射和口服施用。
如本文所用的术语“肠胃外施用”包括其中所述复合物在不涉及经肠吸收的情况下被吸收至受试者中的任何施用形式。本发明中使用的示例性肠胃外施用包括但不限于肌内、静脉内、腹膜内、肿瘤内、眼球内、经鼻或关节内施用。
此外，本发明的斯塔都聚体可以任选地在另一种药剂之前、期间或之后施用。例如，已经令人惊讶地发现，本发明斯塔都聚体和泼尼松龙的同时施用协同地实现比单独采用斯塔都聚体组合物或泼尼松龙时所观察优越的结果(见图3)。
下文是如所述，用于具体示例性疾病的多种药物制剂类型和优选施用途径的具体实例：
颊部或舌下可溶性片剂：心绞痛、结节性多发性动脉炎。
静脉内：特发性血小板减少性紫癜、包涵体肌炎、副蛋白血症IgM脱髓鞘性多发性神经病、坏死性筋膜炎、天疱疮、坏疽、皮肌炎、肉芽肿、淋巴瘤、败血症、再生障碍性贫血、多系统器官衰竭、未知意义的多发性骨髓瘤和单克隆丙种球蛋白病、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病、炎性肌病、血栓性血小板减少性紫癜、肌炎、贫血、瘤形成、溶血性贫血、脑炎、脊髓炎、尤其与人嗜T淋巴细胞病毒1相关的脊髓病、白血病、多发性硬化和视神经炎、哮喘、表皮坏死松解症、朗-爱二氏肌无力综合征、重症肌无力、神经病、葡萄膜炎、Guillain-Barré综合征、移植物抗宿主病、僵人综合征、伴有抗Yo抗体的副肿瘤性小脑变性、伴有抗Hu抗体的副肿瘤性脑脊髓炎和感觉神经病、全身性血管炎、系统性红斑狼疮、自身免疫糖尿病性神经病、急性特发性自主神经机能异常性神经病、伏格特-小柳-原田三氏综合征、多灶性运动神经病、与抗/GMl相关的下位运动神经元综合征、脱髓鞘、膜增生性肾小球肾炎、心肌病、川崎病、类风湿性关节炎和埃文斯综合征IM-ITP、CIDP、MS、皮肌炎、重症肌无力、肌营养不良。如本文所用的术语“静脉内施用”包括通过静脉内注射或输注递送本发明的复合物或组合物至全身循环的全部技术。
皮肤凝胶剂、洗剂、乳膏剂或贴剂：白斑症、带状疱疹、痤疮、唇炎。
直肠栓剂、凝胶剂或输注：溃疡性结肠炎、痔疮炎症。
作为包囊化或具有肠衣的丸剂、药锭剂口服：克罗恩氏病、乳糜泻、肠激惹综合征、炎性肝病、巴氏食道症。
皮质内：癫痫、阿尔茨海默、多发性硬化、帕金森病、亨廷顿病。
腹内输注或植入：子宫内膜异位症。
滴虫的阴道内凝胶或栓剂：细菌性、滴虫性或真菌性阴道炎。
医疗器械：涂覆在冠状动脉支架、假体关节上。
本文所述的斯塔都聚体可以按每公斤体重约0.01mg至每公斤体重约300mg和尤其每公斤体重0.01mg至每公斤体重约1000mg的剂量施用并且可以每日、每周、每两周或每月施用至少一次。可以使用双阶段剂量方案，其中第一剂量阶段占第二剂量阶段的约0.1%至约300%。
斯塔都聚体的治疗性应用
基于理性设计和体外和体内验证，本发明的斯塔都聚体将充当用于治疗自身免疫疾病和用于多种其他背景(如癌症和炎性疾病的生物免疫疗法)下调节免疫功能的重要的生物药物。适于用本文所述的免疫活性生物模拟物治疗的医学病状包括目前用hIVIG常规治疗或其中已经发现hIVIG在临床上有用的那些病状，如自身免疫血细胞减少症、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、格-巴二氏综合征、重症肌无力、抗因子VIII自身免疫疾病、皮肌炎、血管炎和葡萄膜炎(见，F.G.vanderMeche,P.I.Schmitz,N.Engl.J.Med.326,1123(1992)；P.Gajdos等人,Lanceti,406(1984)；Y.Sultan,M.D.Kazatchkine,P.Maisonneuve,U.E.Nydegger,Lancetii,765(1984)；M.C.Dalakas等人,N.Engl.J.Med.329,1993(1993)；D.R.Jayne,M.J.Davies,C.J.Fox,C.M.Black,C.M.Lockwood,Lancet337,1137(1991)；P.LeHoang,N.Cassoux,F.George,N.Kullmann,M.D.Kazatchkine,Ocul.Immunol.Inflamm.8,49(2000))和其中可以使用或已经临床使用单克隆抗体的那些癌症或炎性疾病条件。在可以用作为本发明主题的复合物有效治疗的那些病状中所包括的病状包括存在细胞因子网络不平衡的炎性疾病、由致病性自身抗体或自身侵入性T细胞介导的自身免疫紊乱或者慢性复发性自身免疫、炎性或传染性疾病或过程的急性期或慢性期。
此外，存在炎性组分的其他医学病状将从斯塔都聚体治疗中获益，如肌萎缩侧索硬化、亨廷顿病、阿尔茨海默病、帕金森病、心肌梗死、中风、乙型肝炎、丙型肝炎、人免疫缺损病毒相关炎症、脑白质肾上腺萎缩症和癫痫性障碍，尤其认为与后病毒性脑炎相关的那些障碍，包括Rasmussen综合征、韦斯特综合征和Lennox-Gastaut综合征。
使用本文所述的分离斯塔都聚体的一般治疗方法是向具有疾病或病状的受试者施用治疗有效量的分离的免疫活性生物模拟物以实现治疗。在一些实施方案中，疾病或病状可以宽泛地归类为存在细胞因子网络不平衡的炎性疾病、由致病性自身抗体或自身侵入性T细胞介导的自身免疫紊乱或者慢性复发性疾病或过程的急性期或慢性期。
如本文所用的术语“治疗”和“治疗”指向受试者施用治疗有效量的本发明斯塔都聚体，从而受试者在疾病或病状或疾病或病状的症状方面具有改善。改善是疾病或病状或疾病或病状的症状的任何改善或纠正。改善是可观察或可测量的改善，或可以是受试者总体幸福感的改善。因此，本领域技术人员认识到，治疗可以改善疾病状态，但可以不是疾病的完全治愈。具体而言，受试者中的改善可以包括以下一项或多项：炎症减少；炎性实验室标记(如C-反应蛋白)降低；自身免疫性降低，如以下一项或多项佐证：自身免疫标记(如自身抗体)或血小板计数、白细胞计数或红细胞计数的改善、皮疹或紫癜减少、虚弱、麻木或刺痛减少、高血糖症患者中葡萄糖水平增加、关节疼痛、炎症、肿胀或降解减少、绞痛和腹泻频率和容量下降、心绞痛减少、组织炎症减少或发作频率降低；癌症肿瘤负荷降低、至肿瘤进展的时间增加、癌疼痛减少、存活增加或生活质量改善；或延迟骨质疏松症进展或改善骨质疏松症。
如本文所用的术语“治疗有效量”指导致改善或纠正疾病或病状的症状的量。
如本文所用，“预防”可以意指完全阻止疾病的症状、延迟疾病症状的发作或减轻随后形成的疾病症状的严重性。
如本文所用，术语“受试者”意指根据本文所述方法向其施用本发明斯塔都聚体的任何哺乳动物受试者。在具体实施方案中，本公开的方法用来治疗人类受试者。本公开的方法也可以用来处理非人灵长类(例如，猴、狒狒和黑猩猩)、小鼠、大鼠、牛、马、猫、犬、猪、兔、山羊、鹿、绵羊、雪貂、沙鼠、豚鼠、仓鼠、蝙蝠、鸟(例如，鸡、火鸡和鸭)、鱼类和爬行类以产生物种特异性或嵌合斯塔都聚体分子。
具体而言，本发明的斯塔都聚体可以用来治疗以下病状，包括但不限于充血性心力衰竭(CHF)、血管炎、酒渣鼻、痤疮、湿疹、心肌炎和心肌的其他病状、系统性红斑狼疮、糖尿病、脊椎病、滑膜成纤维细胞瘤和骨髓间充质细胞瘤；骨量丢失；佩吉特病、破骨细胞瘤；肥大性骨形成；多发性骨髓瘤；乳腺癌；废用性骨质减少；营养不良、牙周病、高歇氏病、郎罕氏细胞组织细胞增多症、脊髓损伤、急性脓毒性关节炎、骨软化症、库欣综合征、单骨型骨纤维发育不良、多骨型骨纤维发育不良、牙周重建及骨折、肉瘤样病；溶骨性骨癌、肺癌、肾癌和直肠癌；骨转移、骨疼痛防治及体液性恶性高血钙症、强直性脊柱炎和其他脊椎关节病；移植排斥、病毒性感染、血液肿瘤和肿瘤样病状，例如，霍奇金淋巴瘤；非霍奇金淋巴瘤(伯基特淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤/慢性淋巴细胞白血病、蕈样真菌病、套细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、弥漫大B细胞性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多毛细胞白血病和淋巴浆细胞样白血病)、淋巴细胞前体细胞的肿瘤，包括B-细胞急性淋巴性白血病/淋巴瘤和T-细胞急性淋巴性白血病/淋巴瘤、胸腺瘤、成熟T细胞和NK细胞的肿瘤，包括外周T-细胞白血病、成人T-细胞白血病/T-细胞淋巴瘤和大颗粒淋巴细胞白血病、郎罕氏细胞组织细胞增多症、髓样肿瘤如急性髓性白血病、包括伴成熟的AML、无分化的AML、急性早幼粒细胞白血病、急性粒-单核细胞白血病和急性单核细胞性白血病、骨髓增生异常综合征和慢性骨髓增生病、包括慢性髓性白血病、中枢神经郎罕氏细胞系统肿瘤，例如，脑肿瘤(胶质瘤、神经母细胞瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤和视网膜母细胞瘤)、实体瘤(鼻咽癌、基底细胞癌、胰腺癌、胆管癌、卡波西肉瘤、睾丸癌、子宫癌、阴道癌或宫颈癌、卵巢癌、原发性肝癌或子宫内膜癌、血管系统肿瘤(血管肉瘤和血管外皮细胞瘤)或其他癌症。
“癌症”在本文中指或描述哺乳动物中一般以失调的细胞生长为特征的生理状况。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤(包括脂肪肉瘤、成骨肉瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤、软骨肉瘤)、神经内分泌肿瘤、间皮瘤、脊索瘤、滑膜瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、腺癌、黑素瘤、白血病或淋巴样恶变。此类癌的更多具体实例包括鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)、肺癌包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌、小细胞肺癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌或胃部癌症，包括胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾脏或肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食管癌、胆管肿瘤、尤因氏瘤、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯肿瘤、睾丸肿瘤、肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、骨髓增生异常病、重链病、神经内分泌肿瘤、神经鞘瘤和其他癌，以及头颈癌。
本发明的斯塔都聚体可以用来治疗自身免疫疾病。如本文所用的术语“自身免疫疾病”指多样的超过80种疾病和病状的组。在全部这些疾病和病状中，基础性问题是身体的免疫系统攻击身体本身。自身免疫疾病侵袭身体的全部主要系统，包括结缔组织、神经、肌肉、内分泌系统、皮肤、血液和呼吸系统和胃肠系统。自身免疫疾病例如包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、多发性硬化、重症肌无力和1型糖尿病。
使用本发明的组合物和方法可治疗的疾病或病状可以是血液免疫学过程，包括但不限于特发性血小板减少性紫癜、同种异型免疫性/自身免疫性血小板减少症、获得性免疫性血小板减少症、自身免疫性中性粒细胞减少症、自身免疫性溶血性贫血、细小病毒B19相关性红细胞再生障碍、获得性抗因子VIII自身免疫性、获得性血管性血友病、未知意义的多发性骨髓瘤和单克隆丙种球蛋白病、败血症、再生障碍性贫血、单纯红细胞再生障碍、戴-布二氏贫血、新生儿溶血病、免疫介导的中性粒细胞减少症、血小板输注无效、新生儿输血后紫癜、溶血尿毒症综合征、全身性血管炎、血栓性血小板减少性紫癜或埃文斯综合征。
疾病或病状也可以是神经免疫学过程，包括但不限于格-巴二氏综合征、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病、副蛋白血症IgM脱髓鞘性多发性神经病、朗-爱二氏肌无力综合征、重症肌无力、多灶性运动神经病、与抗/GMl相关的下位运动神经元综合征、脱髓鞘、多发性硬化和视神经炎、僵人综合征、伴有抗Yo抗体的副肿瘤性小脑变性、副肿瘤性脑脊髓炎、伴有抗Hu抗体的感觉神经病、癫痫、脑炎、脊髓炎、与人嗜T淋巴细胞病毒-1相关的脊髓病、自身免疫糖尿病性神经病、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病或急性特发性自主神经机能异常性神经病。
疾病或病状也可以是风湿性疾病过程，包括但不限于川崎病、类风湿性关节炎、费耳提氏综合征、ANCA阳性血管炎、自发多发性肌炎、皮肌炎、抗磷脂综合征、反复自发流产、系统性红斑狼疮、青少年特发性关节炎、雷诺氏综合征、CREST综合征或葡萄膜炎。
疾病或病状也可以是皮肤免疫学疾病过程，包括但不限于中毒性表皮坏死松解症、坏疽、肉芽肿、自身免疫皮肤疱病，包括寻常天疱疮、大疱性类天疱疮、落叶型天疱疮、白斑症、链球菌性中毒性休克综合征、硬皮病、系统性硬化症包括扩散型和局限性皮肤系统性硬化症或异位性皮炎(尤其类固醇依赖性)。
疾病或病状也可以是骨骼肌免疫学疾病过程，包括但不限于包涵体肌炎、坏死性筋膜炎、炎性肌病、肌炎、抗Decorin(BJ抗原)肌病、副肿瘤性坏死性肌病、X连锁的空泡性肌病、青霉胺诱导的多发性肌炎、动脉粥样硬化、冠状动脉病或心肌病。
疾病或病状也可以是胃肠道免疫学疾病过程，包括但不限于恶性贫血、自身免疫慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、乳糜泻、疱疹样皮炎、隐源性肝硬化、反应性关节炎、克罗恩氏病、惠普尔氏病、溃疡性结肠炎或硬化性胆管炎。
疾病或病状也可以移植物抗宿主病、抗体介导的移植体排斥、骨髓移植后排斥、传染病后炎症、淋巴瘤、白血病、瘤形成、哮喘、伴有抗β细胞抗体的1型糖尿病、斯耶格伦氏综合征、混合型结缔组织病、阿狄森病、伏格特-小柳-原田三氏综合征、膜增生性肾小球肾炎、肺出血肾炎综合征、格雷夫斯氏病、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto'sthyroiditis)、韦格纳肉芽肿病(Wegener'sgranulomatosis)、显微镜下多动脉炎(micropolyarterits)、丘-施二氏综合征、结节性多发性动脉炎或多系统器官衰竭。
在另一个实施方案中，本文中所述的斯塔都聚体可以在起动灌注系统中使用，在所述系统中将血液从患者抽出并且引入返回患者之前与斯塔都聚体短暂接触约1.5小时至约3小时的时间。在这种形式的细胞疗法中，患者自身的效应细胞暴露于离体固定在基质上的斯塔都聚体，以便通过使效应细胞暴露于斯塔都聚体而调节效应细胞。随后将包含受调节的效应细胞的血液输回至患者中。这种起动灌注系统可以具有许多临床应用和治疗应用。
本文中公开的斯塔都聚体也可以轻易地用来在多种背景下改变免疫系统反应，以影响免疫反应概况的特定变化。改变或调节受试者中的免疫反应指增加、减少或改变免疫反应的比率或组分。例如，可以根据需要，通过用设计成与FcR相互作用的斯塔都聚体靶向这些受体的适宜组合，增加或减少细胞因子产生或分泌水平。也可以增加或减少抗体产生；可以改变两种或更多种细胞因子或免疫细胞受体的比率；或可以引起额外类型的细胞因子或抗体产生。免疫反应也可以是表达FcγR的免疫细胞的效应子功能，包括与未受本文中公开的免疫活性生物模拟物调节的免疫反应相比，增加或减少的单核细胞吞噬潜能、增加或减少的破骨细胞功能，抗原呈递细胞(例如DC)的增加或减少的抗原呈递作用、增加或减少的NK细胞功能、增加或减少的B细胞功能。
在一个优选实施方案中，患有癌症或自身免疫或炎性疾病的受试者改变他们的免疫反应，包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的斯塔都聚体的步骤，其中治疗有效量的斯塔都聚体改变受试者中的免疫反应。理想地，这种介入治疗了受试者中的疾病或病状。改变的免疫反应可以是增加或减少的反应并且可以涉及改变的细胞因子水平，包括以下细胞因子中任一种的水平：IL-6、IL-10、IL-8、IL-23、IL-7、IL-4、IL-12、IL-13、IL-17、TNF-α和IFN-α。在一个优选实施方案中，IL-6或IL-8应答于疗法而减少。在一个特别优选的实施方案中，IL-6和IL-8应答于疗法而减少。然而本发明不受所描述的生物模拟物的任何具体作用机制限制。改变的免疫反应可以是受试者中改变的自身抗体水平。改变的免疫反应可以是受试者中改变的自身侵入性T-细胞水平。
例如，减少自身免疫疾病中TNF-α产生的量可以具有治疗作用。这种情况的实际应用是临床上经证明斑块状银屑病、类风湿性关节炎、银屑病关节炎、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎和强直性脊柱炎的抗TNF-α抗体疗法(例如，)。这些自身免疫疾病具有不同的病因学，但是共有与炎症和免疫细胞活性相关的疾病过程的关键免疫组分。设计成减少TNF-α产生的斯塔都聚体将同样在这些疾病中有效并且可以用于其他自身免疫疾病中。改变的免疫反应概况也可以是直接或间接调节，以便在受试者中实现抗体(例如靶向受试者自身组织的自身抗体)产生减少或改变的自身侵入性T-细胞水平。例如，多发性硬化是可以通过干扰素β疗法治疗的涉及自身反应性T-细胞的自身免疫紊乱。见，例如，ZafranskayaM等人,Interferon-betatherapyreducesCD4+andCD8+T-cellreactivityinmultiplesclerosis,Immunology2007年5月;121(1):29-39-Epub2006年12月18日。设计成减少自身反应性T-细胞水平的斯塔都聚体将同样在多发性硬化中有效并且可以用于涉及自身反应性T-细胞的其他自身免疫疾病中。
本文所述的斯塔都聚体可以用来调节来自免疫细胞的共刺激分子的表达，所述免疫细胞包括树突状细胞、巨噬细胞、破骨细胞、单核细胞或NK细胞，或用来抑制相同的这些免疫细胞中的分化、成熟或细胞因子分泌(包括白介素-12(IL-12))或用来增加细胞因子分泌，包括白介素-10(IL-10)或白介素-6(IL-6)。技术人员也可以通过使免疫细胞暴露于免疫活性生物模拟物病测量对免疫细胞功能的调节，验证免疫活性生物模拟物的功效，其中所述免疫细胞是树突状细胞、巨噬细胞、破骨细胞或单核细胞。在一个实施方案中，免疫细胞暴露于免疫活性生物模拟物体外并且还包括确定细胞表面受体或细胞因子产生的量的步骤，其中细胞表面受体或细胞因子产生的量的变化指示对免疫细胞功能的调节。在另一个实施方案中，免疫细胞在自身免疫疾病的模型动物中体内暴露于免疫活性生物模拟物，还包括评估改善自身免疫疾病的程度的步骤。
使用固定的Fc的方法
为了理解Fc:Fcγ受体(FcγR，IgGFc的Fc受体)相互作用的角色和对免疫球蛋白内部生物学固定的其Fc的hIVIG功能的重要性，我们比较了单核细胞至不成熟树突状细胞(iDC)的分化期间hIVIG对单核细胞功能的影响，其中hIVIG同时具有固定形式的重组IgG1Fc片段(rFCF)和可溶性形式的含有铰链区3结构域的重组IgG1Fc片段(sFc)，所述重组IgG1Fc片段含有关于单核细胞功能的铰链-CH2-CH3结构域。
使在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素-4(IL-4)存在下培养的单核细胞暴露于固定的rFCF并暴露于固定的hIVIG，但不暴露于低剂量的可溶性hIVIG，这增强细胞上的CD86表达、延迟CD1Ic的表达并且抑制CDIa的表达。另外，这些变化可能不随rFCF在塑料上的非特异性蛋白质固定而继发，因为可溶性热聚集的(sHA)hIVIG、sHArFCF或高剂量hIVIG(认识到含有多聚体Fs)引起的变化类似于随固定rFCF所观察到的那些变化。
考虑在内，我们的数据表明，使iDC暴露于固体、半固体或凝胶状基质表面上固定的hIVIG产生了能够精密协调免疫耐受性的独特DC群体(高CD86，低CDIa)，并且包含免疫球蛋白G(IgG)Fc片段的功能部分的固定分子可以用作hIVIG的模拟物，用于治疗局部性和全身性炎症以及由单核细胞源性细胞(MDC)(如iDC)直接或间接介导的多种其他病理学病状。另外，用含有IgGFc片段的功能部分的分子将IgGFc的功能部分固定在植入身体中或与动物(例如，人类患者)身体接合的装置上(本文描述为“包覆装置”)可以通过影响随后进入循环的免疫细胞来减轻(如果不阻止)针对这类装置的炎症反应或治疗全身性疾病，其中所述免疫细胞已经因接触包覆于植入的装置上或至其中的固定斯塔都聚体而改变。
本发明提供抑制单核细胞源性细胞(MDC)的活性的方法。这种方法包括使细胞与包含基质的组合物接触，所述基质具有与之结合的Fc试剂。接触可以是体外、体内或离体的。可选地，细胞可以存在于动物中。动物可以是患有单核细胞源性细胞介导的病状(MDCMC)或存在形成这种病状的风险的动物。MDC可以例如是树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞或破骨细胞。
本发明也提供治疗或预防的方法。这种方法包括向动物施用包含基质的组合物，所述基质具有与之结合的Fc试剂，所述动物患有MDCMC或存在形成这种病状的风险的动物。
还可能的是，本发明的斯塔都聚体导致体内固定的Fc试剂。“体内固定的Fc试剂”意指Fc在体内固定至细胞(即血小板)的表面。已经观察到，表达FcγR的血小板被本发明的斯塔都聚体高效包覆并且这些包覆的血小板在生物中诱导耐受性直至清除它们。已经令人惊讶地观察到本发明的斯塔都聚体高效地与一定百分比的表达FcγR的血小板结合。由于卵清蛋白(ova):抗卵清蛋白聚集物复合物和RBC:抗RBC聚集物复合物诱导耐受性并且在ITP中防止破坏血小板，故斯塔都聚体包覆的这些血小板可以在生物中诱导耐受性。这可以是本发明斯塔都聚体借以发挥其免疫调节功能的另一种机制。
与斯塔都聚体内部所含的天然免疫球蛋白Fc相比，基于斯塔都聚体对Fcγ受体高得多的结合亲和力，本发明的斯塔都聚体还可能导致体内固定的免疫球蛋白Fc控制试剂。“体内固定的免疫球蛋白Fc控制试剂”意指斯塔都聚体在体内固定至细胞表面，所述细胞包括包括但不限于单核细胞、树突状细胞、T细胞、调节性T细胞、γδ-T细胞和血小板。通过与细胞表面受体(包括Fcγ受体)结合，斯塔都聚体阻断其他免疫球蛋白与这些受体结合。单克隆抗体或多克隆抗体用于研究测定法如流式细胞术和在临床诊断中。本发明的重要方面是通过这些抗体的Fc组分防止与Fcγ受体和免疫球蛋白Fc可以与之结合的其他细胞表面受体非特异性结合。
如本文所用，术语“单核细胞源性细胞介导的病状(MDCMC)”指直接或间接、部分或完全因单核细胞源性细胞的活性或由其产生的因子所致的病理学状况。单核细胞源性细胞包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、并指状树突状细胞(通常在本文中称作“树突状细胞”，包含树突样细胞和滤泡树突样细胞)(成熟和不成熟)、破骨细胞、小胶质细胞样细胞、单核细胞源性产生胰岛素的胰岛样细胞、单核细胞源性不成熟肥大细胞和单核细胞源性微粒子。
就使用固定的Fc的方法而言，术语“Fc试剂”指包含免疫球蛋白Ig(IgG)Fc片段的一个或多个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、15个、18个、20个或更多个)功能部分的任何分子或分子复合物。IgG的Fc片段由IgG分子的连接在一起的两条IgG重链的C端部分组成并且由两条重链的连接在一起的铰链区、CH2结构域和CH3结构域组成。“IgGFc片段的功能部分”由两条重链的连接在一起的铰链区、CH2结构域和任选地CH3结构域前50个(从N末端)氨基酸的全部或一些(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个或49个氨基酸)组成。在人类中，(a)IgG1铰链区含有15个氨基酸，CH2结构域含有110个氨基酸并且CH3结构域含有106个氨基酸；(b)IgG2铰链区含有12个氨基酸，CH2结构域含有109个氨基酸并且CH3结构域含有107个氨基酸；(c)IgG3铰链区含有62个氨基酸，CH2结构域含有104个氨基酸并且CH3结构域含有106个氨基酸；以及(d)IgG4铰链区含有12个氨基酸，CH2结构域含有109个氨基酸并且CH3结构域含有107个氨基酸。
如野生型IgG分子中那样，在上述的Fc试剂中，源自IgG重链的两条多肽链通常是相同的，但是不必然如此。因此，Fc试剂可以是，而不限于完整IgG分子、与源自多肽的非免疫球蛋白连接的完整IgG分子、IgGFc片段、与源自多肽的非免疫球蛋白连接的IgGFc片段、IgGFc片段的功能部分、与非免疫球蛋白连接的IgGFc片段的功能部分，其中所述非免疫球蛋白源自多肽或这些多肽中任一种的多聚体(例如，二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体或十聚体)。Fc试剂也可以是上述的斯塔都聚体和斯塔都体，只要它们落在上述的Fc试剂的定义范围内。
在固定的Fc中，Fc试剂的免疫球蛋白重链组分可以具有野生型氨基酸序列或它们可以是野生型氨基酸序列，但具有不多于20个(例如，不多于19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个)氨基酸置换。这类置换优选地是保守性置换，但不必然如此。保守性变化一般包括在以下组内部的变化：甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸、组氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。
本发明的“Fc试剂”具有至少25%(例如，至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.5%或100%或甚至更多)的IgG分子(参考IgG分子)与目的Fc受体结合的能力，其中Fc试剂的IgG重链组分源自所述IgG分子。在“Fc试剂”具有源自多于一个类型IgG分子的重链组分的情况下，参考IgG分子是以最大亲合力与相关目的Fc受体结合的IgG分子。
如本文所用，“固定的Fc”指与如下文定义的“基质”结合的Fc试剂。术语“固定的Fc”、“结合的Fc”和“稳定的Fc”是同义术语。固定的Fc由与基质连接的Fc的功能部分(包括但不限于包含Fc的功能部分的任何多肽)组成。固定的Fc例如包括Fc与基质直接结合以及经Fc的聚合物与基质间接结合；并入分离的完整IgGFc；仅并入IgGFc的功能性结构域；或并入完整IgGFc或作为较大多肽(如抗体、斯塔都聚体或斯塔都体的部分的IgGFc功能性结构域。
如适用于固定的Fc，术语“基质”指固态、半固态或凝胶状物体。基质可以在动物身体中植入或接合至(或黏附于)动物身体表面。基质可以包含例如液体或气体组分，但是基质的至少一部分是固态、半固态或凝胶状。因此，基质可以是基本上不可溶于水溶剂中但可溶于非水溶剂中的物质。这类物质包括脂类(例如，磷脂)、脂肪酸和其他脂肪、水溶剂不溶性化合物。从这一点看，显而易见基质包括脂质体。基质可以是多孔或非多孔的。在某些实施方案中，基质相对于植入它、与之接合或黏附的表面和/或实体是惰性的。
基质可以含有或由以下物质制成：合成聚合物，例如，尼龙、特富龙、涤纶、聚氯乙烯、PEU(聚(氨基甲酸乙酯))、PTFE(聚四氟乙烯)、PMMA(甲基丙烯酸甲酯)、PEEK、热塑性弹性体、不透辐射的聚合物、聚醚砜、硅、聚碳酸酯、聚氨酯、聚异丁烯及其共聚物、聚酯、聚烯烃、聚异丁烯、乙烯-α烯烃共聚物、丙烯酸聚合物和共聚物、卤乙烯聚合物和共聚物如聚氯乙烯、聚乙烯基醚、聚乙烯基甲基醚、聚偏二卤乙稀、聚偏氟乙烯、聚偏二氯乙稀、聚丙烯腈、聚乙烯基酮、聚乙烯基芳族化合物、聚苯乙烯、聚乙烯基酯、聚乙酸乙烯基酯、乙烯基单体的共聚物、乙烯基单体和烯烃的共聚物、乙烯-甲基丙烯酸甲酯共聚物、丙烯腈-苯乙烯共聚物、ABS树脂、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、聚酰胺、尼龙66、聚己内酯、醇酸树脂、聚氧乙烯、聚酰胺、聚醚、环氧树脂、人造丝-三乙酸酯、纤维素、醋酸纤维素、丁酸纤维素、醋酸丁酸纤维素、赛璐酚、硝酸纤维素、丙酸纤维素、纤维素醚、羧甲基纤维素、胶原蛋白、壳多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸氧化物共聚物、聚硅氧烷、取代的聚硅氧烷、乙烯乙酸乙烯酯共聚物、聚烯烃弹性体和EPDM橡胶及其组合。
基质也可以含有金属或金属合金或由其制成，例如，不锈钢、铂、铱、钛、钽、镍合金或钴-铬合金。另外，基质可以包括或是动物组织或动物组织产物，例如，组织或器官移植体。动物组织可以例如是骨(例如，成骨)或软骨。另外，基质可以含有蛋白质，例如，胶原蛋白或角蛋白。基质也可以是或含有组织基质，例如，无细胞组织基质。颗粒状和非颗粒状无细胞基质在例如美国专利No.5,336,616和6,933,326中详述，所述专利的公开内容以引用方式整体并入本文。基质也可以是或包含动物细胞(例如，组织修复细胞如成纤维细胞；间充质干细胞)和它可以是例如是毛发移植栓(hairtransplantplug)。基质可以含有或是多糖，例如，琼脂糖。它也可以含有或是盐，优选地是相对不溶的盐，例如，硫酸钙。基质可以是凝胶或膏。另外，它可以含有硅或硅橡胶。基质也可以含有天然纤维，例如，丝、棉或羊毛。
此外，基质可以是可植入的医疗装置。它可以例如是支架(例如，血管支架如冠状动脉支架；气道支架如气管内或鼻支架；胃肠道支架如胆管或胰支架；或尿路支架如输尿管支架)或外科缝线(例如，编织丝、羊肠线、尼龙、塑料或金属缝线)或外科夹(例如，动脉瘤夹)。基质可以例如是人工髋、人工髋关节、人工膝和人工膝关节、人工肩、人工肩关节、人工指或趾关节、骨板、骨销钉、非联合的骨植入物、椎间盘植入物、骨水泥或骨水泥间隔物。它可以是动脉-静脉短路、可植入导线、起搏器、人工心脏、心脏辅助装置、耳蜗植入物、可植入的除颤器、脊髓刺激器、中枢神经系统刺激器或外周神经植入物。其他基质是牙修复体或牙套。
在其他实施方案中，基质可以是大血管栓过滤装置或笼、透皮设装置、皮肤或粘膜贴剂或可植入的药物递送装置。基质也可以是大血管移植体，其中所述血管例如是颈动脉、股动脉或主动脉。另外，基质可以是皮下植入物、角膜植入物、人工晶状体或隐形眼镜。
基质可以处于片、珠、网片、粉末粒子、线、珠或纤维形式。它也可以包括或是固体、半固体或凝胶状物质。
基质也可以是表达FcγR的细胞。优选地，基质是血小板。
在本发明中有用的聚合物优选地是具有生物稳定性、生物相容性(特别在将装置插入或植入身体期间)和不刺激身体组织的那些聚合物。
Fc试剂可以按多种方式的任一种方式包覆(即固定或稳定化)到基质上。例如，它们可以直接包覆在基质的表面上，在那里，它们例如通过疏水相互作用保持连接。下文描述涉及使用聚合物的几种其他方法学((a)-(e))。
(a)Fc试剂与可溶混性聚合物掺合物混合，所述掺合物随后铺在可植入合成材料的表面上，从而使Fc试剂稳定。本领域常规用来产生聚合物掺合物的单体包括PLMA[聚(甲基丙烯酸月桂酯)]；PEG[聚乙二醇]、PEO[聚环氧乙烷]；烷基官能化的甲基丙烯酸酯聚合物PMMA、PEMA、PPMA和PBMA；衣康酸酯；延胡索酸酯；和苯乙烯类。
(b)将聚合物底层或纳米尺度薄膜黏附基质表面并且随后将Fc试剂黏附至聚合物底层或纳米尺度薄膜，从而使F试剂稳定。
(c)将聚合物单体薄膜施加至可植入基质表面并且随后使单体聚合。这类单体包括，例如，甲烷、四氟乙烯、苯、甲醇、环氧乙烷、四乙醇二甲醚、丙烯酸、烯丙基胺、甲基丙烯酸羟乙酯、N-乙烯基吡咯烷酮和巯基乙醇。Fc试剂随后与所得到的单体接合。
(d)基质用与Fc试剂接合的蛋白质如蛋白A或白蛋白包覆，从而使Fc稳定至基质的表面。
(e)Fc试剂可以用与可植入性合成材料结合的疏水性氨基酸链标记并且使得稳定的Fc取向一致。
本发明的方法可以适用于任何动物物种，并且从其中产生Fc试剂的IgG衍生部分的IgG分子可以来自任何动物物种。自然，相关动物物种是其中存在IgG或IgG样分子的那些。通常，适用于所述方法的物种和从其中产生Fc试剂的IgG衍生部分的IgG分子的物种是相同的。然而，它们不必然是相同的。相关动物物种优选地是哺乳动物并且这些哺乳动物包括而不限于人、非人灵长类(例如，猴、狒狒和黑猩猩)、马、牛类动物(例如，公牛、母牛或阉牛)、猪、山羊、绵羊、犬、猫、兔、沙鼠、仓鼠、大鼠和小鼠。非哺乳动物物种例如包括鸟类(例如，鸡、火鸡和鸭)和鱼。
使用如上文对斯塔都聚体所述的固定的Fc时，术语“治疗”、“处理”和“预防”具有相同的意思。
在固定的Fc是用Fc试剂包覆的可植入器械时，可以使用本领域熟知的方法，将它们在相关的内部器官或组织或相关受试者的身体表面中植入、与之接合或黏附。将它们配制为例如混悬剂、散剂时，可以将它们如上文对斯塔都聚体所述那样配制和施用。
本发明的固定Fc试剂可以是用来治疗或预防以下病状，包括但不限于癌症、充血性心力衰竭(CHF)、血管炎、酒渣鼻、痤疮、湿疹、心肌炎和心肌的其他病状、系统性红斑狼疮、糖尿病、脊椎病、滑膜成纤维细胞瘤和骨髓间充质细胞瘤；骨量丢失；佩吉特病、肥大性骨形成；废用性骨质减少；营养不良、牙周病、高歇氏病、郎罕氏细胞组织细胞增多症、脊髓损伤、急性脓毒性关节炎、骨软化症、库欣综合征、单骨型骨纤维发育不良、多骨型骨纤维发育不良、牙周重建及骨折、骨疼痛防治及体液性恶性高血钙症、强直性脊柱炎和其他脊椎关节病；移植排斥和病毒性感染。
全部自身免疫疾病可以部分或完全是MDCMD。如本文所用的术语“自身免疫疾病”指多样的超过80种慢性疾病的组。在全部这些疾病中，基础性问题是身体的免疫系统攻击身体本身。自身免疫疾病侵袭身体的全部主要系统，包括结缔组织、神经、肌肉、内分泌系统、皮肤、血液和呼吸系统和胃肠系统。
所述疾病或病状可以是血液免疫学过程，包括但不限于特发性血小板减少性紫癜、同种异型免疫性/自身免疫性血小板减少症、获得性免疫性血小板减少症、自身免疫性中性粒细胞减少症、自身免疫性溶血性贫血、细小病毒B19相关性红细胞再生障碍、获得性抗因子VIII自身免疫性、获得性血管性血友病、未知意义的多发性骨髓瘤和单克隆丙种球蛋白病、败血症、再生障碍性贫血、单纯红细胞再生障碍、戴-布二氏贫血、新生儿溶血病、免疫介导的中性粒细胞减少症、血小板输注无效、新生儿输血后紫癜、溶血尿毒症综合征、全身性血管炎、血栓性血小板减少性紫癜或埃文斯综合征。
自身免疫疾病或病状可以是神经免疫学过程，包括但不限于格-巴二氏综合征、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病、副蛋白血症IgM脱髓鞘性多发性神经病、朗-爱二氏肌无力综合征、重症肌无力、多灶性运动神经病、与抗/GMl相关的下位运动神经元综合征、脱髓鞘、多发性硬化和视神经炎、僵人综合征、伴有抗Yo抗体的副肿瘤性小脑变性、副肿瘤性脑脊髓炎、伴有抗Hu抗体的感觉神经病、癫痫、脑炎、脊髓炎、与人嗜T淋巴细胞病毒-1相关的脊髓病、自身免疫糖尿病性神经病或急性特发性自主神经机能异常性神经病。
自身免疫疾病或病状可以是风湿性疾病过程，包括但不限于川崎病、类风湿性关节炎、费耳提氏综合征、ANCA阳性血管炎、自发多发性肌炎、皮肌炎、抗磷脂综合征、反复自发流产、系统性红斑狼疮、青少年特发性关节炎、雷诺氏综合征、CREST综合征或葡萄膜炎。
自身免疾病或病状可以是皮肤免疫学疾病过程，包括但不限于中毒性表皮坏死松解症、坏疽、肉芽肿、自身免疫皮肤疱病，包括寻常天疱疮、大疱性类天疱疮和落叶型天疱疮、白斑症、链球菌性中毒性休克综合征、硬皮病、系统性硬化症包括扩散型和局限性皮肤系统性硬化症或异位性皮炎(尤其类固醇依赖性)。
自身免疫疾病或病状可以是骨骼肌免疫学疾病过程，包括但不限于包涵体肌炎、坏死性筋膜炎、炎性肌病、肌炎、抗Decorin(BJ抗原)肌病、副肿瘤性坏死性肌病、X连锁的空泡性肌病、青霉胺诱导的多发性肌炎、动脉粥样硬化、冠状动脉病或心肌病。
自身免疫疾病或病状可以是胃肠道免疫学疾病过程，包括但不限于恶性贫血、自身免疫慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、乳糜泻、疱疹样皮炎、隐源性肝硬化、反应性关节炎、克罗恩氏病、惠普尔氏病、溃疡性结肠炎或硬化性胆管炎。
自身免疫疾病或病状可以移植物抗宿主病、抗体介导的移植体排斥、骨髓移植后排斥、传染病后炎症、淋巴瘤、白血病、瘤形成、哮喘、伴有抗β细胞抗体的1型糖尿病、斯耶格伦氏综合征、混合型结缔组织病、阿狄森病、伏格特-小柳-原田三氏综合征、膜增生性肾小球肾炎、肺出血肾炎综合征、格雷夫斯氏病、桥本氏甲状腺炎、韦格纳肉芽肿病、显微镜下多动脉炎、丘-施二氏综合征、结节性多发性动脉炎或多系统器官衰竭。
“癌症”在本文中指或描述哺乳动物中一般以失调的细胞生长为特征的生理状况。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤(包括脂肪肉瘤、成骨肉瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤、软骨肉瘤)、破骨细胞瘤、神经内分泌肿瘤、间皮瘤、脊索瘤、滑膜瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、腺癌、黑素瘤、白血病或淋巴样恶变。此类癌的更多具体实例包括鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)、肺癌包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌、小细胞肺癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌或胃部癌症，包括胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾脏或肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食管癌、胆管肿瘤、尤因氏瘤、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯肿瘤、睾丸肿瘤、肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、骨髓增生异常病、重链病、神经内分泌肿瘤、神经鞘瘤和其他癌、头颈癌、髓样肿瘤如急性髓性白血病、包括伴成熟的AML、无分化的AML、急性早幼粒细胞白血病、急性粒-单核细胞白血病和急性单核细胞性白血病、骨髓增生异常综合征和慢性骨髓增生病、包括慢性髓性白血病、中枢神经系统肿瘤，例如，脑肿瘤(胶质瘤、神经母细胞瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤和视网膜母细胞瘤)、实体瘤(鼻咽癌、基底细胞癌、胰腺癌、胆管癌、卡波西肉瘤、睾丸癌、子宫癌、阴道癌或宫颈癌、卵巢癌、原发性肝癌或子宫内膜癌、血管系统肿瘤(血管肉瘤和血管外皮细胞瘤)、血液肿瘤和肿瘤样病状，例如，霍奇金淋巴瘤；非霍奇金淋巴瘤(伯基特淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤/慢性淋巴细胞白血病、蕈样真菌病、套细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、弥漫大B细胞性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多毛细胞白血病和淋巴浆细胞样白血病)、淋巴细胞前体细胞的肿瘤，包括B-细胞急性淋巴性白血病/淋巴瘤和T-细胞急性淋巴性白血病/淋巴瘤、胸腺瘤、成熟T细胞和NK细胞的肿瘤，包括外周T-细胞白血病、成人T-细胞白血病/T-细胞淋巴瘤和大颗粒淋巴细胞白血病、溶骨性骨癌和骨转移。
如本文所用，“存在形成单核细胞源性细胞介导病状(MDCMD)风险”的受试者是这样的受试者，其具有形成MDCMD的预后，即形成MDCMD的遗传性预后，或已经暴露于可能导致MDCMD的条件。“疑似患有MDCMD”的受试者是具有MDCMD的一个或多个症状的一位受试者。从上文，将显而易见，“存在形成MDCMD风险”的受试者和“疑似患有MDCMD”的受试者均不是目的物种范围内的个体。
在以上方法的任一者中，MDCMC可以是由基质引起的一种病状，并且Fc试剂起到防止或缓解MDCMC的作用。
免疫学测定法中的应用
本文中公开的免疫活性生物模拟物可以用来进行用于检验免疫细胞功能的免疫学测定法，其中免疫活性生物模拟物成设计调节所述免疫细胞功能。
通过低亲和力Fcγ受体途径的信号传导需要在细胞表面上的受体聚集和交联。推测通过相应细胞的表面上Fab与抗原特异性靶结合，随后Fc区和低亲和力FcγR之间相互作用，满足这些聚集参数和交联连接参数。在这种背景下，抗体具有通过两条不同途径激活细胞应答的潜能：1.Fab相互作用于/阻断表位特异性靶并且2.Fc相互作用于FcR。尽管认识到这一点，对于使用单克隆抗体的大部分治疗性研究而言，体内使用的当前对照没有充分消除以下可能：Fc:Fcγ受体相互作用作为所观察到的功能作用的贡献者。目前使用多项策略来消除作为混淆变量的Fc:FcR相互作用。例如，一些研究采用保留表位特异性但是缺少Fc区的Scv(单链可变区)或Fab片段。这些方法受限于这些试剂的短半寿期和它们诱导信号传导的潜力有限。其他研究采用由与Fc片段融合的受体或配体组成的融合蛋白。尽管这些类型的方法有助于将Fab特异性作用与随同受体配体相互作用所观察到的那些作用区分，但是它们没有对Fc介导的作用有效地起到对照。在动物模型中评价基于抗体的治疗剂也可以使用具有无关Fab结合位点的同种型对照抗体。这种选择的理由基于相同同种型的抗体之间假定的功能相似性，无论它们的Fab结合特异性或亲和力是什么。然而，这样使用无关的同种型对照具有几个重大缺陷：
1.如果这些抗体的Fab片段不能结合配体或抗原性表位，则有可能Fc片段将不通过低亲和力FcR相互作用刺激信号传导，原因是不存在Fcγ受体交联。因此，在实验抗体和对照抗体之间观察到的功能性差异不能正确地归因于Fab与缺少交联FcγR的手段的表位特异性靶相互作用。
2.如果这些同种型在形成与亲本抗体不同的糖型或不同相对百分比的各种糖型的细胞中产生，与低亲和力和高亲和力FcR的结合将改变，即便Fab亲和力是相同的。
尽管不存在克服这个问题的完美对照，但是一个选项是，使用在与亲本抗体相同的细胞中产生的同种型特异性斯塔都聚体并且以与实验抗体所靶向的表位的表达水平成正比的剂量给予。例如，在大鼠中产生的表位特异性抗体的适宜对照将是能够聚集效应细胞表面上Fcγ受体的大鼠同种型特异性斯塔都聚体。
通常，免疫细胞暴露于有效量的免疫活性生物模拟物以按照已知方式调节免疫细胞的活性，并且这种免疫调节与试验复合物或分子比较以确定试验复合物是否具有相似的免疫调节活性。
在另一个实施方案中，热聚集的斯塔都聚体和聚集的免疫球蛋白可以在本文所述和本领域普通技术人员已知的多种免疫学测定法中用作实验室对照试剂。
免疫学测定法可以是体外测定法或体内测定法并且可以涉及使用物种匹配或物种不匹配的斯塔都聚体的人或非人免疫细胞。在一个实施方案中，通过使用有效量的免疫活性生物模拟物来调节免疫细胞的活性并且将这种调节与试验化合物对免疫细胞的调节比较，进行免疫学测定。斯塔都聚体可以在涉及检验其他化合物的免疫学作用的测定法中起到阳性对照试剂的功能。与斯塔都聚体的效应细胞Fcγ受体结合和功能反应相比，这种测定法可以比较主题单克隆抗体的作用，如由受体表达水平、细胞因子释放和功能的变化所测量，如通过使用混合淋巴细胞反应测量。以这种方式，如果斯塔都聚体(其缺少Fab)产生部分地与单克隆抗体相似的反应，则单克隆抗体作用在某种程度上不归因于其Fab的特异性，而归因于结合和交联效应细胞上多于一个Fcγ受体的一般作用。
如果物种特异性和同种型特异性抗体的生物学活性由物种特异性和同种型特异性斯塔都聚体部分地或完全复制，则显而易见，Fc-Fcγ受体活性占据一部分归因于物种特异性和同种型特异性斯塔都聚体的观察到的生物学活性。因此物种特异性和同种型特异性斯塔都聚体用于评估潜在治疗性抗体以确定所观察到的生物学活性是否归因于试验抗体的Fab部分或归因于该分子的Fc部分结合于并交联多于一个Fcγ受体的非特异性作用和至何种程度。
本发明的斯塔都聚体也用于在基于抗体的免疫测定法如流式细胞术、蛋白质印迹法、免疫组织化学和免疫荧光法测定法期间阻断对Fc受体的非特异性结合。传统上，在测定法(如这些测定法)中，使用与试验抗体相同的物种的非特异性抗体来阻断与Fc受体的非特异性结合。本发明的斯塔都聚体提供胜过传统Fc阻断手段的益处，在于每个斯塔都聚体具有多个FcR结合位点，并且因此可以使用少得多的斯塔都聚体。另外，因为本发明的斯塔都聚体缺少抗体的Fab抗原结合部分，因此例如将观察不到与死细胞的非特异性结合，采用物种匹配的IgG对照时通常观察到这种非特异性结合。
已经令人惊讶地观察到本发明的斯塔都聚体以极高亲和力结合内毒素。标准内毒素移除试剂盒和柱不能从斯塔都聚体中移除明显百分比的紧密结合的内毒素。因此，要求保护的组合物可以用作内毒素结合池，一种移除药物和实验室制备物中内毒素的有用工具。这是有益的，在于内毒素和斯塔都聚体之间形成的复合物具有足够高的亲和力以从药物制品或组合物中高效移除内毒素。在一个实施方案中，通过过滤从组合物中移除内毒素-斯塔都聚体复合物。
本文中提到的全部参考文献以引用的方式整体并入。
实施例
实施例1：斯塔都聚体的产生和纯化
HEK293F细胞(Invitrogen,Carlsbad,CA)或中国仓鼠卵巢细胞(CHO)用于G045/M045和G051的稳定表达。将HEK293F或CHO细胞悬浮培养用于增加蛋白质表达。
编码G045c(SEQIDNO:4)、G045old(SEQIDNO:7)G051(SEQIDNO:18)、G019(SEQIDNO:8)、G028(SEQIDNO:9)、G046(SEQIDNO:10)、G075(SEQIDNO:20)、G076(SEQIDNO:21)、G096(SEQIDNO:28)、G098(SEQIDNO:24)、G089(SEQIDNO:27)或前述斯塔都聚体的相应鼠序列的基因克隆入含有新霉素抗性基因的载体(如来自Invitrogen(Carlsbad、CA)的pcDNA3.3)并且处于促进G045或G051高水平表达的CMV启动子的转录性控制下。使用无内毒素质粒DNA分离试剂盒(Nucleobond,Macherey-Nagel)从细菌培养物中分离用于转染的质粒DNA。将编码G045c/G045old和G051的质粒DNA用限制性酶线性化并且转染至293-F细胞或CHO细胞中。在转染后，用遗传霉素(Geneticin)/G418选择表达G045c、G045old或G051的阳性细胞以获得转染细胞的汇集物。为获得克隆性细胞系，将稳定转染细胞的汇集物稀释至96孔平板中至每孔1-2个细胞，从所述平板中获得稳定细胞系的单一细胞克隆。通过ELISA对单一细胞克隆筛选蛋白质表达。将单一细胞克隆培育起来，并且从培养基中收获作为分泌型蛋白的G045c、G045old、G051、G019、G028、G046、G075、G076、G096、G098或G089蛋白。
为了通过瞬时转染产生G045c、G045old、G051G019、G028、G046、G075、G076、G096、G098或G089蛋白，将HEK293细胞或CHO细胞用CMV启动子控制下的编码G045c、G045old、G051、G019、G028、G046、G075、G076、G096、G098或G089蛋白的DNA质转染以确保蛋白质的高水平表达。用几种市售转染试剂之一进行转染。转染后4-5日，从细胞培养基中收获G045c、G045old、G051、G019、G028、G046、G075、G076、G096、G098或G089分泌型蛋白。
将源自瞬时转染的细胞或稳定细胞系的细胞培养基使用0.22um滤器过滤，用1体积结合缓冲液(20mM磷酸钠pH7.2+150mMNaCl)调节至pH7.2并且在HiTrapMabselect蛋白A亲和柱上使用AKTAXpress纯化系统(GElifesciences)，通过亲和层析纯化。在0.1M柠檬酸钠pH3.3中洗脱后，蛋白质在用于缓冲液交换的HiPrep26/20脱盐柱上纯化。
为进一步纯化，将G045c、G045old、G051、G019、G028、G046、G075、G076、G096、G098或G089蛋白质在50mMTris-HCLpH7.5+150mMNaCl中的HiLoadSuperdex200凝胶过滤柱(GELifesciences)上通过凝胶过滤纯化，随后在MonoS离子交换柱(GELifesciences)上纯化。在20mMMES缓冲液pH6中以0-1MNaCl梯度进行离子交换纯化。在层析后，通过透析针对PBS调节蛋白质。在图1中描述所得到的G045c斯塔都聚体的示意图。
为了检验所得到的G045c蛋白的多聚化能力，将10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，所述凝胶含有相等浓度的由上述方法产生的G045c和由先前在WO2008/151088中所述的方法产生并且含有外部克隆性序列的G045old。令人惊讶地，与G045old相比，移除外部片段导致G045c中的多聚化大幅度增加，同时与G045old相比，G045c显示高得多的浓度的更高阶多聚体。(见图2A)。
使用Gel-DocIT成像系统分析G045old相对于G045c中的多聚体形成。在凝胶画面的密度扫描后，评估每条凝胶条带中的蛋白质的量。令人惊讶地，G045old样品中的多聚体形成估计是大约27.9%，而移除外部片段以产生天然连接的斯塔都聚体导致G045c样品中明显更高并估计占大约73.8%总蛋白的多聚体形成。(见图2B)。
实施例2：在关节炎的小鼠模型中与M045old相比M045c的增强功效
在胶原蛋白诱导的关节炎中与M045old相比评估M045c的功效。在第0日和第21日，DBA1/J小鼠用II型牛胶原蛋白(Chondrex,Inc.，Cat.20021)连同4mg/ml采用弗氏不完全佐剂(Sigma，Cat#5506)乳化的溶液一起免疫。将小鼠每周称重并且就关节炎体征每日评分。对每只爪评分并且将全部4个评分的总和记录为关节炎指数(AI)。最大可能的AI是以下的16分：0=无可见的关节炎影响；1=一个肢端的水肿和/或红斑；2=2个关节的水肿和/或红斑；3=多于2个关节的水肿和/或红斑；4=整个爪和肢端的严重关节炎，包括肢体变形和关节强直。在第22日开始(第0治疗日)开始，将10只胶原蛋白免疫的小鼠基于平均AI(3.3)分选入治疗组，并且将10只不患病的小鼠命名为不患病组。测量关节炎指数14个治疗日，此后，将小鼠安乐死。对于阳性对照组，将10只小鼠基于平均AI(3.3)分选入治疗组，并且每日用10ml/kg泼尼松龙口服给药。对于用M045c或M045old治疗的组，将20只小鼠基于平均AI(3.3)分选入治疗组，并且每4日(第0日、第4日、第8日和第12日)用400μgM045c或M045old(17.4mg/kg)口服给药。
与M045old治疗的小鼠相比，用M045c治疗的小鼠在几乎所有测试的时间点具有统计上更少的严重病情。(见图3)。因此，移除前导序列和IgG1Fc之间的16个氨基酸克隆片段不仅导致更多的多聚体形成，还增加抗炎性疾病功效。
与泼尼松龙的功效相比，类似地在胶原蛋白诱导的关节炎中评估M045c、M019、M028、M046和M051的功效。如上文所述在小鼠中诱导CIA，并且在诱导CIA后第22日开始，将小鼠用400μgM045、M019、M028、M046或M051每周二次静脉内治疗或或用10mg/kg泼尼松龙每日治疗，并且如上文那样对AI评分持续两周。接受每种所测试的斯塔都聚体的小鼠比PBS治疗的对照具有统计上更少的严重病情(见图9)。
实施例3:在关节炎的小鼠模型中M045和泼尼松龙的协同效应
在胶原蛋白诱导的关节炎模型中评估与低剂量泼尼松龙组合的M045c的功效。简而言之，在第0日和第21日，DBA1/J小鼠用II型牛胶原蛋白(Chondrex,Inc.，Cat.20021)连同4mg/ml采用弗氏不完全佐剂(Sigma，Cat#5506)乳化的溶液一起免疫。将小鼠每周称重并且就关节炎体征每日评分。对每只爪评分并且将全部4个评分的总和记录为关节炎指数(AI)。最大可能的AI是以下的16分：0=无可见的关节炎影响；1=一个肢端的水肿和/或红斑；2=2个关节的水肿和/或红斑；3=多于2个关节的水肿和/或红斑；4=整个爪和肢端的严重关节炎，包括肢体变形和关节强直。在第22日开始(第0治疗日)开始，将10只胶原蛋白免疫的小鼠基于平均AI(3.3)分选入治疗组，并且将10只不患病的小鼠命名为不患病组。测量关节炎指数14个治疗日，此后，将小鼠安乐死。对于阳性对照组，将10只小鼠基于平均AI(3.3)分选入治疗组，并且每日用10ml/kg泼尼松龙口服给药。对于用M045c治疗的组，将10只小鼠基于平均AI(3.3)分选入治疗组，并且每4日(第0日、第4日、第8日和第12日)用400μgM045c(17.4mg/kg)口服给药。为测量泼尼松龙和M045c之间的协同作用，一个组每日用低剂量泼尼松龙2mg/kg治疗，一个组用低剂量M045c200μg/剂量给药治疗，每4日给药，并且一个组用低剂量泼尼松龙2mg/kg外加低剂量M045c200μg/剂量给药治疗，每4日给药一次。
尽管高剂量泼尼松龙(10mg/kg)作为单一药物在缓解胶原蛋白诱导的关节炎方面有效，但低剂量泼尼松龙(2mg/kg)仅是略微有效的。此外，与未治疗的对照相比，低剂量M045c(200μg/剂量或9.1mg/kg)在降低病情严重性方面也无效。然而，令人惊讶地，与泼尼松龙和M045c单一治疗组相比时，用与低剂量M045c组合的低剂量泼尼松龙治疗的小鼠显示病情严重性的协同(不止加性)降低。(见图4)。
实施例4:IgG2A、M045、M046、M028、M019和G051与小鼠受体的 结合分析。
使用胺固定法，将FcγRIIIA、FcγRIIB和SIGN-R1受体固定至CM4芯片分别至560、500和1000RU，以便补偿蛋白质大小。
将M045c(SEQIDNO:11)、M046(SEQIDNO:15)、M019(SEQIDNO:13)和M028(SEQIDNO:14)在HBSS-EP运行缓冲液中从500nM至1.9nM连续稀释并且以20ul/分钟注入持续180秒。通过以100ul/分钟注射1MMgCl持续10秒，随后用运行缓冲液短暂洗涤，实现再生。使用T100评价软件计算KD。
对于小鼠FcγR3A和FcγR2b，与测试的每种斯塔都聚体相比，小鼠IgG2aFc同型二聚体以更低的亲和力和更快的解离速率结合。对于小鼠SIGN-R1，小鼠IgG2aFc同型二聚体并未可察觉地结合，而选择性斯塔都聚体不同程度地缔合并且缓慢解离。(见图5)。
在这个模型中评估M045c级分。首先使用AktaXpress蛋白质纯化系统和GEHiLoad16/60Superdex200制备级柱，对M045F进行凝胶分离。在根据大小分离多聚体后，级分1(M045F1)含有最高分子量组分-M045多聚体。M045F2是具有较低分子量的多聚体组分并且M045F3是斯塔都聚体的同型二聚体级分。对于小鼠FcγRIIIa、FcγRIIb(见图6a)和SIGN-R1(见图6b)，与其他级分或IgG2aFc对照相比，对M045F1的结合亲和力最高，伴以缓慢解离速率。
为评估G051的结合，在Octet96RedInstrument(ForteBio,MenloParkCA)上根据制造商的说明书(数据采集用户指南6.4ForteBio)进行生物双层干涉测量法。对于小鼠蛋白的结合分析，加His标签的小鼠FcγRII(R&Dsystemcat#1460-CD)和FcγRIII(R&Dsystemcat#1960)以1X动力学分析缓冲液(ForteBiocat#18-5032)中的10ug/ml分别加载于抗五His生物传感器(ForteBiocat#18-5077)上。对于人蛋白的结合分析，加His标签的人FcγRIIb(R&Dsystemcat#1875-CD)和FcγRIIIa(R&Dsystemcat#4325-Fc)以1X动力学分析缓冲液(ForteBiocat#18-5032)中的10ug/ml分别加载于抗五His生物传感器(ForteBiocat#18-5077)上。在传感器尖加载后，通过将尖端转移至1X动力学分析缓冲液中单体级分(在某个浓度范围内)或多聚体级分(在某个浓度范围内)的制备物，测量蛋白质缔合，并且通过将传感器尖端转移至1X动力学分析缓冲液，测量解离。如描述那样分析(数据分析用户指南6.4ForteBio)。如上文所述那样使分析标准化，赋予同型二聚体50kDMW并且赋予全部其他蛋白质制备物150kDMW。
表2显示，与较小多聚体级分相比，M051的较大斯塔都聚体多聚体级分以更大的亲和力和亲合力及更慢的解离结合，其中与同型二聚体级分相比，所述较小多聚体转而以更大的亲和力和亲合力及更慢的解离结合。
表2
样品 KD Kon Kdis Rmax R2 级分
M051 6.55E-9 8.53E+5 5.59E-3 0.394 0.987
M051单体 9.59E-7 7.24E+5 6.94E-1 0.373 0.985 2A11
M051二聚体 1.25E-8 1.45E+6 1.81E-2 0.4129 0.987 2H10
M051三聚体 3.36E-9 1.28E+6 4.28E-3 0.5093 0.996 3E12
M051四聚体 1.39E-9 1.56E+6 2.04E-3 0.567 0.996 3H4
M051多聚体 1.77E-9 4.19E+6 1.15E-4 0.6237 0.998 4F4
为评估G045或G051相对于G001(天然IgG1Fc)的结合，如上文那样，在Octet96RedInstrument(ForteBio,MenloParkCA)上进行生物双层干涉测量法。测量G045和G001与人FcγRIIb、FcγRIIIa(均为F和V变体)、食蟹猴FcγRIIIa、食蟹猴FcγRIIIb和食蟹猴FcγRIII的结合。与G001相比，G045对测试的每种受体具有伴以较慢解离的明显更高的结合亲和力以及亲合力的迹象(见表3和4)。
表3
受体 蛋白质 KD kon kdis R max R2
人FcγRIIb G045 1.42E-9 7.99E+5 1.14E-3 0.7166 0.999
人FcγRIIIa(F) G045 1.22E-9 6.20E+5 7.567E-4 0.7507 0.999
人FcγRIIIa(V) G045 2.95E-10 6.07E+5 1.79E-4 0.9182 0.999
食蟹猴FcγRIIb G045 1.19E-9 7.56E+5 8.81E-4 0.7125 0.999
食蟹猴FcγRIIIa G045 2.58E-10 6.17E+5 1.59E-4 1.0356 0.999
小鼠FcγRIIb G045 5.42E-10 1.21E+6 6.56E-4 0.4555 0.998
小鼠FcγRIII G045 8.00E-10 1.03E+6 8.23E+4 0.519 0.998
表4
受体 蛋白质 KD kon kdis R max R2
人FcγRIIb G001 1.31E-6 6.86E+5 8.99E-1 0.19 0.986
人FcγRIIIa(F) G001 2.43E-6 1.11E+5 2.69E-1 0.383 0.990
人FcγRIIIa(V) G001 1.14E-6 1.18E+5 1.35E-1 0.7265 0.995
食蟹猴FcγRIIb G001 2.04E-6 3.94E+5 8.06E-1 0.3456 0.988
食蟹猴FcγRIIIa G001 9.15E-7 1.24E-5 1.14E-1 0.837 0.995
小鼠FcγRII* G001 1.51E-6 2.56E+5 3.87E-1 0.1173 0.963*
小鼠FcγRIII* G001 4.18E-6 1.18E+5 4.91E-1 0.1026 0.904*
类似地，测量G051和G001与人FcγRIIb和FcγRIIIa的结合。与G001相比，G051对测试的每种受体具有伴以较慢解离的明显更高的结合亲和力以及亲合力的迹象(见表5)。
表5
蛋白质 受体 KD Kon Kdis RmaxR2
G001 FcγRIIb 2.99E-06 3.72E+05 1.11E+00 0.31520.986
G001 FcγRIIIa 6.77E-07 1.64E+05 1.11E-01 0.65350.991
G051 FcγRIIb 4.39E-08 7.10E+05 3.12E-02 0.28680.991
G051 FcγRIIIa 2.30E-08 2.83E+05 6.50E-03 0.8860.996
实施例5：天然连接的斯塔都聚体复合物在治疗ITP方面有效
为阐明斯塔都聚体在特发性血小板减少性紫癜(ITP)中的作用，在ITP预防性小鼠模型中测试斯塔都聚体。在暴露于使整联蛋白受体包覆在血小板上的小鼠整联蛋白抗IIb抗体后，引起低的血小板计数。简而言之，在抽取血液和血小板计数后第1日，8周龄C57BL/6小鼠(CharlesRiver)经尾静脉注射斯塔都聚体或对照。在抽取血液和血小板计数后第2日，小鼠用200μl磷酸盐缓冲盐水中以浓度2μg抗体给予的MWReg30(BDPharmingencat#553847)治疗，所述MWReg30通过腹腔注射施用至引起血小板丢失。在第3、4和5日继续抽取血液用于血小板计数和注射MWReg30。IVIG阳性对照在第2至第5天每天给药。用DrewScientificHemavet950血细胞计数板进行血小板计数。将M045c和其级分在第2日给药一次。通过尾静脉切口法采集血液并且将其与柠檬酸盐缓冲液混合以防止凝固。
M045c在这种个模型中相对于无药物治疗ITP对照和IgG2aFc对照具有明显保护作用并且与IVIG预防性疗法和未接受MWReg30注射的小鼠可比(见图7)。如实施例4中所述那样产生M045c级分。M045级分1在这种个模型中相对于无药物治疗ITP对照具有明显保护作用，而M045级分3则没有保护作用。
实施例6：用天然连接的斯塔都聚体复合物移除内毒素复合物
为移除内毒素，将内毒素结合性斯塔都聚体混入含有目的蛋白的含内毒素的蛋白质溶液后，这种溶液将用1体积结合缓冲液(20mM磷酸钠pH7.2+150mMNaCl)调节至pH7.2。为移除内毒素，含有蛋白质的溶液将施加至亲和层析柱(HiTrapMabselect蛋白A亲和柱，GELifeSciences)。结合斯塔都聚体的内毒素将与亲和柱结合，并且无内毒素的纯化蛋白质将在通流级分中洗脱。
在使用斯塔都聚体截获内毒素的替代性方法中，蛋白A包覆的磁珠(NewEnglandBioLabs,MA)将与内毒素结合性斯塔都聚体一起混入含有内毒素的蛋白溶液，并且将通过磁性分离法移除结合斯塔都聚体的内毒素。
实施例7：天然连接的斯塔都聚体复合物在免疫学测定法中阻断Fc的 用途
改善基于抗体的研究工具和临床诊断法的灵敏度和特异性。抗体的研究性用途和临床诊断用途受非特异性结合限制。这可以例如，因单克隆或多克隆抗体的Fc部分与细胞(包括免疫细胞和肿瘤)上的高亲和力Fcγ受体和其他Fc结合性受体结合或因抗体聚集物或被抗体包覆的细胞聚集物与低亲和力Fcγ受体结合而发生。
为了展示斯塔都聚体阻断Fcγ受体与特异性抗Fcγ相互作用的能力，我们进行流式细胞术并且将渐增剂量的人斯塔都聚体G045c与G001(IgG1Fc的同型二聚体单体)在其阻断抗FcγR抗体与已知存在于特定细胞上的FcγR结合的能力方面比较。发现斯塔都聚体相对于IgG1Fc对照有效阻断抗FcγR抗体与FcγR结合并且以剂量依赖方式做到这一点(见图8)。
因为它们对Fcγ受体和结合免疫球蛋白Fc区的其他受体具有极高结合亲和力，所以斯塔都聚体令人惊讶地有效阻断特定抗Fcγ受体单克隆抗体的结合作用和相互作用。因此斯塔都聚体用作对照试剂以削弱研究工具环境下和临床诊断环境下所施用抗体的非特异性抗体结合作用。
实施例8：天然连接的斯塔都聚体复合物在治疗实验性自身免疫神经炎 方面有效
在实验性自身免疫神经炎(EAN)大鼠模型中评估M045c和M051的功效，在每种情况下，与IVIG并与白蛋白比较。鼠EAN模型是广泛使用的人急性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病的动物模型。简而言之，45只路易斯大鼠(Lewisrat)用牛完整外周神经髓鞘质免疫并且随机分成3个组。在临床缺损发作(通常是在第9日或第10日体重减轻)时，每个治疗组15只大鼠用IVIg(1gm/1Kg体重)、M045(20mg/Kg)或M051(17.5mg/Kg)治疗或用白蛋白治疗，所述药物均作为两个剂量连续两天静脉内给予。通过尾静脉注射静脉内施用全部药物。
以临床、电生理和组织学方式评估EAN大鼠。通过每日临床定级和通过体重变化评估临床病情严重性。电生理研究包括检查复合肌肉动作电位(CMAP)幅值和运动传导速度(MCV)。在第15日病情鼎盛时，处死来自每个组的5只大鼠，采集坐骨神经并且分析组织病理学变化。在IVIg组和白蛋白组和重组M045c或M051组和白蛋白组之间比较治疗功效。
接受所测试的斯塔都聚体M045c的大鼠比白蛋白治疗的对照具有统计上更少的严重病情(见图12)。与IVIg治疗的大鼠(15只中有1只)和与M045c治疗的大鼠(15只中有0只)相比，用白蛋白治疗的EAN大鼠表现出更高的死亡率(15只中有4只)。接受M045c和IVIg治疗的动物显示明显较不突出的体重减轻。与白蛋白治疗的那些大鼠相比，在IVIg治疗和M045c治疗的大鼠中存在运动传导速度(MCV)和远端和近端CMAP幅值的统计显著改善。与用IVIg治疗或用M045c治疗的大鼠相比，白蛋白治疗的大鼠在坐骨神经中显示更严重的轴突损失和活跃的轴突变性。因此，与白蛋白相比，斯塔都聚体M045c展示死亡率、体重、临床、电生理、和组织病理学功效，其与临床金标准IVIg以大约2%剂量的IVIg所展示的功效可比较。
在每个试验组采用11只大鼠的独立实验中，接受所测试的斯塔都聚体M051的大鼠比白蛋白治疗的对照具有统计上更少的严重病情(见图11)。在中这项研究，与M051组中4只动物死亡相比，对照(白蛋白)组中的11只动物有7只死亡。与接受白蛋白对照的大鼠相比，接受IVIg或M051的大鼠展示显著更少的体重减轻。与接受白蛋白对照的大鼠相比，接受IVIg或M051的大鼠在临床评分方面展示显著改善。用IVIg或M051治疗后，在MCV和CMAP幅值方面存在统计显著的改善。因此，与白蛋白相比，斯塔都聚体M051展示死亡率、体重、临床和电生理功效，其与临床金标准IVIg以大约2%剂量的IVIg所展示的功效可比较。
实施例9：含有Fc突变的天然连接的斯塔都聚体复合物显示与FcγR增 强的结合作用并且在关节炎的小鼠模型中有效用于治疗
如上文实施例4中所述那样，通过Biacore结合分析法进行含有Fc突变体的斯塔都聚体G075(SEQIDNO:20)和G076(SEQIDNO:21)与FcγRIIIa、FcγRIIb和FcγRIIa的结合。G075显示与FcγRIIIa的结合增加和与FcγRIIa和FcγRIIb的结合减少，而G076显示与FcγRIIIa的结合减少和与FcγRIIa和FcγRIIb的结合增加。(见图10A和B)。
接下来，如上文实施例3中所述那样，在关节炎的小鼠模型上评估含有Fc突变体的斯塔都聚体M075(SEQIDNO:22)、M076(SEQIDNO:23)和M098(SEQIDNO:25)的功效。含有Fc突变体的斯塔都聚体与媒介物和M045c比较。M098和M075在抑制CIA进展方面均是显著更有效的，而M076斯塔都聚体则不是这样。(见图13A和B)。我们预期，已知改变各个Fc-FcR结合作用或改变补体依赖的细胞毒性的免疫球蛋白Fc的其他突变将类似地完善包含IgG1Fc并向Fc受体提供多价IgG1Fc的斯塔都聚体。

Claims (40)

1.一种复合物的二聚体或更高阶多聚体，其中所述复合物包含以其羧基端直接连接多聚化结构域的IgG1Fc结构域，其中所述多聚化结构域为IgG2铰链结构域，其中所述IgG1Fc结构域单体包含SEQIDNO:2的第一多肽序列，且其中每个所述IgG2铰链结构域单体包含SEQIDNO:3的第二多肽序列，其中所述第二多肽序列直接连接所述第一多肽序列的羧基端，其中所述二聚体或更高阶多聚体能够结合至少两个Fcγ受体(FcγR)。
2.根据权利要求1所述的复合物的二聚体或更高阶多聚体，其中所述Fc结构域包含FC结构域单体的同型二聚体，每个包含IgG1的铰链区、CH2和CH3结构域，且其中所述IgG2铰链结构域包含IgG2铰链单体的同型二聚体。
3.根据权利要求1所述的复合物的二聚体或更高阶多聚体，其中所述复合物是糖基化的。
4.根据权利要求1所述的复合物的二聚体或更高阶多聚体，进一步包含直接连接至至少一种所述第一序列的氨基端的前导序列。
5.根据权利要求1所述的复合物的二聚体或更高阶多聚体，其中SEQIDNO:3中的4个半胱氨酸残基中没有一个被突变。
6.根据权利要求1所述的二聚体或更高阶多聚体，其中所述更高阶多聚体包含至少3个复合物。
7.根据权利要求1所述的二聚体或更高阶多聚体，其中所述更高阶多聚体包含至少4个复合物。
8.根据权利要求1所述的二聚体或更高阶多聚体，其中所述更高阶多聚体包含至少5个复合物。
9.根据权利要求1所述的二聚体或更高阶多聚体，其中所述更高阶多聚体包含至少6个复合物。
10.根据权利要求1所述的二聚体或更高阶多聚体，其中所述更高阶多聚体包含至少7个复合物。
11.根据权利要求1所述的二聚体或更高阶多聚体，其中第一复合物通过其多聚化结构域连接至至少第二复合物。
12.根据权利要求11所述的二聚体或更高阶多聚体，其中所述第二复合物通过其多聚化结构域连接至所述第一复合物。
13.根据权利要求11所述的二聚体或更高阶多聚体，其中所有连接的复合物通过多聚化结构域连接。
14.根据权利要求11所述的二聚体或更高阶多聚体，其中所述第一和至少第二复合物通过各个多聚化结构域中存在的半胱氨酸残基之间的二硫键共价连接。
15.分离的核酸，其包含编码直接连接的权利要求3的第一和第二多肽序列的核酸序列。
16.根据权利要求15所述的核酸，进一步包含编码直接连接至所述第一多肽序列的氨基端的前导序列的核酸序列。
17.包含权利要求15所述的核酸的表达载体。
18.用权利要求15所述的核酸稳定转染且因此表达所编码的多肽的哺乳动物细胞。
19.根据权利要求18所述的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞选自下组：CHO细胞、HEK293细胞、PER.C6细胞和CAP细胞。
20.获得权利要求1所述复合物的方法，包括从用包含编码所述直接连接的第一和第二多肽序列的核酸序列的核酸序列的表达载体稳定转染的哺乳动物细胞的培养基收获所述复合物。
21.一种组合物，其包含权利要求1所述的二聚体或更高阶多聚体。
22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述二聚体或更高阶多聚体包含所述组合物中至少45％的总复合物的量。
23.根据权利要求21所述的组合物，其中所述二聚体或更高阶多聚体包含所述组合物中至少55％的总复合物的量。
24.根据权利要求21所述的组合物，其中所述二聚体或更高阶多聚体包含所述组合物中至少65％的总复合物的量。
25.根据权利要求21所述的组合物，其中所述二聚体或更高阶多聚体包含所述组合物中至少70％的总复合物的量。
26.根据权利要求21所述的组合物，其中所述二聚体或更高阶多聚体包含所述组合物中至少73％的总复合物的量。
27.有效量的权利要求1所述的二聚体或更高阶多聚体在制备用于调节受试者中免疫反应的药物中的用途。
28.根据权利要求27所述的用途，其中所述调节影响树突状细胞中CD86表达的诱导或CD1a表达的抑制。
29.有效量的权利要求1所述的二聚体或更高阶多聚体在制备用于治疗受试者中炎性或自身免疫疾病的药物中的用途。
30.根据权利要求29所述的用途，其中所述炎性或自身免疫疾病是可用人IVIG治疗的。
31.根据权利要求29所述的用途，其中所述炎性或自身免疫疾病选自下组：获得性自身免疫性血小板减少症、获得性抗因子VIII自身免疫性、获得性血管性血友病、急性特发性自主神经机能异常性神经病、同种异型免疫性/自身免疫性血小板减少症、ANCA阳性血管炎、强直性脊柱炎、抗Decorin(BJ抗原)肌病、再生障碍性贫血、哮喘、异位性皮炎、自身免疫贫血、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性中性粒细胞减少症、自身免疫性甲状腺炎、自身免疫性葡萄膜炎、骨髓移植排斥、乳糜泻、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、克罗恩氏病、库欣综合征、皮肌炎、皮肤多发性肌炎、糖尿病性神经病、戴-布二氏贫血、癫痫、埃文斯综合征、费耳提氏综合征、高歇氏病、肺出血肾炎综合征、格雷夫斯氏病、格-巴二氏综合征、新生儿溶血病、溶血尿毒症综合征、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、免疫介导的中性粒细胞减少症、包涵体肌炎、炎性肠病、炎性肌病、青少年特发性关节炎、川崎病、朗-爱二氏肌无力综合征、与抗/GMl相关的下位运动神经元综合征、未知意义的单克隆丙种球蛋白病、多灶性运动神经病(MMN)、多发性硬化、重症肌无力、脊髓炎、肌炎、坏死性筋膜炎、视神经炎、器官移植排斥、佩吉特病、伴有抗Yo抗体的副肿瘤性小脑变性、副肿瘤性脑脊髓炎、副肿瘤性坏死性肌病、副蛋白血症IgM脱髓鞘性多发性神经病、天疱疮、青霉胺诱导的多发性肌炎、输血后紫癜、银屑病、单纯红细胞再生障碍、反应性关节炎、血小板输注无效、类风湿性关节炎、肉瘤样病、硬皮病、硬化性胆管炎、伴有抗Hu抗体的感觉神经病、败血症、镰状细胞危象、脊椎病、自发多发性肌炎、僵人综合征、系统性红斑狼疮(SLE)、全身性血管炎、血栓性血小板减少性紫癜、1型糖尿病、溃疡性结肠炎、韦格纳肉芽肿病、惠普尔氏病和X连锁的空泡性肌病。
32.根据权利要求31所述的用途，其中所述炎性或自身免疫疾病选自下组：慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、糖尿病性神经病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、格-巴二氏综合征、多灶性运动神经病(MMN)和系统性红斑狼疮(SLE)。
33.一种复合物，其包含连接的二聚体的多聚体，每个二聚体包含两个单体，其每个包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的IgG1Fc结构域单体，其以其羧基端直接连接IgG2铰链结构域单体，所述IgG2铰链结构域单体为SEQIDNO:3的氨基酸序列，其中二聚体的连接通过其各自的IgG2铰链结构域存在。
34.根据权利要求33所述的多聚体，其中所述多聚体包含至少2个连接的二聚体。
35.根据权利要求33所述的多聚体，其中所述多聚体包含至少3个连接的二聚体。
36.根据权利要求33所述的多聚体，其中所述多聚体包含至少4个连接的二聚体。
37.根据权利要求33所述的多聚体，其中所述多聚体包含至少5个连接的二聚体。
38.根据权利要求33所述的多聚体，其中所述多聚体包含至少6个连接的二聚体。
39.根据权利要求33所述的多聚体，其中所述多聚体包含至少7个连接的二聚体。
40.有效量的权利要求1所述的复合物在制备用于治疗受试者中炎性或自身免疫疾病的药物中的用途，其中所述炎性或自身免疫疾病选自下组：获得性自身免疫性血小板减少症、获得性抗因子VIII自身免疫性、获得性血管性血友病、急性特发性自主神经机能异常性神经病、同种异型免疫性/自身免疫性血小板减少症、ANCA阳性血管炎、强直性脊柱炎、抗Decorin(BJ抗原)肌病、再生障碍性贫血、哮喘、异位性皮炎、自身免疫贫血、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性中性粒细胞减少症、自身免疫性甲状腺炎、自身免疫性葡萄膜炎、骨髓移植排斥、乳糜泻、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、克罗恩氏病、库欣综合征、皮肌炎、皮肤多发性肌炎、糖尿病性神经病、戴-布二氏贫血、癫痫、埃文斯综合征、费耳提氏综合征、高歇氏病、肺出血肾炎综合征、格雷夫斯氏病、格-巴二氏综合征、新生儿溶血病、溶血尿毒症综合征、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、免疫介导的中性粒细胞减少症、包涵体肌炎、炎性肠病、炎性肌病、青少年特发性关节炎、川崎病、朗-爱二氏肌无力综合征、与抗/GMl相关的下位运动神经元综合征、未知意义的单克隆丙种球蛋白病、多灶性运动神经病(MMN)、多发性硬化、重症肌无力、脊髓炎、肌炎、坏死性筋膜炎、视神经炎、器官移植排斥、佩吉特病、伴有抗Yo抗体的副肿瘤性小脑变性、副肿瘤性脑脊髓炎、副肿瘤性坏死性肌病、副蛋白血症IgM脱髓鞘性多发性神经病、天疱疮、青霉胺诱导的多发性肌炎、输血后紫癜、银屑病、单纯红细胞再生障碍、反应性关节炎、血小板输注无效、类风湿性关节炎、肉瘤样病、硬皮病、硬化性胆管炎、伴有抗Hu抗体的感觉神经病、败血症、镰状细胞危象、脊椎病、自发多发性肌炎、僵人综合征、系统性红斑狼疮(SLE)、全身性血管炎、血栓性血小板减少性紫癜、1型糖尿病、溃疡性结肠炎、韦格纳肉芽肿病、惠普尔氏病和X连锁的空泡性肌病。
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