CN102573944A

CN102573944A - 原位成型水凝胶及其生物医学用途

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Publication number: CN102573944A
Application number: CN2010800389630A
Authority: CN
Inventors: 朴基东; 郑润基; 朴敬珉
Original assignee: Ajou University Industry Academic Cooperation Foundation
Current assignee: Ajou University Industry Academic Cooperation Foundation
Priority date: 2009-07-02
Filing date: 2010-07-01
Publication date: 2012-07-11
Anticipated expiration: 2030-07-01
Also published as: KR101091028B1; EP2448610A4; US20120100103A1; EP2448610B1; KR20110002741A; US8815277B2; JP2012531960A; WO2011002249A3; JP5608741B2; CN102573944B; WO2011002249A2; EP2448610A2

Abstract

本发明公开了原位成型可注射水凝胶及其医学用途。在该原位成型可注射水凝胶中，两个或多个同质或异质的聚合物通过相邻聚合物上的苯酚或苯胺部分之间的脱氢反应彼此键合，其中，聚合物骨架利用接头与苯酚或苯胺部分进行接枝。与传统的水凝胶相反，该原位成型可注射水凝胶在体内稳定性和机械强度方面更出色，这要归功于作为接头的水溶性聚合物的引入使苯酚或苯胺部分的反应性得以改善。由于该水凝胶具有生物稳定性和机械强度十分出色的优点，该水凝胶在生物医学领域中有许多应用。

Description

原位成型水凝胶及其生物医学用途

技术领域

本发明涉及在生物稳定性和机械强度方面有所改进的原位成型(insitu-forming)可注射水凝胶及其生物医学用途。

背景技术

由于水凝胶生物相容性高、水含量高并且对营养物质和代谢产物的透过性优异，已经对水凝胶作为用于各种生物医学应用的生物材料(如植入物、药物和细胞递送载体)进行了广泛研究。水凝胶可由天然存在的或合成的聚合物制备，并能够以化学和物理的三维交联网络的形式形成。在过去的十年中，水凝胶研究的趋势转向了原位成型水凝胶，所述原位成型水凝胶在将聚合物溶液进行体内注射后的实际部位处成型。

可将原位成型水凝胶用于可注射水凝胶体系中。基于微创技术，可注射水凝胶体系引起了广泛的重视，这是由于可注射水凝胶体系构成了令患者感到舒适的简单制剂。这些体系可由可注射流体组成，在使用微创方法注射后，这些可注射流体在固化前可在体内(例如，在组织、器官或体腔内)形成水凝胶。

例如，可注射水凝胶体系的植入并不需要手术操作，但是可通过简单混合将各种药物和生物活性分子容易地包封入该水凝胶。利用可注射水凝胶可以填充体腔的缺陷或凹陷部位(defected or depressed sites)。可注射水凝胶体系的机械性能差，但是却享有如下优势：显示出高的细胞接种效率；可用作生物活性药物(如肽、蛋白质和DNA)的载体；有效地将营养物质递送至细胞。

原位水凝胶的成型可以是由UV-聚合或Michael加成实现的化学交联的结果，或是物理化学交联(如疏水相互作用后的热敏结合、立构复合物(stereocomplex)形成或离子键合)的结果。当通过化学交联成型时，原位成型后的水凝胶其用途受限于细胞毒性和不佳的体内安全性，这主要是由使用有毒的添加剂(如光引发剂或交联剂)而引起。相反，通过物理化学交联制备的原位成型水凝胶原则上不含有有毒添加剂，但是却存在机械强度和稳定性低的缺点。

就光敏水凝胶来说，由于其前体聚合物溶液的高粘度，很难将其前体聚合物溶液的溶液与细胞或药物均匀混合；并且另一缺点在于制备光敏水凝胶要花费的时间长。另一方面，当立构复合水凝胶降解时，它产生导致周围组织坏死和细胞毒性的酸性副产品。

为了克服这些问题，最近开发了酶触发型(enzyme-triggered)原位成型水凝胶。该交联的水凝胶是在辣根过氧化物酶(HRP)和过氧化氢(H₂O₂)存在时，由聚合物的原位聚合得到的。除具有良好的原位安全性之外，该酶触发型原位成型水凝胶还享有化学交联水凝胶的优势，即，机械强度高。

迄今为止开发出的酶触发型原位成型水凝胶如下：葡聚糖-酪胺(dec-TA)(Rong Jin等，Biomaterials 2007)、透明质酸-酪胺(HA-TA)(Motoichi Kurisawa等，Chem.Commun.2005)、明胶-羟基苯丙酸(LishanWang等，Biomaterials 2009)、明胶-酪胺(GTA)(Shinji Sakai等，Biomateirals 2009)和海藻酸-羟基苯乙酸(AHPA)(Shinji Sakai等，ActaBiomaterialia 2007)。

通过酶介导的交联由透明质酸-酪胺原位成型后的水凝胶可从LifeCore购得，并且已有许多相关的PCT专利和美国专利公告。聚合物骨架中的苯酚部分通过邻位碳-碳键和/或通过邻位碳原子与苯氧基的氧之间的碳-氧键，发生HRP-介导的偶联反应。

利用HRP与H₂O₂的浓度比可容易地控制成型后的水凝胶的理化性质(如凝胶化时间、机械强度、生物可降解性等)。然而，由于聚合物溶液的溶解度和苯酚-苯酚偶联的反应性，这些酶触发型水凝胶存在稳定性与机械性能差的缺点。

例如，由于聚合物溶液的高粘度，这些水凝胶中的聚合物溶液的量被限制在低至1-5wt％。实际上，这种高粘度使细胞或药物难以在水凝胶内均匀地混合。

明胶-酪胺(GTA)的低溶解度会产生不透明的水凝胶，并使得聚合物溶液处于5wt％以下的浓度。由于明胶的溶解率受到其它因素(特别是低温)的影响，因此需要解决这一问题。

对于明胶-羟基苯丙酸水凝胶，它们的机械强度最多为600Pa。这一不佳的机械强度归因于聚合物骨架的苯酚部分彼此直接键合的事实。因为形成苯酚-苯酚键的自由基需要HRP分子和苯酚部分之间的距离为至少数埃

所以苯酚部分的可移动性在苯酚-苯酚键的形成中起重要作用。因此，在苯酚部分直接键合的结构中存在不利之处。

因此，需要在生物稳定性和机械强度方面出色的原位成型水凝胶。

发明内容

技术问题

为克服本领域中遇到的问题，对原位成型水凝胶进行深入、彻底的研究，得到了以下发现从而完成了本发明：作为天然存在的或合成的聚合物骨架与苯酚或苯胺部分之间的接头，亲水性聚合物链(水溶性聚合物)的引入不仅改善了该聚合物骨架的溶解度(因此使其易于处理)，而且改善了苯酚-苯酚键或苯胺-苯胺键的反应性(因此使得稳定性和机械强度提高)。

因此，本发明的目的是提供在生物稳定性与机械强度方面出色的原位成型水凝胶。

技术方案

根据本发明的一个方面，本发明提供了由下述化学式2表示的可注射水凝胶，其中，两个或多个由下述化学式1代表的同质或异质聚合物(homogeneous or heterogeneous polymers)通过相邻聚合物上的苯酚或苯胺部分之间发生的脱氢反应彼此键合，其中，聚合物骨架利用接头与所述苯酚或苯胺部分进行接枝(grafted)。

化学式1

化学式2

其中，

R为羟基或胺；并且

L为亲水性聚合物链(水溶性聚合物接头)。

在辣根过氧化物酶和过氧化氢存在时，该聚合物可在体内原位交联。

可以利用亲水性聚合物链(水溶性聚合物)作为接头，使用酰胺键、氨基甲酸酯键、脲键或酯键，将由下述化学式3表示的苯酚或苯胺衍生物接枝至具有氨基、羟基或羧基基团的聚合物骨架，来制备化学式1的聚合物：

化学式3

其中，

R¹为羟基基团或胺基团；和

R²为羧基基团或胺基团。

例如，可按反应历程1-5所示制备化学式1的聚合物。在这些反应历程中，EDC代表1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺，NHS代表N-羟基琥珀酰亚胺，TEA代表三乙胺，DMAP代表二甲铵吡啶，NPCF代表对硝基苯基氯甲酸酯。

详细地，可通过如下步骤完成化学式1聚合物的制备：(i)制备具有羟基或羧基基团的水溶性聚合物作为接头；(ii)将苯酚衍生物或苯胺衍生物键合至该接头，形成接头-苯酚衍生物或接头-苯胺衍生物的缀合物；和(iii)以将接头直接连接至骨架的方式使聚合物骨架与该缀合物接枝。

任选地，可在步骤(i)和步骤(ii)之间进行添加琥珀酸酐或NPCF(同时添加TEA和DMAP)的步骤。

EDC和HNS的存在活化了苯酚或苯胺衍生物，从而与亲水性聚合物链(水溶性聚合物)反应。另外，当聚合物骨架与该缀合物接枝时，可加入EDC和HNS以促进反应。

在步骤(iii)之前，可用二胺化合物进一步修饰该缀合物。

反应历程1

反应历程2

反应历程3

反应历程4

反应历程5

适用于本发明的聚合物骨架可选自于由如下物质所组成的组：明胶、壳聚糖、肝素、纤维素、葡聚糖、硫酸葡聚糖、硫酸软骨素、硫酸角质素、硫酸皮肤素、海藻酸盐/酯、胶原蛋白、白蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、玻连蛋白、透明质酸、纤维蛋白原、多臂聚合物以及上述物质的组合；但不仅限于此。

本发明中有用的苯酚衍生物选自于由下列物质所组成的组：酪胺、羟基苯乙酸、羟基苯丙酸、它们的衍生物以及上述物质的组合。本发明中有用的苯胺衍生物可使用选自于由羟乙基苯胺、氨基乙基苯胺、氨基苄醇以及它们的衍生物所组成的组中的一种或多种化合物。

对于在本发明中用作接头的水溶性聚合物，可选自于由下列物质所组成的组：聚阳离子链、聚阴离子链、聚两性链、聚非离子链、多肽链、聚脂肪族链、聚芳香族链、聚酯链、聚酸酐链、聚原酸酯链、聚氨基甲酸酯链及聚酰胺链。所述水溶性聚合物的实例包括聚乙二醇(PEG)、聚环氧乙烷(PEO)、聚乙烯亚胺(PEI)、聚环氧丙烷(PPO)、聚乙烯醇(PVA)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(聚NIPAAM)、聚富马酸酯、聚有机磷腈、聚丙烯酸(聚AAc)、聚磺酸烯丙酯(polyacrylsulfonate)、聚甲基丙烯酸羟乙酯(聚HEMA)以及上述物质的组合；但不仅限于此。另外，共聚物的实例包括PEO-PPO-PEO(Pluronic^TM系列)、4臂PEO-PPO-PEO(Tetronic^TM系列)、PEG-PEI、PEG-PVA、PEG-PEI-PVA、PEI-PVA、聚(NIPAAM-co-AAc)、聚(NIPAAM-co-HEMA)以及上述物质的组合，但不仅限于此。

对于在本发明中用作接头的水溶性聚合物，可选自于由线型或多臂的亲水嵌段共聚物所组成的组，所述共聚物选自于由下列物质所组成的组：聚乙二醇(PEG)-聚乳酸(PLA)、聚乙二醇(PEG)-聚己内酯(PCL)、聚乙二醇(PEG)-聚(DL-乳酸-co-乙醇酸)(PLGA)、聚富马酸丙二醇酯、聚富马酸乙二醇酯以及上述物质的组合；但不仅限于此。

可通过控制辣根过氧化物酶和过氧化氢的浓度来定制本发明水凝胶的理化性质，包括凝胶化时间、凝胶稳定性(降解所花费的时间)、机械强度和水含量。

此外，水溶性聚合物的分子量对该水凝胶的理化性质(包括凝胶化时间、凝胶稳定性、机械强度和水含量)有影响。

本发明的水凝胶可借助于双注射器试剂盒(dual syringe kit)原位交联，或可使用安装有喷嘴的(nozzle-mounted)双注射器试剂盒进行喷雾。此外，可使用双注射器试剂盒和聚四氟乙烯(Teflon)模具使该水凝胶成型为片(sheets)或圆盘(discs)。

进一步而言，本发明的原位成型可注射水凝胶可包含具有苯酚或苯胺基团的生物学活性物质。在优选的实施方式中，该生物学活性物质为含有酪氨酸的肽。

根据本发明的另一个方面，本发明提供了用于组织再生和填充(tissue regeneration and augmentation)的植入材料，该植入材料含有本发明的可注射水凝胶作为活性成分。

该植入材料应用的实例包括：软骨再生、骨再生、牙周再生、皮肤再生、心脏组织再生、人工晶状体、脊髓再生、颅骨再生、声带再生和填充、防粘连隔离物(adhesion barrier)、小便失禁治疗、除皱、创伤敷料、组织填充和椎间盘治疗。

根据本发明的另一个方面，本发明提供了用于递送生物学活性物质和药物的载体，该载体含有所述原位成型可注射水凝胶作为活性成分。

在优选实施方式中，所述生物学活性物质或药物可为肽或蛋白质药物、抗菌剂、抗癌剂和/或消炎剂。

肽或蛋白质药物的实例包括：成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子(TGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、人生长激素(hGH)、猪生长激素(pGH)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、促红细胞生成素(EPO)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、干扰素-α，β，γ、白细胞介素-2(IL-2)、降血钙素、神经生长因子(NGF)、生长激素释放激素、血管紧张素、促黄体激素释放激素(LHRH)、促黄体激素释放激素激动剂(LHRH激动剂)、胰岛素、促甲状腺素释放激素(TRH)、血管抑素(angiostatin)、内皮抑素(endostatin)、生长抑素、胰高血糖素、内啡肽、杆菌肽、mergain、粘菌素、单克隆抗体和疫苗。

本发明适用的抗菌剂可选自如下物质：米诺环素、四环素、氧氟沙星、磷霉素、mergain、环丙氟啶酸、氨苄青霉素、青霉素、强力霉素、硫霉素、头孢菌素、诺卡杀菌素、庆大霉素、新霉素、卡那霉素、巴龙霉素、小诺霉素、阿米卡星、妥布霉素、地贝卡星、头孢噻肟、头孢克洛、红霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、依诺沙星、万古霉素、亚胺培南和夫西地酸。

适用于本发明的抗癌剂可选自于：紫杉醇、泰索帝、阿霉素(adriamycin)、内皮抑素、血管抑素、丝裂霉素、博来霉素、顺铂、卡铂、多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素、伊达比星、5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、放线菌素D以及上述物质的组合。

消炎剂的实例包括对乙酰氨基酚、阿司匹林、布洛芬、双氯芬酸、吲哚美辛、吡罗昔康、非诺洛芬、氟比洛芬、酮洛芬、萘普生、舒洛芬、洛索洛芬、辛诺昔康和替诺昔康。

根据一个实施方式，将明胶(可酶促降解的天然聚合物)用作聚合物骨架，使用水溶性聚合物(例如PEG)作为接头使苯酚衍生物连接至该骨架，合成明胶-PEG-酪胺(GPEG-TA)。与由无接头聚合物(即明胶-羟基苯乙酸(GHPA))制备的水凝胶相比，前述的原位成型可注射水凝胶在溶解度、凝胶化时间、机械强度和生物稳定性方面有所改进，这应归功于该PEG接头。

本发明的水凝胶在生物医学领域中有许多应用，包括：原位成型组织工程支架；用于蛋白质、DNA、生长因子、细胞等的缓释药物递送系统；组织填充；创伤愈合；以及防止器官粘连。

更详细地，本发明的水凝胶可被用作人工胞外基质以建造组织工程支架。适当的降解速率对于将该水凝胶改造为胞外基质而言是非常重要的，这是因为水凝胶在使用时可对其中细胞的分化和生长起重要作用。例如，基质金属蛋白酶(MMP)、特别是MMP-2和MMP-9特异性地水解明胶。包含明胶的水凝胶基质被酶降解，随后转变为由细胞分泌的胞外基质(ECM)，从而使得该水凝胶内的细胞可有效地生长和分化。

此外，当该水凝胶被用作组织工程支架时，它的基质刚度对位于凝胶内部的细胞的生长和分化有很大的影响。各种类型的细胞所必需的基质刚度互不相同。例如，已知骨细胞在刚性基质上生长良好，而软组织细胞(例如成纤维细胞、成肌细胞等)的生长需要软基质。在利用酶促反应的体系中，可通过过氧化氢的量容易地控制水凝胶的交联程度，因此可操控水凝胶的刚度。

在一个实施方式中，本发明的水凝胶可被用作适合于作为药物递送支架使用的人工胞外基质。例如，当在其中引入酪胺时，可与各种生长因子物理结合的肝素可阻留生长因子，并使这些生长因子得以缓释(生长因子结合位点)。苯酚修饰的细胞粘附肽或蛋白质(例如RGDY或YIGSR)可被用来增加水凝胶基质内的细胞粘附作用。可通过酶促机制将对细胞生长和分化有效的成分引入水凝胶，从而制备原位成型人工ECM。

有益效果

如上所述，将水溶性聚合物(如PEG)引入作为天然存在的或合成的聚合物骨架与苯酚或苯胺部分之间的接头，不仅改善了该聚合物骨架的溶解度(因此使其易于操作)，而且改善了苯酚-苯酚键或苯胺-苯胺键的反应性(因此使得凝胶稳定性和机械强度提高)。此外，本发明的水凝胶在生物医学领域中有许多应用。

附图说明

将下述详细说明与附图结合会更加清楚地理解本发明的上述及其他目的、特征和优势，其中：

图1示出合成GPEG-TA的反应历程；

图2示出合成GHPA的反应历程；

图3示出基于酶促反应合成GPEG-TA水凝胶的反应历程；

图4为示出使用双注射器试剂盒形成原位成型水凝胶的照片；

图5为示出使用装备有喷雾嘴的双注射器试剂盒形成水凝胶的一组照片；

图6为示出使用聚四氟乙烯模具使GPEG-TA成型为片或圆盘的一组照片；

图7为示出GPEG-TA水凝胶中的2D细胞粘附和增殖的一组显微照片；

图8为示出GPEG-TA水凝胶中的3D细胞粘附和增殖的一组照片；

图9为示出GPEG-TA水凝胶体内稳定性的一组照片；

图10为示出GPEG-TA水凝胶的人生长激素(hGH)释放行为的图；

图11为示出GPEG-TA水凝胶对软骨再生的效果的一组照片；

图12为示出GPEG-TA水凝胶对脊髓再生的效果的一组照片；

图13为示出GPEG-TA水凝胶对声带再生和填充的效果的一组照片；

图14为示出GPEG-TA防止器官粘连的效果的一组照片；

图15和图16为示出将GPEG-TA用于椎间再生的图解和一组照片；

图17为示出GPEG-TA和GHPA水凝胶的凝胶化时间随酶浓度变化的图；

图18为示出GPEG-TA和GHPA水凝胶的机械强度以及随H2O2水平变化的GPEG-TA水凝胶机械强度的一组图。

具体实施方式

在本发明的一个实施方式中，使用PEG作为接头将作为聚合物骨架的明胶与苯基衍生物酪胺接枝，以合成明胶-PEG-酪胺(GPEG-TA)聚合物。这些聚合物可通过酶促反应进行原位交联，来得到原位成型水凝胶。

将PEG作为接头引入改善了该聚合物的溶解度并提高了酪胺的反应性。结果，由此得到的水凝胶在生物稳定性和机械强度方面具有比无接头的水凝胶更大的优势。为了比较，在水凝胶(有接头或无接头)的理化性质分析中，将明胶-羟基苯乙酸(GHPA)用作对照。

在原位成型GPEG-TA水凝胶中，明胶在尤其是MMP引起的蛋白降解(proteineous degradation)中起到底物的作用。在不同的过氧化氢水平下，测定GPEG-TA水凝胶的理化性质，如凝胶化时间、凝胶稳定性、溶胀和机械强度。特别地，对体外细胞活性进行分析来测定GPEG-TA的生物相容性。进行动物实验，来分析GPEG-TA水凝胶的生物稳定性和组织再生作用(包括软骨再生、声带再生和填充、防止器官粘连、脊髓再生、椎间盘治疗和骨再生)。

实施例

借助于下述实施例可更好地理解本发明，这些实施例用于举例说明本发明，不应被解释为对本发明的限制。

<制备实施例1>明胶-PEG-酪胺(GPEG-TA)的合成

图1为合成GPEG-TA共聚物的反应历程。

1.聚(乙二醇)-(对硝基苯基氯甲酸酯)(PEG-NPCF)的合成

将10g(2.9mmol)PEG在100mL二氯甲烷(MC)中的溶液顺序地与0.779g(6.38mmol)DMAP和0.645g(6.38mmol)TEA在10mL MC中的溶液以及1.286g(6.38mmol)NPCF在50mL MC中的溶液混合。PEG∶DMAP∶TEA∶NPCF的摩尔比为1∶2.2∶2.2∶2.2。该反应在氮气气氛中于30℃下进行24h。

反应完成后，使用过滤器将反应混合物过滤并去除未反应的试剂，然后使用旋转蒸发仪浓缩该反应混合物。将浓缩物滴加到1600mL经冷冻的乙醚中形成沉淀，然后通过过滤得到该沉淀。将得到的滤出物在真空烘箱中放置24h以去除残留的有机溶剂，从而得到白色粉末状的期望化合物(PEG-NPCF)。

2.GPEG-TA的合成

向5g(1.471mmol)PEG-NPCF在100mL二甲基亚砜(DMSO)中的溶液中加入0.202g(1.471mmol)酪胺(TA)在50mL DMSO中的溶液。PEG-NPCF∶TA的摩尔比为1∶1。该反应在氮气气氛中于30℃下进行6h。随后加入明胶溶液(1g/200ml；DMSO中)，继之以在氮气气氛中于30℃下反应24h。

在反应完成后，将反应混合物用水进行膜透析(截留Mw 6000-8000Da)以去除未反应的PEG-TA。将经透析的溶液冻干，生产白色粉末状的期望化合物(GPEG-TA)。在¹H NMR谱上，在6.91-7.23ppm处出峰，这对应于TA取代基，证实了GPEG-TA的合成。

<制备实施例2>明胶-羟基苯乙酸(GHPA)的合成

图2示出合成GHPA的反应历程。

将10g明胶溶于200mL的0.1M 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)中制备A溶液。另外，将0.609g(4mmol)4-羟基苯乙酸(HPA)溶于50mL的0.1M MES中以配制B溶液。将0.92g(4.8mmol)1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和0.276g(2.4mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)各自溶于5mL的0.1M MES中。

将EDC溶液和NHS溶液以15min的间隔顺序地加入到B溶液中。加入NHS溶液15min之后，将用EDC/NHS活化后的B溶液与A溶液混合。该反应于40℃下进行24h。

反应完成后，通过注射式过滤器(450nm)过滤反应混合物。然后，将滤液用蒸馏水进行膜透析(截留Mw 3500Da)3～4天，继之以冷冻干燥，得到白色粉末状的GHPA。通过¹H NMR分析对合成的GHPA的化学结构进行鉴定。在该谱上，在6.91-7.23ppm处出峰，该峰对应于TA取代基，证实了GHPA的合成。

<实施例1>利用酶促反应制备GPEG-TA水凝胶

将处于HRP中的GPEG-TA溶液(A溶液)与处于H₂O₂中的GPEG-TA溶液(B溶液)混合以制备水凝胶。控制聚合物溶液的终浓度为1-20wt％，并通过双注射器试剂盒或喷雾试剂盒或通过聚四氟乙烯模具以各种形式施用该聚合物溶液。

将GHPA和CHPA、GPEG-TA或CPEG-TA溶于H₂O₂(B溶液)，并与处于HRP中的Tet-TA/DA溶液(A溶液)混合以制备水凝胶。

以同样方式制备GHPA水凝胶。然而，可以将GHPA的终浓度控制在仅有5-10wt％。在浓度为10wt％时，由于聚合物溶液的高粘度，实际上难以对其进行处理。与此相反，向其中引入了PEG的聚合物GPEG-TA在水中是高度可溶的，因此该聚合物溶液由于其低粘度而比较易于处理。

图3为示出GPEG-TA水凝胶的酶促制备的反应历程。

<实施例2>使用双注射器试剂盒制备原位成型水凝胶

使用双注射器试剂盒，将处于HRP中的GPEG-TA溶液(A溶液)与处于H₂O₂中的GPEG-TA溶液(B溶液)混合，形成原位成型水凝胶。就这点而言，将A溶液和B溶液放入不同的注射器中。图4为示出使用双注射器试剂盒制备原位成型水凝胶的照片。

<实施例3>使用双注射器试剂盒和喷雾试剂盒制备喷雾型水凝胶

将处于HRP中的GPEG-TA溶液(A溶液)与处于H₂O₂中的GPEG-TA溶液(B溶液)各自放入单独的注射器中，得到安装中喷雾嘴的双注射器试剂盒。使用该试剂盒将上述溶液进行喷雾，形成水凝胶。图5为示出使用安装有喷雾嘴的双注射器试剂盒制备水凝胶的一组照片。

<实施例4>使用聚四氟乙烯模具形成水凝胶片和水凝胶圆盘

将处于HRP中的GPEG-TA溶液(A溶液)和处于H₂O₂中的GPEG-TA溶液各自放入双注射器试剂盒的单独的注射器中，并引入至聚四氟乙烯模具中以形成水凝胶片和水凝胶圆盘。图6为示出使用聚四氟乙烯模具形成GPEG-TA水凝胶片和圆盘的一组照片。

<实验实施例1>GPEG-TA水凝胶对2D细胞的生物相容性

为了在体外生物相容性分析中使用，以与实施例4中相同的方式使用聚四氟乙烯模具制备GPEG-TA水凝胶圆盘。在该水凝胶圆盘上培养各种类型的细胞，从而对细胞粘附和增殖进行分析。用于该分析中的水凝胶具有5wt％的浓度和2700Pa的机械强度。

使用成肌细胞(C2C12)、成骨细胞(MC3T3)和大鼠间充质干细胞(MSC)进行生物相容性分析。将这些细胞以1×10⁵细胞/孔的密度在水凝胶圆盘上培养，并在相差显微镜下利用存活/死亡分析进行研究。

图7中示出了结果。如该图所示，发现所有的细胞都很好地粘附至圆盘上并在圆盘上显著地增殖，这显示出了该GPEG-TA水凝胶的体外生物相容性。与此相反，与GPEG-TA水凝胶相比，由于GHPA水凝胶稳定性非常低，因而在24h内溃解(collapsed)，以致不能进行生物相容性分析。

GPEG-TA水凝胶良好的稳定性被认为是归功于PEG的引入，这提高了酪胺的反应性从而改善了聚合物的交联度，产生良好的稳定性。这种稳定性连同对各种细胞良好的生物相容性，使GPEG-TA水凝胶能够应用于各种组织的再生。

<实验实施例2>对GPEG-TA水凝胶的3D细胞粘附和增殖的分析

使用GPEG-TA水凝胶进行3D细胞包封实验。就这点而言，制备处于HRP中的GPEG-TA溶液(A溶液)和处于H₂O₂中的GPEG-TA溶液(B溶液)，并用A溶液分散细胞。将负载有细胞的A溶液与等量的B溶液混合以形成水凝胶，继之以将细胞孵育7天。

由此得到的水凝胶具有5wt％的终浓度。以5×10⁴细胞/孔的密度培养人心脏祖细胞(hCPC)和大鼠MSC。培养后，使用F-肌动蛋白和存活/死亡分析对这些细胞进行研究。

如图8中所示，观察到3D包封的细胞有效地粘附至水凝胶基质并在水凝胶基质内增殖，这表明GPEG-TA水凝胶对各种细胞的有效3D生长和各种组织的再生是有用的。

<实验实施例3>对GPEG-TA水凝胶的体内稳定性分析

在白兔中进行GPEG-TA水凝胶的体内稳定性分析。为了实验，制备处于HRP中的GPEG-TA溶液(A溶液)和处于H₂O₂中的GPEG-TA溶液(B溶液)，随后以与实施例2中相同的方式得到双注射器试剂盒。使用该双注射器试剂盒将上述溶液对白兔进行经皮注射。在移植就位两周后，切除该组织并用H&E进行染色，来研究炎症和浸润(infiltration)。

如图9所示，周围组织浸润了所注射的GPEG-TA并在其中生长，既无炎症也无异体反应(alloplastic reaction)，这表明GPEG-TA水凝胶具有良好的体内稳定性，除适用于原位成型植入之外，在组织再生中也是有用的。

<实验实施例4>对GPEG-TA水凝胶的体内人生长激素(hGH)释放行为的体内分析

对原位成型GPEG-TA水凝胶进行人生长激素(hGH)释放行为的体内分析。使用S.D.大鼠(5-6周龄)作为实验动物。

以与实施例2中相同的方式制成双注射器试剂盒，不同之处在于将人生长激素(hGH)与A溶液混合。使用该试剂盒，将该激素经皮注射到大鼠体内并孵育2周。

如图10中所绘，观察到hGH在动物体内以缓释的方式释放，同时GPEG-TA水凝胶在2周内已全部降解。此外，可通过改变过氧化氢或聚合物的浓度，来控制释放速率。因此，发现该原位成型GPEG-TA水凝胶作为递送hGH的载体是有用的。

<实验实施例5>对GPEG-TA水凝胶的软骨再生作用的分析

对原位成型GPEG-TA水凝胶进行软骨再生作用的分析。用GPEG-TA水凝胶、其中负载有软骨细胞的GPEG-TA水凝胶、其中负载有TGF-β3和软骨细胞的GPEG-TA水凝胶以及对照物(仅有缺陷)进行分析。

就这点而言，以与实施例2中相同的方式制成双注射器试剂盒，不同之处在于将软骨细胞单独或与TGF-β3一起与A溶液混合。使用该试剂盒，将溶液注射到白兔的软骨中并孵育4周。

结果在图11中给出。如这些照片所示，在所有的实验组中软骨都有效地再生，这表明该原位成型GPEG-TA水凝胶可被有效地应用于软骨再生。

<实验实施例6>对GPEG-TA水凝胶的脊髓再生作用的分析

对原位成型GPEG-TA水凝胶进行脊髓再生作用的分析。就这点而言，以与实施例2中相同的方式制成双注射器试剂盒。在大鼠的脊髓上进行对切(hemisection)，之后使用该双注射器试剂盒将水凝胶注射到损伤处，并对该动物观察2周。

结果在图12中示出。可以看出，该原位成型GPEG-TA水凝胶填补了该损伤。注射2周后，切除该组织并进行免疫组化染色。免疫染色结果表明，使用经注射的GPEG-TA水凝胶(与周围宿主组织融合得非常好)使脊髓组织得以再生。

因此，该原位成型GPEG-TA水凝胶可被有效地应用于脊髓再生。

<实验实施例7>对GPEG-TA水凝胶的声带再生和填充作用的分析

对原位成型GPEG-TA水凝胶进行声带再生和填充作用的分析。就这点而言，以与实施例2中相同的方式制成双注射器试剂盒，不同之处在于将软骨细胞与A溶液混合。

使用该双注射器试剂盒，将与溶液混合的软骨细胞植入白兔的声带，然后观察1个月。在植入期间，对动物进行CT拍照。CT图像显示出了声带的再生和填充。切除声带组织后，检查声带组织的炎症和免疫反应，并将该声带组织用于RT-PCR和Western印迹中，从而定量测定软骨细胞的增殖以及声带再生的程度。

因此，如图13中所示，该原位成型GPEG-TA水凝胶可被有效地应用于声带再生和填充。

<实验实施例8>对GPEG-TA水凝胶的防止器官粘连作用的分析

对原位成型GPEG-TA水凝胶防止器官粘连的能力进行分析。为此目的，以与实施例3中相同的方式制成喷雾式双注射器试剂盒。使用大鼠作为实验动物。该动物模型的盲肠和腹膜处受到损伤，并使用喷雾式双注射器试剂盒将水凝胶施用于损伤部位。施用2周后，对大鼠进行剖腹以便能够检查器官粘连和异体反应。

如图14所示，既没有观察到器官粘连，也没有观察到特异性炎症和异体反应，这显示出该原位成型GPEG-TA水凝胶可被有效地用作防止器官粘连的介质。

<实验实施例9>对GPEG-TA水凝胶的椎间盘再生作用的分析

如图15和图16中所示，对原位成型GPEG-TA水凝胶进行椎间盘再生作用的分析。就这点而言，以与实施例2中相同的方式制成双注射器试剂盒。使用猪作为动物模型。使用该双注射器试剂盒，将水凝胶注射到椎间盘(髓核)，随后监测1个月。

在植入期间，用MRI监测动物的髓核再生。随后，切除该组织并检查炎症和免疫反应。进行组织化学染色和RT-PCR来定量测定髓核的再生。

总之，上述实验中获得的数据显示出该原位成型GPEG-TA水凝胶可被有效地应用于腰椎间盘突出的治疗。

<实验实施例10>对GPEG-TA水凝胶的骨再生作用的分析

对原位成型GPEG-TA水凝胶进行骨再生作用的分析。以此为目的，以与实施例2中相同的方式制成双注射器试剂盒，不同之处在于将对骨生成有效的有机材料(如羟基磷灰石或磷酸三钙)以及用于骨形态发生的生长因子(如骨形态发生蛋白(BMP)或转化生长因子(TGF))与A溶液混合。

使大鼠受到损伤，从而在颅骨上形成缺陷。使用该双注射器试剂盒，在缺陷部位使水凝胶成型并观察1-2个月。在植入期间，用CT成像监测该动物模型的骨再生。随后，切除该组织以检查炎症和免疫反应，并利用组织化学染色和钙分析来定量测定骨再生作用。

总之，通过上述实验获得的数据显示出该原位成型GPEG-TA水凝胶可被有效地应用于骨再生。

<实验实施例11>随着酶水平变化的、GPEG-TA和GHPA水凝胶的凝胶化时间

在各种HRP浓度下评价GPEG-TA和GHPA水凝胶的凝胶化时间。为此目的，以与实施例1中相同的方式制备A溶液和B溶液，不同之处在于将各种浓度的HRP用于A溶液。将两种溶液等量混合以制备水凝胶。使用小瓶倾斜法(vial tilting method)测量混合物停止流动所花费的时间段，该时间段被认为是水凝胶的凝胶化时间。

如图17中所示，发现随着HRP的浓度不同，凝胶化时间控制在5-180s。由于HRP浓度的增加促进了H₂O₂降解为自由基，从而介导了凝胶形成，因而凝胶化时间随HRP浓度的增加而缩短。

此外，在相同的HRP浓度下，GPEG-TA水凝胶显示出比GHPA水凝胶更短的凝胶化时间，这表明由于在聚合物骨架(明胶)和酪胺部分之间引入了PEG，该GPEG-TA聚合物比苯酚部分直接键合至聚合物骨架(明胶)的GHPA其反应性更强，因而可形成更有效的酪胺-酪胺键。

<实验实施例12>GPEG-TA和GHPA水凝胶之间的机械强度比较以及GPEG-TA的机械强度随H₂O₂浓度的变化

使用流速计，对GPEG-TA水凝胶的机械强度随过氧化氢浓度的变化情况进行评价。所使用的水凝胶具有5wt％的终浓度。

在相同的条件下(HRP、水凝胶过氧化物含量、聚合物水平)，观察到GHPA水凝胶和GPEG-TA水凝胶分别具有100Pa和2700Pa的机械强度(参见图18)。这可通过如下事实进行解释：相比于苯酚部分直接键合至聚合物骨架的GHPA，在聚合物骨架和酪胺部分之间引入了PEG的GPEG-TA显示出更强的反应性，并由此显示出更高的交联程度。

随着过氧化氢浓度不同，GPEG-TA水凝胶的机械强度为90-2700Pa。

因此，如图18中所示，具有PEG作为接头的GPEG-TA在机械强度方面优于GHPA，并且可通过控制水凝胶过氧化物的浓度提供具有各种机械强度的原位成型水凝胶。

表1

尽管为了说明的目的公开了本发明的优选实施方式，本领域技术人员将会明白，在不背离所附权利要求书中公开的本发明的范围和精神的情况下，可以进行各种改进、添加和置换。

Claims

1.由下述化学式2表示的原位成型可注射水凝胶，其中，两个或多个由下述化学式1表示的同质或异质聚合物通过相邻聚合物上的苯酚或苯胺部分之间的脱氢反应彼此键合，其中聚合物骨架利用接头与所述苯酚或苯胺部分进行接枝：

化学式1

化学式2

其中，

R为羟基或胺；并且

L为亲水性聚合物链。

2.如权利要求1所述的原位成型可注射水凝胶，其中，所述聚合物在辣根过氧化物酶和过氧化氢的存在下在体内原位交联。

3.如权利要求1所述的可注射水凝胶，其中，化学式1的聚合物按以下步骤制备：以水溶性聚合物作为接头，利用酰胺键、氨基甲酸酯键、脲键或酯键，将由下述化学式3表示的苯酚或苯胺衍生物接枝至具有氨基、羟基或羧基基团的聚合物骨架：

化学式3

其中，

R¹为羟基基团或胺基团；和

R²为羧基基团或胺基团。

4.如权利要求1所述的原位成型可注射水凝胶，其中，所述聚合物骨架选自于由如下物质所组成的组：明胶、壳聚糖、肝素、纤维素、葡聚糖、硫酸葡聚糖、硫酸软骨素、硫酸角质素、硫酸皮肤素、海藻酸盐/酯、胶原蛋白、白蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、玻连蛋白、透明质酸、纤维蛋白原、多臂聚合物以及上述物质的组合。

5.如权利要求1所述的原位成型可注射水凝胶，其中，所述苯酚衍生物选自于由如下物质所组成的组：酪胺、羟基苯乙酸、羟基苯丙酸、它们的衍生物以及上述物质的组合。

6.如权利要求1所述的原位成型可注射水凝胶，其中，所述苯胺衍生物选自于由如下物质所组成的组：羟乙基苯胺、氨基乙基苯胺、氨基苄醇、它们的衍生物以及上述物质的组合。

7.如权利要求1所述的原位成型可注射水凝胶，其中，所述接头选自于由如下物质所组成的组：聚阳离子、聚阴离子、聚两性、聚非离子以及上述物质的组合。

8.如权利要求1所述的原位成型可注射水凝胶，其中，所述接头选自于由如下物质所组成的组：聚酯、聚酸酐、聚原酸酯、聚氨基甲酸酯、聚酰胺、多肽、聚脂肪族、聚芳香族以及上述物质的组合。

9.如权利要求1所述的原位成型可注射水凝胶，其中，所述接头选自于由如下物质所组成的组：聚乙二醇(PEG)-聚乳酸(PLA)、聚乙二醇(PEG)-聚己内酯(PCL)、聚乙二醇(PEG)-聚(DL-乳酸-co-乙醇酸)(PLGA)、聚富马酸丙二醇酯、聚富马酸乙二醇酯以及上述物质的组合。

10.如权利要求1所述的原位成型可注射水凝胶，其中，所述接头选自于由如下物质所组成的组：聚乙二醇(PEG)、聚环氧乙烷(PEO)、聚乙烯亚胺(PEI)、聚环氧丙烷(PPO)、聚乙烯醇(PVA)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(聚NIPAM)、聚富马酸酯、聚有机磷腈、聚丙烯酸(聚AAc)、聚磺酸烯丙酯、聚甲基丙烯酸羟乙酯(聚HEMA)以及上述物质的共聚物。

11.如权利要求10所述的原位成型可注射水凝胶，其中，所述共聚物选自于由如下物质所组成的组：PEO-PPO-PEO(Pluronic^TM系列)、4臂PEO-PPO-PEO(Tetronic^TM系列)、PEG-PEI、PEG-PVA、PEG-PEI-PVA、PEI-PVA、聚(NIPAAM-co-AAc)、聚(NIPAAM-co-HEMA)以及上述物质的组合。

12.如权利要求1所述的原位成型可注射水凝胶，所述水凝胶的生理性质通过控制辣根过氧化物酶和过氧化氢的浓度进行定制，所述生理性质选自于由凝胶化时间、凝胶稳定性(降解所花费的时间)、机械强度、水含量以及它们的组合所组成的组。

13.如权利要求1所述的原位成型可注射水凝胶，所述水凝胶的生理性质通过控制所述水溶性聚合物的分子量进行定制，所述生理性质选自于由凝胶化时间、凝胶稳定性、机械强度、水含量以及它们的组合所组成的组。

14.如权利要求1所述的原位成型可注射水凝胶，所述水凝胶使用双注射器试剂盒原位交联。

15.如权利要求14所述的原位成型可注射水凝胶，其中，所述双注射器试剂盒兼有喷雾嘴并因此具有喷雾的能力。

16.如权利要求14所述的原位成型可注射水凝胶，所述水凝胶使用聚四氟乙烯模具和所述双注射器试剂盒成型为水凝胶片或水凝胶圆盘。

17.如权利要求1所述的原位成型可注射水凝胶，该水凝胶中包含具有苯酚或苯胺基团的生物学活性物质。

18.如权利要求17所述的原位成型可注射水凝胶，其中，所述生物学活性物质为含有酪氨酸的肽。

19.用于组织再生和填充的植入材料，所述植入材料含有如权利要求1-18任一项所述的原位成型可注射水凝胶作为活性成分。

20.如权利要求19所述的植入材料，所述植入材料适用于选自于由下述用途所组成的组：软骨再生、骨再生、牙周再生、皮肤再生、心脏组织再生、人工晶状体、脊髓再生、颅骨再生、声带再生和填充、防止粘连隔离物、小便失禁治疗、除皱、创伤敷料、组织填充和椎间盘治疗。

21.用于递送生物学活性物质或药物的载体，所述载体含有如权利要求1-18任一项所述的原位成型可注射水凝胶作为活性成分。

22.如权利要求21所述的载体，其中，所述生物学活性物质或药物选自于由如下物质所组成的组：肽、蛋白质药物、抗菌剂、抗癌剂、消炎剂以及上述物质的组合。

23.如权利要求22所述的载体，其中，所述肽或蛋白质药物选自于由如下物质所组成的组：成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子(TGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、人生长激素(hGH)、猪生长激素(pGH)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、促红细胞生成素(EPO)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、干扰素-，，、白细胞介素-2(IL-2)、降血钙素、神经生长因子(NGF)、生长激素释放激素、血管紧张素、促黄体激素释放激素(LHRH)、促黄体激素释放激素激动剂(LHRH激动剂)、胰岛素、促甲状腺激素释放激素(TRH)、血管抑素、内皮抑素、生长激素抑素、胰高血糖素、内啡肽、杆菌肽、mergain、粘菌素、单克隆抗体、疫苗以及上述物质的组合。

24.如权利要求22所述的载体，其中，所述米诺环素、四环素、氧氟沙星、磷霉素、mergain、环丙氟啶酸、氨苄青霉素、青霉素、强力霉素、硫霉素、头孢菌素、诺卡杀菌素、庆大霉素、新霉素、卡那霉素、巴龙霉素、小诺霉素、阿米卡星、妥布霉素、地贝卡星、头孢噻肟、头孢克洛、红霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、依诺沙星、万古霉素、亚胺培南、夫西地酸以及上述物质的组合。

25.如权利要求22所述的载体，其中，所述抗癌剂选自于由如下物质所组成的组：紫杉醇、泰索帝、阿霉素、内皮抑素、血管抑素、丝裂霉素、博来霉素、顺铂、卡铂、多柔比星、柔红霉素、伊达比星、5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、放线菌素D以及上述物质的组合。

26.如权利要求22所述的载体，其中，所述消炎剂选自于由如下物质所组成的组：对乙酰氨基酚、阿司匹林、布洛芬、双氯芬酸、吲哚美辛、吡罗昔康、非诺洛芬、氟比洛芬、酮洛芬、萘普生、舒洛芬、洛索洛芬、辛诺昔康、替诺昔康以及上述物质的组合。