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CN100342004C - 生产透明质酸的微生物及透明质酸的纯化方法 - Google Patents

生产透明质酸的微生物及透明质酸的纯化方法 Download PDF

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CN100342004C CNB03819581XA CN03819581A CN100342004C CN 100342004 C CN100342004 C CN 100342004C CN B03819581X A CNB03819581X A CN B03819581XA CN 03819581 A CN03819581 A CN 03819581A CN 100342004 C CN100342004 C CN 100342004C
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Abstract

本发明涉及生产透明质酸的菌株链球菌KL0188和一种纯化透明质酸的方法，具体而言涉及不表达透明质酸酶的非溶血性的链球菌KL0188以及一种使用芳族吸附树脂和活性炭纯化透明质酸的方法。

Description

生产透明质酸的微生物及透明质酸的纯化方法
                        发明背景
a)发明领域
本发明涉及生产透明质酸的微生物菌株以及一种纯化透明质酸的方法，具体而言涉及链球菌KL0188以及一种使用芳族吸附树脂和活性碳纯化透明质酸的方法。
b)相关技术描述
透明质酸是一种无色高粘性的多糖，其分子量为50,000～13,000,000Da，重复单元为以(1-3)和(1-4)键交替键接的葡糖醛酸和N-乙酰氨基葡糖。透明质酸具有润肤作用(moisturizingeffect)，优良的减少物理摩擦的润滑作用，并且还提供优良的抗细菌入侵的保护作用等。透明质酸广泛用作化妆品的添加剂、关节炎的治疗剂、眼科手术的补助剂以及外科手术后的粘附抑制剂等。奶牛的眼球、公鸡鸡冠、动物的缓冲组织、胎盘、癌细胞及皮肤等均含有大量透明质酸。
透明质酸可从上述生物组织中提取(美国专利No.4,141,973和美国专利No.4,303,676)，或通过发酵微生物作为发酵产品收集。然而，提取获得的透明质酸含有诸如硫酸软骨素、硫酸葡糖胺聚糖等杂质，从而需要复杂的纯化流程除去所述杂质，因此生产成本高。但是，按照使用微生物的生产透明质酸的方法，其生产成本相对较低，并且可通过较简单的方法获得高分子量的透明质酸(日本专利早期公开No.58-056692，美国专利86-00066)。
用于生产透明质酸的微生物包括脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、兽瘟链球菌(Streptococcuszooepidemicus)、马链球菌(Streptococcus equi)、类马链球菌(Streptococcus equisimilis)等。根据伯吉氏手册(Bergy’smanual)，上述微生物属于兰氏(Lancefield)血清A组或C组。该微生物是溶血性链球菌，并且据报道具有β-溶血功能。
由于使用链球菌微生物(日本专利早期公开No.58-566922、美国专利早期公开No.60-500997、韩国专利注册公开No.10-250573和韩国专利早期公开No.10-250573)生产的透明质酸平均分子量较低，仅为300,000～3,500,000Da，因此难以用作医疗剂或补助剂，并且对于化妆品其润肤力不足。此外，美国专利No.6,090,596描述了一种生产分子量为6,300,000～9,500,000Da的高分子量透明质酸的方法，但透明质酸的生产率相当低，仅为每升培养液0.35g。
已知的使用微生物分离并纯化透明质酸的方法如下：
美国专利No.4,157,296公开的一种纯化透明质酸的方法包括：用三氯代乙酸处理脓链球菌的培养液以除去菌株，然后用有机溶剂使其沉淀。然而，由于使用有机溶剂的沉淀法需要大量重复操作，因此其成本较高并且非常耗时。
美国专利No.4,782,046描述的纯化方法包括：向马链球菌的培养液中加入0.01％的硫酸月桂酯表面活性剂以分离附着在细胞壁上的透明质酸，然后加入非离子表面活性剂溴化十六烷基三甲铵以形成透明质酸沉淀，并用醇使其沉淀。
美国专利No.4,784,990描述的纯化方法包括：向兽瘟链球菌的培养液中加入乙醇使透明质酸从微生物中分离出来，然后用氯代十六烷基吡啶使其沉淀。
日本专利早期公开No.63-012293描述了一种通过使用大网状阴离子交换树脂(Dianion HPA-25、HPA-75、IRA-900、IRA-904)处理含透明质酸的溶液以除去分子量等于或小于1,500,000Da的低分子量透明质酸及发热物质的方法。
日本专利早期公开No.13-131503描述的一种纯化透明质酸的方法包括：用氧化铝或硅胶等处理含透明质酸的溶液以除去发热物质、蛋白质、核酸、金属杂质等，并用有机溶剂使其沉淀。
日本专利早期公开No.06-199656描述的一种纯化透明质酸的方法包括：使含透明质酸的溶液通过在pH为6～10的溶液中带电荷的膜过滤器以除去发热物质并用醇使其沉淀。
韩国专利早期公开No.1994-2478描述了一种通过向生产透明质酸的菌株培养液中加入铝酸铁粉末以纯化透明质酸的方法。
此外，韩国专利早期公开No.1997-42603描述的纯化透明质酸的方法包括：用疏水性聚合物(聚乙烯、聚丙稀或聚苯乙烯)处理含透明质酸的溶液，然后加入活性氧化铝并用醇使其沉淀。
然而，上述方法涉及复杂的处理过程，从而加大了生产成本，并且难以完全除去发热物质、蛋白质、核酸等。
                      发明内容
本发明的一个目的在于提供可以高产量生产高分子量透明质酸的微生物菌株。
本发明的另一个目的在于提供一种生产透明质酸的微生物菌株，所述微生物菌株不表达透明质酸酶并且不是溶血性的。
本发明的另一个目的在于提供由非溶血性微生物菌株生产的并经纯化的高分子量透明质酸。
本发明的另一个目的在于提供一种由微生物生产的透明质酸的纯化方法，该方法可以简单直接的方式除去发热物质并分离出高纯度的透明质酸。
为达到上述目的，本发明提供链球菌KL0188(KCTC1024BP)，该链球菌不表达透明质酸酶并且是非溶血性的。
本发明还提供一种纯化透明质酸及其盐的方法，该方法包括如下步骤：用芳族吸附树脂处理生产透明质酸的微生物菌株的培养液，用活性碳处理并用有机溶剂使其沉淀。
                      具体实施方式
本发明涉及生产透明质酸的微生物菌株和透明质酸的纯化方法。
根据本发明，提供一种通过在兽瘟链球菌中引起突变而制备的链球菌KL0188。链球菌KL0188已于2002年5月10日由韩国典型菌种保藏中心(Korean Collection for Type Culture)保藏，保藏号为KCTC10248BP。链球菌KL0188是一种非溶血性菌株，并且由于其没有透明质酸酶活性，因此可以高产量生产透明质酸。
链球菌KL0188可在含有诸如碳源、氮源、无机盐、维生素等微量成份的培养基中培养。葡萄糖、蔗糖、半乳糖、果糖可用作碳源，并优选使用葡萄糖。硝酸铵、硫酸铵、胰胨、蛋白胨、酵母提取物或酪蛋白氨基酸可用作氮源；氯化钠、磷酸钠、磷酸氢二钠、硫酸亚铁或硫酸镁可用作无机盐。
本发明所用的链球菌KL0188的培养基的实例包括：20～80g/L的葡萄糖、5g/L的酵母提取物、17g/L的酪蛋白胨、7g/L的谷氨酸、0.7g/L的硫酸镁、2.5g/L的磷酸钾和5.0g/L的氯化钠。
链球菌KL0188可在30～37℃的有氧条件下培养。培养液的pH优选维持在6.5～7.5的范围内，并且由于pH会在培养过程中变化，因此优选通过人工手段控制pH。可使用5N的NaOH和1N的HCl溶液控制pH。如果pH超出上述范围，透明质酸的产量和分子量可能有变化。
由链球菌KL0188生产的透明质酸可通过一般方法(J.Soc.Cosmet.Japan.22，35～42(1988))或通过本发明的纯化方法分离和纯化。链球菌KL0188产生约6.0～7.5g/L的透明质酸，其平均分子量高达4,000,000Da或以上。
因此，根据本发明，链球菌KL0188可以低成本、高产量生产透明质酸，并且透明质酸还可通过较简单的方法纯化。此外，由此生产的透明质酸可用于化妆品或医疗剂或补助剂。
与现有的使用表面活性剂的透明质酸沉淀法不同，本发明的纯化方法包括如下步骤：生产透明质酸的微生物菌株的培养液经活性炭处理、芳族吸附树脂处理、超滤作用及乙醇沉淀作用。
从三菱公司购得的苯乙烯二乙烯苯型树脂可用作芳族吸附树脂。具体地说，所述树脂选自HP10、HP20(苯乙烯和二乙烯苯共聚物)、HP21、HP30、SP800、SP825、SP850、SP875、SP205、SP206和SP207(溴化聚苯乙烯)，并优选使用HP20或SP207。
任何将透明质酸作为代谢产物生成的菌株均可用作生产透明质酸的菌株，并且典型地，可使用链球菌。链球菌微生物包括脓链球菌、粪链球菌、停乳链球菌、兽瘟链球菌、马链球菌、类马链球菌和链球菌KL0188(KCTC10248BP)。生产透明质酸的菌株可通过一般的培养方法培养以制备含有透明质酸的培养液。
更具体地，透明质酸的纯化方法包括如下步骤：(a)由生产透明质酸的菌株的培养液制备培养滤液；(b)向培养滤液中加入芳族吸附树脂，搅拌，并进行超滤以制备透明质酸溶液；以及(c)向透明质酸的水溶液中加入有机溶剂以使透明质酸或其盐沉淀，并干燥沉淀。上述方法还包括在步骤(a)或(b)后向培养滤液中或透明质酸的水溶液中加入活性炭并搅拌，然而除去活性炭。
在步骤(a)中，向培养液中加入硫酸月桂酯和福尔马林并搅拌，由此从细菌表面分离透明质酸并同时使细菌失活。然后，将培养液离心以分离上层清液或过滤以得到滤液。
将培养滤液滴定到pH为7.5～8.5后进行步骤(b)，并加入0.1～10wt％的芳族吸附树脂。加入芳族吸附树脂后，在4～10℃搅拌混合滤液以吸附内毒素，然后过滤以获得已除去吸附树脂的滤液。滤液经超滤除去各种培养基组分和无机盐。可使用分子量截留值(cut-off)为10,000～100,000Da的滤膜进行超滤。
在步骤(c)中，通过一般的有机溶剂沉淀法使透明质酸或其盐沉淀。诸如丙酮、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇或乙腈等水性有机溶剂可用作有机溶剂，并优选使用乙醇。向透明质酸的水溶液中加入NaCl使NaCl浓度为0.5～3M，溶液过滤并向滤液中加入1～5倍于滤液体积的有机溶剂以沉淀透明质酸及其盐。然后用70％的乙醇洗涤沉淀并干燥。
活性炭处理可在步骤(a)或(c)后进行。具体而言，向步骤(a)的培养滤液中或步骤(b)的透明质酸中加入0.1～3(w/v)的NaCl，然后加入0.1～10(w/v)的活性炭。活性炭用于吸附蛋白质或核酸以将其除去。
与常规方法相比，本发明的透明质酸的纯化方法可有效除去发热物质、蛋白质、核酸和金属杂质，并可将有机溶剂沉淀操作的频率降到最低，从而通过简单经济的纯化方法制得高纯度的透明质酸。故而，由本发明的纯化方法纯化的透明质酸纯度高达99％，并因此可用于化妆品和药品。
参考下列实施例描述本发明。然而，所述实施例仅用于示例本发明并且本发明并不受其限制。
                实施例1：突变菌株的筛选
在兽瘟链球菌中引起突变以选择出具有非溶血性能并且无透明质酸酶活性的突变菌株。
将兽瘟链球菌(KCTC 3318)接种到50ml的从DIFCO公司购得的Baco Todd Hewitt Broth中并在37℃培养直至出现代数生长期(algebraic growth period)。然后，取1ml的培养液在低温下离心以回收沉淀下来的细胞，向其中加入50mM的Tris-马来酸缓冲溶液(pH6.0)并洗涤两次。
细胞以1×103个/ml的浓度分散在缓冲溶液中，使NTG(N-甲基-N’-亚硝基胍)以200μg/ml的浓度与上述溶液混合。混合物在37℃搅拌30分钟，然后用50mM的Tris-马来酸缓冲溶液(pH 6.0)洗涤细胞两次。将细胞接种到Todd Hewitt Broth中并在37℃培养18小时。得到的培养液用无菌盐水溶液稀释到浓度为1×103个细胞/ml，然后取0.1ml稀释溶液在血琼脂(Blood Agar)中培养以选择出不表现溶血性的菌落。
通过与上述相同的方法在选择出的非溶血性突变菌株上引起突变以选择无透明质酸酶活性的菌株。将非溶血性突变菌株涂覆在含有400μg透明质酸和1％白蛋白V组分的Todd Hewitt Agar Broth上以形成单菌落。在湿培养箱中于37℃静置培养(standing culture)2～5天，然后加入10ml 2N的醋酸盐溶液并静置10分钟。选择出表现出快速生长并大量形成粘性物质的菌落。
将选择出的菌落分别接种到1.5L的透明质酸生产培养基中，并在35℃，pH为6.95～7.05下有氧培养20小时。回收培养液并使用数字粘度计(Brookfield DVII+，4转，30rpm)在25℃测量绝对粘度。部分溶液用有机溶剂沉淀后溶于蒸馏水中，通过咔唑法(Z.Dische，J.Biol.Chem.167，189(1949))确定透明质酸的产量，从而选择出其培养液绝对粘度高并且透明质酸产量高的菌株。
通过分析16S rDNA的氨基酸序列(Jukes，T.H.&C.R.，(1969).In mammalian protein metabolism，21～132页；H.N.Munro编辑.Saito，N.和Nei，M(1987)Mol Biol第4卷，406～425)鉴别选择出的菌株。由此选择出的菌株经鉴别为链球菌，因而命名为链球菌KL0188。链球菌KL0188于2002年5月10日由韩国典型菌种保藏中心保藏，保藏号为KCTC10248BP。
            实施例2：透明质酸生产率的检验
培养链球菌KL0188以测量透明质酸的生产效率以及所生产的透明质酸的分子量。
将分离出的微生物接种到100ml的Todd Hewitt Broth中并在35℃培养直至出现代数生长期，然后将其用作第一种子培养液。将第一种子培养液接种到1L的胰胨豆胨培养液(美国Difco)中并在35℃培养直至出现代数生长期，然后将其用作第二种子培养液。
在30L的发酵罐中，加入含有60g/L的葡萄糖、5g/L的酵母提取物、17g/L的酪蛋白胨、7g/L的谷氨酸、0.7g/L的硫酸镁、2.5g/L的磷酸氢二钾和5.0g/L的氯化钠的透明质酸生产培养基并灭菌，然后在其中接种1000ml的第二种子培养液。保持培养液的pH在6.95～7.05的范围内，温度为35℃，换气量为1.0VVM的同时进行有氧培养。
培养过程中，取部分样品并测量培养液的粘度，继续培养直至粘度不再增大。通过测量确定培养液的粘度在培养20小时后不再增大，然后停止培养。最大粘度为约20,000cps。
通过已知的分离和纯化方法(J.Soc.Cosmet.Japan.22，35～42(1988))回收存在于培养液中的透明质酸。通过咔唑法(Z.Dische，J.Biol.Chem.167，189(1947))测定透明质酸的量并通过毛细管粘度计法(Narlin，Analytical Biochemistry 147，347～395(1985))测量所生产的透明质酸的平均分子量。结果，证实透明质酸的产量为7.0g/L，其平均分子量为5,500,000Da。
      比较例1：兽瘟链球菌的透明质酸生产率的检验
通过实施例中2相同的方法培养兽瘟链球菌(KCTC3318)并测量透明质酸的生产率和分子量。
24小时后，培养液的粘度不再增大并从而停止培养。测得的粘度为约4000cps，透明质酸的生产率为3.0g/L，其平均分子量为2,500,000Da。
已证实与兽瘟链球菌相比，本发明的链球菌KL0188具有优良的透明质酸生产率并且所生产的透明质酸的分子量高。
本发明的链球菌KL0188是非溶血性菌株，并以高产量生产高分子量的透明质酸。因此，由链球菌KL0188生产的透明质酸可用于化妆品或药品。
        实施例3：使用芳族吸附树脂SP207纯化透明质酸
3-1生产透明质酸的菌株的制备
将链球菌KL0188(KCTC10248BP)接种到100ml的Todd HewittBroth中并在35℃培养直至出现代数生长期，然后将其用作第一种子培养液。将第一种子培养液接种到1L的胰胨豆胨培养液(美国Difco)中并在35℃培养直至出现代数生长期，然后将其用作第二种子培养液。
向30L的发酵罐中加入20L含有60g/L的葡萄糖、5g/L的酵母提取物、17g/L的酪蛋白胨、7g/L的谷氨酸、0.7g/L的硫酸镁、2.5g/L的磷酸氢二钾和5.0g/L的氯化钠的透明质酸生产培养基并灭菌，然后在其中接种1000ml的第二种子培养液。在pH为6.95～7.05，温度为35℃下培养20小时。
3-2培养滤液的制备
稀释透明质酸培养液使透明质酸的浓度变为0.1～0.2％。向其中加入0.02％的硫酸月桂酯和0.05％的福尔马林溶液并搅拌3小时。然后，通过离心或过滤除去细菌以制备培养滤液。
3-3SP207树脂处理
滴定培养滤液使其pH变为7.5～8.5，加入3(w/v)％的芳族吸附树脂SP207，在4～10℃搅拌3小时以吸附发热物质。然后，过滤经吸附树脂处理过的溶液即得到已除去吸附树脂的滤液，并进行超滤。
3-4活性炭处理
向滤液中加入0.9(w/v)％的NaCl和3(w/v)％的活性炭并搅拌2小时以使蛋白质和核酸等吸附到活性炭中。然后，过滤即得到已除去活性炭的透明质酸水溶液。
3-5乙醇沉淀
向透明质酸水溶液中加入NaCl以使其浓度变为1M，然后用0.2μm的过滤器过滤溶液。接着，加入1.5～3倍于溶液体积的乙醇以沉淀透明质酸及其盐，然后用70％的乙醇洗涤数次。在无菌条件下干燥沉淀即得到透明质酸及其盐。
     实施例4：使用芳族吸附树脂HP20纯化透明质酸
通过实施例3中相同的方法纯化透明质酸及其盐，但使用HP20作为吸附树脂。
实施例5：在活性炭处理后使用芳族吸附树脂SP207纯化透明质酸
通过实施例3中相同的方法纯化透明质酸及其盐，但在活性炭处理后进行SP207吸附。
实施例6：在活性炭处理后使用芳族吸附树脂HP20纯化透明质酸
通过实施例4中相同的方法纯化透明质酸及其盐，但在活性炭处理后进行HP20吸附。
          实施例7：使用SP207纯化透明质酸
通过实施例3中相同的方法纯化透明质酸及其盐，但使用兽瘟链球菌(KCTC3318)作为生产透明质酸的菌株。
                       比较例2
通过实施例3中相同的方法纯化透明质酸及其盐，但省略芳族树脂吸附步骤。
             实验例：透明质酸纯化产量的测量
测量由实施例3～7及比较例的方法纯化的透明质酸及其盐的纯度。
A.透明质酸的产量：通过改进的咔唑法测定透明质酸的产量，并对初始体积和最终体积进行比较。
B.发热物质的测量：将透明质酸及其盐溶于含有等于或小于0.001EU/ml发热物质的水中使其密度变为1.5g/L，然后使用从Charles River Endosafe购得的LAL(鲎试剂，Limulus AmebocyteLysate)按照该产品所附手册进行分析。分析值以每毫克透明质酸中存在的内毒素单位(EU)表示。
C.纯度试验：通过咔唑法(Anal.Biochem.，4，330(1962))进行纯度试验。
D.蛋白质含量：通过劳拉法(Lowry method)测量蛋白质的含量。
E.核酸含量：将透明质酸及其盐溶于盐水溶液中使其浓度为1％，然后在260nm测量其吸光度。
结果如下表1所示。
(表1)
测量项目   结果
  实施例3   实施例4   实施例5   实施例6   实施例7   比较例2
  产量   78％   80％   82％   79％   78％   79％
  纯度(％)   99.0   99.0   99.0   99.0   99.0   95
  发热物质(EU/mg) ＜0.005 ＜0.005 ＜0.005 ＜0.005 ＜0.005 0.1
  蛋白质(％)   ＜0.01％   ＜0.01％   ＜0.01％   ＜0.01％   ＜0.01％   0.2
  核酸   未测到   未测到   未测到   未测到   未测到   0.1％
  分子量(百万Da)   5.3   5.2   5.5   5.4   2.5   5.4
金属离子  铁(ppm)   ＜1ppm   ＜1ppm   ＜1ppm   ＜1ppm   ＜1ppm   ＜1ppm
 铅(ppm)   ＜1ppm   ＜1ppm   ＜1ppm   ＜1ppm   ＜1ppm   ＜1ppm
 砷(ppm)   ＜1ppm   ＜1ppm   ＜1ppm   ＜1ppm   ＜1ppm   ＜1ppm
从表1中可看出，由实施例1～7纯化的透明质酸及其盐纯度高达99％。而同时，由比较例纯化的透明质酸纯度仅为95％。此外，实施例3～7的透明质酸及其盐中发热物质、蛋白质和核酸的含量比比较例低很多。

Claims (3)

1.一种链球菌KCTC 10248BP，所述链球菌产生分子量为5,500,000Da的透明质酸，但是不表达透明质酸酶，并表现出非溶血性能。
2.一种纯化透明质酸及其盐的方法，其特征在于所述方法包括：
(a)由权利要求1的链球菌KCTC 10248BP的培养液制备培养滤液；
(b)向培养滤液中加入芳族吸附树脂，搅拌，并进行超滤以制备已除去发热物质的透明质酸的水溶液；
(c)向透明质酸的水溶液中加入有机溶剂以沉淀透明质酸及其盐，并干燥沉淀，
其中所述方法还包括在步骤(a)或(b)后向培养滤液中或透明质酸的水溶液中加入活性炭以除去蛋白质或核酸的步骤，以及除去活性炭的步骤。
3.权利要求2的纯化透明质酸及其盐的方法，其特征在于芳族吸附树脂是苯乙烯和二乙烯苯的共聚物或溴化聚苯乙烯。
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