CN117947130B - 一种微生物发酵法生产透明质酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微生物发酵法生产透明质酸的方法，属于微生物发酵技术领域，本发明将马链球菌兽疫亚种种子液接种于含有黄芪提取物和丝氨酸的发酵培养基中，发酵培养，得到含有透明质酸的发酵液；发酵培养过程中，通过分批补料的方式向发酵培养基中加入N‑乙酰氨基葡萄糖和尿苷二磷酸。本发明通过向培养基中加入黄芪提取物和丝氨酸，并向发酵培养基中补充N‑乙酰氨基葡萄糖和尿苷二磷酸，黄芪提取物的加入提高了马链球菌兽疫亚种的菌活性；丝氨酸的加入有利于碳酸流向HA合成的支路，减少了乳酸的合成；N‑乙酰氨基葡萄糖和尿苷二磷酸的加入缓解了菌体自身细胞生长和HA合成的底物竞争，进一步提高了透明质酸的产量。

Description

一种微生物发酵法生产透明质酸的方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种微生物发酵法生产透明质酸的方法。

背景技术

透明质酸（hyaluronic acid，简称HA）又被叫做玻尿酸、玻璃酸等，是一种常见的大分子粘多糖。天然透明质酸都来自于动物和微生物，动物体的各个部位都含有不同量的透明质酸，其中含量较多的有结缔组织、关节液、玻璃体、脐带和皮肤等。微生物主要存在于菌体的外荚膜中。透明质酸具有保湿、抗炎、促进细胞再生等强大的生理功能，已被开发并广泛应用于食品、医疗、美容等领域中。工业上透明质酸的生产方法以微生物发酵法和动物组织提取法最为常见。由于动物组织提取法存在提取率低、质量差、污染性高等缺点，导致该方法在目前市场中占有率很小，并有逐渐被微生物发酵法完全替代的趋势。目前工业上透明质酸生产的主要菌株是马链球菌兽疫亚种（兽疫链球菌（S. zooepidemicus））。兽疫链球菌荚膜层天然包含透明质酸，利用兽疫链球菌发酵生产透明质酸具有发酵周期短，生产强度大，产物提纯简便等优点。同时，兽疫链球菌发酵生产获得的透明质酸分子量高，可以在体外降解为低分子量透明质酸及透明质酸寡糖等，更具应用价值。因此，提高兽疫链球菌的透明质酸生产水平具有重要意义。

但是，利用兽疫链球菌发酵制备透明质酸存在诸多问题。文献《透明质酸的生物合成及其代谢工程的研究进展》中提到，在透明质酸生物合成过程中，存在前体底物和HA产物之间不平衡的问题，HA合成的两个合成前体D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖同时也是用于菌体细胞壁生物合成的前体，因此菌体自身的细胞生长和HA合成存在底物的竞争，此外HA合成过程中会产生乳酸等副产物，需要消耗大量的碳源，严重影响了HA底物的利用，从而影响透明质酸的产量。文献《发酵法生产透明质酸的诱变育种及分子量可控工艺研究》中也提到，从链球菌合成HA途径中可知，一方面，碳源产生的果糖-6-磷酸也会被用来合成乳酸，研究表明，乳酸会抑制菌体的生长和HA合成。另一方面，葡萄糖-1-磷酸、尿苷-葡萄糖和尿苷二磷酸-N-酰基-氨基葡萄糖也会被用于合成细胞壁，说明HA合成和细胞生长繁殖之间存在竞争关系，因此抑制乳酸的合成和转变代谢途径对于提高HA的产量具有重要的意义。针对上述问题，现有技术中多采用基因工程的方式对菌株进行改造以提高透明质酸的产量，但工程菌异源表达透明质酸的技术并不成熟，透明质酸产量低，分子量低，应用十分受限，不具备工业化发酵的条件。

专利CN107653280A公开了一种透明质酸发酵用的组合物、培养基和方法及其应用，所述组合物包括N-乙酰葡糖胺和天冬氨酸，还含有尿嘧啶及其衍生物中的一种或几种，通过向培养基中补充HA合成的前体物质，可以有效的缓解HA合成过程中，由于竞争性前体物质缺乏导致的HA合成乏力的问题，而且研究结果表明，通过添加以上前体物质，HA产率可提高10％-40％，解决了在发酵过程中，透明质酸产率低的问题。尽管其相较于空白对照组中透明质酸的产量显著提高，但是通过分析其不同处理的配方以及透明质酸的产量可以看出，对比例4虽然省略了添加天冬氨酸，但是其透明质酸的产量在14h后反而高于实施例2和实施例5中透明质酸产量；另外由于其在初始培养基中补充HA合成的前体物质，因此HA在发酵前期产量快速提高，但是在发酵到14h以后，HA的产量出现了下降趋势，这可能是由于发酵前期由于发酵培养基中HA合成前体充足，但是在发酵后期由于菌体自身的细胞生长和HA合成存在底物的竞争，透明质酸的合成前体依旧不足导致，从而限制了透明质酸产量的提高。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种微生物发酵法生产透明质酸的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种微生物发酵法生产透明质酸的方法，包括以下步骤：

将马链球菌兽疫亚种种子液接种于含有黄芪提取物和丝氨酸的发酵培养基中，发酵培养，得到含有透明质酸的发酵液；

发酵培养过程中，通过分批补料的方式向发酵培养基中加入N-乙酰氨基葡萄糖和尿苷二磷酸。

作为优选，马链球菌兽疫亚种种子液的接种量为发酵培养基体积的7%-15%；马链球菌兽疫亚种种子液的活菌数≥1×10⁹cfu/ml。

作为优选，发酵培养的条件为：

搅拌转速为300-500rpm，通气速度为1.0-2.0vvm，培养温度为35-40℃，培养时间为16-18h，通过加入5 mol/L NaOH调整发酵培养基的PH为7.0-7.5。

作为优选，在发酵至6、10、14h时，分别向发酵培养基中加入初始发酵培养基质量分数0.5-1%的N-乙酰氨基葡萄糖和0.5-1%的尿苷二磷酸。

作为优选，发酵培养基中，黄芪提取物的含量为10-30g/L，丝氨酸的含量为2-3g/L。

作为优选，所述发酵瓶培养基的组成为：

葡萄糖80-100 g/L，蛋白胨10-15g/L，酵母浸粉10-15g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5-2.5g/L，K₂HPO₄·3H₂O 1.5-2 g/L，黄芪提取物 10-30g/L，丝氨酸 2-3g/L。

作为优选，所述黄芪提取物由如下方法制备而成：

将黄芪根干燥、粉碎后过筛，得到黄芪粉末，向黄芪粉末中加水混匀，采用高压协同微波法提取，过滤，得到水提液；将水提液浓缩、干燥得到黄芪提取物。

作为优选，黄芪粉末和水的料液比为1g：（15-25）ml。

作为优选，高压协同微波提取的条件为：压力为10-30Mpa，温度为 60-70℃，微波提取的功率为 400-500W，提取时间为10-30min。

本发明的有益效果：

本发明通过向培养基中加入黄芪提取物和丝氨酸，并在发酵培养过程中向发酵培养基中补充HA合成的前体物质N-乙酰氨基葡萄糖和尿苷二磷酸，黄芪提取物的加入提高了马链球菌兽疫亚种的菌活性，提高了发酵过程中的菌体浓度；丝氨酸的加入不仅有利于菌体的生长，还有利于碳酸流向HA合成的支路，减少了乳酸的合成，从而促进透明质酸的合成；N-乙酰氨基葡萄糖和尿苷二磷酸的加入缓解了菌体自身细胞生长和HA合成的底物竞争，并促进了发酵后期HA的合成，进一步提高了透明质酸的产量。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术所述，利用兽疫链球菌发酵制备透明质酸存在诸多问题，其中最主要的问题就是透明质酸生物合成过程中，菌体自身的细胞生长和透明质酸合成存在底物的竞争，因此存在前体底物和透明质酸产物之间不平衡的问题，因此如何缓解透明质酸合成与菌体自身细胞之间生长之间的竞争而影响透明质酸合成的问题对于提高透明质酸的产量至关重要。现有技术中，为了解决该问题，多采用基因工程的方式对菌株进行改造，以调控HA合成前体UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc相关基因的表达，从而促进HA合成前体的合成以提高透明质酸的产量，但是由于基因工程菌异源表达透明质酸的技术并不成熟，透明质酸产量低，应用十分受限，不具备工业化发酵的条件。专利CN107653280A选择向发酵培养基中直接投入HA合成的前体物质，虽然在HA发酵前期，透明质酸产量显著提高，但是在发酵后期HA的合成依旧会受到限制。

基于此，本发明提供了一种微生物发酵法生产透明质酸的方法，本发明从培养基和培养条件上进行优化，从提高菌体量以及补充合成前提两个方面出发。由于本发明用的菌株马链球菌兽疫亚种是是一种营养缺陷型的菌株，对营养要求很高，不能提供一些生长必需的物质，因此需要向培养基中添加营养物质以促进菌体的生长。发明人参阅文献发现向培养基中加入丝氨酸能够促进HA的合成，但是其菌体量不如对照组高，这可能是由于加入丝氨酸能够调整碳源的流向，但是受限于菌体量的减少，因此HA的产量提高并不是很明显。因此发明人参考了大量文献发现，一些中药提取物可以促进某些菌株的生长，例如扶正固本类中草药可以促进双歧杆菌的生长，因此发明人选取了多种中草药，莱藻子、娅葫芦、猪筌、马勃、阿胶等，验证其提取物对马链球菌兽疫亚种生长的作用，发现黄芪可以促进马链球菌兽疫亚种的生长。而后为了提高透明质酸的产量，菌体量增大之后，其代谢产物透明质酸产量也会更高，但是菌体自身所需的营养物质也会增加，以及菌体和HA合成之间对底物的竞争会更加激烈，因此发明人通过考察发酵的不同时期，菌体量和透明质酸合成之间的关系，研究了在发酵过程中的不同时间向培养基中加入补充HA合成的前体物质N-乙酰氨基葡萄糖和尿苷二磷酸，发现在6、10、14h时加入HA合成前体，有利于透明质酸后期合成产量的提升。

因此，发明人通过在发酵培养基中加入丝氨酸和黄芪提取物，以及在发酵过程中向发酵培养基中补充HA的合成前体N-乙酰氨基葡萄糖和尿苷二磷酸，发现其对于提高丝氨酸、黄芪提取物以及N-乙酰氨基葡萄糖和尿苷二磷酸对于提高透明质酸的产量具有协同作用。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

其中，本发明所用马链球菌兽疫亚种（又称兽疫链球菌，Streptococcus Equi Subsp. Zooepidemicus）的菌株编号为ATCC 39920，购买于上海复祥生物科技有限公司。

本发明所用马链球菌兽疫亚种种子液由如下方法制备而成：

（1）菌种活化：将马疫链球菌兽疫亚种接种于固体活化培养基，于37℃培养16小时进行活化培养；

（2）种子培养：将活化后的马疫链球菌兽疫亚种按照10%（体积分数）的接种量接种于液体活化培养基中，在37℃下培养16h，得到马疫链球菌兽疫亚种种子液；

马疫链球菌兽疫亚种种子液的活菌数为1×10⁹cfu/ml。

固体活化培养基：葡萄糖5 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2 g/L，琼脂20 g/L，pH=7.5，115℃灭菌30 min。

液体活化培养基：葡萄糖5 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2 g/L，pH=7.5，115℃灭菌30 min。

本发明所用黄芪提取物由如下方法制备而成：

将黄芪根干燥、粉碎后过筛，得到黄芪粉末，向黄芪粉末中加水混匀，黄芪粉末和水的料液比为1g：20ml；

采用高压协同微波法提取，高压协同微波提取的条件为：压力为10Mpa，温度为 65℃，微波提取的功率为 400W，提取时间为20min；提取后过滤，得到水提液；将水提液浓缩、干燥得到黄芪提取物。

实施例1：

将马链球菌兽疫亚种种子液按照10%（体积分数）的接种量接种于发酵培养基中，进行发酵培养18h，得到含有透明质酸的发酵液；

发酵培养的条件为：搅拌转速为400rpm，通气速度为2.0vvm，培养温度为37℃，分别在发酵至6、10、14h时进行三次补料，每一次补料所加入的物质均为N-乙酰氨基葡萄糖和尿苷二磷酸，每一次补料加入N-乙酰氨基葡萄糖和尿苷二磷酸的量均为初始培养基质量的0.5%；在整个发酵过程中通过加入5 mol/L NaOH调整发酵体系的PH为7.0-7.5。

本实施例中，发酵瓶培养基的组成为：

葡萄糖100 g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉10g/L，MgSO₄·7H₂O 2g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2g/L，黄芪提取物 10g/L，丝氨酸 2g/L。

实施例2：

将马链球菌兽疫亚种种子液按照10%（体积分数）的接种量接种于发酵培养基中，进行发酵培养18h，得到含有透明质酸的发酵液；

发酵培养的条件为：搅拌转速为400rpm，通气速度为2.0vvm，培养温度为37℃，分别在发酵至6、10、14h时进行三次补料，每一次补料所加入的物质均为N-乙酰氨基葡萄糖和尿苷二磷酸，每一次补料加入N-乙酰氨基葡萄糖和尿苷二磷酸的量均为初始培养基质量的0.75%；在整个发酵过程中通过加入5 mol/L NaOH调整发酵体系的PH为7.0-7.5。

本实施例中，发酵瓶培养基的组成为：

葡萄糖100 g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉10g/L，MgSO₄·7H₂O 2g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2g/L，黄芪提取物 20g/L，丝氨酸 2.5g/L。

实施例3：

将马链球菌兽疫亚种种子液按照10%（体积分数）的接种量接种于发酵培养基中，进行发酵培养18h，得到含有透明质酸的发酵液；

发酵培养的条件为：搅拌转速为400rpm，通气速度为2.0vvm，培养温度为37℃，分别在发酵至6、10、14h时进行三次补料，每一次补料所加入的物质均为N-乙酰氨基葡萄糖和尿苷二磷酸，每一次补料加入N-乙酰氨基葡萄糖和尿苷二磷酸的量均为初始培养基质量的1%；在整个发酵过程中通过加入5 mol/L NaOH调整发酵体系的PH为7.0-7.5。

本实施例中，发酵瓶培养基的组成为：

葡萄糖100 g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉10g/L，MgSO₄·7H₂O 2g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2g/L，黄芪提取物 30g/L，丝氨酸3g/L。

对比例1：

将马链球菌兽疫亚种种子液按照10%（体积分数）的接种量接种于发酵培养基中，进行发酵培养18h，得到含有透明质酸的发酵液；

发酵培养的条件为：搅拌转速为400rpm，通气速度为2.0vvm，培养温度为37℃，分别在发酵至6、10、14h时进行三次补料，每一次补料所加入的物质均为N-乙酰氨基葡萄糖和尿苷二磷酸，每一次补料加入N-乙酰氨基葡萄糖和尿苷二磷酸的量均为初始培养基质量的0.5%；在整个发酵过程中通过加入5 mol/L NaOH调整发酵体系的PH为7.0-7.5。

本对比例中，发酵瓶培养基的组成为：

葡萄糖100 g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉10g/L，MgSO₄·7H₂O 2g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2g/L。

本对比例和实施例1的区别在于：发酵培养基中省略了黄芪提取物和丝氨酸。

对比例2：

将马链球菌兽疫亚种种子液按照10%（体积分数）的接种量接种于发酵培养基中，马链球菌兽疫亚种种子液的活菌数为1×10⁹cfu/ml；

发酵培养的条件为：搅拌转速为400rpm，通气速度为2.0vvm，培养温度为37℃，在整个发酵过程中通过加入5 mol/L NaOH调整发酵体系的PH为7.0-7.5。

本对比例中，发酵瓶培养基的组成为：

葡萄糖100 g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉10g/L，MgSO₄·7H₂O 2g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2g/L，黄芪提取物 10g/L。

本对比例和实施例1的区别在于：在发酵过程中不添加HA的合成前体N-乙酰氨基葡萄糖和尿苷二磷酸，发酵培养基中省略了丝氨酸。

对比例3：

将马链球菌兽疫亚种种子液按照10%（体积分数）的接种量接种于发酵培养基中，马链球菌兽疫亚种种子液的活菌数为1×10⁹cfu/ml；

发酵培养的条件为：搅拌转速为400rpm，通气速度为2.0vvm，培养温度为37℃，在整个发酵过程中通过加入5 mol/L NaOH调整发酵体系的PH为7.0-7.5。

本对比例中，发酵瓶培养基的组成为：

葡萄糖100 g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉10g/L，MgSO₄·7H₂O 2g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2g/L，丝氨酸 2g/L。

本对比例和实施例1的区别在于：在发酵过程中不添加HA的合成前体N-乙酰氨基葡萄糖和尿苷二磷酸，发酵培养基中省略了黄芪提取物。

对比例4：

将马链球菌兽疫亚种种子液按照10%（体积分数）的接种量接种于发酵培养基中，马链球菌兽疫亚种种子液的活菌数为1×10⁹cfu/ml；

发酵培养的条件为：搅拌转速为400rpm，通气速度为2.0vvm，培养温度为37℃，在整个发酵过程中通过加入5 mol/L NaOH调整发酵体系的PH为7.0-7.5。

本对比例中，发酵瓶培养基的组成为：

葡萄糖100 g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉10g/L，MgSO₄·7H₂O 2g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2g/L。

本对比例和实施例1的区别在于：在发酵过程中不添加HA的合成前体N-乙酰氨基葡萄糖和尿苷二磷酸，发酵培养基中省略了黄芪提取物和丝氨酸。

试验例1：

在实施例1-3 和对比例 1-4的发酵过程中，分别在12、14、16、18h进行取样，参照文献《Jin P, Kang Z, Yuan PH, et al. Production of specific-molecular-weighthyaluronan by metabolically engineered Bacillus subtilis 168. Metab Eng,2016, 35: 21–30.》中提到的Bitter-Muir氏法检测发酵液中透明质酸的产量，结果如表 1所示。

表1 不同处理组透明质酸的产量（g/L）

由表 1 可以看出，本发明向发酵培养基中加入黄芪提取物和丝氨酸，并在发酵过程中补充N-乙酰氨基葡萄糖和尿苷二磷酸，透明质酸的产量在14h后仍旧能够显著提高，对比例1在发酵过程中补充N-乙酰氨基葡萄糖和尿苷二磷酸，虽然在发酵后期，透明质酸的产量也在提高，但是其产量显著低于实施例1。对比例2和对比例3分别在发酵培养基中加入黄芪提取物和丝氨酸，对于提高透明质酸的产量有一定的优势，但是产量提升的幅度并不大。在发酵至18h时，实施例1相较对比例4透明质酸产量提高了75.1%，对比例1相较于对比例4透明质酸产量提高了44.9%，对比例2相较对比例4透明质酸产量提高了6.7%，对比例3相较对比例4透明质酸产量提高了8.6%，这说明本申请在发酵过程中补充合成前体，以及在发酵培养基中加入黄芪提取物和丝氨酸对于提升透明质酸的产率具有协同增效作用。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种微生物发酵法生产透明质酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将马链球菌兽疫亚种种子液接种于含有黄芪提取物和丝氨酸的发酵培养基中，发酵培养，得到含有透明质酸的发酵液；

发酵培养过程中，通过分批补料的方式向发酵培养基中加入N-乙酰氨基葡萄糖和尿苷二磷酸；

所述发酵培养基的组成为：

葡萄糖100 g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉10g/L，MgSO₄·7H₂O 2g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2 g/L，黄芪提取物 10g/L，丝氨酸 2g/L；

在发酵至6、10、14h时，分别向发酵培养基中加入初始发酵培养基质量分数0.5%的N-乙酰氨基葡萄糖和0.5%的尿苷二磷酸；

所述黄芪提取物由如下方法制备而成：

将黄芪根干燥、粉碎后过筛，得到黄芪粉末，向黄芪粉末中加水混匀，采用高压协同微波法提取，过滤，得到水提液；将水提液浓缩、干燥得到黄芪提取物；

黄芪粉末和水的料液比为1g：20ml；

高压协同微波提取的条件为：压力为10Mpa，温度为 65℃，微波提取的功率为 400W，提取时间为20min。

2.根据权利要求1所述的一种微生物发酵法生产透明质酸的方法，其特征在于，马链球菌兽疫亚种种子液的接种量为发酵培养基体积的10%；马链球菌兽疫亚种种子液的活菌数为1×10⁹cfu/ml。

3.根据权利要求2所述的一种微生物发酵法生产透明质酸的方法，其特征在于，发酵培养的条件为：

搅拌转速为400rpm，通气速度为2.0vvm，培养温度为37℃，培养时间为18h，通过加入5mol/L NaOH调整发酵培养基的PH为7.0-7.5。