CN114397399B - 测定透明质酸-季铵盐聚合物中季铵盐含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定透明质酸‑季铵盐聚合物中季铵盐含量的方法，所述方法包括：供试品溶液的制备：将透明质酸‑季铵盐聚合物水解得到透明质酸和季铵盐的混合溶液，接着加入盐溶液和乙腈对透明质酸进行沉降，得到的上清液作为供试品溶液；使用离子色谱法测定供试品溶液中游离季铵盐的含量。本发明所述的方法利用高浓度的盐溶液和乙腈的共同作用，降低透明质酸在水溶液中的溶解度，从而能够准确地测定季铵盐的含量，具有较高的检测准确度和分离度。
Description
技术领域
本发明涉及检测技术领域，尤其涉及一种测定透明质酸-季铵盐聚合物中季铵盐含量的方法。
背景技术
透明质酸含有多个活性基团，可进行修饰。季铵盐可以连接到透明质酸的活性基团上形成透明质酸接枝聚合物。2，3-环氧丙基三甲基氯化铵(Glycidyl trimethylammonium chloride，GTA)是一种常用的季铵盐，可以与透明质酸接枝形成HA-GTA聚合物。反应结束后，会有部分GTA残留在产物中，检测产物中残留GTA的含量，即可得到HA-GTA聚合物的纯度。同时，为了验证GTA的接枝率，需要将HA-GTA聚合物分解得到2,3-二羟基丙基-三甲基氯化铵((2,3-Dihydroxypropyl)trimethyl ammonium chlorid，DTA)，通过检测水溶液中的DTA的含量，即可得到HA的接枝率。
现有技术中，还未发现直接用于检测GTA或者DTA的方法，季铵盐作为阳离子，常用离子色谱检测进行检测，利用常规的季铵盐检测方法检测GTA或者DTA会出现拖尾、保留时间飘移等现象，干扰检测精确度。此外，产物中含有透明质酸，需要进行前处理，因透明质酸亲水性强，导致水解后溶液中含有大量的有机糖类，被色谱柱吸附，损害色谱柱寿命，因此，需要对水解液中的透明质酸进行沉降。目前常用的沉降法为醇沉，但是由于聚合物反应改变了透明质酸的性质，导致醇沉法不在适用，需要开发新的检测方法。
发明内容
鉴于上述问题，本发明提供了一种测定季铵盐的方法，特别是透明质酸和季铵盐同时存在的情况下，可以去除透明质酸的干扰，准确测定季铵盐的含量，所述方法还可以用于测定透明质酸-季铵盐聚合物的纯度以及接枝率，所述方法具有较高的检测准确度和分离度。
本发明具体技术方案如下：
1.一种测定透明质酸-季铵盐聚合物中季铵盐含量的方法，其包括：
供试品溶液的制备：将透明质酸-季铵盐聚合物水解得到透明质酸和季铵盐的混合溶液，接着加入盐溶液和乙腈对透明质酸进行沉降，得到的上清液作为供试品溶液；
使用离子色谱法测定供试品溶液中游离季铵盐的含量。
2.根据项1所述的方法，其中，盐溶液和乙腈的体积比在1：4以上，优选为1:4-1:6；
所述盐溶液为氯化钠溶液、硫酸铵溶液或甲酸铵溶液；
所述透明质酸和季铵盐的混合溶液与所述盐溶液和乙腈总体积的体积比为4:3-9。
3.根据项1或2所述的方法，其中，所述季铵盐为2，3-环氧丙基三甲基氯化铵和/或2,3-二羟基丙基-三甲基氯化铵。
4.根据项1-3中任一项所述的方法，其中，色谱柱为羧酸官能化阳离子交换色谱柱，优选为CS12A色谱柱。
5.根据项1-4中任一项所述的方法，其中，流动相为甲磺酸和乙腈，优选的，甲磺酸与乙腈的体积比为60-80:20-40，进一步优选为65-72:28-35；
优选地，甲磺酸的浓度为10-30mmol/L，优选为10-15mmol/L。
6.根据项1-5中任一项所述的方法，其中，流动相流速为0.5-1.5ml/min，优选为0.5-1ml/min。
7.根据项1-6中任一项所述的所述方法，其中，进样量为20-100μL。
8.根据项1-7中任一项所述的方法，其中，柱温为25-40℃，优选为30-35℃。
9.根据项1-8中任一项所述的方法，其中，检测器为电导检测器。
10.根据项1-9中任一项所述的方法，其中，抑制器为阳离子抑制器，所述抑制器流速为流动相流速的1.5-2倍。
11.根据项1-10中任一项所述的方法，其中，采用外标法计算供试品溶液中游离季铵盐的含量。
12.根据项1-11中任一项所述的方法，其中，季铵盐的检出限为0.5-2mg/g。
13.一种供试品溶液的制备方法，其包括：
将透明质酸-季铵盐聚合物水解得到透明质酸和季铵盐的混合溶液，接着加入盐溶液和乙腈对透明质酸进行沉降，得到的上清液为供试品溶液。
14.根据项13所述的制备方法，其中，盐溶液和乙腈的体积比在1：4以上，优选为1:4-6；
所述盐溶液为氯化钠溶液、硫酸铵溶液或甲酸铵溶液；
所述透明质酸和季铵盐的混合溶液与所述盐溶液和乙腈总体积的体积比为4:3-9。
15.根据项13或14所述的制备方法，其中，所述季铵盐为2，3-环氧丙基三甲基氯化铵和/或2,3-二羟基丙基-三甲基氯化铵。
发明的效果
本发明所述的方法可用于透明质酸-季铵盐聚合物纯度的检测以及接枝率的检测。
本发明所述的方法利用高浓度的盐溶液和乙腈的共同作用，降低透明质酸在水溶液中的溶解度，从而能够准确地测定季铵盐的含量，具有较高的检测准确度和分离度。
具体实施方式
下面对本发明做以详细说明。虽然显示了本发明的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然而所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
本发明提供了一种测定透明质酸-季铵盐聚合物中季铵盐含量的方法，其包括：
供试品溶液的制备：将透明质酸-季铵盐聚合物水解得到透明质酸和季铵盐的混合溶液，接着加入盐溶液和乙腈对透明质酸进行沉降，得到的上清液作为供试品溶液；
使用离子色谱法测定供试品溶液中游离季铵盐的含量。
对于上述的水解方法，本发明不作任何限制，其可以使用本领域常规的方法进行水解，例如，使用氢氧化钠溶液对透明质酸-季铵盐聚合物进行水解。
本发明采用上述所述的盐溶液和乙腈对透明质酸进行沉降，能够降低透明质酸在水溶液中的溶解度，使透明质酸最终沉淀下来，从而能够准确测出季铵盐的含量。
本发明使用盐溶液和乙腈对样品进行预处理，并结合离子色谱分析技术得到季铵盐的含量，方法特异性高。
在一个实施方式中，盐溶液和乙腈的体积比在1：4以上，优选为1:4-6；
所述盐溶液为氯化钠溶液、硫酸铵溶液或甲酸铵溶液等；
所述透明质酸和季铵盐的混合溶液与所述盐溶液和乙腈总体积的体积比为4:3-9。
当盐溶液和乙腈的体积比在1：4以上时，透明质酸能够有效沉降，再进行测量季铵盐的含量时，具有较高的准确度。
例如，盐溶液和乙腈的体积比(v盐溶液：v乙腈)可以为1:4、1:5、1:6等。
对于盐溶液中盐的浓度，本发明不作任何限制，一般为浓度大于5％的盐溶液，例如可以为7％的盐溶液。
在一个实施方式中，所述季铵盐为2，3-环氧丙基三甲基氯化铵和/或2,3-二羟基丙基-三甲基氯化铵。
由于2，3-环氧丙基三甲基氯化铵(Glycidyl trimethyl ammonium chloride，GTA)是一种常用的季铵盐，可以与透明质酸(HA)接枝形成HA-GTA聚合物，在在反应过程中，会添加过量的GTA以保证反应的顺利进行，虽然反应结束后使用大量的乙醇冲洗反应产物以除去过量GTA，以纯化产物，但仍会有部分GTA残留在产物中，检测产物中残留GTA的含量，即可得到HA-GTA聚合物的纯度，而对于GTA的接枝率，需要将产物溶于水后加入氢氧化钠水溶液水解，氢氧化钠会使HA和GTA连接的酯键断开，形成2,3-二羟基丙基-三甲基氯化铵((2,3-Dihydroxypropyl)trimethyl ammonium chlorid，DTA)，使聚合物尽可能的全部水解，检测水溶液中的DTA的含量，即可得到HA的接枝率，因此，使用本发明所述的方法既可以检测所得到的含有季铵盐的透明质酸接枝聚合物的纯度，又可以检测透明质酸的接枝率。
在一个实施方式中，色谱柱为羧酸官能化阳离子交换色谱柱，优选为CS12A。
本发明所采用的色谱柱，其可以检测沉降透明质酸后游离季铵盐的含量，并且本发明所述的前处理方法能够防止亲水性强的透明质酸随水进入离子色谱柱，影响色谱柱的柱效以及使用寿命，使用外接水系统可以避免长期使用有机溶剂对离子色谱抑制器造成损伤的问题，能够更有效地检测季铵盐。
在一个实施方式中，流动相为甲磺酸和乙腈，优选的，甲磺酸与乙腈的体积比为60-80:20-40，进一步优选为65-72:28-35；进一步优选为70:30；
优选地，甲磺酸的浓度为10-30mmol/L，优选为10-15mmol/L。
例如甲磺酸与乙腈的体积比(v甲磺酸：v乙腈)可以为60:40、65:35、70:30、80:20等。
甲磺酸的浓度可以为10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、25mmol/L、30mmol/L等。
本发明所述的流动相采用甲磺酸和乙腈，由于用甲磺酸作为流动相，其能够分离样品中的简单阳离子，但是用于分离季铵盐时，会出现拖尾现象，且随着季铵盐的浓度增高，保留时间会减小，漂移过大，而加入乙腈，可以对峰形进行优化。
而对于乙腈的用量，浓度过高会影响抑制器的稳定性，因此，在使用离子色谱法测定透明质酸中的季铵盐的含量时，采用外接水系统，能够有效地防止长期使用有机相会对离子色谱抑制器造成损伤的问题。
在一个实施方式中，流动相流速为0.5-1.5ml/min，优选为0.5-1ml/min。
例如，流动相流速可以为0.5ml/min、0.6ml/min、0.7ml/min、0.8ml/min、0.9ml/min、1.0ml/min、1.1ml/min、1.2ml/min、1.3ml/min、1.4ml/min、1.5ml/min等。
在一个实施方式中，进样量为20-100μL，优选为25μL。
在一个实施方式中，柱温为25-40℃，优选为30-35℃，进一步优选为30℃。
例如，柱温可以为25℃、30℃、35℃、40℃等。
在一个实施方式中，检测器为电导检测器。
在一个实施方式中，抑制器为阳离子型抑制器，所述抑制器流速为流动相流速的1.5-2倍，优选地，为了减少乙腈对于抑制器的影响，抑制器电流设置增加5-10mA。
本发明采用上述所述的方法，能够更加准备地测定季铵盐的含量。
在一个实施方式中，采用外标法计算供试品溶液中游离季铵盐的含量。
在一个实施方式中，季铵盐的检出限为0.5-2mg/g。
在一个实施方式中，使用液相色谱检测上清液中的残余HA的含量，以验证前处理方法对于HA的沉降效果，检测证明该前处理方法对于透明质酸的沉降率可达90％以上。
使用上述所述的方法检测这样的溶液，透明质酸不易干扰色谱柱，使得测定结果更加准确。使用的色谱柱可以长期运行，也不会出现堵塞等情况，不需要经常对色谱柱等进行清洗。
在一个实施方式中，所述方法包括供试品溶液的制备：将透明质酸-季铵盐聚合物水解得到透明质酸和季铵盐的混合溶液，接着加入盐溶液和乙腈对透明质酸进行沉降，得到的上清液作为供试品溶液；使用离子色谱法测定供试品中季铵盐的含量。在一个实施方式中，盐溶液和乙腈的体积比在1：4以上，优选为1:4-1:6；所述盐溶液为氯化钠溶液、硫酸铵溶液或甲酸铵溶液；所述透明质酸和季铵盐的混合溶液与所述盐溶液和乙腈总体积的体积比为4:3-9。
在一个实施方式中，所述方法包括供试品溶液的制备：将透明质酸-季铵盐聚合物水解得到透明质酸和季铵盐的混合溶液，接着加入盐溶液和乙腈对透明质酸进行沉降，得到的上清液作为供试品溶液；使用离子色谱法测定供试品中季铵盐的含量。在一个实施方式中，盐溶液和乙腈的体积比在1：4以上，优选为1:4-1:6；所述盐溶液为氯化钠溶液、硫酸铵溶液或甲酸铵溶液；所述透明质酸和季铵盐的混合溶液与所述盐溶液和乙腈总体积的体积比为4:3-9。在一个实施方式中，所述季铵盐为2，3-环氧丙基三甲基氯化铵和/或2,3-二羟基丙基-三甲基氯化铵。
在一个实施方式中，所述方法包括供试品溶液的制备：将透明质酸-季铵盐聚合物水解得到透明质酸和季铵盐的混合溶液，接着加入盐溶液和乙腈对透明质酸进行沉降，得到的上清液作为供试品溶液；使用离子色谱法测定供试品中季铵盐的含量。在一个实施方式中，盐溶液和乙腈的体积比在1：4以上，优选为1:4-1:6；所述盐溶液为氯化钠溶液、硫酸铵溶液或甲酸铵溶液；所述透明质酸和季铵盐的混合溶液与所述盐溶液和乙腈总体积的体积比为4:3-9。在一个实施方式中，所述季铵盐为2，3-环氧丙基三甲基氯化铵和/或2,3-二羟基丙基-三甲基氯化铵。在一个实施方式中，色谱柱为羧酸官能化阳离子交换色谱柱，优选为CS12A色谱柱。
在一个实施方式中，所述方法包括供试品溶液的制备：将透明质酸-季铵盐聚合物水解得到透明质酸和季铵盐的混合溶液，接着加入盐溶液和乙腈对透明质酸进行沉降，得到的上清液作为供试品溶液；使用离子色谱法测定供试品中季铵盐的含量。在一个实施方式中，盐溶液和乙腈的体积比在1：4以上，优选为1:4-1:6；所述盐溶液为氯化钠溶液、硫酸铵溶液或甲酸铵溶液；所述透明质酸和季铵盐的混合溶液与所述盐溶液和乙腈总体积的体积比为4:3-9。在一个实施方式中，所述季铵盐为2，3-环氧丙基三甲基氯化铵和/或2,3-二羟基丙基-三甲基氯化铵。在一个实施方式中，色谱柱为羧酸官能化阳离子交换色谱柱，优选为CS12A色谱柱。在一个实施方式中，流动相为甲磺酸和乙腈，优选的，甲磺酸与乙腈的体积比为60-80:20-40，进一步优选为65-72:28-35；优选地，甲磺酸的浓度为10-30mmol/L，优选为10-15mmol/L。
在一个实施方式中，所述方法包括供试品溶液的制备：将透明质酸-季铵盐聚合物水解得到透明质酸和季铵盐的混合溶液，接着加入盐溶液和乙腈对透明质酸进行沉降，得到的上清液作为供试品溶液；使用离子色谱法测定供试品中季铵盐的含量。在一个实施方式中，盐溶液和乙腈的体积比在1：4以上，优选为1:4-1:6；所述盐溶液为氯化钠溶液、硫酸铵溶液或甲酸铵溶液；所述透明质酸和季铵盐的混合溶液与所述盐溶液和乙腈总体积的体积比为4:3-9。在一个实施方式中，所述季铵盐为2，3-环氧丙基三甲基氯化铵和/或2,3-二羟基丙基-三甲基氯化铵。在一个实施方式中，色谱柱为羧酸官能化阳离子交换色谱柱，优选为CS12A色谱柱。在一个实施方式中，流动相为甲磺酸和乙腈，优选的，甲磺酸与乙腈的体积比为60-80:20-40，进一步优选为65-72:28-35；优选地，甲磺酸的浓度为10-30mmol/L，优选为10-15mmol/L。在一个实施方式中，流动相流速为0.5-1.5ml/min，优选为0.5-1ml/min。
在一个实施方式中，所述方法包括供试品溶液的制备：将透明质酸-季铵盐聚合物水解得到透明质酸和季铵盐的混合溶液，接着加入盐溶液和乙腈对透明质酸进行沉降，得到的上清液作为供试品溶液；使用离子色谱法测定供试品中季铵盐的含量。在一个实施方式中，盐溶液和乙腈的体积比在1：4以上，优选为1:4-1:6；所述盐溶液为氯化钠溶液、硫酸铵溶液或甲酸铵溶液；所述透明质酸和季铵盐的混合溶液与所述盐溶液和乙腈总体积的体积比为4:3-9。在一个实施方式中，所述季铵盐为2，3-环氧丙基三甲基氯化铵和/或2,3-二羟基丙基-三甲基氯化铵。在一个实施方式中，色谱柱为羧酸官能化阳离子交换色谱柱，优选为CS12A色谱柱。在一个实施方式中，流动相为甲磺酸和乙腈，优选的，甲磺酸与乙腈的体积比为60-80:20-40，进一步优选为65-72:28-35；优选地，甲磺酸的浓度为10-30mmol/L，优选为10-15mmol/L。在一个实施方式中，流动相流速为0.5-1.5ml/min，优选为0.5-1ml/min。在一个实施方式中，进样量为20-100μL。
在一个实施方式中，所述方法包括供试品溶液的制备：将透明质酸-季铵盐聚合物水解得到透明质酸和季铵盐的混合溶液，接着加入盐溶液和乙腈对透明质酸进行沉降，得到的上清液作为供试品溶液；使用离子色谱法测定供试品中季铵盐的含量。在一个实施方式中，盐溶液和乙腈的体积比在1：4以上，优选为1:4-1:6；所述盐溶液为氯化钠溶液、硫酸铵溶液或甲酸铵溶液；所述透明质酸和季铵盐的混合溶液与所述盐溶液和乙腈总体积的体积比为4:3-9。在一个实施方式中，所述季铵盐为2，3-环氧丙基三甲基氯化铵和/或2,3-二羟基丙基-三甲基氯化铵。在一个实施方式中，色谱柱为羧酸官能化阳离子交换色谱柱，优选为CS12A色谱柱。在一个实施方式中，流动相为甲磺酸和乙腈，优选的，甲磺酸与乙腈的体积比为60-80:20-40，进一步优选为65-72:28-35；优选地，甲磺酸的浓度为10-30mmol/L，优选为10-15mmol/L。在一个实施方式中，流动相流速为0.5-1.5ml/min，优选为0.5-1ml/min。在一个实施方式中，进样量为20-100μL。在一个实施方式中，柱温为25-40℃，优选为30-35℃。在一个实施方式中，检测器为电导检测器。在一个实施方式中，抑制器为阳离子抑制器，所述抑制器流速为流动相流速的1.5-2倍。在一个实施方式中，采用外标法计算供试品溶液中游离季铵盐的含量。在一个实施方式中，铵盐的检出限为0.5-2mg/g。
本发明提供了一种供试品溶液的制备方法，其包括：
将透明质酸-季铵盐聚合物水解得到透明质酸和季铵盐的混合溶液，接着加入盐溶液和乙腈对透明质酸进行沉降，得到的上清液作为供试品溶液；
在一个实施方式中，盐溶液和乙腈的体积比在1：4以上，优选为1:4-6；
所述盐溶液为氯化钠溶液、硫酸铵溶液或甲酸铵溶液；
所述透明质酸和季铵盐的混合溶液与所述盐溶液和乙腈总体积的体积比为4:3-9。
在一个实施方式中，所述季铵盐为2，3-环氧丙基三甲基氯化铵和/或2,3-二羟基丙基-三甲基氯化铵。
本发明使用上述所述的方法制备供试品溶液，能够降低透明质酸在水溶液中的溶解度，从而能够更准确地测定季铵盐的含量。
实施例
本发明对试验中所用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述，在下面的实施例中，如果无其他特别的说明，％表示wt％，即重量百分数。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1
1.试剂及材料
氯化钠(国药集团化学试剂有限公司)、甲磺酸(赛默飞世尔科技有限公司)、乙腈(国药集团化学试剂有限公司)
2，3-环氧丙基三甲基氯化铵(GTA)(阿拉丁)、2,3-二羟基丙基-三甲基氯化铵(DTA)(江苏艾康生物医药研发有限公司)，透明质酸-季铵盐聚合物(华熙生物科技有限公司)
2.色谱条件
色谱柱：CS12A(赛默飞世尔科技有限公司，4×250mm，5μm)；
流动相：10mmol/L甲磺酸-30％乙腈溶液；
流速：1ml/min；
进样量：25μL；柱温：30℃
抑制器电流：35mA。
色谱条件的说明：
其中，流动相、流速、柱温均为色谱柱使用说明推荐参数，进样量为常用值。
3.溶液配制
标准溶液储备液：称取2,3-环氧丙基三甲基氯化铵100mg于100mL容量瓶中，用水稀释定容，得到1000mg/L的标准溶液储备液。
称取2,3-二羟基丙基-三甲基氯化铵100mg于100mL容量瓶中，用水稀释定容，得到1000mg/L的标准溶液储备液。
标准品溶液：分别取50、100、200、400、500μL的标准溶液储备液于进样管中，稀释至5mL，制成5、10、20、40、80、100mg/L的标准样品曲线。
NaCl水溶液：称取7gNaCl于100mL容量瓶中，溶解并定容至刻度，混匀，制成7％的NaCl水溶液。
供试品(也可以称为待测样品)溶液：精密称取透明质酸-季铵盐聚合物的样品约15mg于10mL容量瓶中，加入1mL 1mol/L的氢氧化钠溶液，3mL水，水解后加入1mL NaCl水溶液以及5mL的乙腈，混匀，静置，稀释后经0.22μm滤膜过滤，即得供试品溶液。
4.测定
分别取标准品，供试品溶液25μL进样，按照上述色谱条件进行检测，以外标法峰面积计算供试品溶液中季铵盐含量。
5.计算
按以下公式计算供试品溶液中的季铵盐含量：
式中，X—供试品溶液中季铵盐含量，mg/g
C—供试品溶液浓度，mg/L
V—供试品溶液体积，mL
m—供试品称样量，mg
6.结果
该方法的检测范围以及检出限如表1所示，其中检出限按三倍信噪比计算，所得到的谱图中，2，3-环氧丙基三甲基氯化铵的保留时间为8.7min，2,3-二羟基丙基-三甲基氯化铵的保留时间为4.8min。
表1实施例1中供试品的检测范围
从表1可以看出，GTA的线性范围为5-100mg/L，检出限为0.5mg/g，DTA的线性范围为5-100mg/L，检出限为1mg/g，且分离度和相关系数均良好，满足要求。
然后配置不同浓度的标准品，在不同的时间重复进样5次，测得样品中季铵盐的含量，计算其峰面积相对标准偏差(RSD)来衡量方法的精密度，其精密度分析结果见表2。
表2精密度分析结果
从表2可以看出，峰面积相对标准偏差(RSD)在1.27％-6.51％，精密度良好。
样品中GTA含量一般较DTA含量少，取不同样品进行不同水平加标，计算样品加标回收率，其结果如表3所示。GTA加标浓度为2、5、10mg/g，DTA加标浓度为10、20、40mg/g。
表3样品含量及加标回收率
从表3可以看出，回收率在81％-112％之间，具有较高的准确度。
实施例2
将实施例1中的色谱的流动相的甲磺酸浓度改变为15mmol/L，其他条件与实施例1相同，测定供试品溶液中季铵盐含量。
该方法的检测范围以及检出限如表4所示，检出限按三倍信噪比计算。
表4实施例2中供试品的检测范围
| 样品 | 线性范围mg/L | 线性方程 | R2 | 检出限 | 出峰时间 | 分离度 |
| GTA | 5-100 | Y＝0.0238X-0.0021 | 0.9999 | 0.5mg/g | 5.3min | 3.41 |
| DTA | 5-100 | Y＝0.0197X-0.0098 | 0.9995 | 1mg/g | 4.2min | 1.98 |
从表1可以看出，GTA的线性范围为5-100mg/L，检出限为0.5mg/g，DTA的线性范围为5-100mg/L，检出限为1mg/g。
然后按照实施例1的方法配置不同浓度的标准品，测得样品中季铵盐的含量，得到的精密度分析结果如表5所示。
表5精密度分析结果
从表5可以看出，峰面积相对标准偏差(RSD)在1.11％-5.68％，精密度良好。
按照与实施例1相同的方法计算样品加标回收率，其结果如表6所示。
表6样品含量及加标回收率
从表6可以看出，回收率在81％-110％，具有较高的准确度。
实施例3
将实施例1中的色谱的流动相的流速改为0.5ml/min，其他条件与实施例1相同，测定供试品溶液中季铵盐含量。
该方法的检测范围以及检出限如表7所示，检出限按三倍信噪比计算。
表7实施例3中供试品的检测范围
| 样品 | 线性范围mg/L | 线性方程 | R2 | 检出限 | 出峰时间 | 分离度 |
| GTA | 5-100 | Y＝0.0521X-0.0144 | 0.9999 | 2mg/g | 12.5min | 6.54 |
| DTA | 5-100 | Y＝0.0426X-0.0178 | 0.9999 | 2mg/g | 7.6min | 3.31 |
从表1可以看出，GTA的线性范围为5-100mg/L，检出限为2mg/g，DTA的线性范围为5-100mg/L，检出限为2mg/g。
按照实施例1的方法计算样品加标回收率，其结果如表8所示。
表8样品含量及加标回收率
从表8可以看出，回收率在87％-112％，具有较高的准确度。
实施例4
改变前处理方法中的氯化钠溶液和乙腈的体积比，以及当二者的体积比为1:5时，改变前处理方法中的透明质酸和季铵盐的混合溶液与所述盐溶液和乙腈总体积的体积比，其他条件与实施例1相同，测定供试品溶液中季铵盐含量，并按照实施例1的方法计算样品加标回收率，改变前处理方法中的氯化钠溶液和乙腈的体积比的结果如表9所示。
表9样品含量及加标回收率
当氯化钠溶液和乙腈的体积比过低时，溶液无法形成HA的有效沉降，无法上机检测，当体积比达到1：4以上时，才可以沉降HA，并且当体积比达到1：4以上时，回收率在90％-110％，具有较高的准确度，如表9所示。
当氯化钠溶液和乙腈二者的体积比为1:5时，改变前处理方法中的透明质酸和季铵盐的混合溶液与所述盐溶液和乙腈总体积的体积比，并按照实施例1的方法计算样品加标回收率，其结果如表10所示。二者体积比在4:3-9之间时，回收率在85.36％-104.31％之间，具有较高的准确度。
表10样品含量及加标回收率
实施例5
实施例5和实施例1的区别在于，实施例5的流动相流速为1.5ml/min，测定季铵盐的含量，其结果如表11所示。
表11季铵盐的含量
从表11可以看出，GTA的线性范围为5-100mg/L，检出限为1mg/g，DTA的线性范围为5-100mg/L，检出限为2mg/g，使用该法检测实施例1中的样品1，GTA含量无较大偏移，DTA分离度和相关系数较低，含量偏移较大，不满足要求。
实施例6
实施例6和实施例1的区别在于，色谱的流动相的甲磺酸浓度改变为20mmol/L，其结果如表12所示。
表12季铵盐的含量
| 线性范围 | 线性方程 | R2 | 出峰时间 | 分离度 | 含量(mg/g) | |
| GTA | 5-100 | Y＝0.0245X-0.0936 | 0.9915 | 5.4min | 1.21 | 7.24 |
| DTA | 5-100 | Y＝0.0105X-0.0809 | 0.8947 | 3.2min | / | / |
从表12可以看出，当甲磺酸浓度为20mmol/L时，因为流动相浓度过高，各种物质保留时间均有所降低，导致检测物质和干扰物质无法完全分离，GTA和DTA的相关系数和分离度均不满足要求。使用该法检测实施例1中的样品1，GTA含量偏差较大，DTA无法检测。
实施例7
实施例7和实施例1的区别在于，实施例7中的甲磺酸与乙腈的比例为60:40，测定季铵盐的含量，其结果如表13所示。
表13季铵盐的含量
从表13可以看出，乙腈浓度达到40％时，GTA和DTA分离度良好，对于峰形改善效果良好，峰形尖锐，峰宽均低于0.4min，但由于乙腈浓度过高，导致检测过程中信号过高，达到20μs左右，会掩盖低季铵盐含量的出峰，导致DTA的线性方程相关系数偏低，对于检测结果和仪器破坏较大。
实施例8
实施例8和实施例1的区别在于，实施例8中的甲磺酸与乙腈的比例为65:35，测定季铵盐的含量，其结果如表14所示。
表14季铵盐的含量
从表14可以看出，GTA和DTA的曲线方程、分离度和相关系数良好，样品检出正常。
实施例9
实施例9和实施例1的区别在于，实施例9中的甲磺酸与乙腈的比例为80:20，测定季铵盐的含量，其结果如表15所示。
表15季铵盐的含量
从表15可以看出，GTA的曲线方程、分离度和相关系数良好，且样品检出已基本正常，而DTA用于对照品检测时，线性和相关系数已满足要求，但用于实际样品检测时，因为干扰峰过大，且样品基质过于复杂，导致样品DTA出峰仍不稳定，峰形经常会由一个大峰拆分成为两个小峰，无法确定具体峰形，从而无法对DTA进行定量分析。
实施例10
实施例10和实施例1的区别在于，实施例10中的甲磺酸与乙腈的比例为90:10，其结果如表16所示。
表15季铵盐的含量
| 线性范围 | 线性方程 | R2 | 出峰时间 | 分离度 | |
| GTA | 5-100 | Y＝0.0083X-0.0008 | 0.9999 | 8.6min | / |
| DTA | 5-100 | Y＝0.0005X-0.0019 | 0.9973 | 6.7min | / |
从表16可以看出，乙腈比例为10％时，GTA和DTA线性方程斜率仅为0.0083和0.0005，仪器对于季铵盐响应过低，不利于样品定性分析，且由于乙腈比例过低，GTA和DTA峰形拖尾现象严重，峰宽达到3min以上，无法实现与干扰物质的分离，无法检测季铵盐。
实施例11
实施例11和实施例1的区别在于，实施例11进样量为50μL，其结果如表17所示。
表17季铵盐的含量
| 线性范围 | 线性方程 | R2 | 出峰时间 | 分离度 | 含量(mg/g) | |
| GTA | 5-100 | Y＝0.0258X-0.0049 | 0.9999 | 8.7min | 5.28 | 5.38 |
| DTA | 5-100 | Y＝0.0219X-0.0121 | 0.9996 | 4.8min | 3.41 | 40.05 |
从表17可以看出，GTA和DTA的曲线方程、分离度和相关系数良好，样品检出正常。
实施例12
实施例12和实施例1的区别在于，实施例12柱温为35℃，其结果如表18所示。
表18季铵盐的含量
从表18可以看出，GTA和DTA的曲线方程、分离度和相关系数良好，样品检出正常。
实施例13
实施例13和实施例1的区别在于，实施例13柱温为40℃，其结果如表19所示。
表19季铵盐的含量
| 线性范围 | 线性方程 | R2 | 出峰时间 | 分离度 | 含量(mg/g) | |
| GTA | 5-100 | Y＝0.0205X-0.0009 | 0.9997 | 8.3min | 5.69 | 3.66 |
| DTA | 5-100 | Y＝0.0102X-0.0093 | 0.9995 | 4.7min | 1.51 | 23.43 |
从表19可以看出，GTA和DTA的线性范围为5-100mg/L，分离度和相关系数较低，使用该法检测实施例1中的样品1，灵敏度较低，GTA和DTA含量检出偏低，不满足要求。
实施例14
实施例14和实施例1的区别在于，实施例14中色谱柱为CS16，测定季铵盐的含量，该方法的检测范围以及检出限如表20所示，检出限按三倍信噪比计算。
表20季铵盐的检测范围
| 样品 | 线性范围mg/L | 线性方程 | R2 | 检出限 | 出峰时间 | 分离度 |
| GTA | 5-100 | Y＝0.0352X-0.0021 | 0.9994 | 1mg/g | 8.7min | 4.38 |
| DTA | 10-100 | Y＝0.0183X-0.0179 | 0.9991 | 2mg/g | 5.2min | 2.51 |
按照实施例1的方法计算样品加标回收率，其结果如表21所示。
表21样品含量及加标回收率
从表20和21可以看出，色谱柱对于季铵盐的分离较弱,相关系数较低,实际样品检测过程中受到干扰峰干扰较大,回收率超出80％-120％之间，准确度较低。
对比例1
对比例1和实施例1的区别在于，对比例1中色谱柱为CS5A，无法检测GTA和DTA。
对比例2
对比例2和实施例1进行对比，流动相仅使用纯甲磺酸，拖尾现象极其严重，峰宽达到5min以上，无法实现与干扰物质的分离与季铵盐的检测。
对比例3
对比例3和实施例1的区别在于，对比例1中流动相为20％的四氢呋喃，其他条件与实施例1相同,测定季铵盐的含量，其结果如表22所示。
表22季铵盐的含量
| 线性范围mg/L | 线性方程 | R2 | 出峰时间 | 分离度 | |
| GTA | 5-100 | Y＝0.0232X-0.0076 | 0.9969 | 9.6min | 5.68 |
| DTA | 5-100 | Y＝0.0171X-0.0157 | 0.9894 | 5.3min | 3.25 |
季铵盐检测过程中需加入有机试剂调节拖尾现象，抑制器和色谱柱无法负载醇类和丙酮，使用四氢呋喃改善季铵盐的峰形，结果证明四氢呋喃相关系数过低，且检测过程中信号过高，达到25μs左右，会掩盖低季铵盐含量样品的出峰。考虑到四氢呋喃的毒性远大于乙腈，和对于抑制器的负担过大，不建议使用四氢呋喃作为流动相。
表23实施例中的色谱条件
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (21)
1.一种测定透明质酸-季铵盐聚合物中季铵盐含量的方法，其包括：
供试品溶液的制备：将透明质酸-季铵盐聚合物水解得到透明质酸和季铵盐的混合溶液，接着加入盐溶液和乙腈对透明质酸进行沉降，得到的上清液作为供试品溶液；其中，盐溶液和乙腈的体积比在1：4以上；
使用离子色谱法测定供试品溶液中游离季铵盐的含量；
色谱柱为CS12A色谱柱；
流动相为甲磺酸和乙腈；
甲磺酸的浓度为10-15mmol/L。
2.根据权利要求1所述的方法，其中盐溶液和乙腈的体积比为1:4-1:6。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述盐溶液为氯化钠溶液、硫酸铵溶液或甲酸铵溶液。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述透明质酸和季铵盐的混合溶液与所述盐溶液和乙腈总体积的体积比为4:3-9。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述季铵盐为2，3-环氧丙基三甲基氯化铵和/或2,3-二羟基丙基-三甲基氯化铵。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，甲磺酸与乙腈的体积比为60-80:20-40。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，甲磺酸与乙腈的体积比为65-72:28-35。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，流动相流速为0.5-1.5ml/min。
9.根据权利要求1所述的方法，其中流动相流速为0.5-1ml/min。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，进样量为20-100μL。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，柱温为25-40℃。
12.根据权利要求1所述的方法，其中，柱温为30-35℃。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中，离子色谱法采用的检测器为电导检测器。
14.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中，离子色谱法采用的抑制器为阳离子抑制器，所述抑制器流速为流动相流速的1.5-2倍。
15.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中采用外标法计算供试品溶液中游离季铵盐的含量。
16.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中季铵盐的检出限为0.5-2mg/g。
17.一种供试品溶液的制备方法，其包括：
将透明质酸-季铵盐聚合物水解得到透明质酸和季铵盐的混合溶液，接着加入盐溶液和乙腈对透明质酸进行沉降，得到的上清液为供试品溶液；
盐溶液和乙腈的体积比在1：4以上。
18.根据权利要求17所述的制备方法，其中，盐溶液和乙腈的体积比为1:4-6。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述盐溶液为氯化钠溶液、硫酸铵溶液或甲酸铵溶液。
20.根据权利要求17所述的方法，其中所述透明质酸和季铵盐的混合溶液与所述盐溶液和乙腈总体积的体积比为4:3-9。
21.根据权利要求17-20中任一项所述的方法，其中所述季铵盐为2，3-环氧丙基三甲基氯化铵和/或2,3-二羟基丙基-三甲基氯化铵。
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