JPS5856692A - ヒアルロン酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は微生物によるヒアルロン酸の製造方法に関する
ものである〇 従来・ヒアルロン酸はウシの眼のガラス液・ニワトリの
トサカ、このほか謄帯、関節液等より単離され、タンパ
ク質および水と結合してゼリー状を保ち、潤滑剤的な役
割、バクテリアの侵入からの保護、水分の保持等に役立
っている。

しかし、極めて高価であることが問題点であった。

一方ストレプトコ、カス属細菌を利用したヒアルロン噌
の生成についてはストレブトフ、カス・ピオゲネス（５
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅａ　）　、
ストレブトコ、カス・エキ（５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ　ｅｑｕｉ　）　、ストレブトコ　、カ　ス　・　エ
　キーシ　ミ　リ　ス　（５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
　ｅｑｕｉａｉｍｉｌｉｓ　）ストレブトコ、カス・デ
ィスガラクチイエ（５ｔｒ８ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｄｙ
ｓｇａｌａｃｔｉａｅ　）およびストレプトコ。

カス・ズーエピデミカス（５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
　ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）等の細菌によりヒアル
ロン酸を生産する事がすでに知られている。その報告は
ホルムストレーム（Ｅ、Ｈｏ１ｍ５ｔｒδｍ　Ａｐｐｌ
、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　１９６７）　、ジェー・ピー・
ウールコ、り（、Ｔ、Ｂ、Ｗｏｏｌｃｏｃｋ　８５．３
７２　ヘ３７５　Ｊ、Ｇｅｎ。

Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　１９７４　）　、イー・キエム（
Ｅ、Ｋｊｅｍ　Ａｃｔａ　Ｐａｔｈｏｌ。

Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ、５ｃａｎｄ　１９７６）らによっ
てすでに報告されている。しかしいずれも大量生産を目
的としたものではなく、グルコース１％、培養時間Ｍ時
間、ｐＨ７０〜７６、温度３０〜３７６Ｃ等の条件で行
なうもので収量は０．６ｇ／／以下と低いものであった
。

本発明者らは簡単で安価な培地でヒアルロン酸を収量良
く安定に生成せしめる事を意図して鋭意研究した結果、
特定の条件で上記細菌を培養する即ち、本発明は糖成分
３％以上を主炭素源とする栄養培地にてストレプトコツ
カス属のヒアルロン酸を生成する能力を有する微生物を
通気攪拌培養し、培養液中にヒアルロン酸を生成せしめ
、これを採取するものである。

（以下余白） １！Ｉ開口Ｒ５８−５０Ｇ９２（２） 本発明のヒアルロン酸を生産する能力を有する細菌とし
てはストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッ
カス・エキ、ストレプトコッカス・エキシミリス、スト
レプトコッカス・ディスガラクチイエ、ストレプトコッ
カス・ズーエピデミカス等があげられる。

本発明においてヒアルロン酸の生産は上記ヒアルロン酸
生産菌を特定の栄養培地にて培養することにより行なわ
れる。培地としては・炭素源・ｔ−素源、無機塩及びそ
の他に必要ならば有機微量栄養素を含有する培地がよい
。炭素源としては例えば有機酸、脂肪族アルコール等い
ろいろあるが本発明では澱粉加水分解物、グルコース・
蔗糖・ガラクトース、７ラクトース等の糖分が必須成分
と各種アミノ酸混合物、酵母エキス等の一般的な源料が
用いられる。

さらにこの他に塩化ナトリウム、あるいはマグネシウム
、カリウム、鉄、カルシウム等の燐酸塩硫酸塩あるいは
炭素塩等及び微量のビタミン類が必要に応じて添加され
る。

ヒアルロン酸の収量増加には炭素源のうちグルコースを
用いると特に良い結果が得られる。糖の添加は一度に多
量添加するよりも少量に分割して適時添加する方が良い
結果となる。糖の濃度は３％以上添加するとヒアルロン
酸の生産量が１％の時に比べ顕著に増加する。その濃麻
は６〜８％添加すれば十分で、これ以上添加しても収量
の増加はない。３％未満では本発明の効果は発揮出来な
添加量を変えて培養した結果を表−■に示した。

グルコース３％以上添加の場合は１％と比較するとかな
り収量が増加する事が分かる。

すなわち、 表−１培地組成の比較 ＰＨ５５−９，ＯＳ湿度刀〜４４°０２通気ｉ　１〜２
　ｌ／ｍｉｘ培養時間（１〜４日） グルコース８％添加時のヒアルロン酸の収量は常法に従
い精製した結果４０り／ｌであった。

培養時においては通気攪拌が必須である。通気攪拌の方
法としては振とう培養あるいは空気吹込みによる通常の
通気攪拌培養があるが、いずれを使用してもよい。その
際、攪拌力は弱く、通気量を多くした方が良い結果が得
られる。通気の有無を表−Ｈに示す。通気する事によっ
て収量が明らかに増加することが分かる。

さらに培養時に、アルカリ水浴液にてｐＨを５５〜９０
に調整するとヒアルロン酸が安定に生成出来、より好ま
しい。アルカリ水溶液どしては水酸化ナトリウム・水酸
化カリウム・塩基性アミノ酸・低級アミン等の通常用い
られるアルカリの単独あるいは混合溶液が使用出来る。

培養後培養液中に蓄積されたヒアルロン酸を分離、採取
するにあたっては、培地を酸性にして処理すると純度が
よくなり処理しやすい。

ヒアルロン酸の分離には従来から行われている多糖類の
分離採取法が利用出来る・ 例えば培養液中の菌体、その他の不溶成分は濾過又は遠
心分離等により分離除去する。溶液中に混在する蛋白質
はトリクロル酢酸、又はクロロホルム、イソアミルアル
コール混液での除去あるいは活性白土、活性炭等の吸着
剤あるいはペプシン、パパイン、プロナーゼ等の蛋白質
分解酵素にて除去することが出来る。

また、混在する低分子物質は限外濾過、透析あるいは有
機溶媒再沈法等により分離除去する０そ出来る、 このようにして得られたヒアルロン酸は水に可溶、メタ
ノール、エタノール、アセトン、クロロホルム、エーテ
ル等の有機溶媒には不溶の白色繊維状、無味、無臭の乾
燥物である。

べる。

呈色反応 アンスロン−硫酸反応：緑色 カルバゾール−硫酸反応：　ａｒＥ色 赤外吸収スペクトル ＫＢｒ錠剤法で測定した赤外線吸収スペクトルは第１図
の通りである。

０１％水溶液の比旋光度：〔α〕苫−−６７５゜電気泳
動による分析 等速電気泳動のチャートを第２図に示した。

泳動条件は下記の通りで、本多糖のボテンシフルユニ、
トバリａ　　（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　Ｕｎｉｔ　Ｖａｌ
ｕｅ　）は０２３であるところから、本粘質物はヒアル
ロン酸であることを確認した。

又、セルロースアセテ−、ト膜を用いるろ紙電気泳動法
でも０．１Ｍ酢酸亜鉛電極液で本多糖はヒアルロン酸と
一致した。その際、真菌性ヒアルロニダーゼ（ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｈｙａｌｕｒｏｌｙｔｉｃｕｓ　）
で処理後電気泳動にて分析したものは標品と同様スボ、
トを示さず、本酵素により分解される事からもヒアルロ
ン酸である事が確認出来た。

実施例１ グルコース８％、酵母エキスｏ５％、ペプトン１５％、
リン１酸第１水素カリウム０２％、チオ硫酸ナトリウム
６１１％、亜硫酸ナトリウム００２％の組成のの培地を
ｌ／のジャーファーメンタ−（いわしや製ＭＡ型５０−
ミニジャー）に４０−分注し、１２０°Ｃ１１５分間加
熱殺菌後・前培養したストレプトコッカス・ズーエピデ
ミカスを接種し、ｐ）Ｉ　７　、３３°Ｃで４日間通気
攪拌（通気量２ｔ、′ｍｉｎ、回転数２００ｒｐｍ　）
培養した。

、培養終了後培養液より遠心分離により、菌体及びその
他の夾雑物を除去し、上澄液へ２倍量のエタノールを攪
拌しつつ加えると繊維状物質が沈殿した。これを戸別し
た後、エーテル、ついでエタノールで充分洗浄後、再び
水に溶解し、セチルピリジニウムクロライドを加え、生
じた沈殿を戸数し・水およびＯ，１Ｍ　Ｎａ０ｊ水溶液
にて十分洗浄後０．５ＭＮａＣ７にてヒアルロン酸を抽
出し、その溶液を透析法により脱塩後、溶液を凍結乾燥
して培養液１１より４０ｇのヒアルロン酸を得た。本品
はｐ紙電気泳動にて標品のヒアルロン酸と同じ位置に泳
動され・等速電気泳動のユ斤、トバリ、−も０．２３と
標品のそれと一致した。さらに赤外線吸収スペクトルモ
檜品のスペクトルと一致シタ。

一方・グルコース８％の代りにグルコース１％添加した
培地で同様にストレプトコアカス・ズーエピデミカスを
培養した場合には、培養液１１よりｏ、５ｑ／ｌのヒア
ルロン酸が得られたにすぎなかった。

実施例２ 実施例１に於て使用した培地中のグルコースの量を４％
におきかえた培地を用いてストレプトコアカス、ズーエ
ピデミカスを実施例１と同様の方法で培養した。ヒアル
ロン酸の収量は２．１９／ｌであった◇ただし、本条件
で通気攪拌しなかった場合の収量は００５り／ｌと低か
った。

実施例３ 実施例１に於て使用した培地中のグルコースの量を３％
におきかえた培地を用いてストレプトコアカス・ズーエ
ピデミカを実施例１と同様の方法で培養し、処理した。

ヒアルロン酸の収量は・ｚＯり／ｌであった〇 実施例４ 実施例１と同様の方法でストレプトコアカス・エキ（Ａ
　Ｔ　ＯＯ９５２７）を培養し、培養液からヒアルロン
酸を単離精製し、培養液１１より３８９のヒアルロン酸
を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は本培養により得たヒアルロン酸の赤外線吸収ス
ペクトルである。 第２図は本培養により得たヒアルロン酸の等速電気泳動
のチャートである。 特許出願人　　株式会社資生堂 年１図 Ｗｏｅ地艶印（、つ １ｆ−ｚ図 手続補正書（自発） 昭和５５年１１月ｑ日 特許庁長官　島　１）春　樹　殿 １、事件の表示 昭和元年特許願第１５２３５５号 ３　補正をする者 Ｃｍ話番４０　　東京（ａ７２１＋ｘｘｚ内１４２１１
〕４、補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 ５　補正の内容 （１）　　明細書の第４頁第１７行〜１８９ノ’　１１
の「原料」を「原料」と補正します。 （２）　　明細書の第５頁第１行目の「炭素塩」を「炭
酸塩」と補正します。 （３）明細書の第７頁第１０行目め「水浴液」を「水溶
液」と補正します。 （４）明細書の第９頁第１０行目の［〔α〕薯−−６７
，５°」を「〔α〕□−、ｊ５７．５°」と補正します
。 （５〕　　明細書の第１１頁第５行目〜第６行目のｌ’
−１７のジャーファーメンタ−（いわしや製ＭＡ−型５
００ｍ１！ミニジャー）」を「いわしや製ＭＡ型５００
ｍ１ミニジャー」と捕正します２

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）糖成分３％以上を主炭素源とする栄養培地にてス
   トレプトコッカス属のヒアルロン酸を生成する能力を有
   する微生物を通気攪拌培養して、培養液中にヒアルロン
   酸を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする
   微生物によるヒアルロン酸の製造方法。