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CN114134090A - 兽疫链球菌菌株及其应用 - Google Patents

兽疫链球菌菌株及其应用 Download PDF

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CN114134090A
CN114134090A CN202010920926.8A CN202010920926A CN114134090A CN 114134090 A CN114134090 A CN 114134090A CN 202010920926 A CN202010920926 A CN 202010920926A CN 114134090 A CN114134090 A CN 114134090A
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CN
China
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streptococcus zooepidemicus
strain
glucokinase gene
streptococcus
vector
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Pending
Application number
CN202010920926.8A
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谭秀梅
李凯峰
鲍素敏
石江水
谢文平
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Yichang Dongyangguang Biochemical Pharmaceutical Co ltd
Original Assignee
Yichang Dongyangguang Biochemical Pharmaceutical Co ltd
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Abstract

本发明提出了一种兽疫链球菌菌株。所述兽疫链球菌菌株的葡萄糖激酶基因过表达。根据本发明实施例的兽疫链球菌菌株经发酵处理后，所获得的HA产量显著提高。

Description

兽疫链球菌菌株及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及兽疫链球菌菌株及其应用，更具体地，本发明涉及兽疫链球菌菌株以及发酵生产透明质酸的方法。
背景技术
透明质酸(hyaluronic acid或hyaluronan,HA)是由葡萄醛酸和氨基葡糖的双糖重复单位所组成的多糖，广泛分布于软骨组织、关节液和皮肤组织的真皮以及表皮中，并在其中起到保湿、营养、修复和预防损伤等生理作用。透明质酸的生产方法有动物组织提取法和发酵法，由于动物组织提取法的制备成本高，分离纯化复杂，逐渐被发酵法所取代。
由于发酵方法简单，所需原料易得，成本相对较低，微生物发酵法生产透明质酸是当前生产透明质酸最主要的方式之一。目前可用于直接生产HA的微生物菌株主要分为链球菌属中的A类和C类，如酿脓链球菌和兽疫链球菌等。兽疫链球菌作为C类链球菌中的一员，由于其更低的致病性，更高的HA产率而常常受到青睐。然而，利用微生物发酵法生产HA也体现出许多局限。受宿主菌的影响，不同宿主生产HA的能力不同，但摇瓶产量大多小于1g/L，发酵罐产量也一般在7g/L以内，这不但增加了生产成本，也难以满足日益增长的市场需求。以目前的宿主改良技术而言，化学诱变或物理诱变技术是筛选优良生产菌株的主流方式之一，但诱变育种周期较长、结果不确定性大、高毒性的弊端也常常是限制其发展的主要因素之一。
相比诱变育种而言，利用基因工程手段来定向改造宿主，从而获得高产菌株的手段具有更快捷、更可控、周期短的优势，是当前及未来最主要的育种技术之一。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
已知，合成HA的两个前体UDP-葡糖糖醛酸和UDP-N-乙酰葡萄糖胺都来自于6-磷酸葡萄糖。葡萄糖被运输进细胞体内后，经己糖激酶活化成6-磷酸葡萄糖(在兽疫链球菌中是葡萄糖激酶参与反应)，再进入糖酵解途径和HA合成途径。发明人通过构建葡萄糖激酶过表达载体，进而将过表达载体导入兽疫链球菌，在兽疫链球菌中增加原始前体6-磷酸葡萄糖的供应，最后兽疫链球菌HA的摇瓶产量可达到1.15-1.29g，较出发兽疫链球菌菌株0.8g的产量提高了将近40％-60％。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种兽疫链球菌菌株。根据本发明的实施例，所述兽疫链球菌菌株的葡萄糖激酶基因过表达。根据本发明实施例的兽疫链球菌菌株经发酵处理后，所获得的HA产量显著提高。需要说明的是，本申请所述的葡萄糖激酶基因是指可以表达葡萄糖激酶完整结构或功能区的基因，即所述葡萄糖激酶基因所表达出的葡萄糖激酶既可以是完整结构的葡萄糖激酶，也可以仅是葡萄糖激酶功能区，葡萄糖激酶基因的表达产物可催化促进葡萄糖活化成6-磷酸葡萄糖。
根据本发明的实施例，上述兽疫链球菌菌株还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述葡萄糖激酶基因过表达是通过增加葡萄糖激酶基因的拷贝数实现的。进而可显著提高葡萄糖激酶在兽疫链球菌菌株中的表达量。
根据本发明的实施例，所述葡萄糖激酶基因过表达是通过将所述葡萄糖激酶基因设置于强启动子的调控下实现的。进而可显著提高葡萄糖激酶在兽疫链球菌菌株中的表达量。
根据本发明的实施例，所述增加葡萄糖激酶基因的拷贝数是通过将携带所述葡萄糖激酶基因的游离载体或整合载体导入受体兽疫链球菌细胞内实现的。需要说明的是，本申请所述的游离载体是指载体进入宿主细胞后，不能使其携带基因整合入宿主基因组的载体，如本申请实施例2所述的pSET4-PGT；本申请所述的整合载体是指载体进入宿主细胞后，能使其携带基因整合入宿主基因组的载体，例如本申请实施例3所述的pSET4-APGTA。根据本发明的实施例，携带所述葡萄糖激酶基因的游离载体或整合载体导入受体兽疫链球菌细胞内之后，葡萄糖激酶基因可在兽疫链球菌细胞内表达，实现葡萄糖激酶的过表达。
根据本发明的实施例，所述受体兽疫链球菌的保藏号为CCTCC NO:M 2020231。进而根据本发明实施例的兽疫链球菌发酵后的HA的产量更高。
根据本发明的实施例，所述强启动子包括乳酸脱氢酶启动子。进而葡萄糖激酶基因可在乳酸脱氢酶启动子的调节下，启动表达，而兽疫链球菌内的乳酸脱氢酶的表达受到竞争性抑制，进而有效降低发酵副产物的量。
根据本发明的实施例，所述游离载体或整合载体携带葡萄糖激酶基因表达框，所述葡萄糖激酶基因表达框包括所述乳酸脱氢酶启动子和所述葡萄糖激酶基因，所述乳酸脱氢酶启动子与所述葡萄糖激酶基因可操作地连接。所述游离载体进入宿主兽疫链球菌体内后，游离载体不与兽疫链球菌基因组整合，而可以随着宿主兽疫链球菌体的复制而复制，所述整合载体进入宿主兽疫链球菌体内后，整合载体中的同源臂位点与兽疫链球菌基因组的相应整合位点发生同源重组，进而可将其所携带的葡萄糖激酶基因表达框整合入兽疫链球菌基因组，所述葡萄糖激酶基因在乳酸脱氢酶启动子的启动调控下，高效表达，实现乳酸脱氢酶在宿主兽疫链球菌体内的大量表达。
需要说明的是，当采用整合载体将葡萄糖激酶基因表达框导入受体细胞时，整合载体的整合位点不受特别限制，只要不影响HA的合成均可。例如，整合位点可选自乙醇脱氢酶(ADH)位点、乳酸脱氢酶(LDH)位点。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种兽疫链球菌菌株。根据本发明的实施例，所述兽疫链球菌菌株携带游离载体或整合载体，所述游离载体或整合载体携带葡萄糖激酶基因表达框，所述葡萄糖激酶基因表达框包括启动子和葡萄糖激酶基因，所述启动子与所述葡萄糖激酶基因可操作地连接。根据本发明实施例的兽疫链球菌菌株中原始前体6-磷酸葡萄糖的合成量高，兽疫链球菌HA的产量显著提高，较出发兽疫链球菌菌株HA的产量提高了将近40％-60％。
根据本发明的实施例，上述兽疫链球菌菌株还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述启动子为乳酸脱氢酶启动子。进而所述兽疫链球菌菌株中乳酸脱氢酶的合成受到竞争性抑制，发酵副产物显著减少。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种发酵生产透明质酸的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括将前面所述的兽疫链球菌菌株进行发酵处理，以便获得透明质酸。根据本发明实施例的方法获得的HA的产量显著提高，较出发兽疫链球菌菌株HA的产量提高了将近40％-60％。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是根据本发明实施例的S2菌株的革兰氏染色镜检图。
图2是根据本发明实施例的游离表达载体pSET4-PGT的结构示意图。
图3是根据本发明实施例的整合表达载体pSET4-APGTA的结构示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
实施例1兽疫链球菌的筛选
发明人从市场采购一些新鲜的牛鼻，对其外围裸露部分进行消毒清洁；用棉签擦拭牛鼻内侧，并用无菌剪刀将棉签头剪下，放入BHI液体培养基中，37℃，220rpm培养12-18h。根据培养基的浑浊程度，将其稀释至10-3、10-4和10-5，分别取100μL涂布于BHI固体培养基上，37℃培养24h，表观观察单菌落的形态、粘度等，初步筛选出颜色灰白、表面光滑湿润、圆形凸起的菌落，用枪尖挑起有明显粘滞感的菌落共计20株备用，并标记为 F1-F20。
分别挑取F1-F20单菌落在血平板上进行划线扩培，37℃恒温培养48h，观察血平板上的溶血情况。挑取周围出现明显透明圈的、菌落较大、生长旺盛、用枪尖挑起有明显粘滞感的菌落作为候选菌株，共计6株，并分别编号S1-S6。
挑取S1-S6单菌落接种至BHI液体培养基中37℃，220rpm扩培24h，按照0.1％接种量转接到种子培养基中，37℃，220rpm培养12h；按照10％的接种量转接到发酵培养基中，37℃，220rpm发酵48h，取样进行GPC检测，透明质酸产量最高的菌株为S2，产量为0.39 g/L，分子量251WDa。
提取S2菌株的基因组，采用PCR的方法，用细菌鉴定通用引物16S 27F和16S1492R，对S2菌株基因组的16S rDNA进行扩增。
16S 27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG(SEQ ID NO:1)。
16S 1492R:TACGGCTACCTTGTTACGACTT(SEQ ID NO:2)。
PCR体系为：基因组50ng，PrimerStar Max Mix(2X)50μL，16S 27F 4μL，16S 1492R4μL，加dH2O补足至100μL。
PCR程序为：98℃5min；98℃30s，55℃30s，72℃2min；72℃2min；16℃2min；30cycles。
扩增条带送测序公司测序，经NCBI BLAST比对得知S2菌株为兽疫链球菌。
用革兰氏染色法对S2菌株进行染色鉴定，显微镜下菌体形态符合链球菌形态特征，为革兰氏阳性菌(如图1所示)。
将S2菌株在BHI平板上反复活化3次，取适量菌体接种到BHI液体培养基中培养，并加入无菌玻璃珠将菌体制备成单菌悬液，取10uL悬液均匀涂布于诱变仪配套的无菌金属载片上，ARTP诱变处理30s。处理完立即用生理盐水将载样片上的菌体洗脱制成诱变菌株母液。取诱变菌株母液涂布于BHI固体平板上培养至长出单菌落，挑取单菌落进行发酵验证，选取透明质酸产量较高的单菌落继续进行第二轮诱变，依此方法进行多轮诱变，最终得到一株摇瓶产量为0.8-0.9g/L的兽疫链球菌突变菌株，分类命名为：马链球菌兽疫亚种HEC-SE01(Streptococcus equi subsp.zooepidemicus HEC-SE01)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国湖北省武汉市洪山区八一路，武汉大学，保藏编号：CCTCC NO:M2020231。
取HEC-SE01菌种或S2菌株，按0.1％(v/v)接种到500ml种子培养基中，37℃，220rpm培养至OD660＝0.5-0.8，将种子液倒入15L发酵罐中，37℃发酵48h，发酵期间通过流加NaOH来调节PH维持在7.0，取样检测HA产量，HEC-SE01菌种最终获得7-8g/L的产量，分子量在240WDa，而S2菌株发酵获得的HA产量为4.5g/L，分子量234WDa。 HEC-SE01菌种相比S2菌株，HA产量得到显著提高。
以下实施例所用的马链球菌兽疫亚种HEC-SE01(Streptococcus equisubsp.zooepidemicus HEC-SE01)为实施例1所筛选出的保藏号为CCTCC NO:M 2020231的兽疫链球菌。但以下实施例的出发菌种绝不限于该株兽疫链球菌。
以下实施例中所采用的种子培养基和摇瓶发酵培养基的组成包括：
种子培养基(g/L)：葡萄糖10，蛋白胨15，酵母浸粉5，K2HPO4 1.5，MgSO4 0.35， pH6.5。
摇瓶发酵培养基(g/L)：葡萄糖30，酵母粉5.55，蛋白胨(日本株式会社)16.67，K2HPO4 1.72，MgSO4 0.36，味精3.44，无水磷酸二氢钠9.36，十二水合磷酸氢二钠43.69，PH＝7.5。
以下实施例所使用的引物的序列如下表1所示。
表1：
Figure RE-GDA0002757110000000051
Figure RE-GDA0002757110000000061
实施例2葡萄糖激酶基因过表达菌株构建过程
用引物01F/01R从兽疫链球菌的基因组中克隆出Pldh启动子序列(乳酸脱氢酶启动子)，其中，01F引入BglⅡ酶切位点；用引物02F/02R从兽疫链球菌的基因组中克隆出葡萄糖激酶基因(GcK基因)，所述克隆出的GcK基因的序列如SEQ ID NO:17所示。
ATGAGTCAAAAATTGATAGGGATTGATTTGGGCGGAACCACGATTAAATTTGGTAT TTTAACCTCAGAGGGTGACGTTCAGGAAAAATGGGCGATTGAGACAAATGTTTTAGA GGACGGTAAACATATCGTTCCAGATATTGTCGCCTCACTCAAGCATCGCCTTGACCTTT ATGGACTGACTAAGGACGATTTTATCGGTATTGGTATGGGCTCACCTGGAGCTGTCAAT CGCACAGATCATACTGTTACAGGGGCCTTTAACCTCAACTGGAGAGGCACCCAAGAG GTGGGATCTGTTATTGAAAGGGAGCTAGGAATTCCCTTTGCTATTGATAATGACGCAAA TGTTGCGGCCCTCGGCGAGCGCTGGGTCGGTGCAGGTGACAATAATCCTGATGTGGTC TTTATGACCTTAGGAACAGGTGTTGGTGGTGGTATCATCGCTGATGGGAACTTGATTCA TGGTGTGGCTGGAGCTGGTGGTGAGTTTGGGCACATGATAGTAGAGCCGCTTAAGGG CTTTGCTTGCACCTGTGGCTCACAGGGCTGCCTGGAGACAGTGGCCTCTGCTACAGGT GTTGTTAAGGTTGCTCGTCTTTTAGCAGAAGCCTACGAAGGAGATTCAAGCATTAAGG CAGCGATTGATAATGGAGAGGCTGTCTCAAGCAAGGACATTTTTGTTGCAGCGGAGG CTGGTGATGCCTTTGCCAACTCTGTTGTTGAAAAGGTCAGTTATTATCTAGGACTGGCA GCGGCTAATATCTCAAATATTTTGAACCCTGATTCGGTCGTTATTGGCGGTGGTGTATCT GCTGCGGGTGAGTTTTTACGTTCACGTGTTGAAAAGTACTTTATGACCTTTACCTTTCC GCAGGTTAGACAGTCCACTAAAATCAAAATAGCAGAGCTTGGTAATGATGCTGGTATT ATTGGTGCAGCTAGCCTTGCAAGACAATTTATCACAGAATAG(SEQ ID NO:17)。
上述克隆中所采用的PCR反应体系和反应条件如下表2和表3所示。02R引入一段终止子序列Ter和EcoRⅠ酶切位点，将克隆出的表达框命名为PGT(Pldh+GcK+Ter，首字母简写)并采用酶切酶连的方式将PGT表达框插入到pSET4载体的BglⅡ和EcoRⅠ酶切位点之间，由此生成游离载体pSET4-PGT(质粒图谱如图2所示)。将兽疫链球菌制备成感受态细胞，采用电穿孔法将pSET4-PGT载体导入兽疫链球菌中，在含50μg/mL终浓度的壮观霉素BHI固体培养基上筛选转化子，用YF/YR对转化子进行验证，验证正确的转化子即GcK过表达菌株。
将GcK过表达菌株按0.1％接种量接种到种子培养基中，培养至OD660＝0.5-0.6，按10％接种量转接至发酵培养基中，37℃，220rpm培养48h，取样检测透明质酸产量，所获得的 HA产量为1.15-1.29g/L，HA的分子量为2125063Da。
出发兽疫链球菌菌株在同样的发酵条件下，所获得的HA产量为0.8g/L，HA的分子量为2342309Da。
表2：PCR反应体系
名称 体积
PrimeSTAR MAX 100μL
02F 8μL
02R 8μL
模板(兽疫链球菌基因组) 100ng
dH<sub>2</sub>O 补至200μL
表3：PCR反应条件
Figure RE-GDA0002757110000000071
实施例3葡萄糖激酶基因整合菌株构建过程
将PGT表达框整合至兽疫链球菌基因组乙醇脱氢酶(ADH)位点，ADH同源臂序列如下：
CAGCTTAAAGTGATGTGTTACCATCTTAGTTGCATCAATCTTACCTGATTTTAGAA CATTTAATAGCATTTCTGTCGTATTGGCATTTACTAGGCCAGTTGACATCGTAATATTTTT GATCCATAGGTCCTGTAGATCCAAGCTAACTGGTTTTCCATGAACACCAACGTTAGAA ACATGCCCGCCTATAGCAACAATCTTTTGACAGATATCAAAGGTAGCAGGATAGCCCA CACACTCAATAGCAACATCAACGCCTCGACCATCAGTTAATTCATGGACTTTTTTAACAATATCATCAAGGTCACCAGAACAACTGCTTGAGGAATATGAACATACTCTGCTTGTGTC CCATTAATCAAATGCCCTAGAATCCAACCACCGCTTTCACAATGAGCAGGAATTCCTTT TTTACAATAATAGCAGGTATTGCAGGCTGTGATACAGGAAATAATAACCTTATCACCTA CCTTAAAATTATTCACTGCAGAGCCAACTGACTCGACAATACCAATACCTTCATGACCT AAAATGGTACCATGAGTAGTCTCTGGGACATCTCCACCTAAAATATGCAAATCTGTTCC ACAGATTGTTGTTTTCAATAAACGAACCACAGCATCCGTCGGAGCAAGAATCTCTGGT TTTGG(SEQ ID NO:18)。
其中， CAGCTTAAAGTGATGTGTTACCATCTTAGTTGCATCAATCTTACCTGATTTTAGAACATT TAATAGCATTTCTGTCGTATTGGCATTTACTAGGCCAGTTGACATCGTAATATTTTTGAT CCATAGGTCCTGTAGATCCAAGCTAACTGGTTTTCCATGAACACCAACGTTAGAAACA TGCCCGCCTATAGCAACAATCTTTTGACAGATATCAAAGGTAGCAGGATAGCCCACAC ACTCAATAGCAACATCAACGCCTCGACCATCAGTTAATTCATGGACTTTTTTAACAATA TCATCAAGGTCACCAGAACAA为上游同源臂序列； CTGCTTGAGGAATATGAACATACTCTGCTTGTGTCCCATTAATCAAATGCCCTAGAATC CAACCACCGCTTTCACAATGAGCAGGAATTCCTTTTTTACAATAATAGCAGGTATTGCA GGCTGTGATACAGGAAATAATAACCTTATCACCTACCTTAAAATTATTCACTGCAGAGCCAACTGACTCGACAATACCAATACCTTCATGACCTAAAATGGTACCATGAGTAGTCTCT GGGACATCTCCACCTAAAATATGCAAATCTGTTCCACAGATTGTTGTTTTCAATAAACG AACCACAGCATCCGTCGGAGCAAGAATCTCTGGTTTTGG为下游同源臂序列。
用引物03F/03R从兽疫链球菌的基因组中克隆出ADH上游同源臂序列其中，03F引入 BamHI酶切位点；用引物04F/04R从pSET4-PGT中克隆出PGT表达框；用引物05F/05R 从兽疫链球菌的基因组中克隆出ADH下游同源臂序列。上述克隆中所采用的PCR反应体系和反应条件如下表4和表5所示。其中05R引入HindIII酶切位点，最终以三片段为模板使用引物03F/05R克隆出ADH上游同源臂+PGT+ADH下游同源臂片段，命名为APGTA 片段。并采用酶切酶连的方式将APGTA表达框插入到pSET4载体的BamHI和HindIII酶切位点之间，由此生成整合载体pSET4-APGTA(质粒图谱如图3所示)。将兽疫链球菌制备成感受态细胞，采用电穿孔法将pSET4-APGTA载体导入兽疫链球菌中，在含50μg/mL 终浓度的壮观霉素BHI固体培养基上筛选转化子，经过三次抗性传代验证单交换菌株使用引物YF1/YR验证，筛选到单交换转化子后无抗传代一代筛选双交换转化子YF1/YR1验证，则证明PGT表达框整合至ADH位点。
将GcK整合菌株按0.1％接种量接种到种子培养基中，培养至OD660＝0.5-0.6，按10％接种量转接至发酵培养基中，37℃，220rpm培养48h，取样检测透明质酸产量，所获得的HA产量为1.1-1.20g/L，HA的分子量为2124153Da。
出发兽疫链球菌菌株在同样的发酵条件下，所获得的HA产量为0.8g/L，HA的分子量为2351208Da。
表4：PCR反应体系
名称 体积
PrimeSTAR MAX 100μL
02F 8μL
02R 8μL
模板(兽疫链球菌基因组) 100ng
dH<sub>2</sub>O 补至200μL
表5：PCR反应条件
Figure RE-GDA0002757110000000091
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
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<120> 兽疫链球菌菌株及其应用
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 16S 27F
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 16S 1492R
<400> 2
tacggctacc ttgttacgac tt 22
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 01F
<400> 3
gaagatcttc ttaaggaatg ctccttttct 30
<210> 4
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 01R
<400> 4
atccctatca atttttgact catttctaaa catctccttc attttagtt 49
<210> 5
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 02F
<400> 5
aactaaaatg aaggagatgt ttagaaatga gtcaaaaatt gatagggat 49
<210> 6
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 02R
<400> 6
cggaattccg aaaaaagccc gctcattagg cgggctctat tctgtgataa attgtcttgc 60
aaggct 66
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> YF
<400> 7
gagaggaggg attattgaat aaataaaag 29
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> YR
<400> 8
caggaaacag ctatgac 17
<210> 9
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 03F
<400> 9
cgggatccca gcttaaagtg atgtgttacc atcttagt 38
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 03R
<400> 10
aaaaggagca ttccttaatt gttctggtga ccttga 36
<210> 11
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 04F
<400> 11
tcaaggtcac cagaacaatt aaggaatgct cctttt 36
<210> 12
<211> 62
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 04R
<400> 12
tatgttcata ttcctcaagc agaaaaaagc ccgctcatta ggcgggctct attctgtgat 60
aa 62
<210> 13
<211> 62
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 05F
<400> 13
ttatcacaga atagagcccg cctaatgagc gggctttttt ctgcttgagg aatatgaaca 60
ta 62
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 05R
<400> 14
cccaagcttc caaaaccaga gattcttgc 29
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> YF1
<400> 15
accaagcaat tgatacacga tcacc 25
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> YR1
<400> 16
accaagcaat tgatacacga tcacc 25
<210> 17
<211> 972
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> GcK基因
<400> 17
atgagtcaaa aattgatagg gattgatttg ggcggaacca cgattaaatt tggtatttta 60
acctcagagg gtgacgttca ggaaaaatgg gcgattgaga caaatgtttt agaggacggt 120
aaacatatcg ttccagatat tgtcgcctca ctcaagcatc gccttgacct ttatggactg 180
actaaggacg attttatcgg tattggtatg ggctcacctg gagctgtcaa tcgcacagat 240
catactgtta caggggcctt taacctcaac tggagaggca cccaagaggt gggatctgtt 300
attgaaaggg agctaggaat tccctttgct attgataatg acgcaaatgt tgcggccctc 360
ggcgagcgct gggtcggtgc aggtgacaat aatcctgatg tggtctttat gaccttagga 420
acaggtgttg gtggtggtat catcgctgat gggaacttga ttcatggtgt ggctggagct 480
ggtggtgagt ttgggcacat gatagtagag ccgcttaagg gctttgcttg cacctgtggc 540
tcacagggct gcctggagac agtggcctct gctacaggtg ttgttaaggt tgctcgtctt 600
ttagcagaag cctacgaagg agattcaagc attaaggcag cgattgataa tggagaggct 660
gtctcaagca aggacatttt tgttgcagcg gaggctggtg atgcctttgc caactctgtt 720
gttgaaaagg tcagttatta tctaggactg gcagcggcta atatctcaaa tattttgaac 780
cctgattcgg tcgttattgg cggtggtgta tctgctgcgg gtgagttttt acgttcacgt 840
gttgaaaagt actttatgac ctttaccttt ccgcaggtta gacagtccac taaaatcaaa 900
atagcagagc ttggtaatga tgctggtatt attggtgcag ctagccttgc aagacaattt 960
atcacagaat ag 972
<210> 18
<211> 650
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ADH同源臂序列
<400> 18
cagcttaaag tgatgtgtta ccatcttagt tgcatcaatc ttacctgatt ttagaacatt 60
taatagcatt tctgtcgtat tggcatttac taggccagtt gacatcgtaa tatttttgat 120
ccataggtcc tgtagatcca agctaactgg ttttccatga acaccaacgt tagaaacatg 180
cccgcctata gcaacaatct tttgacagat atcaaaggta gcaggatagc ccacacactc 240
aatagcaaca tcaacgcctc gaccatcagt taattcatgg acttttttaa caatatcatc 300
aaggtcacca gaacaactgc ttgaggaata tgaacatact ctgcttgtgt cccattaatc 360
aaatgcccta gaatccaacc accgctttca caatgagcag gaattccttt tttacaataa 420
tagcaggtat tgcaggctgt gatacaggaa ataataacct tatcacctac cttaaaatta 480
ttcactgcag agccaactga ctcgacaata ccaatacctt catgacctaa aatggtacca 540
tgagtagtct ctgggacatc tccacctaaa atatgcaaat ctgttccaca gattgttgtt 600
ttcaataaac gaaccacagc atccgtcgga gcaagaatct ctggttttgg 650

Claims (9)

1.一种兽疫链球菌菌株，其特征在于，所述兽疫链球菌菌株的葡萄糖激酶基因过表达。
2.根据权利要求1所述的兽疫链球菌菌株，其特征在于，所述葡萄糖激酶基因过表达是通过增加葡萄糖激酶基因的拷贝数实现的。
3.根据权利要求1所述的兽疫链球菌菌株，其特征在于，所述葡萄糖激酶基因过表达是通过将所述葡萄糖激酶基因设置于强启动子的调控下实现的。
4.根据权利要求2所述的兽疫链球菌菌株，其特征在于，所述增加葡萄糖激酶基因的拷贝数是通过将携带所述葡萄糖激酶基因的游离载体或整合载体导入受体兽疫链球菌细胞内实现的；
任选地，所述受体兽疫链球菌的保藏号为CCTCC NO:M 2020231。
5.根据权利要求3所述的兽疫链球菌菌株，其特征在于，所述强启动子包括乳酸脱氢酶启动子。
6.根据权利要求4或5所述的兽疫链球菌菌株，其特征在于，所述载体携带葡萄糖激酶基因表达框，所述葡萄糖激酶基因表达框包括所述乳酸脱氢酶启动子和所述葡萄糖激酶基因，所述乳酸脱氢酶启动子与所述葡萄糖激酶基因可操作地连接。
7.一种兽疫链球菌菌株，其特征在于，携带游离载体或整合载体，所述游离载体或整合载体携带葡萄糖激酶基因表达框，所述葡萄糖激酶基因表达框包括启动子和葡萄糖激酶基因，所述启动子与所述葡萄糖激酶基因可操作地连接。
8.根据权利要求7所述的兽疫链球菌菌株，其特征在于，所述启动子为乳酸脱氢酶启动子。
9.一种发酵生产透明质酸的方法，其特征在于，将权利要求1～8任一项所述的兽疫链球菌菌株进行发酵处理，以便获得透明质酸。
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