CH694589A5 - Humanisierte Anti-ErbB2-Antikörper und Behandlung mit Anti-ErbB2-Antikörpern. - Google Patents

Description

  



   



   Die vorliegende Erfindung betrifft humanisierte Anti-ErbB2-Antikörper  und Verfahren zur Behandlung von Krebs mit Anti-ErbB2-Antikörpern,  wie z.B. humanisierte Anti-ErbB2-Antikörper.   Hintergrund der  Erfindung  



   Die ErbB-Familie von Rezeptor-Tyrosinkinasen sind wichtige Vermittler  von Zellwachstum, Differenzierung und Überleben. Die Rezeptorfamilie  umfasst vier gesonderte Mitglieder, einschliesslich Epidermis-Wachstumsfaktor-Rezeptor  (EGFR oder ErbB1), HER2 (ErbB2 oder p185<neu>), HER3 (ErbB3) und  HER4 (ErbB4 oder tyro2). 



   EGFR, kodiert durch das erbB1-Gen, ist kausal mit humaner Malignität  in Zusammenhang gebracht worden. Im Besonderen ist erhöhte Expression  von EGFR bei Brust-, Blasen-, Lungen-, Kopf-, Hals- und Magenkrebs  wie auch in Glio-Blastomen beobachtet worden. Erhöhte EGFR-Expression  in denselben Tumorzellen ist oft mit erhöhter Produktion des EGFR-Liganden,  dem transformierenden Wachstumsfaktor Alpha (TGF- alpha ), assoziiert  und führt über einen autokrinen Stimulations-Stoffwechselweg zu Rezeptoraktivierung.  Baselga und Mendelsohn, Pharmac. Ther. 64, 127-154 (1994). Monoklonale  Antikörper gegen EGFR oder dessen Liganden, TGF- alpha  und EGF,  sind als therapeutische Mittel zur Behandlung solcher Malignitäten  evaluiert worden. Siehe z.B. Baselga und Mendelsohn (s.o.); Masui  et al., Cancer Research 44, 1002-1007 (1984); und Wu et al., J. Clin.

    Invest. 95, 1897-1905 (1995). 



   Das zweite Mitglied der ErbB-Familie, p185<neu>, ist ursprünglich  als das Produkt des transformierenden Gens aus Neuroblasten chemisch  behandelter Mäuse identifiziert    worden. Die aktivierte Form des  neu-Proto-Oncogens resultiert aus einer Punktmutation (Valin zu Glutaminsäure)  in der Transmembran-Region des kodierten Proteins. Amplifizierung  des humanen Analogons von neu wird bei Brust- und Eierstockkrebs  beobachtet und korreliert mit einer schlechten Prognose (Slamon et  al., Science 235, 177-182 (1987); Slamon et al., Science 244, 707-712  (1989); und US Patent Nr. 4 968 603).

   Bis heute ist für humane Tumoren  von keiner Punktmutation analog zu der im neu-Proto-Oncogen berichtet  worden. Überexpression von ErB2 (häufig aber nicht einheitlich auf  Gen-Amplifizierung zurückzuführen) ist auch bei anderen Karzinomen,  einschliesslich Karzinomen von Magen, Endometrium, Speicheldrüse,  Lunge, Niere, Dickdarm, Schilddrüse, Pankreas und Blase beobachtet  worden. Siehe unter anderem King et al., Science 229, 974 (1985);  Yokota et al., Lancet 1, 765-767 (1986); Fukushigi et al., Mol. Cell.  Biol. 6, 955-958 (1986); Geurin et al., Oncogene Res. 3, 21-31 (1988);  Cohen et al., Oncogene 4, 81-88 (1989); Yonemura et al., Cancer Res.  51, 1034 (1991); Borst et al., Gynecol. Oncol. 38, 364 (1990); Weiner  et al., Cancer Res. 49, 6605 (1989); Zhau et al., Mol. Carcinog.  3, 354-357 (1990); Aasland et al., Br. J.

   Cancer 57, 358-363 (1988);  Williams et al., Pathiobiology 59, 46-52 (1991); und McCann et al.,  Cancer 65, 88-92 (1990). 



   ErbB2 kann bei Prostatakrebs überexprimiert werden (Gu et al., Cancer  Lett. 99, 185-9 (1996); Ross et al., Hum. Pathol. 28, 827-33 (1997);  Ross et al., Cancer 79, 2162-70 (1997); und Sadasivan et al., J.  Urol. 150, 126-31 (1993)). 



   Antikörper gegen das Ratten-p185<neu> und Human-ErbB2-Protein-Produkte  sind beschrieben worden. Drebin und Mitarbeiter haben Antikörper  gegen das Ratten-neu-Genprodukt, p185<neu>, hergestellt. Siehe, z.B.  Drebin et al., Cell 41, 695-706 (1985); Myers et al., Meth. Enzym.  198, 277-290 (1991); und WO94/22478. Drebin et al., Oncogene 2, 273-277  (1988), berichten, dass gegen zwei gesonderte p185<neu>-Regionen  reaktive Antikörpermischungen zu synergistischen Anti-Tumor-Effekten  auf neu-transformierte, in nackte Mäuse implantierte NIH-3T3-Zellen  führen. Siehe auch U.S.-Patent 5 824 311, erteilt am 20. Oktober  1998. 



     Hudziak et al., Mol. Cell. Biol. 9(3), 1165-1172 (1989), beschreiben  eine Liste von Anti-ErbB2-Antikörpern, die unter Verwendung der Human-Brusttumor-Zellinie  SK-BR-3 charakterisiert wurden. Relative Zellproliferation der SK-BR-3-Zellen  nach Einwirken der Antikörper wurde mittels KristalIviolett-Färbung  der Monoschichten nach 72 Stunden bestimmt. Mit diesem Assay wurde  maximale Inhibierung mit dem als 4D5 bezeichneten Antikörper erhalten,  der die Zellproliferation um 56% inhibierte. Andere Antikörper dieser  Liste verminderten in diesem Assay die Zellproliferation in einem  geringeren Ausmass. Weiters wurde gefunden, dass der Antikörper 4D5  ErbB2-überexprimierende Brusttumor-Zellinien für die zytotoxischen  Effekte von TNF- alpha  sensitiviert. Siehe auch U.S.-Patent Nr.  5 677 171, erteilt am 14. Oktober 1997.

   Die bei Hudziak et al. diskutierten  ErbB2-Antikörper werden weiter charakterisiert von Fendly et al.,  Cancer Research 50, 1550-1558 (1990); Kotts et al., In Vitro 26(3),  59A (1990); Saruo et al., Growth Regulation 1, 72.82 (1991); Shepard  et al., Clin. Immunol. 11(3), 117-127 (1991); Kumar et al., Mol.  Cell. Biol. 11(2), 979-986 (1991); Lewis et al., Cancer Immunol.  Immunother. 37, 255-263 (1993); Pietras et al., Oncogene 9, 1829-1838  (1994); Vitetta et al., Cancer Research 54, 5301-5309 (1994); Sliwkowski  et al., J. Biol. Chem. 269 (20), 14661-14665 (1994); Scott et al.,  J. Biol. Chem. 266, 14300-5 (1991); D'souza et al., Proc. Natl. Acad.  Sci. 91, 7202-7206 (1994); Lewis et al., Cancer Research 56, 1457-1465  (1996); und Schaefer et al., Oncogene 15, 1385-1394 (1997). 



   Eine rekombinante, humanisierte Version des murinen Anti-ErbB2-Antikörpers  4D5 (huM Ab4D5-8, rhuM Ab HER2 oder HERCEPTIN< <TM> >; U.S.-Patent  Nr. 5 821 337) ist in Patienten mit ErbB2-überexprimierenden metastasierenden  Brustkrebsen, und die eine umfassende Vor-Anti-Krebstherapie erhalten  haben, klinisch aktiv (Baselga et al., J. Clin. Oncol. 14, 737-744  (1996)). HERCEPTIN< <TM> > erhielt die Marktzulassung von der Food  and Drug Administration am 25. September 1998 für die Behandlung  von Patienten mit metastasierendem Brustkrebs, deren Tumore das ErbB2-Protein  überexprimieren. 



     Andere Anti-ErbB2-Antikörper mit verschiedensten Eigenschaften  wurden beschrieben von Tagliabue et al., Int. J. Cancer 47, 933-937  (1991); McKenzie et al., Oncogene 4, 543-548 (1989); Maier et al.,  Cancer Res. 51, 5361-5369 (1991); Bacus et al., Molecular Carcinogenesis  3, 350-362 (1990); Stancovski et al., PNAS (USA) 88, 8691-8695 (1991);  Bacus et al., Cancer Research 52, 2580-2589 (1992); Xu et al., Int.  J. Cancer 53, 401-408 (1993); WO94/00136; Kasprzyk et al., Cancer  Research 52, 2771-2776 (1992); Hancock et al., Cancer Res. 51, 4575-4580  (1991); Shawver et al., Cancer Res. 54, 1367-1373 (1994); Arteaga  et al., Cancer Res. 54, 3758-3765 (1994); Harwerth et al., J. Biol.  Chem. 267, 15160-15167 (1992); U.S.-Patent Nr. 5 783 186; und Klapper  et al., Oncogene 14, 2099-2109 (1997). 



   Homologie-Screening führt zur Identifizierung von zwei anderen Mitgliedern  der ErbB-Rezeptor-Familie; ErbB3 (US-Pat. Nr. 5 183 884 und 5 480  968; wie auch Kraus et al., PNAS (USA) 86, 9193-9197 (1989)) und  ErbB4 (EP Pat. Anm. Nr. 599 274; Plowman et al., Proc. Natl. Acad.  Sci. USA 90, 1746-1750 (1993); und Plowman et al., Nature 366, 473-475  (1993)). Beide dieser Rezeptoren zeigen erhöhte Expression bei zumindest  einigen Brustkrebs-Zelllinien. 



   Die ErbB-Rezeptoren werden im Allgemeinen in verschiedensten Kombinationen  in Zellen gefunden und es wird angenommen, dass Hetero-Dimerisierung  die Diversität zellulärer Antworten auf eine Vielzahl von ErbB-Liganden  steigert (Earp et al., Breast Cancer Research and Treatment 35, 115-132  (1995)). EGFR wird von sechs verschiedenen Liganden gebunden; Epidermis-Wachstumsfaktor  (EGF), transformierender Wachstumsfaktor Alpha (TGF- alpha ), Amphiregulin,  Heparin-bindender Epidermis-Wachstumsfaktor (HB-EGF), Betacellulin  und Epiregulin (Groenen et al., Growth Factors 11, 235-257 (1994)).  Eine Familie von Heregulin-Proteinen, resultierend vom alternativen  Spleissen eines einzelnen Gens, sind Liganden für ErbB3 und ErbB4.

    Die Heregulin-Familie umfasst Alpha-, Beta- und Gamma-Hereguline  (Holmes et al., Science 256, 1205-1210 (1992); U.S.-Patent Nr. 5  641 869; und Schaefer et al., Oncogene 15, 1385-1394 (1994)); neu-Differenzierungsfaktoren  (NDFs), Glial-Wachstumsfaktoren (GGFs);    Acetylcholin-Rezeptor-induzierende  Aktivität (AREA); und sensorisches und motorisches Neuron-abgeleiteter  Faktor (SMDF). Für einen Überblick, siehe Groenen et al., Growth  Factors 11, 235-257 (1994);  G. Lemke, Molec. & Cell. Neurosci.  7, 247-262 (1996) und Lee et al., Pharm. Rev. 47, 51-85 (1995).

   Kürzlich  wurden drei zusätzliche ErbB-Liganden identifiziert; Neuregulin-2  (NRG-2), der entweder ErbB3 oder ErbB4 binden soll (Chang et al.,  Nature 387, 509-512 (1997); und Carraway et al., Nature 387, 512-516  (1997)); Neuregulin-3, das ErbB4 bindet (Zhang et al., PNAS (USA)  94(18), 9562-7 (1997); und Neuregulin-4, das ErbB4 bindet (Harari  et al., Oncogene 18, 2681-89 (1999)). HB-EGF, Betacellulin und Epiregulin  binden ebenfalls an ErbB4. 



   Während EGF und TGF- alpha  nicht an ErbB2 binden, stimuliert EGF  EGFR und ErbB2, um ein Heterodimer zu bilden, das EGFR aktiviert  und zu Transphosphorylierung von ErbB2 im Heterodimer führt. Dimerisierung  und/oder Transphosphorylierung scheinen die ErbB2-Tyrosinkinase zu  aktivieren. Siehe Earp et al. (s.o.). Ebenso wird ein aktiver Signal-Komplex  gebildet, wenn ErbB3 mit ErbB2 co-exprimiert wird und Antikörper  gegen ErbB2 sind in der Lage, diesen Komplex zu zerstören (Sliwkowski  et al., J. Biol. Chem. 269(20), 14661-14665 (1996)). Zusätzlich wird  die Affinität von ErbB3 für Heregulin (HRG) auf einen höheren Affinitätszustand  gesteigert, wenn es mit ErbB2 co-exprimiert wird. Siehe auch Levi  et al., Journal of Neuroscience 15, 1329-1340 (1995); Morrissey et  al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 1431-1435 (1995); und Lewis et  al., Cancer Res. 56, 1457-1465 (1996).

   Bezüglich ErbB2-ErbB3-Komplexes.  ErbB4 bildet wie ErbB3 einen aktiven Signalkomplex mit ErbB2 (Carraway  und Cantley, Cell 78, 5-8 (1994)).   Zusammenfassung der Erfindung  



   Die vorliegende Erfindung betrifft einen Antikörper laut Anspruch  1, Verfahren zu dessen Herstellung sowie dessen Verwendung. 



   In einem ersten Aspekt führt die vorliegende Erfindung zu einem Verfahren  zur Behandlung von Krebs beim Menschen, worin der Krebs den Epidermis-Wachstumsfaktor-Rezeptor  (EGFR) exprimiert, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch  wirksamen Menge eines Antikörpers, der ErbB2 bindet, an den Menschen.                                                          



     Verschiedenste Vorteile der Verwendung eines Antikörpers, der  ErbB2 bindet, zur Behandlung einer solchen Krebsform, im Gegensatz  zu auf EGFR abzielende Medikamente, werden hierin ins Auge gefasst.  Im Speziellen wird EGFR in höchstem Ausmass in Leber und Haut exprimiert,  und dies schafft eine enorme Senke für das aktive Medikament, wo  das Medikament an EGFR bindet. Zusätzlich ist für andere, auf EGFR  abzielende Medikamente, wie z.B. der chimäre Anti-EGFR-Antikörper  C225 und das kleinmolekulare Medikament ZD1839, das EGFR bindet,  Hauttoxizität beobachtet worden. Von Antikörpern, die ErbB2 binden,  wird erwartet, dass sie ein besseres Sicherheitsprofil aufweisen,  als derartige Medikamente. 



   Wo der hierin für die Therapie verwendete Antikörper die Liganden-Aktivierung  eines ErbB-Rezeptors blockiert und/oder eine biologische Eigenschaft  des monoklonalen Antikörpers 2C4 aufweist, werden weitere Vorteile  erreicht. Beispielsweise werden hierin besonders interessierende  Antikörper (z.B. 2C4, einschliesslich humanisierte und/oder deren  affinitätsgereifte Varianten) mit EGFR/ErbB2-, ErbB3/ErbB4- und ErbB2/ErbB3-Heterodimeren  interferieren, während auf ERGF abzielende Medikamente nur mit EGFR  interferieren. Zusätzlich werden die Antikörper hierin, die ErbB2  binden und die Liganden-Aktivierung eines ErbB-Rezeptors blockieren,  komplementär zu auf EGFR abzielende Medikamente sein, wo auf EGFR  abzielende Medikamente zueinander nicht komplementär sind. 



   Weiters führt die Erfindung zu einem Verfahren für die Behandlung  von Krebs in einem Menschen, worin die Krebsform nicht durch Überexpression  eines ErbB2-Rezeptors charakterisiert ist, umfassend die Verabreichung  einer therapeutisch wirksamen Menge eines Antikörpers, der an ErbB2  bindet und die Liganden-Aktivierung eines ErbB-Rezeptors blockiert,  an den Menschen. 



   Zusätzlich führt die vorliegende Erfindung zu einem Verfahren der  Behandlung von Hormon-unabhängigem Krebs in einem Menschen, umfassend  die Verabreichung einer    therapeutisch wirksamen Menge eines Antikörpers,  der an ErbB2-Rezeptor bindet und die Liganden-Aktivierung eines ErbB-Rezeptors  blockiert, an den Menschen. 



   Die Erfindung führt weiters zu einem Verfahren zur Behandlung von  Krebs in einem Menschen, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch  wirksamen Menge von (a) einem ersten Antikörper, der ErbB2 bindet  und das Wachstum von Krebszellen, die ErbB2 überexprimieren, inhibiert;  und (b) eines zweiten Antikörpers, der ErB2 bindet und Liganden-Aktivierung  eines ErbB-Rezeptors blockiert, an den Menschen. 



   Die Erfindung führt auch zu einem Verfahren der Behandlung von Krebs  in einem Menschen, worin der Krebs von der Gruppe bestehend aus Dickdarm-,  Rektal- und Kolorektal-Krebs selektiert wird, umfassend die Verabreichung  einer therapeutisch wirksamen Menge eines Antikörpers, der ErbB2  bindet und Liganden-Aktivierung eines ErbB-Rezeptors blockiert, an  den Menschen. 



   In weiteren Ausführungsformen führt die Erfindung zu Produkten zur  Verwendung (unter anderem) in obigen Verfahren. Beispielsweise führt  die Erfindung zu einem Produkt, umfassend einen Behälter und eine  darin befindliche Zusammensetzung, worin die Zusammensetzung einen  Antikörper, der ErbB2 bindet, umfasst, und weiters eine Packungsbeilage  umfasst, die darauf hinweist, dass die Zusammensetzung zur Behandlung  von Krebs verwendet werden kann, der Epidermis-Wachstumsfaktor-Rezeptor  (EGFR) exprimiert. 



   Die Erfindung betrifft zusätzlich ein Produkt, umfassend einen Behälter  und eine darin befindliche Zusammensetzung, worin die Zusammensetzung  einen Antikörper, der ErbB2 bindet und Liganden-Aktivierung eines  ErbB-Rezeptors blockiert, umfasst, und das weiters eine Packungsbeilage  umfasst, die darauf hinweist, dass die Zusammensetzung verwendet  werden kann, um Krebs zu behandeln, worin der Krebs nicht durch Überexpression  des ErbB2-Rezeptors charakterisiert ist. 



     Die Erfindung betrifft auch ein Produkt, umfassend einen Behälter  und eine darin enthaltene Zusammensetzung, worin die Zusammensetzung  einen Antikörper, der ErbB2 bindet und Liganden-Aktivierung eines  ErbB-Rezeptors blockiert, umfasst, und umfasst weiters eine Packungsbeilage,  die darauf hinweist, dass die Zusammensetzung zur Behandlung von  hormonunabhängigem Krebs verwendet werden kann. 



   In einer weiteren Ausführungsform wird ein Produkt bereitgestellt,  das umfasst: (a) einen ersten Behälter mit einer darin enthaltenen  Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung einen ersten Antikörper,  der ErbB2 bindet und das Wachstum von Krebszellen, die ErbB2 überexprimieren,  hemmt; und (b) einen zweiten Behälter mit einer darin enthaltenen  Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung einen zweiten Antikörper,  der ErbB2 bindet und die Liganden-Aktivierung eines ErbB-Rezeptors  blockiert, umfasst. 



   Ein weiteres Produkt wird bereitgestellt, das einen Behälter und  eine darin enthaltene Zusammensetzung, worin die Zusammensetzung  einen Antikörper, der ErbB2 bindet und die Liganden-Aktivierung -eines  ErbB-Rezeptors blockiert, umfasst, und weiters eine Packungsbeilage  umfasst, die darauf hinweist, dass die Zusammensetzung zur Behandlung  einer Krebsform, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Dickdarm-,  Rektal- und Kolorektal-Krebs, verwendet werden kann. 



   Die Erfindung stellt zusätzlich bereit: einen humanisierten Antikörper,  der ErbB2 bindet und Liganden-Aktivierung eines ErbB-Rezeptors blockiert;  eine Zusammensetzung, enthaltend den humanisierten Antikörper und  einen pharmazeutisch vertretbaren Träger; sowie ein Immunkonjugat,  umfassend den humanisierten Antikörper, konjugiert mit einem cytotoxischen  Mittel. 



   Weiters stellt die Erfindung bereit: isolierte Nukleinsäure, die  für den humanisierten Antikörper kodiert; einen Vektor, der die Nukleinsäure  enthält; eine Wirtszelle, die die Nukleinsäure oder den Vektor enthält;  sowie ein Verfahren zur Produktion des humani   sierten Antikörpers,  einschliesslich die Kultivierung einer Wirtszelle die die Nukleinsäure  enthält, so dass die Nukleinsäure exprimiert wird, und weiters gegebenenfalls  die Gewinnung des humanisierten Antikörpers aus der Wirtszellenkultur  (z.B. aus dem Wirtszellen-Kulturmedium). 



   Die Erfindung betrifft weiters ein Immunkonjugat, umfassend einen  Antikörper, der ErbB2 bindet, konjugiert an ein oder mehrere Calichaemicin-Moleküle  und die Verwendung solcher Konjugate zur Behandlung ErbB2-exprimierender  Krebsformen, z.B. ErbB2-überexprimierender Krebs, in einem Menschen.  Vorzugsweise ist der Antikörper im Konjugat monoklonaler Antikörper  4D5, z.B. humanisierter 4D5 (und vorzugswiese huMAb4D5-8 (HERCEPTIN<  <TM> >)); oder monoklonaler Antikörper 2C4, z.B. humanisierter 2C4.  Der Antikörper im Immunkonjugat kann ein intakter Antikörper (z.B.  ein intakter lgG 1 Antikörper) oder ein Antikörperfragment (z.B.  ein Fab, F(ab)' 2 , Diakörper, usw.) sein.

     Kurzbeschreibung  der Zeichnungen        Die Fig. 1A und 1B beschreiben die  Epitop-Kartierung der Reste 22-645 innerhalb der extrazellulären  Domäne (ECD) von ErbB2 (Aminosäuresequenz, einschliesslich Signalsequenz,  gezeigt in Fig. 1A; Seq.-ID Nr. 13), wie bestimmt mittels Trunkations-Mutanten-Analyse  und ortsgerichteter Mutagenese (Nakamura et al., J. of Virology 67(10),  6179-6191 (1991); und Renz. et al., J. Cell. Biol. 125(6), 1395-1406  (1994)). Die verschiedenen ErbB2-ECD-Trunkationen wurden als gD-Fusionsproteine  in einem Säugetier-Expressionsplasmid exprimiert. Dieses Expressionsplasmid  verwendet den Cytomegalievirus-Promotor/Enhancer mit SV40-Terminations-  und Polyadenylierungs-Signalen, die stromabwärts der insertierten  cDNA lokalisiert ist. Plasmid-DNA wurde in 293 Zellen transfiziert.

    Einen Tag nach der Transfektion wurden die Zellen über Nacht metabolisch  markiert, und zwar in Methionin- und Cystein-freiem, Glucose-armem  DMEM, enthaltend 1% dialysiertes Fetal-Rinderserum und jeweils 25  mu Ci <35>S-Methionin und <35>S-Cystein. Überstände wurden gesammelt,  und es wurden entweder die   monoklonalen Anti-ErbB2-Antikörper oder  Kontroll-Antikörper dem Überstand zugesetzt und 2-4 Stunden bei 4  DEG C inkubiert. Die Komplexe wurden präzipitiert, auf ein 10-20%  Tricin-SDS-Gradientengel aufgetragen und Elektrophorese bei 100 V  durchgeführt. Das Gel wurde auf eine Membran elektrogeblottet und  mittels Autoradiographie analysiert. Wie in Fig. 1B gezeigt, binden  die Antikörper 7C2, 7F3, 2C4, 7D3, 3E8, 4D5, 2H11 und 3H4 verschiedenste  ErbB2-ECD-Epitope.

       Die Fig. 2A und 2B zeigen den Effekt der  monoklonalen Anti-ErbB2-Antikörper 2C4 und 7F3 auf die rHRG beta  1-Aktivierung von MCF7-Zellen. Fig. 2A zeigt Dosis-Antwort-Kurven  von 2C4- oder 7F3-lnhibierung von HRG-Stimulation der Tyrosin-Phosphorylierung.  Fig. 2B zeigt Dosis-Antwort-Kurven für die Inhibierung von <125>l-markiertem  rHRG beta 1  177-244 -Bindung and MCF7-Zellen durch 2C4 und 7F3.     Fig. 3 beschreibt die Inhibierung der spezifischen Bindung  von <125>l-markiertem rHRG beta 1 177 _ 2  44  an eine Liste von  humanen Tumor-Ziellinien durch die monoklonalen Anti-ErbB2-Antikörper  2C4 oder 7F3. Monoklonale Antikörper-Kontrollen sind Isotypen-übereinstimmende,  murine monoklonale Antikörper, die die rHRG-Bindung nicht blockieren.

    Unspezifische Bindung von <125>l-markiertem rHRG beta 1 177  -  2  44  wurde aus parallelen Inkubationen, durchgeführt in Gegenwart  von 100 nM rHRG beta 1, bestimmt. Werte für unspezifische Bindung  von <125>l-markiertem rHRG beta 1  177-  2  44  waren unter 1% der  aller getesteten Ziellinien.     Die Fig. 4A und 4B zeigen den  Effekt der monoklonalen Antikörper 2C4 und 4D5 auf die Proliferation  von MDA-MB-175- (Fig. 4A) und SK-BR-3- (Fig. 4B) Zellen. MDA-MB-175-  und SK-BR-3-Zellen wurden in 96-Napf-Platten geimpft und für 2 Stunden  anhaften gelassen. Das Experiment wurde in 1% Serum enthaltendem  Medium durchgeführt. Anti-ErbB2-Antikörper oder Medium alleine wurden  den Zellen zugesetzt und für 2 Stunden bei 37 DEG C inkubiert. Anschliessend  wurde rHRG beta 1 (1 nM) oder Medium alleine zugesetzt und die Zellen  für 4 Tage inkubiert.

   Monoschichten wurde gewaschen und mit   0,5%  Kristall-violett gefärbt/fixiert. Zur Bestimmung der Zellproliferation  wurde die Absorption bei 540 nm gemessen.     Die Fig. 5A und 5B  zeigen den Effekt von monoklonalem Antikörper 2C4, HERCEPTIN< <TM>  >-Antikörper oder einem Anti-ErbB2-Antikörper auf die Heregulin-(HRG-)abhängige  Assoziierung von ErbB2 mit ErbB3 in niedrige/normale ErbB2-Spiegel  (Fig. 5BA exprimierenden MCF7-Zellen und hohe Spiegel von ErbB2 (Fig.  5B) exprimierenden SK-BR-3-Zellen; siehe Beispiel 2 unten.      Die Fig. 6A und 6B vergleichen die Aktivitäten von intaktem, murinen  monoklonalen Antikörper 2C4 (mu-2C4) und einem Chimären 2C4-Fab-Fragment.  Fig. 6A zeigt die Inhibierung der <125>I-HRG-Bindung an MCF7-Zellen  durch den chimären 2C4-Fab- oder intakten, murinen monoklonalen Antikörper  2C4.

   MCF7-Zellen wurden in 24-Napf-Platten (1  x  10<5> Zellen/Napf)  inokuliert und für 2 Tage auf ungefähr 85% Konfluenz gezüchtet. Bindungsexperimente  wurden wie in Lewis et al., Cancer Research 56, 1457-1465 (1996)  durchgeführt. Fig. 6B beschreibt die Inhibierung der rHRG beta 1-Aktivierung  der p180-Tyrosin-Phosphorylierung in MCF7-Zellen, die wie in Lewis  et al., Cancer Research 56, 1457-1465 (1996), durchgeführt wurde.

       Die Fig. 7A und 7B beschreiben Anordnungen der Aminosäure-Sequenzen  von variablen Leicht- (V L ) (Fig. 7A) und variablen Schwerketten-Domänen  (V H ) (Fig. 7B) des murinen monoklonalen Antikörpers 2C4 (Seq.-ID  Nr. 1 bzw. 2); V L - und V H -Domänen der humanisierten 2C4-Version  von 574 (Seq.-ID Nr. 3 bzw. 4) und humanen V L - und V H -Konsensus-Gerüsten  (hum- kappa i, leichte Kappa-Untergruppe I; humIII, schwere Untergruppe  III) (Seq.-ID Nr. 5 bzw. 6). Sterne identifizieren Unterschiede zwischen  der humanisierten 2C4-Version 574 und dem murinen monoklonalen Antikörper  2C4 oder zwischen der humanisierten 2C4-Version 574 und dem Humangerüst.  Komplementarität bestimmende Regionen (CDRs) sind in eckigen Klammern  gezeigt.

         Die Fig. 8A bis C zeigen die Bindung von chimären  Fab-2C4 (Fab.v1) und mehreren humanisierten 2C4-Varianten an die  extrazelluläre ErbB2-Domäne (ECD), wie bestimmt mittels ELISA in  Beispiel 3.     Fig. 9 ist eine Bandgrafik der V L - und V H -Domänen  des monoklonalen Antikörpers 2C4 mit markiertem CDR-Grundgerüst (L1,  L2; L3, H1, H2, H3). V H -Seitenketten, mittels Mutagenese während  Humanisierung evaluiert (siehe Beispiel 3, Tabelle 2), sind ebenfalls  gezeigt.     Fig. 10 beschreibt den Effekt des von monoklonalen  Antikörper 2C4 oder HERCEPTIN< <TM> > auf EGF-, TGF- alpha - oder  HRG-vermittelte Aktivierung von mitogen-aktivierter Proteinkinase  (MAPK).     Fig. 11 ist ein Balkendiagramm, das den Effekt von  Anti-ErbB2-Antikörpern (alleine oder in Kombinationen) auf Calu3-Lungen-Adenokarzinom-Pfropfungen  (3+ ErbB2 Überexprimierer) zeigt.

   Hinweis: Behandlung am Tag 24 gestoppt.     Fig. 12 beschreibt den Effekt von rekombinantem, humanisiertem  monoklonalen Antikörper 2C4 (rhuMAb 2C4) oder HERCEPTIN< <TM> > auf  das Wachstum von MDA-175-Zellen, bewertet in einem Alamarblau-Assay.     Fig. 13 zeigt die Effizienz von rhuMab 2C4 gegen MCF7-Xenografts.    Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen   I. Definitionen  



   Ein "ErbB-Rezeptor" ist eine Rezeptorprotein-Tyrosinkinase, die zur  ErbB-Rezeptorfamilie gehört und EGFR-, ErbB2-, ErbB3- und ErbB4-Rezeptoren  umfasst, sowie in Zukunft zu identifizierende, andere Mitglieder  dieser Familie. Der ErbB-Rezeptor wird im    Allgemeinen umfassen:  eine extrazelluläre Domäne, die an einen ErbB-Liganden binden kann;  eine lipophile Transmembran-Domäne; eine konservierte intrazelluläre  Tyrosinkinase-Domäne; und eine carboxylterminale, mehrere phosphorylierbare  Tyrosin-reste tragende Signaldomäne. Der ErbB-Rezeptor kann eine  "Nativsequenz"-ErbB-Rezeptor oder eine derer "Aminosäuresequenz-Varianten"  sein. Vorzugsweise ist der ErbB-Rezeptor der humane Nativsequenz-ErbB-Rezeptor.                                                



   Die Begriffe "ErbB1", "Epidermis-Wachstumsfaktor-Rezeptor" und "EGFR"  werden hierin austauschbar verwendet und betreffen EGFR, wie offenbart  z.B. in Carpenter et al., Ann. Rev. Biochem. 56, 881-914 (1987),  umfassend deren natürlich auftretenden Mutantenformen (z.B. eine  Deletionsmutante -EGFR, wie bei Humphrey et al., PNAS (USA) 87, 4207-4211  (1990)). ErbB1 betrifft das Gen, das für das -EGFR-Protein-Produkt  kodiert. 



   Die Ausdrücke "ErbB2" und "HER2" werden hierin austauschbar verwendet  und betreffen das humane HER2-Protein, beschrieben z.B. in Semba  et al., PNAS (USA) 82, 6497-6501 (1985); und Yamamoto et al., Nature  319, 230-234 (1986) (Genbank-Zugangsnummer X03363). Der Begriff "erbB2"  betrifft das Gen, welches für humanes ErbB2 kodiert, und "neu" betrifft  das Gen, welches für Ratten-p185<neu> kodiert. Bevorzugtes ErbB2  ist humanes Nativsequenz-ErbB2. 



   "ErbB3" und "HER3" betreffen das Rezeptor-Polypeptid, wie offenbart  in z.B. US-Patent Nr. 5 183 884 und 5 480 968, wie auch Kraus et  al., PNAS (USA) 86, 9193-9197 (1989). 



   Die Begriffe "ErbB4" und "HER4" betreffen hierin das Rezeptor-Polypeptid  wie offenbart in z.B. der EP-Patentanmeldung Nr. 559 274; Plowman  et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 90, 1746-1750 (1993); und Plowman  et al., Nature 366, 473-475 (1993), einschliesslich dessen Isoformen,  wie z.B. offenbart in WO99/19488, publiziert am 22. April 1999. 



     Mit "ErbB-Ligand" ist ein Polypeptid gemeint, das an den ErbB-Rezeptor  bindet und/oder diesen aktiviert. Das der hierin speziell interessierende  ErbB-Ligand ist ein humaner Nativsequenz-ErbB-Ligand, wie z.B. Epidermis-Wachstumsfaktor  (EGF) (Savage et al., J. Biol. Chem. 247, 7612-7621 (1992)); transformierender  Wachstumsfaktor Alpha (TGF- alpha ) (Marquardt et al., Science 223,  1079-1082 (1984)); Amphiregulin, auch bekannt als Schwanoma- oder  autokriner Keratinocyten-Wachstumsfaktor (Shoyab et al., Science  243, 1074-1076 (1989); Kimura et al., Nature 348, 257-260 (1990);  und Cook et al., Mol. Cell. Biol. 11, 2547-2557 (1991)); Betacellulin  (Shing et al., Science 259, 1604-1607 (1993); und Sasada et al.,  Biochem. Biophys. Res.

   Commun. 190, 1173 (1993)); Heparin-bindender  Epidermis-Wachstumsfaktor (HB-EGF) (Higashiyama et al., Science 251,  936-939 (1991)); Epiregulin (Toyoda et al., J. Biol. Chem. 270, 7495-7500  (1995); und Komurasaki et al., Oncogene 15, 2841-2848 (1997)); ein  Heregulin (siehe unten); Neuregulin-2 (NRG-2) (Carraway et al., Nature  387, 512-516 (1997)); Neureguliert-3 (NRG-3) (Zhang et al., Proc.  Natl. Acad. Sci. 94, 9562-9567 (1997)); Neuregulin-4 (NRG-4) (Harari  et al., Oncogene 18, 2681-89 (1999)) oder Cripto (CR-1) (Kannan et  al., J. Biol. Chem. 272(6), 3330-3335 (1997). ErbB-Liganden, die  EGFR binden, umfassen EGF, TGF- alpha , Amphiregulin, Betacellulin,  HB-EGF und Epiregulin. ErbB-Liganden, die ErbB3 binden, umfassen  Hereguline. ErbB-Liganden, die in der Lage sind, ErbB4 zu binden,  umfassen Betacellulin, Epiregulin, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 und  Hereguline. 



   "Heregulin" (HRG), wenn hierin verwendet, betrifft ein Polypeptid,  das durch das Heregulin-Genprodukt kodiert wird, wie offenbart in  U.S.-Patent Nr. 5 641 869 oder Marchionni et al., Nature 362, 312-318  (1993). Beispiele für Hereguline umfassen Heregulin- alpha , Heregulin-  beta 1, Heregulin- beta 2 und Heregulin- beta 3 (Holmes et al., Science  256, 1205-1210 (1992); und U.S.-Patent Nr. 5 641 869); neu-Differenzierungsfaktor  (NDF) (Peles et al., Cell 69, 205-216 (1992)); Acetylcholin-Rezeptor-induzierende  Aktivität (ARIA) (Falls et al., Cell 72, 801-815 (1993)); Glial-Wachstumsfaktoren  (GGFs) (Marchionni et al., -Nature 362, 312-318 (1993)); sensorisches  und motorisches Neuron-abgeleiteter Faktor (SMDF) (Ho et al., J.  Biol. Chem. 270, 14523-14532 (1995));  gamma -Heregulin    (Schaefer  et al., Oncogene 15, 1385-1394 (1997)).

   Der Begriff inkludiert biologisch  aktive Fragmente und/oder Aminosäuresequenz-Varianten eines Nativsequenz-HRG-Polypeptids,  wie z.B. ein vEGF-artiges Domänen-Fragment davon (z.B. rHRG beta  1 177 _ 24 4 ). 



   Ein "ErbB-Hetero-Oligomer" ist hierin ein nicht-kovalent assoziiertes  Oligomer, umfassend mindestens zwei verschiedene ErbB-Rezeptoren.  Solche Komplexe können gebildet werden, wenn eine Zelle, die zwei  oder mehrere ErbB-Rezeptoren exprimiert, einem ErbB-Liganden ausgesetzt  wird, und kann mittels Immunpräzipitation isoliert und mittels SDS-PAGE  analysiert werden, wie z.B. in Sliwkowski et al., J. Biol. Chem.  269(20), 14661-14665 (1994) beschrieben ist. Beispiele solcher ErbB-Hetero-Oligomere  umfassen EGFR-ErbB2-, ErbB2-ErbB3- und ErbB3-ErbB4-Komplexe. Überdies  können die ErbB-Hetero-Oligomere zwei oder mehrere ErbB2-Rezeptoren,  kombiniert mit einem verschiedenen ErbB-Rezeptor, wie z.B. ErbB3,  ErbB4 oder EGFR, beinhalten. Andere Proteine, wie z.B. eine Cytokin-Rezeptor-Untereinheit  (z.B. pg130), können im Hetero-Oligomer umfasst sein. 



   Mit "Liganden-Aktivierung eines ErbB-Rezeptors" ist Signalübertragung  gemeint (z.B. jene, die von einer intrazellulären Kinase-Domäne eines  ErbB-Rezeptors verursacht wird, die Tyrosin-Reste im ErbB-Rezeptor  oder ein Substrat-Polypeptid phosphoryliert), vermittelt durch ErbB-Ligandenbindung  an ein ErbB-hetero-Oligomer, umfassend den ErbB-Rezeptor von Interesse.  Im Allgemeinen wird dies die Bindung eines ErbB-Liganden an ein ErbB-hetero-Oligomer  beinhalten, was eine Kinase-Domäne von einer oder mehrerer der ErbB-Rezeptoren  im Hetero-Oligomer aktiviert, und so zur Phosphorylierung von Tyrosin-Resten  in einem oder mehreren der ErbB-Rezeptoren und/oder zur Phosphorylierung  von Tyrosin-Resten in (einem) zusätzlichen Substrat-Polypeptid(en)  führt. ErbB-Rezeptor-Aktivierung kann mittels verschiedener Phosphorylierungs-Tests  quantifiziert werden. 



   Ein "Nativsequenz"-Polypeptid ist eines, das dieselbe Aminosäuresequenz  wie ein von der Natur hergeleitetes Polypeptid (z.B. ErbB-Rezeptor  oder ErbB-Ligand) besitzt. Solche    Nativsequenz-Polypeptide können  aus der Natur isoliert oder auf rekombinante oder synthetische Weise  hergestellt werden. Folglich kann ein Nativsequenz-Polypeptid die  Aminosäuresequenz eines natürlich auftretenden humanen Polypeptids,  eines murinen Polypeptids, oder eines Polypeptids von jeder anderen  Säugetier-Spezies besitzen. 



   Der Begriff "Aminosäuresequenz-Variante" betrifft Polypeptide mit  Aminosäuresequenzen, die sich in einem gewissen Ausmass von einem  Nativsequenz-Polypeptid unterscheiden. Normalerweise werden Aminosäuresequenz-Varianten  zumindest 70% Homologie mit zumindest einer Rezeptor-Bindungsdomäne  eines nativen ErbB-Liganden, oder mit zumindest einer Liganden-Bindungsdomäne  eines nativen ErbB-Rezeptors aufweisen, und vorzugsweise werden sie  zumindest zu 80%, stärker bevorzugt zumindest zu 85% homolog zu solchen  Rezeptor- oder Liganden-Bindungsdomänen sein. Die Aminosäuresequenz-Varianten  besitzen an bestimmten Stellen Substitutionen, Deletionen und/oder  Insertionen innerhalb der Aminosäuresequenz der nativen Aminosäuresequenz.                                                     



   "Homologie" wird definiert als der Prozentanteil von identischen  Resten in der Aminosäuresequenz-Variante, nach gegebenenfalls erforderlicher  Ausrichtung der Sequenzen und Einführung von Leerstellen, um die  maximalen %-Homologie zu erzielen. Verfahren und Computerprogramme  für die Ausrichtung sind gut fachbekannt. Ein solches Computerprogramm  ist "Align 2", verfasst von Genentech, Inc., das mit Benutzer-Dokumentation  im United States Copyright Office, Washington, DC 20559, am 10. Dezember  1991, abgelegt wurde. 



   Der Begriff "Antikörper", wie hierin im weitesten Sinne verwendet,  umfasst im Speziellen intakte monoklonale Antikörper, polyklonale  Antikörper, multispezifische Antikörper (z.B. bispezifische Antikörper),  die aus mindestens zwei intakten Antikörpern gebildet werden, und  Antikörperfragmente, solange sie die gewünschte biologische Aktivität  aufweisen. 



     Der Begriff "monoklonaler Antikörper", wie er hierin verwendet  wird, betrifft einen Antikörper, der aus einer Population im Wesentlichen  homogener Antikörper erhalten wird, d.h. die einzelnen im der Population  enthaltenen Antikörper sind identisch, abgesehen von natürlich auftretenden  Mutationen, die in geringem Ausmass vorhanden sein können. Monoklonale  Antikörper sind höchst spezifisch und sind gegen eine einzelne Antigen-Stelle  gerichtet. Weiters ist jeder monoklonale Antikörper, im Gegensatz  zu polyklonalen Antikörper-Präparaten, die verschiedene Antikörper  gegen verschiedene Determinanten (Epitope) beinhalten, gegen eine  einzelne Determinante am Antigen gerichtet. Zusätzlich zu ihrer Spezifität,  sind monoklonale Antikörper in der Weise vorteilhaft, dass sie unkontaminiert  durch andere Antikörper synthetisiert werden können.

   Die nähere Bestimmung  "monoklonal" bezeichnet den Charakter des Antikörpers als von einer  im Wesentlichen homogenen Population von Antikörpern herstammend,  und ist nicht dahingehend auszulegen, dass die Produktion des Antikörpers  ein bestimmtes Verfahren erfordert. Beispielsweise können die gemäss  der vorliegenden Erfindung zu verwendenden monoklonalen Antikörper  mit dem erstmals von Kohler et al., Nature 256, 495 (1975), beschriebenen  Hybridom-Verfahren oder mittels rekombinanter DNA-Verfahren (siehe  z.B. U.S.-Patent Nr. 4 816 567) hergestellt werden. Die "monoklonalen  Antikörper" können beispielsweise auch von Phagen-Antikörperbibliotheken,  unter Verwendung der in Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991),  und Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991), beschriebenen  Techniken isoliert werden. 



   Die monoklonale Antikörper umfassen hierin insbesondere "chimäre"  Antikörper, in denen ein Teil der schweren und/oder leichten Kette  identisch mit oder homolog zu entsprechenden Sequenzen in Antikörpern  sind, die von einer bestimmten Spezies hergeleitet sind oder zu einer  bestimmten Antikörper-Klasse oder Unterklasse gehören, während die  verbleibende(n) Ketten(n) identisch mit oder homolog zu entsprechenden  Antikörper-Sequenzen ist/sind, die von einer anderen Spezies hergeleitet  sind oder zu einer anderen Antikörper-Klasse oder Unterklasse gehören,  sowie zu Fragmenten solcher Antikörper, solange sie die gewünschte  biologische Aktivität aufwiesen (U.S.Patent Nr. 4 816 567; und Morrison  et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855    (1984)).

   Chimäre  Antikörper von Interesse umfassen hierin "primatisierte" Antikörper,  beinhaltend antigenbindende Sequenzen variabler Domänen, die von  einem nichthumanen Primaten (z.B. Altwelt-Affen, Menschenaffen) herrühren,  und humaner Kon-stantregion-Sequenzen. 



   "Antikörperfragmente" umfassen einen Teil eines intakten Antikörpers,  vorzugsweise dessen antigenbindende oder variable Region. Beispiele  von Antikörperfragmenten umfassen Fab-, Fab'-, F(ab') 2 -, und Fv-Fragmente;  Diakörper; lineare Antikörper; Einzelketten-Antikörper-Moleküle und  multispezifische, aus Antikörperfragment(en) gebildete Antikörper.                                                             



   Ein "intakter" Antikörper ist einer, der sowohl ein antigenbindende  variable Region als auch eine konstante Leichtketten-Domäne (C L  ) und konstante Schwerketten-Domänen C H 1, C H 2, und C H 3 umfasst.  Die konstanten Domänen können konstante Nativsequenz-Domänen (z.B.  humane konstante Nativsequenz-Domänen) oder deren Aminosäuresequenz-Varianten  sein. Vorzugsweise hat der intakte Antikörper eine oder mehrere Effektorfunktionen.                                            



   Antikörper-"Effektorfunktionen" betreffen jene biologischen Aktivitäten,  die der Fc-Region (eine Nativsequenz-Fc-Region oder Aminosäuresequenz-Varianten-Fc-Region)  eines Antikörpers zuzuordnen sind. Beispiele von Antikörper-Effektorfunktionen  umfassen C1q-Bindung; komplementabhängige Zytotoxizität; Fc-Rezeptorbindung;  Antikörperabhängige, zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC); Phagozytose;  Down-Regulierung von Oberflächen-Rezeptoren (z.B. B-Zellen-Rezeptor;  BCR) usw. 



   In Abhängigkeit von der Aminsäuresequenz der konstanten Domäne ihrer  schweren Ketten, können intakte Antikörper verschiedenen "Klassen"  zugeordnet werden. Es gibt fünf Hauptklassen intakter Antikörper:  IgA, IgD, IgE, IgG und IgM, und mehrere von diesen können in "Unterklassen"  (Isotypen) unterteilt werden, z.B. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA und  IgA2.  Die konstanten  Schwerkettendomänen,  die den  verschiedenen    Antikörperklassen entsprechen, heissen  alpha ,  delta ,  epsilon  ,  gamma  bzw.  mu . Die Strukturen der Untereinheiten und dreidimensionale  Konfigurationen der verschiedenen Immunglobulin-Klassen sind gut  bekannt. 



   "Antikörper-abhängige, zellvermittelte Zytotoxizität" und "ADCC"  betreffen eine zellvermittelte Reaktion, in der unspezifische zytotoxische  Zellen, die in Fc-Rezeptoren (FcRs) (z.B. natürliche Killerzellen  (NK), Neutrophile und Makrophagen) exprimieren, an eine Zielzelle  gebundene Antikörper erkennen und darauf folgend Lyse der Zielzelle  verursachen. Die primären ADCC-vermittelnden Zellen, NK-Zellen, exprimieren  ausschliesslich Fc gamma RIII, wogegen Monozyten Fc gamma RI, Fc  gamma RII und Fc gamma RIII exprimieren. FcR-Expression an hämapoetischen  Zellen ist in Tabelle 3 auf Seite 464 in Ravetch and Kinet, Annu.  Rev. Immunol. 9, 457-92 (1991) zusammengefasst. Um die ADCC-Aktivität  eines Moleküls von Interesse zu bewerten, kann ein in vitro ADCC-Assay,  wie z.B. der in U.S.-Patent Nr. 5 500 362 oder 5 821 337 beschriebene,  ausgeführt werden.

   Nützliche Effektorzellen für solche Tests umfassen  mononukleare Peripherblutzellen (PBMC) und natürliche Killerzellen  (NK). Alternativ dazu oder zusätzlich kann ADCC-Aktivität des Moleküls  von Interesse in vivo beurteilt werden, z.B. in einem Tiermodell  wie dem offenbart in Clynes et al., PNAS (USA) 95, 652-656 (1998).                                                             



   "Human-Effektorzellen" sind Leukozyten, die eine oder mehrere FcRs  exprimieren und Effektorfunktionen ausführen. Vorzugsweise exprimieren  die Zellen zumindest Fc gamma RIII und verrichten die ADCC-Effektorfunktion.  Beispiele humaner Leukozyten, die ADCC vermitteln, umfassen mononukleare  Peripherblutzellen (PBMC), natürliche Killerzellen (NK), Monozyten,  zytotoxische T-Zellen und Neutrophile; wobei PBMCs und NK-Zellen  bevorzugt werden. Die Effektorzellen können aus einer ihrer natürlichen  Quellen, z.B. aus Blut oder PBBCs, wie hierin beschrieben, isoliert  werden. 



   Die Begriffe "Fc-Rezeptor" oder "FcR" werden verwendet, um einen  Rezeptor zu beschreiben, der an die Fc-Region eines Antikörpers bindet.  Der bevorzugte FcR ist ein humanes Nativsequenz-FcR. Ausserdem ist  ein bevorzugter FcR einer, der an IgG-An   tikörper (ein Gamma-Rezeptor)  bindet und umfasst Rezeptoren der Fc gamma RI-, Fc gamma RII- und  Fc gamma RIII-Unterklassen, einschliesslich allelischer Varianten  und alternativ gespleisster Formen dieser Rezeptoren. Fc gamma RII-Rezeptoren  umfassen Fc gamma RHA (ein "aktivierender Rezeptor") und Fc gamma  RIlB (ein "inhibierender Rezeptor"), die ähnliche Aminosäure-Sequenzen  besitzen, die sich primär in deren Cytoplasma-Domänen unterscheiden.  Aktivierender Rezeptor Fc gamma RIIA enthält ein Immunrezeptor-Tyrosin-basierendes-Aktivierungsmotiv  (ITAM), in dessen Cytoplasma-Domäne.

   Inhibierender Rezeptor Fc gamma  RIlB enthält ein Immunrezeptor-Tyrosin-basierendes-lnhibierungsmotiv  (ITIM), in dessen Cytoplasma-Domäne (siehe Übersichtsartikel M. in  Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15, 203-234 (1997)). Übersichtsartikel  über FcRs sind Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9, 457-92 (1991);  Capel et al., Immunoemethods 4, 25-34 (1994); und de Haas et al.,  J. Lab. Clin. Med. 126, 330-41 (1995). Andere FcRs, einschliesslich  jene in Zukunft zu identifizierende, werden hierin durch den Begriff  "FcR" umfasst. Der Begriff umfasst auch den neonatalen Rezeptor,  FcRn, der für den Transfer maternaler IgGs in den Fetus verantwortlich  ist (Guyer et al., J. Immunol. 117, 587 (1976) und Kim et al.,J.  immunol. 24, 249 (1994)). 



   "Komplement-abhängige Zytotoxizität" oder "CDC" betrifft die Fähigkeit  eines Moleküls, in Gegenwart von Komplement ein Ziel zu lysieren.  Der Stoffwechselweg der Komplement-Aktivierung wird durch die Bindung  der ersten Komponente des Komplementsystems (C1q) an ein Molekül  (z.B. ein Antikörper), komplexiert mit einem zugehörigen Antigen,  initiiert. Zur Beurteilung von Komplement-Aktivierung kann ein CDC-Assay,  wie z.B. in Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202, 163  (1996), durchgeführt werden. 



   "Native Antikörper"  sind gewöhnlich heterotetramere Glykoproteine  von ungefähr 150 000 Dalton, zusammengesetzt aus zwei identischen  leichten (L) Ketten und zwei identischen schweren (H) Ketten. Jede  leichte Kette ist über eine kovalente Disulfidbindung an eine schwere  Kette gebunden, während die Anzahl von Disulfidbrücken unter den  schweren Ketten verschiedener Immunglobulin-Isotypen variiert. Jede  schwere und    leichte Kette besitzt in regelmässigen Abständen auch  Interketten-Disulfidbrücken. Jede schwere Kette hat an einem Ende  eine variable Domäne (V H ), gefolgt von einer Anzahl konstanter  Domänen. Jede leichte Kette hat an einem Ende eine variable Domäne  (V L ) und eine konstante Domäne am anderen Ende.

   Die konstante Domäne  der leichten Kette ist mit der ersten konstanten Domäne der schweren  Kette ausgerichtet, und die variable Leichtketten-Domäne ist mit  der variablen Domäne der schweren Kette ausgerichtet. Es wird angenommen,  dass bestimmte Aminosäurereste eine Schnittstelle zwischen den Domänen  der leichten Kette und schweren Kette bildet. 



   Der Begriff "variabel" betrifft die Tatsache, dass sich bestimmte  Teile der variablen Domänen von Antikörpern in ihrer Sequenz stark  unterscheiden und für die Bindung und Spezifität jedes einzelnen  Antikörpers für ihr spezielles Antigen gebraucht werden. Die Variabilität  ist jedoch über die variablen Domänen von Antikörpern nicht gleichmässig  verteilt. Sie ist in drei Segmenten der variablen Domänen, genannt  hypervariable Regionen, von sowohl leichter als auch schwerer Kette  konzentriert. Die stärker konservierten Teile der variablen Domänen  heissen Gerüst-Regionen (FRs).

   Jede der variablen Domänen von nativen  schweren und leichten Ketten beinhalten vier FRs, die grösstenteils  eine  beta -Faltblattkonfiguration einnehmen, durch drei hypervariable  Regionen verbunden sind, die Schleifen bilden, die die  beta -Faltblattstruktur  verbinden und in manchen Fällen bilden. Die hypervariablen Regionen  in jeder Kette werden durch die FRs in unmittelbarer Nähe zusammengehalten,  und tragen mit den hypervariablen Regionen der anderen Kette zur  Bildung der Antigen-bindenden Stelle von Antikörpern bei (siehe Kabat  et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. Auflage,  Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, M.D.,  USA (1991)). Die konstanten Domänen sind nicht direkt an der Bindung  eines Antikörpers an ein Antigen beteiligt, zeigen jedoch verschiedene  Effektorfunktionen, wie z.B.

   Beteiligung des Antikörpers in Antikörper-abhängiger  Zellzytotoxizität (ADCC). 



   Der Begriff "hypervariable Region", wenn hierin verwendet, betrifft  die Aminosäurereste eines Antikörpers, die für die Antigenbindung  verantwortlich sind. Die hypervariable    Region umfasst im Allgemeinen  Aminosäurereste einer Komplementarität bestimmenden Region oder "CDR"  (z.B. Reste 24-34 (L1), 50-56 (L2) und 89-97 (L3) in der variablen  Domäne der leichten Kette und 31-35 (H1), 50-65 (H2) und 95-102 (H3)  in der variablen Domäne der schweren Kette; Kabat et al., Sequences  of Pro-teins of Immunological Interest, 5. Auflage, Public Health  Service, National Institutes of Health, Bethesda, M.D., USA (1991)  und/oder jene Reste einer "hypervariablen Schleife" (z.B. Reste 26-32  (L1), 50-52 (L2) und 91-96 (L3) in der variablen Domäne der leichten  Kette und 26-32 (H1), 53-55 (H2) und 96-101 (H3) in der variablen  Domäne der schweren Kette; Chothia und Lesk, J. Mol.

   Biol. 196, 901-917  (1987)). "Gerüst-Regionen" oder "FR"-Reste sind jene Reste der variablen  Domäne, die nicht die Reste der hierin definierten hypervariablen  Domänen sind. 



   Papain-Verdau von Antikörpern führt zu zwei identischen Antigen-bindenden  Fragmenten, genannt "Fab"-Fragmente, jedes mit einer einzelnen Anigen-bindenden  Stelle, und ein Rest-"Fc"-Fragment, dessen Name die Fähigkeit widerspiegelt,  leicht zu kristallisieren. Papain-Behandlung führt zu einem F(ab)'  2 -Fragment, das zwei Antigen-bindende Stellen besitzt und immer  noch in der Lage ist, Antigen zu vernetzen. 



   "Fv" ist das minimale Antikörper-Fragment, welches eine vollständige  Antigen-Erkennungs- und Antigen-Bindungsstelle enthält. Diese Region  besteht aus einem Dimer von variabler Domäne einer schweren Kette  und einer leichten Kette, in enger, nicht-kovalenter Assoziierung.  Es ist diese Konfiguration, bei der die drei hypervariablen Regionen  jeder variablen Domäne interagieren, um eine Antigen-Bindungsstelle  an der Oberfläche des V H -V L -Dimers zu definieren. Gemeinsam verleihen  die sechs hypervariablen Regionen dem Antikörper seine Antigen-bindende  Spezifität. Jedoch hat sogar eine einzelne variable Domäne (oder  die Hälfte eines Fv, nur drei für ein Antigen spezifische hypervariable  Regionen umfassend) die Fähigkeit, Antigen zu erkennen und zu binden,  wenn auch mit einer niedrigeren Affinität als die gesamte Bindungsstelle.

                                                        



     Das Fab-Fragment enthält auch die konstante Domäne der leichten  Kette und die erste konstante Domäne (CH1) der schweren Kette. Fab'-Fragmente  unterscheiden sich von Fab-Fragmenten durch den Zusatz einiger Reste  am Carboxy-Terminus der CH1-Domäne der schweren Kette und enthalten  eine oder mehrere Cysteine der Antikörper-Hinge-Region. Fab'-SH ist  hierin die Bezeichnung für Fab', in dem die Cystein-Rest(e) der konstanten  Domänen zumindest eine freie Thiolgruppe tragen. F(ab)' 2 -Antikörper-Fragmente  wurden ursprünglich als Paare von Fab'-Fragmenten produziert, die  Hinge-Cysteine zwischen ihnen besitzen. Andere chemische Kopplungen  von Antikörper-Fragmenten sind auch bekannt. 



   Die "leichten Ketten" von Antikörpern jeglicher Wirbeltier-Spezies  können einer von zwei klar unterscheidbaren, genannt ( kappa ) und  Lambda ( lambda ), basierend auf den Aminosäuresequenzen ihrer konstanten  Regionen zugeordnet werden. "Einzelketten-Fv"- oder "scFv"-Antikörper-Fragmente  umfassen die V H - und V L - Domänen von Antikörper, worin diese  Domänen in einer einzelnen Polypeptidkette vorhanden sind. Vorzugsweise  beinhaltet das Fv-Polypeptid weiters einen Polypeptid-Linker zwischen  den V H - und V L -Domänen, die es scFv ermöglichen, die gewünschte  Struktur für Antigen-Bindung zu bilden. Für einen Überblick über  scFv siehe Plückthun, "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies",  Bd. 13, Rosenburg und Moore (Hrsg.), Springer-Verlag, New York, Seiten  269-315 (1994).

   Anti-ErbB2-Antikörper-scFv-Fragmente werden beschrieben  in WO93/16185: U.S.-Patent Nr. 5 571 894 und U.S.-Patent Nr. 5 587  458. 



   Der Begriff "Diakörper" betrifft kleine Antikörper-Fragmente mit  zwei Antigen-bindenden Stellen, derer Fragmente eine variable schwere  Domäne (V H ), verbunden mit einer variablen leichten Domäne (V L  ) in derselben Polypeptidkette (V H -V L ) umfassen. Bei Verwendung  eines Linkers, der zu klein ist um die Paarung der beiden Domänen  an derselben Kette zu erlauben, sind die Domänen gezwungen, mit komplementären  Domänen einer anderen Kette zu paaren, um zwei Antigen-Bindungsstellen  zu erzeugen. Diakörper werden vollständiger beschrieben in z.B. der  EP-A-404 097; WO93/ 11161; und bei Hollinger et al., Proc. Natl.  Acad. Sci. USA 90, 6444-6448 (1993). 



     "Humanisierte" Formen nicht-humaner (Nagetier-) Antikörper sind  chimäre Antikörper, die von nicht-humanem Immunglobulin hergeleitete  Minimal-Sequenz enthalten. Humanisierte Antikörper sind überwiegend  Human-Immunglobuline (Empfänger-Antikörper), in denen Reste einer  hypervariablen Region des Empfängers durch Reste einer hypervariablen  Region einer nicht-humanen Spezies (Spender-Antikörper), wie z.B.  Maus, Ratte, Kaninchen oder nicht-humaner Primat, mit der gewünschten  Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt ist. In einigen Fällen  werden Gerüst-Region-Reste (FR) des Human-Immunglobulins durch entsprechende  nicht-humane Reste ersetzt. Weiters können humanisierte Antikörper  Reste umfassen, die im Empfänger-Antikörper oder im Spender-Antikörper  nicht vorhanden sind.

   Diese Modifizierungen werden durchgeführt,  um die Leistungsfähigkeit der Antikörper weiter zu verfeinern. Im  Allgemeinen wird der humanisierte Antikörper im Wesentlichen alle  von mindestens einer und typischerweise zwei variabeln Domänen umfassen,  in denen alle oder im Wesentlichen alle der hypervariablen Schleifen  denen eines nicht-humanen Immunglobulins entsprechen und alle oder  im Wesentlichen alle FRs sind jene einer Human-Immunglobulin-Sequenz.  Der humanisierte Antikörper wird optional auch zumindest einen Teil  einer konstanten Immunglobulin-Region (Fc), typischerweise das eines  Human-Immunglobulins umfassen. Für weitere Details siehe Jones et  al., Nature 321, 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323-329  (1988); und Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596 (1992). 



   Humanisierte Anti-ErbB2-Antikörper umfassen huMAb4D5-1, huMAb4D5-2,  huMAb-4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 und huMAb4D5-8  (HERCEPTIN< <TM> >) wie beschrieben in Tabelle 3 von U.S.-Patent  Nr. 5 821 337, hierin ausdrücklich durch Verweis aufgenommen; humanisiertes  520C9 (WO93/21319) und humanisierte 2C4-Antikörper wie hierin unten  beschrieben. 



   Ein "isolierter" Antikörper ist einer, der aus einem Bestandteil  seiner natürlichen Umgebung identifiziert und getrennt und/oder gewonnen  worden ist. Kontaminierende Be   standteile seiner natürlichen Umgebung  sind Materialien, die diagnostische oder therapeutische Anwendungen  des Antikörpers stören würden, und können Enzyme, Hormone und andere  proteinhaltige und nicht-proteinhaltige Lösungen umfassen.

   In bevorzugten  Ausführungsformen wird der Antikörper gereinigt, und zwar (1) zu  mehr als 95 Gewichts-% von Antikörper, wie mittels Lowry-Methode  bestimmt und insbesondere zu mehr als 99 Gewichts-%, (2) in einem  Ausmass, der ausreicht, um mittels Verwendung eines Rotierbecher-Sequenzierers  zumindest 15 Reste der N-terminalen oder internen Aminosäuresequenz  zu erhalten oder (3) zu Homogenität mittels SDS-PAGE unter reduzierenden  oder nicht-reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von Coomassie-Blau  oder, vorzugsweise, Silberfärbung. Isolierter Antikörper umfasst  den Antikörper in situ innerhalb rekombinanter Zellen, da zumindest  eine Komponente der natürlichen Umgebung des Antikörpers nicht vorhanden  sein wird. Gewöhnlich wird isolierter Antikörper mittels zumindest  einem Reinigungsschritt hergestellt. 



   Ein Antikörper, der an ein Antigen von Interesse "bindet", z.B. ErbB2-Antigen,  ist in der Lage, das Antigen mit ausreichender Affinität zu binden,  so dass der Antikörper nützlich ist als therapeutisches Mittel zum  Angriff auf eine Antigen-exprimierende Zelle. Wenn der Antikörper  einer ist, der ErbB2 bindet, wird er gewöhnlich, im Gegensatz zu  anderen ErbB-Rezeptoren, ErbB2 bevorzugt binden und kann einer sein,  der nicht signifikant mit anderen Proteinen, wie z.B. EGFR, ErbB3  oder ErbB4, kreuzreagiert. In solchen Ausführungsformen wird das  Ausmass der Bindung des Antikörpers an diese Nicht-ErbB2-Proteine  (z.B. Zelloberflächen-Bindung an endogenen Rezeptor) weniger als  10% betragen, wie bestimmt mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierungs-Analyse  (FACS) oder Radioimmunpräzipitation (RIA).

   Manchmal wird der Anti-ErbB2-Antikörper  mit dem Ratten-neu-Protein nicht signifikant kreuzreagieren, wie  z.B. beschrieben in Schaefer et al., Nature 312, 513 (1984), Drebin  et al., Nature 312, 545-548 (1984). 



   Ein Antikörper, der Liganden-Aktivierung eines ErB-Rezeptors "blockiert",  ist einer, der eine solche, wie hierin oben definierte Aktivierung  herabsetzt oder verhindert, wobei der Antikörper in der Lage ist,  die Liganden-Aktivierung des ErbB-Rezeptors im We   sentlichen effizienter  zu blockieren als der monoklonale Antikörper 4D5, z.B. ungefähr genauso  effektiv wie die monoklonalen Antikörper 7F3 oder 2C4 oder deren  Fab-Fragemente, und vorzugsweise ungefähr genauso effektiv wie die  monoklonalen Antikörper 2C4 oder ein Fab-Fragment davon. Beispielsweise  kann der Antikörper, der die Liganden-Aktivierung eines ErbB-Rezeptors  blockiert, einer sein, der in der Blockierung einer ErB-Hetero-Oligomer-Bildung  ungefähr 50-100% effektiver ist als 4D5.

   Die Blockierung der Liganden-Aktivierung  eines ErbB-Rezeptors kann auf jegliche Weise erfolgen, z.B. durch  Interferieren mit: Liganden-Bindung an einen ErbB-Rezeptor, ErbB-Komplexbildung,  Tyrosinkinase-Aktivität eines ErbB-Rezeptors in einem ErbB-Komplex  und/oder Phosphorylierung von Tyrosinkinase-Reste(n) in einem oder  durch einen ErbB-Rezeptor. Beispiele solcher Antikörper, die die  Liganden-Aktivierung eines ErbB-Rezeptors blockieren, umfassen monoklonale  Antikörper 2C4 und 7F3 (welche die HRG-Aktivierung von ErbB2/ErbB3-  und ErbB2/ErbB4-Hetero-Oligomeren blockieren; und EGF, TGF- alpha  , Amphiregulin, HB-EGF und/oder Epiregulin-Aktivierung eines EGFR/ErbB2-hetero-Oligomers);  und L26-, L96- und L288-Antikörper (Klapper et al., Oncogene 14,  2099-2109 (1997)), welche EGF- und NDF-Bindung an T47D-Zellen, die  EGFR, ErbB2, ErbB3 und ErbB4 exprimieren, blockieren. 



   Ein Antikörper mit einem "biologischen Charakteristikum" eines bezeichneten  Antikörpers, wie z.B. der als 2C4 bezeichnete monoklonale Antikörper,  ist einer, der eine oder mehrere der biologischen Charakteristika  jenes Antikörpers besitzt, der ihn von anderen Antikörpern, die an  dasselbe Antigen binden (z.B. ErbB2) unterscheiden.

   Beispielsweise  kann ein Antikörper mit einem biologischen Charakteristikum von 2C4  die HRG-Aktivierung eines ErbB-Hetero-Oligomers, umfassend ErbB2  und ErbB3 oder ErbB4, blockieren; kann EGF-, TGF- alpha -, HB-EGF-,  Epiregulin- und/oder Amphiregulin-Aktivierung eines ErbB-Rezeptors,  umfassend EGFR und ErbB2, blockieren; kann EGF-, TGF- alpha - und/oder  HRG-vermittelte Aktivierung von MAPK blockieren; und/oder kann dasselbe  Epitop in der extrazellulären Domäne von ErbB2 binden, wie jenes,  das von 2C4 gebunden wird (z.B. der die Bindung von monoklonalem  Antikörper 2C4 an ErbB2 blockiert). 



     Wenn nicht anders angegeben betrifft der Ausdruck "monoklonaler  Antikörper 2C4" einen Antikörper, der Antigen-bindende Reste des  murinen 2C4-Antikörpers oder davon hergeleiteter Reste Antigen-bindender  Reste der untenstehenden Beispiele besitzt. Beispielsweise kann der  monoklonale Antikörper 2C4, der murine monoklonale Antikörper 2C4  oder eine Variante davon sein, wie z.B. humanisierter Antikörper  2C4 und Antigen-bindende Aminosäurereste des murinen monoklonalen  Antikörpers 2C4 besitzen. Beispiele humanisierter 2C4-Antikörper  werden im untenstehenden Beispiel 3 bereitgestellt.

   Wenn nicht anders  bezeichnet, betrifft der Ausdruck "rhuMAb2C4", wenn hierin verwendet,  einen Antikörper, umfassend die variablen leichten (VL) und variablen  schweren (V H ) Sequenzen der Seq.-ID Nummern 3 bzw. 4, fusioniert  an Sequenzen humaner konstanter leichter und schwerer Regionen von  IgGI (Nicht-A-Allotyp), optional exprimiert durch eine Chinahamster-Eierstock-(CHO-)-Zelle.                                    



   Wenn nicht anders angegeben, betrifft der Begriff "monoklonaler Antikörper  4D5" einen Antikörper, der Antigen-bindende Reste von, oder abgeleitet  von murinem Antikörper 4D5 (ATCC CRL 10463) besitzt. Beispielsweise  kann der monoklonale Antikörper 4D5 ein muriner monoklonaler Antikörper  4D5 oder eine Variante davon sein, wie z.B. ein humanisiertes 4D5,  besitzend Antigen-bindende Reste von murinem monoklonalen Antikörper  4D5. Beispiele humanisierter 4D5-Antikörper umfassen huMAb4D5-1,  huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7  und huMAb4D5-8 (HERCEPTIN< <TM> >) wie in U.S.-Patent Nr. 5 821 337,  mit huMAb4D5-8 (HERCEPTIN< <TM> >) als ein bevorzugter humanisierter  4D5-Antikörper. 



   Ein "wachstumshemmendes Mittel", wenn hierin verwendet, betrifft  eine Verbindung oder Zusammensetzung, die das Wachstum einer Zelle  inhibiert, im Besonderen einer ErbB-exprimierenden Krebszelle in  vitro oder in vivo. Folglich kann das wachstumshemmende Mittel eines  sein, das den Prozentsatz an ErbB-exprimierenden Zellen in der S-Phase  signifikant reduziert. Beispiele von wachstumshemmenden Mitteln umfassen  Mittel, die die Zellzyklus-Progression blockieren (an einer anderen  Stelle als die S-   Phase), wie z.B. Mittel, die G1-Stillstand oder  M-Phasen-Stillstand induzieren. Klassische M-Phasen-Blocker umfassen  Vincas- (Vincristin und Vinblastin), Taxan- und Topo-II-Inhibitoren  wie z.B. Doxorubicin, Epirubicin, Daunorubicin, Etoposid und Bleomycin.  Jene Mittel, die G1 hemmen, ergiessen sich auch in den S-Phasen-Stillstand,  z.B. DNA-alkylierende Mittel wie z.B.

   Tamoxifen, Prednison, Dacarbazin,  Mechlorethamin, Cisplatin, Methotrexat, 5-Fluorouracil und ara-C.  Weiterführende Informationen finden sich in "The Molecular Basis  of Cancer", Mendelsohn und Israel (Hrsg.), Kapitel 1, betitelt "Cell  cycle regulation, oncogeneses, and antineoplastic drugs" von Murakami  et al. (WB Saunders, Philadelphia (1995)), speziell Seite 13. 



   Beispiele von "wachstumshemmenden" Antikörpern sind jene, die an  ErbB2 binden und das Wachstum ErbB2-überexprimierenden Krebszellen  inhibieren. Bevorzugte wachstumshemmende Anti-ErbB2-Antikörper inhibieren  das Wachstum von SK-BR-3-Brusttumorzellen in Zellkultur zu mehr als  20% und bevorzugt zu mehr als 50% (z.B. von ungefähr 50% bis zu ungefähr  100%) bei einer Antikörper-Konzentration von ungefähr 0,5 bis 30  mu g/ml, wobei die Wachstumshemmung bestimmt wird, nachdem die SK-BR-3-Zellen  sechs Tage den Antikörpern ausgesetzt worden sind (siehe U.S. Patent  Nr. 5 677 171, erteilt am 14. Oktober 1997). Der SK-BR-3-Zellen Wachstumshemmungs-Assay  wird in diesem Patent und hierin unten näher im Detail beschrieben.  Der bevorzugte inhibierende Antikörper ist monoklonaler Antikörper  4D5, z.B. humanisierter 4D5. 



   Ein Antikörper, der "Zelltod induziert" ist einer, der eine lebensfähige  Zelle zu einer lebensunfähigen Zelle macht. Die Zelle ist im Allgemeinen  eine, die den ErbB2-Rezeptor exprimiert, besonders wenn die Zelle  den ErbB2-Rezeptor überexprimiert. Vorzugsweise ist die Zelle eine  Krebszelle, z.B. Brust-, Eierstock-, Magen-, Endometrium-, Speicheldrüsen-,  Lungen-, Nieren-, Dickdarm-, Schilddrüsen-, Pankreas- oder Blasen-Zelle.  In vitro kann die Zelle eine SK-BR-3-, BT474-, Calu 3-, MDA-MB-453-,  MDA-MB-361 oder SKOV3-Zelle sein. In vitro-Zelltod kann in Abwesenheit  von Komplement und Immuneffektor-Zellen bestimmt werden, um Zelltod,  induziert durch Antikörper   abhängige, zellvermittelte Zytotoxizität  (ADCC) oder Komplement-abhängige Zytotoxizität (CDC) zu unterscheiden.

    Folglich kann der Zelltod-Assay unter Verwendung von hitzeinaktiviertem  Serum (d.h. in Abwesenheit von Komplement) und in Abwesenheit von  Immuneffektor-Zellen durchgeführt werden. Um zu bestimmen, ob der  Antikörper fähig ist, Zelltod zu induzieren, kann der Verlust von  Membran-Integrität, beurteilt durch Aufnahme von Propidium-Iodid  (PI), Trypanblau (siehe Moore et al., Cytotechnology 17, 1-11 (1995))  oder 7ADD, in Relation zu unbehandelten Zellen bewertet werden. Bevorzugte  Zelltod-induzierende Antikörper sind jene, die im Pl-Aufnahme-Assay  die Aufnahme von PI in BT474-Zellen induzieren (siehe unten). 



   Ein Antikörper, der "Apoptose induziert", ist einer, der programmierten  Zelltod induziert, wie bestimmt durch Bindung von Annexin V, Fragmentierung  von DNA, Zellschrumpfung, Erweiterung des endoplasmatischen Retikulums,  Zellfragmentierung und/oder Bildung von Membran-Vesikeln (genannt  Apoptosekörper). Die Zelle ist gewöhnlich eine, die den ErbB2-Rezeptor  überexprimiert. Vorzugsweise ist die Zelle eine Tumorzelle, z.B.  Brust-, Eierstock-, Magen-, Endometrium-, Speicheldrüsen-, Lungen-,  Nieren-, Dickdarm-, Schilddrüsen-, Pankreas- oder Blasen-Zelle. In  vitro kann die Zelle eine SK-BR-3-, BT474-, Calu 3-Zelle, MDA-MB-453-,  MDA-MB-361 oder SKOV3-Zelle sein. Verschiedene Methoden stehen zur  Evaluierung von zellulären Ereignissen, die mit Apoptosen assoziiert  sind, zur Verfügung.

   Beispielsweise kann Phosphatidylserin-(PS-)-Translokation  mittels Annexin-Bindung gemessen werden; DNA-Fragmentierung kann  über DNA-Laddering evaluiert werden; und Nukleo-/Chromatin-Kondensation  zusammen mit DNA-Fragmentierung kann durch jede Zunahme hypodiploider  Zellen evaluiert werden. Vorzugsweise ist der Antikörper, der Apoptose  induziert, einer, der in einem Annexin-Bindungs-Assay, unter Verwendung  von BT474-Zellen (siehe unten), relativ zu unbehandelten Zellen zu  ungefähr 2- bis 50facher, bevorzugt ungefähr 5- bis 50facher und  insbesondere ungefähr 10- bis 50facher Induktion von Annexin-Bindung.  Gelegentlich wird der Pro-apoptotische Antikörper einer sein, der  die ErbB-Liganden-Aktivierung eines ErbB-Rezeptors (z.B. 7F3-Antikörper)  weitergehend blockiert; d.h., der Antikörper teilt ein biologisches  Charakteristikum mit monoklonalem Antikörper 2C4.

   In    anderen Situationen  ist der Antikörper einer, der die ErbB-Liganden-Aktivierung eines  ErbB-Rezeptors (z.B. 7C2) nicht signifikant blockiert. Weiters kann  der Antikörper einer wie 7C2 sein, der, während er Apoptose induziert,  eine starke Abnahme des Prozentanteils von S-Phasen-Zellen nicht  induziert (z.B. einer, der den Prozentsatz dieser Zellen im Vergleich  zur Kontrolle um nur ungefähr 0-10% herabsetzt). 



   Das "Epitop 2C4" ist diejenige Region in der extrazellulären Domäne  von ErbB2, an die der Antikörper 2C4 bindet. Um Antikörper zu screenen,  die an das 2C4-Epitop binden, kann ein Cross-Blocking-Routine-Assay  durchgeführt werden, wie er in "Antibodies, A Laboratory Manual",  Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow und David Lane (1988), beschrieben  wird. Alternativ dazu kann Epitop-Kartierung durchgeführt werden,  um zu beurteilen, ob der Antikörper an das 2C4-Epitop von ErbB2 bindet  (z.B. jedes von einem oder mehreren Reste(n) in der Region von ungefähr  Rest 22 bis inklusive ungefähr Rest 584 von ErbB2; siehe die Fig.  1A-B). 



   Das "Epitop 4D5" ist diejenige Region in der extrazellulären Domäne  von ErbB2, an die der Antikörper 4D5 (ATCC CRL 10463) bindet. Dieses  Epitop ist nahe der Transmembrandomäne von ErbB2. Um Antikörper zu  screenen, die an das 4D5-Epitop binden, kann ein Cross-Blocking-Routine-Assay  durchgeführt werden, wie er in "Antibodies, A Laboratory Manual",  Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow und David Lane (1988), beschrieben  wird. Alternativ dazu kann Epitop-Kartierung durchgeführt werden,  um zu beurteilen, ob der Antikörper an das 4D5-Epitop von ErbB2 bindet  (z.B. jedes von einem oder mehreren Reste(n) in der Region von ungefähr  Rest 529 bis inklusive ungefähr Rest 625 von ErbB2; siehe die Fig.  1A-B). 



   Das "Epitop 3H4" ist diejenige Region in der extrazellulären Domäne  von ErbB2, an die der Antikörper 3H4 bindet. Dieses Epitop umfasst  die Reste von ungefähr 541 bis inklusive ungefähr 599 in der Aminosäuresequenz  der extrazellulären ErbB2-Domäne; siehe die Fig. 1A-B. 



     Das Epitop 7C2/7F3 ist die Region am N-Terminus der extrazellulären  Domäne von ErbB2, an die die 7C2- und/oder 7F3-Antikörper (beide  mit ATCC hinterlegt, siehe unten) binden. Um Antikörper zu screenen,  die an das 7C2/7F3-Epitop binden, kann ein Cross-Blocking-Routine-Assay  durchgeführt werden, wie er in "Antibodies, A Laboratory Manual",  Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow und David Lane (1988), beschrieben  wird. Alternativ dazu kann Epitop-Kartierung durchgeführt werden,  um herauszufinden, ob der Antikörper an das 7C2/7F3-Epitop von ErbB2  bindet (z.B. jeder von einem oder mehreren Reste(n) in der Region  von ungefähr Rest 22 bis ungefähr Rest 53 von ErbB2; siehe die Fig.1A-B).                                                      



   "Behandlung" betrifft sowohl therapeutische Behandlung, als auch  prophylaktische und präventive Massnahmen. Jene, die eine Behandlung  benötigen, umfassen jene, bei denen die Störung schon vorliegt, wie  auch jene, bei denen die Störung verhindert werden soll. Daher kann  das hierin zu behandelnde Säugetier mit der Störung diagnostiziert  worden sein oder kann für die Störung prädisponiert oder anfällig  sein. 



   "Säugetier" zum Zwecke von Behandlung betrifft jedes Tier, das als  Säugetier klassifiziert ist, einschliesslich Menschen, Haus- und  Nutztiere, Tiergarten-, Sport- und Haustiere, wie z.B. Hunde, Pferde,  Katzen, Kühe, usw. Bevorzugt ist das Säugetier der Mensch. 



   Eine "Störung" ist jeder Zustand, der aus der Behandlung mit Anti-ErbB2-Antikörper  Nutzen ziehen könnte. Dies umfasst chronische und akute Störungen  oder Krankheiten, einschliesslich jene pathologischen Zustände, die  das Säugetier für die fragliche Störung prädisponiert. Nichteinschränkende  Beispiele von hierin zu behandelnden Störungen umfassen gutartige  und maligne Tumore; Leukämien und Lymphoid-Malignitäten; neuronale,  gliale, astrocytale, hypothalamische und andere glandulare, makrophagale,  epitheliale, stromale und blastozölische Störungen; und entzündliche,  angiogene und immunologische Störungen. 



     Der Begriff "therapeutisch wirksame Menge" betrifft eine Menge  eines Medikaments, die zur Behandlung einer Krankheit oder Störung  in einem Säugetier effektiv ist. Im Falle von Krebs kann die therapeutisch  wirksame Menge des Medikaments die Anzahl von Krebszellen herabsetzen;  die Tumorgrösse herabsetzen; die Infiltration von Krebszellen in  periphere Organe inhibieren (d.h., in gewissem Ausmass verlangsamen  und bevorzugt stoppen); das Tumor-Wachstum in gewissem Ausmass inhibieren;  und/oder in gewissem Ausmass ein oder mehrere mit dem Krebs assoziierte  Symptome erleichtern. In dem Ausmass, in dem das Medikament das Wachstum  verhindert und/oder vorhandene Krebszellen abtötet, kann es zytostatisch  und/oder zytotoxisch sein.

   Zur Krebstherapie kann die Effizienz beispielsweise  gemessen werden, indem die Zeit zur Krankheits-Progression (TTP)  beurteilt und/oder die Reaktionsrate (RR) bestimmt wird. 



   Die Begriffe "Krebs" und "krebsartig" betreffen oder beschreiben  den physiologischen Zustand in Säugetieren, der typischerweise durch  unkontrolliertes Zellwachstum charakterisiert ist. Beispiele für  Krebs umfassen (sind aber nicht beschränkt auf) Karzinome, Lymphome,  Blastome, Sarcome und Leu-kämie oder lymphatische Malignitäten.

   Speziellere  Beispiele für solche Krebsformen umfassen Plattenepithelkarzinom,  Lungenkrebs, Plattenepithelkarzinom der Lunge, Krebs des Peritoneum,  Leberzellenkrebs, Magenkrebs einschliesslich Magen-Darm-Krebs, Pankreaskrebs,  Glioblastom, Zervikalkrebs, Eierstockkrebs, Leberkrebs, Blasenkrebs,  Hepatom, Brustkrebs, Dickdarmkrebs, Rektalkrebs, Kolon-Rektum-Krebs,  Endometrium- oder Uterus-Karzinom, Speicheldrüsenkrebs, Nieren- oder  Renalkrebs, Prostatakrebs, Vulvakrebs, Schilddrüsenkrebs, Leberkarzinom,  Analkrebs, Peniskrebs, sowie auch Kopf- und Halskrebs. 



   Ein "ErbB-exprimierender Krebs" ist einer, der Zellen beinhaltet,  an deren Oberfläche ErbB-Proteine vorhanden sind. Ein "ErbB2-exprimierender  Krebs" ist einer, der ausreichende Spiegel von ErbB2 an der Oberfläche  seiner Zellen produziert, so dass ein Anti-ErbB2-Antikörper daran  binden und in Bezug auf den Krebs einen therapeutischen Effekt haben  kann. 



     Ein Krebs "charakterisiert durch übermässige Aktivierung" eines  ErbB-Rezeptors ist einer, bei dem das Ausmass der ErbB-Rezeptor-Aktivierung  in Krebszellen den Level der Aktivierung dieses Rezeptors in nicht-krebsartigen  Zellen desselben Gewebes signifikant übersteigt. Solch übermässige  Aktivierung kann aus der Überexpression des ErbB-Rezeptors und/oder  höher als normale, für die Aktivierung des ErbB-Rezeptors in den  Krebszellen verfügbare Level eines ErbB-Liganden resultieren. Solche  übermässigen Aktivierungen können verursachen und/oder verursacht  werden durch den malignen Zustand einer Krebszelle.

   In einigen Ausführungsformen  wird der Krebs diagnostischen oder prognostischen Tests unterworfen,  um zu bestimmen, ob eine Amplifizierung und/oder Überexpression eines  ErbB-Rezeptors auftritt, die zu einer solch übermässigen Aktivierung  des ErbB-Rezeptors führt. Alternativ oder zusätzlich dazu kann der  Krebs einem diagnostischen oder prognostischen Test unterzogen werden,  um festzustellen, ob eine Amplifizierung und/oder Überexpression  eines ErbB-Rezeptors im Krebs auftritt, die zur übermässigen Aktivierung  des ErbB-Rezeptors beiträgt. In einer Untergruppe solcher Krebsformen,  könnte die übermässige Aktivierung des Rezeptors von einem autokrinen  Stimulations-Stoffwechselweg herrühren. 



   In einem "autokrinen" Stimulationsweg tritt Selbst-Stimulation auf,  und zwar weil Krebszellen sowohl den ErbB-Liganden, als auch seinen  zugehörigen ErbB-Rezeptor produzieren. Beispielsweise kann der Krebs  EGFR und auch einen EGFR-Liganden (z.B. EGF, TGF- alpha  oder HB-EGF)  exprimieren oder überexprimieren. In einer anderen Ausführungsform  kann der Krebs ErbB2 exprimieren oder überexprimieren und auch ein  Heregulin (z.B. gamma -HRG) exprimieren oder überexprimieren. 



   Ein Krebs, der einen ErbB-Rezeptor "überexprimiert", ist einer, der  an seiner Oberfläche, im Vergleich zu nicht-krebsartigen Zellen desselben  Gewebetyps, signifikant höhere Level eines ErbB-Rezeptors, wie z.B.  ErbB2, aufweist. Eine solche Überexpression kann durch Genamplifikation  oder erhöhte Transkription oder Translation verursacht sein. ErbB-Rezeptor-Überexpression  kann in einem diagnostischen oder prognostischen Test bestimmt werden,  indem erhöhte Level eines an der Oberfläche einer Zelle    vorhandenen  ErbB-Proteins evaluiert wird (z.B. über einen Immunhistochemie-Assay;  IHC). Alternativ dazu oder zusätzlich kann man den Level von ErbB-kodierende  Nukleinsäure in der Zelle messen, z.B. über Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung  (FISH; siehe WO98/45479, publiziert im Oktober 1998), Southern-Blotting,  oder Polymerase-Kettenreaktions-(PCR-)Techniken, wie z.B.

   Echtzeit-quantitative  PCR (RT-PCR). Man kann ErbB-Rezeptor-Überexpression auch untersuchen,  indem man abgeworfenes Antigen (z.B. extrazelluläre ErbB-Domäne)  in einer biologischen Flüssigkeit wie z.B. Serum misst (siehe z.B.  U.S.-Patent Nr. 5 933 294, erteilt am 12. Juni 1990; WO91/05264,  publiziert am 18. April 1991; U.S.-Patent Nr. 5 401 638, erteilt  am 28. März 1995; und Sias et al., J. Immunol. Methods 132, 73-80  (1990)). Abgesehen von den obigen Tests, stehen dem erfahrenen Praktiker  verschiedene in vivo-Tests zur Verfügung.

   Beispielsweise kann man  Zellen innerhalb des Körpers eines Patienten einem Antikörper aussetzen,  der optional mit einem detektierbaren Marker, z.B. einem Radioisotop,  markiert ist, und die Bindung des Antikörpers an Zellen im Patienten  kann z.B. mittels externen Scanning der Radioaktivität oder mittels  Analyse einer nach Antikörper-Exposition des Patienten entnommenen  Biopsie evaluiert werden. 



   Umgekehrt ist ein Krebs, der "nicht durch Überexpression eines ErbB2-Rezeptors"  charakterisiert ist, einer, der in einem diagnostischen Test, im  Vergleich zu einer nichtkrebsartigen Zelle desselben Gewebetyps,  keine höheren als die normalen Level von ErbB-Rezeptor exprimiert.                                                             



   Ein Krebs der einen ErbB-Liganden "überexprimiert" ist einer, der  im Vergleich zu einer nicht-krebsartigen Zelle desselben Gewebetyps,  signifikant höhere Level dieses Liganden exprimiert. Eine solche  Überexpression kann durch Genamplifikation oder erhöhte Transkription  oder Translation verursacht sein. Überexpression des ErbB-Liganden  kann diagnostisch mittels Evaluierung des Liganden-Levels (oder der  kodierenden Nukleinsäure) in Patienten, z.B. in einer Tumor-Biopsie  oder mittels verschiedener diagnostischer Tests, wie z.B. die oben  beschriebenen IHC-, FISH-, Southern-Blotting-, PCR- oder in vitro-Tests  bestimmt werden. 



     Ein "Hormon-unabhängiger" Krebs ist einer, bei dem seine Proliferation  von der Anwesenheit eines Hormons, das an einen durch Krebszellen  exprimierten Rezeptor bindet, unabhängig ist. Solche Krebsformen  untergehen keine klinische Rückbildung bei Anwendung pharmakologischer  oder operativer Strategien, die die Hormonkonzentration im oder in  der Nähe des Tumors herabsetzen. Beispiele Hormon-unabhängiger Krebsformen  umfassen Androgen-unabhängigen Prostatakrebs, Östrogen-unabhängigen  Brustkrebs, Endometrium-Krebs und Eierstock-Krebs. Solche Krebsformen  können als Hormon-abhängige Tumoren beginnen und im Anschluss an  Anti-Hormon-Therapie von einem Hormon-sensitiven Stadium zu einem  Hormonrefraktären Tumor fortschreiten. 



   Der Begriff "zytotoxisches Mittel", wie hierin verwendet, betrifft  eine Substanz, die die Funktion von Zellen inhibiert oder Verhindert  und/oder die Zerstörung von Zellen verursacht. Der Begriff intendiert  die Umfassung vom radioaktiven Isotope (z.B. At<211>, I<131>, I<125>,  Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32> und radioaktive  Lu-lsotope), chemotherapeutischen Mittel und Toxinen wie z.B. Kleinmolekül-Toxine  oder enzymatisch aktive Toxine bakterieller, pilzlicher, pflanzlicher  oder tierischer Herkunft, einschliesslich derer Fragmente und/oder  Varianten. 



   Ein "chemotherapeutisches Mittel" ist eine chemische Verbindung,  die zur Behandlung von Krebs zweckdienlich ist. Beispiele chemotherapeutischer  Mittel umfassen Alkylierungsmittel wie z.B. Thiotepa und Cyclophosphamid  (CYTOXAN< <TM> >); Alkylsulfonate wie z.B. Busulfan, Improsulfan  und Piposulfan; Aziridine wie z.B. Benzodopa, Carboquon, Meturedopa  und Uredopa; Ethylenimine und Methylamelamine einschliesslich Altretamin,  Triethylenmelamim, Triethylenphosphoramid, Triethylenthiophosphoramid  und Trimethylolomelamin; Stickstofflosts wie z.B. Chlorambucil, Chlornaphazin,  Cholophosphamid, Estramustin, Ifosfamid, Mechlorethamin, Mechlorethaminoxid-Hydrochlorid,  Melphalan, Novembichin, Phenesterin, Prednimustin, Trofosfamid, Uracil-Lost;  Nitrosoharnstoffe wie z.B. Carmustin, Chlorozotocin, Fotemustin,  Lomustin, Nimustin, Ranimustin; Antibiotika wie z.B.

   Aclacinomysin,  Actinomycin, Authramycin, Azaserin, 



     Bleomycine, Cactinomycin, Calicheamicin, Carabicin, Carminomycin,  Carzinophilin, Chromomycin, Dactionmycin, Daunorubicin, Detorubicin,  6-Diazo-5-oxo-L-norleucin, Doxorubicin, Epirubicin, Esorubicin, Idarubicin,  Marcellomycin, Mitomycin, Mycophenolsäure, Nogalamycin, Olivomycine,  Peplomycin, Potfiromycin, Puromycin, Quelamycin, Rodorubicin, Streptonigrin,  Streptozocin, Tubercidin, Ubenimex, Zinostatin, Zorubicin; Anti-Metaboliten  wie z.B. Methotrexat und 5-Fluorouracil (5-FU); Folsäure-Analoga  wie z.B. Denopterin, Methotrexat, Pteropterin, Trimetrexat; Purin-Analoga  wie z.B. Fludarabin, 6-Mercaptopurin, Thiamiprin, Thioguanin; Pyrimidin-Analoga  wie z.B. Ancitabin, Azacitidin, 6-Azauridin, Carmofur, Cytarabin,  Didesoxyuridin, Doxifluridin, Enocitabin, Floxuridin, 5-FU; Androgene  wie z.B.

   Calusteron, Dromostanolon-Propionat, Epitiostanol, Mepitiostan,  Testolacton; Anti-Adrenale wie z.B. Aminoglutethimid, Mitotan, Trilostan;  Folsäure-Ergänzer wie z.B. Frolinsäure; Aceglaton; Aldophosphamidglykosid;  Aminolevulinsäure; Amsacrin; Bestrabucil; Bisantren; Edatraxat; Defofamin;  Demecolcin; Diaziquon; Elfornithin; Elliptiniumacetat; Etoglucid;  Galliumnitrat; Hydroxyharnstoff; Lentinan; Lonidamin; Mitoguazon;  Mitoxantron; Mopidamol; Nitracrin; Pentostatin; Phenamet; Pirarubicin;  Podophyllinsäure; 2-Ethylhydrazid; Procarbazin; PSK< <TM> >; Razoxan;  Sizofiran; Spirogermanium Tenuazonsäure; Triaziquon; 2,2',2''-Trichlortri-ethylamin;  Urethan; Vindesin; Dacarbazin; Mannomustin; Mitobronitol; Mitolactol;  Pipobroman; Gacytosin; Arabinosid ("Ara-C"); Cyclophosphamid; Thiotepa;  Taxane, z.B.

   Paclitaxel (TAXOL <TM> , Bristol-Myers Squibb Oncology,  Princeton, NJ) und Docetaxel (TAXOTERE, Rhone-Poulenc Rorer, Antony,  France); Chlorambucil; Gemcitabin; 6-Thioguanin; Mercaptopurin; Methotrexat;  Platin-Analoga wie z.B. Cisplatin und Carboplatin; Vinblastin; Platin;  Etoposid (VP-16); Ifosfamid; Mitomycin C; Mitoxantron; Vincrisitin,  Vinorelbin; Navelbin; Novantron; Teniposid; Daunomycin; Aminopterin;  Xeloda; Ibandronat; CPT-11; Topoisomerase-Inhibitor RFS 2000; Difluormethylorthinin  (DMFO); Retinsäure; Esperamicin; Capecitabin und pharmazeutisch vertretbare  Salze, Säuren oder Derivate aller obenstehenden Substanzen. Ebenso  sind in dieser Definition Anti-Hormon-Mittel eingeschlossen, die  die Hormonwirkung auf Tumore regulieren oder inhibieren, wie z.B.  Anti-Östrogene, einschliesslich z.B.

   Tamoxifen, Raloxifen, Aromatase-inhibierende  4(5)-lmidazole, 4-Hydroxytamoxifen,    Trioxifen, Keoxifen, LY117018,  Onapriston und Toremifen (Fareston); und Anti-Androgene wie z.B.  Flutamid, Nilutamid, Bicalutamid, Leuprolid und Goserelin; und pharmazeutisch  vertretbare Salze, Säuren oder Derivate aller obigen Substanzen. 



   Wie hierin verwendet, betrifft der Begriff "auf EGFR-abzielendes  Medikament" eine therapeutische Verbindung, die an ECFR bindet und  optional EGFR-Aktivierung inhibiert. Beispiele für solche Mittel  umfassen Antikörper und kleine Moleküle, die an EGFR binden. Beispiele  von Antikörpern, die an EGFR binden umfassen MAb579 (ATCC CRL HB  8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528  (ATCC CRL 8509) (siehe U.S.-Patent Nr. 4 943 533, Mendelsohn et al.)  und deren Varianten, wie z.B. chimärisiertes 225 (C225) und neugeformtes  Human-225 (H225) (siehe WO96/40210, Imclone Systems Inc.); Antikörper,  die Typ Il-Mutanten-EGFR binden (U.S.-Patent Nr. 5 212 290); humanisierte  und chimäre Antikörper, die EGFR binden, wie beschrieben in U.S.-Patent  Nr. 5 891 996; und humane Antikörper, die EGFR binden (siehe WO98/50433,  Abgenix).

   Der Anti-EGFR-Antikörper kann mit einem zytotoxischen Mittel  konjugiert werden und so ein Immunkonjugat bilden (siehe EP 659 439  A2, Merck Patent GmbH). Beispiele kleiner Moleküle, die EGFR binden,  umfassen ZD1839 (Astra Zeneca), CP-358 774 (OSl/Pfizer) und AG1478.                                                            



   Ein "antiangiogenes Mittel" betrifft eine Verbindung, die die Entwicklung  von Blutgefässen blockiert oder in gewissem Ausmass damit interferiert.  Der antiangiogene Faktor kann beispielsweise ein kleines Molekül  oder Antikörper sein, das an einen Wachstumsfaktor oder Wachstumsfaktor-Rezeptor,  beteiligt an der Förderung von Angiogenese, bindet. Der hierin bevorzugte  angiogene Faktor ist ein Antikörper, der an den vaskulären endothelischen  Wachstumsfaktor (VEGF) bindet. 



   Der Begriff "Cytokin" ist ein allgemeiner Begriff für Proteine, die  von einer Zellpopulation freigesetzt werden und als intrazelluläre  Mediatoren auf andere Zellen einwirken. Beispiele für solche Cytokine  sind Lymphokine, Monokine und traditionelle Polypeptid-Hormone. In  den Cytokinen umfasst sind Wachstumshormone wie z.B. humanes    Wachstumshormon,  N-Methionyl-humanes-Wachstumshormon und Rinder-Wachstumshormon; Parathormon;  Thyroxin; Insulin; Proinsulin; Relaxin; Prorelaxin; Glykoproteinhormone  wie z.B. follikelstimulierendes Hormon (FSH); Schilddrüsen-stimulierendes  Hormon (TSH), -Luteinisierungshormon (LH); Leber-Wachstumsfaktor;  Fibroblasten-Wachstumsfaktor; Prolactin; Plazentalaktogen; Tumornekrosefaktor-  alpha  und - beta ; Mullerian-inhibierende Substanz; Maus-Gonadotropin-assoziiertes  Peptid; Inhibin; Activin; vaskulärer endothelischer Wachstumsfaktor;

    Integrin; Thrombopoietin (TPO); Nerven-Wachstumsfaktoren wie z.B.  NGF- beta ; Blutplättchen-Wachstumsfaktor; transformierende Wachstumsfaktoren  (TGFs) wie z.B. TGF- alpha  und TGF- beta : insulinartiger Wachstumsfaktor-I  und -II; Erythropoietin (EPO); osteoinduzierende Faktoren; Interferone  wie z.B. Interferon- alpha , - beta  und - gamma ; koloniestimulierende  Faktoren (CSFs) wie z.B. Makrophagen-CSF (M-CSF); Granulocyten-Makrophagen-CSF  (GM-CSF); und Granulocyten-CSF (G-CSF); Interleukine (ILs) wie z.B.  IL-1, IL-1 alpha , IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9,  IL-10, IL-11, IL-12; ein Tumornekrosefaktor wie z.B. TNF- alpha   oder TNF- beta  und andere Polypeptidfaktoren, einschliesslich LIF  und Kit-Ligand (KL).

   Wie hierin verwendet, umfasst der Begriff Cytokine  Proteine natürlicher Quellen oder von rekombinanten Zellkulturen  und biologisch aktive Äquivalente der Nativsequenz-Cytokine. 



   Der Begriff "Prodrug" wie in dieser Anmeldung verwendet, betrifft  einen Vorläufer oder eine derivatisierte Form einer pharmazeutisch  aktiven Substanz, die auf Tumorzellen weniger toxisch wirkt als das  Stamm-Medikament und enzymatisch aktiviert oder zur aktiveren Stammform  umgesetzt werden kann. Siehe z.B. Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy",  Biochemical Society Transactions 14, Seiten 375-382, 615th Meeting,  Belfast (1986) und Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach  to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt et  al. (Hrsg.), Seiten 247-267, Humana Press (1985).

   Die Prodrugs dieser  Erfindung umfassen (sind aber nicht beschränkt auf) Phosphat-enthaltende  Pro-drugs, Thiophosphat-enthaltende Prodrugs, Sulfat-enthaltende  Prodrugs, Peptid-enthaltende Prodrugs, D-Aminosäure-modifizierte  Prodrugs, glykosylierte Prodrugs,  beta -Lactam-enthaltende Prodrugs,  optional substituierte Phenoxyacetamid-enthaltende Prodrugs oder  optional substituierte Phenylacetamid-   enthaltende Prodrugs, 5-Fluorocytosin  und andere 5-Fluorouridin Prodrugs, die zu dem aktiveren freien zytotoxischen  Medikament umgesetzt werden können. Beispiele für zytotoxische Medikamente,  die zu einer Prodrug-Form zur Verwendung in dieser Erfindung derivatisiert  werden können umfassen, sind aber nicht beschränkt auf jene oben  beschriebenen chemotherapeutischen Mittel. 



   Ein "Liposom" ist ein kleines Vesikel, zusammengesetzt aus verschiedenen  Arten von Lipiden, Phospholipiden und/oder Tensid, das für die Zufuhr  des Medikaments (z.B. die hierin offenbarten Anti-ErbB2-Antikörper  und, optional, ein chemotherapeutisches Mittel) in ein Säugetier  zweckmässig ist. Die Verbindungen der Liposomen sind gewöhnlich als  Doppelschicht angeordnet, ähnlich der Lipidanordnung in biologischen  Membranen. 



   Der Begriff "Packungsbeilage" wird verwendet in Bezug auf Anweisungen,  die üblicherweise den Handelsverpackungen therapeutischer Produkte  beiliegt und die Informationen über Indikationen, Verwendung, Dosierung,  Verabreichung, Gegenindikationen und/oder Warnungen über die Verwendung  solcher therapeutischen Produkte enthalten. 



   Ein "Kardioprotektor" ist eine Verbindung oder Zusammensetzung, die  Myokard-Dysfunktion (d.h. Kardiomyopathie und/oder kongestive Herzinsuffizienz)  verhindert oder herabsetzt, assoziiert mit der Verabreichung eines  Medikaments, wie z.B. Anthracyclin Antibiotikum und/oder einem Anti-ErbB2-Antikörper,  an einen Patienten. Der Kardioprotektor kann beispielsweise Radikal-vermittelte  kardiotoxische Effekte blockieren oder herabsetzen und/oder Schäden  durch oxidativen Stress verhindern oder herabsetzen. In der vorliegenden  Definition umfasste Beispiele von Kardioprotektor sind das Eisen-chelatierende  Mittel Dexrazoxan (ICRF-187) (Seifert et al., Annais of Pharmacology  28, 1063-1072 (1994)); ein Lipid-herabsetzendes Mittel und/oder Antioxidans  wie z.B. Probucol (Singal et al., J. Mol. Cell.

   Cardiol. 27, 1055-1063  (1995)); Amifostin (Aminothiol-2-[(3-aminopropyl)amino]ethanthiol-dihydrogenphosphatester,  auch WR-2721 genannt, und dessen dephosphorylierte Zellaufnahmeform,  genannt WR-1065) und S-(3-Methylaminopropylamino)thiophosphorsäure  (WR-151327), siehe Green et al.,    Cancer Research 54, 738-741 (1994);  Digoxin (M.R. Bristow, In: M.R. Bristow (Hrsg.), Drug Induced Heart  Disease, New York, Elsevier, Seiten 191-215 (1980); Beta-Blocker  wie z.B. Metoprolol (Hjalmarson et al., Drugs 47, Suppl 4, 31-9 (1994)  und Shaddy et al., Am. Heart J. 129, 197-9 (1995)); Vitamin E; Ascorbinsäure  (Vitamin C); Radikalfänger wie z.B. Oleanolsäure, Ursolsäure und  N-Acetylcystein (NAC); Spin-Trapping-Verbindungen wie z.B.  alpha  -Phenyl-tert-butylnitron (PBN); (Paracchini et al., Anticancer Res.  13, 1607-1612 (1993)); Seleno-organische Verbindungen wie z.B.

   P251  (Elbesen); und ähnliche. 



   Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül ist ein Nukleinsäuremolekül,  das identifiziert und von zumindest einem kontaminierenden Nukleinsäuremolekül  getrennt wird, mit dem es gewöhnlich in der natürlichen Quelle der  Antikörper-Nukleinsäure assoziiert ist. Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül  unterscheidet sich von der in der Natur gefundenen Form oder Anordnung.  Isolierte Nukleinsäuremoleküle werden deshalb von den Nukleinsäuremolekülen,  die in natürlichen Zellen existieren, unterschieden. Ein isoliertes  Nukleinsäuremolekül umfasst jedoch ein in Zellen, die gewöhnlich  den Antikörper exprimieren, enthaltenes Nukleinsäuremolekül, wo sich  z.B. das Nukleinsäuremolekül an einer chromosomalen Stelle befindet,  die von der in natürlichen Zellen verschieden ist. 



   Der Ausdruck "Kontrollsequenz" betrifft DNA-Sequenzen, die zur Expression  einer operativ verbundenen Kodierungssequenz in einem bestimmten  Wirtsorganismus erforderlich sind. Die für Prokaryoten geeigneten  Kontrollsequenzen umfassen z.B. einen Promoter, optional eine Operatorsequenz  und eine Ribosom-Bindungsstelle. Es ist bekannt, dass eukaryotische  Zellen Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer verwenden.                                                            



   Eine Nukleinsäure ist "operativ verbunden", wenn sie in einer funktionellen  Beziehung zu einer anderen Nukleinsäuresequenz steht. Beispielsweise  ist eine DNA für einen Präsequenz- oder sekretorischen Leader operativ  mit einer DNA für ein Polypeptid verbunden, wenn es als Prä-Protein  exprimiert wird, das sich an der Sekretion des Po   lypeptids beteiligt;  ein Promotor oder Enhancer ist operativ mit einer Kodierungssequenz  verbunden, wenn es die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder  eine Ribosomen-Bindungsstelle ist operativ mit einer Kodierungssequenz  verbunden, wenn sie so positioniert ist, das sie die Translation  erleichtert. Im Allgemeinen bedeutet "operativ verbunden", dass die  zu verbindenden DNA-Sequenzen zusammenhängend sind und im Falle eines  sekretorischen Leader zusammenhängend und in Ablesephase sind.

   Enhancer  müssen jedoch nicht zusammenhängend sein. Das Verbinden wird durch  Ligation an günstigen Restriktionsstellen erzielt. Wenn solche Stellen  nicht existieren, werden synthetische Oligonukleotid-Adaptoren oder  Linker, gemäss konventioneller Praktiken, verwendet. 



   Wie hierin verwendet, werden die Ausdrücke "Zelle", "Zelllinie" und  "Zellkultur" austauschbar verwendet und alle solche Bezeichnungen  schliessen Nachkommenschaften ein. Folglich umfassen die Worte "Transformanten"  und "transformierte Zellen" die ursprünglich betroffenen Zellen und  davon hergeleitete Kulturen ohne Berücksichtigung der Anzahl der  Transfers. Es versteht sich ebenso, dass aufgrund von beabsichtigten  und unabsichtlichen Mutationen nicht alle Nachkommenschaften in ihrem  DNA-Gehalt exakt identisch sein müssen. Mutanten-Nachkommenschaften,  die dieselbe Funktion oder biologische Aktivität besitzen wie jene,  auf die in der ursprünglich transformierten Zelle gescreent worden  ist, sind eingeschlossen. Wo gesonderte Bezeichnungen beabsichtigt  sind, gehen sie aus dem Kontext klar hervor.   II. Herstellung  von Anti-ErbB2-Antikörpern  



   Es folgt eine Beschreibung beispielhafter Verfahren zur Herstellung  von Antikörpern gemäss vorliegender Erfindung. Das zur Herstellung  von Antikörpern zu verwendende ErbB-Antigen kann z.B. eine lösliche  Form der extrazellulären Domäne von ErbB2 oder ein das gewünschte  Epitop enthaltender Teil davon sein. Alternativ dazu können Zellen,  die an ihrer Zelloberfläche ErbB2 exprimieren (z.B. NIH-3T3-Zellen,  transformiert zur Überexpression von ErbB2; oder eine Karzinom-Zelllinie  wie z.B. SK-BR-3-Zellen, siehe    Stancovski et al., PNAS (USA) 88,  8691-8695 (1991)) verwendet werden, um Antikörper zu generieren.  Andere zur Generierung von Antikörpern geeignete ErbB2-Formen sind  für den Fachkundigen offensichtlich.  (i)  Polyklonale Antikörper  



   Polyklonale Antikörper werden bevorzugt in Tieren durch subkutane  (sc) oder intraperitoneale (ip) Injektionen des relevanten Antigens  und eines Adjuvans hergestellt. Es kann zweckmässig sein, das relevante  Antigen an ein Protein zu koppeln, das in der zu immunisierenden  Spezies immunogen wirkt, z.B. Keyhole-Limpet-Hemocyanin, Serumalbumin,  Rinderthyroglobulin oder Sojabohnen-Trypsininhibitor, unter Verwendung  eines bifunktionellen oder derivatisierenden Mittels, beispielsweise  Maleoimidobenzoylsulfosuccinimidester (Konjugation über Cystein-Reste),  N-Hydroxysuccinimid (über Lysin-Reste), Glutaraldehyd, Bernsteinsäureanhydrid,  SOCI 2  oder R<1>N=C=NR, wobei R und R<1> verschiedene Alkylgruppen  sind. 



   Tiere werden gegen das Antigen, Immunogen-Konjugate, oder Derivate  immunisiert, indem z.B. 100  mu g oder 5  mu g (für Kaninchen bzw.  Mäuse) des Proteins oder Konjugats mit 3 Volumina Freund'schem komplettem  Adjuvans kombiniert und die Lösung intradermal an mehreren Stellen  injiziert wird. Einen Monat später werden die Tiere mit 1/5 bis 1/10  der ursprünglichen Menge Peptid oder Konjugat in Freund'schem komplettem  Adjuvans durch subkutane Injektion an mehreren Stellen geboostet.  Sieben bis 14 Tage später wird den Tieren Blut abgenommen und das  Serum auf Antikörper-Titer getestet. Die Tiere werden bis zum Erreichen  des Titer-Plateaus geboostet. Vorzugsweise wird das Tier mit dem  Konjugat desselben Antigens geboostet, jedoch konjugiert an ein anderes  Protein und/oder über ein anderes vernetzendes Reagens.

   Konjugate  können auch in rekombinater Zellkultur als Fusionsproteine hergestellt  werden. Ebenso sind aggregierende Mittel wie Alaun zur Verstärkung  der Immunantwort in geeigneter Weise verwendbar.    (ii)  Monoklonale  Antikörper  



   Monoklonale Antikörper werden aus einer Population von im Wesentlichen  homogenen Antikörpern erhalten, d.h. die in der Population enthaltenen,  einzelnen Antikörper sind bis auf mögliche, natürlich auftretende  Mutationen, die in geringer Menge vorhanden sein können, identisch.  Folglich weist die nähere Bestimmung "monoklonal" auf den Charakter  des Antikörpers als nicht aus einer Mischung getrennter Antikörper  bestehend hin. 



   Beispielsweise können monoklonale Antikörper mittels des Hybridom-Verfahrens,  das zuerst von Kohler et al., Nature 256, 495 (1995), beschrieben  worden ist, oder mittels rekombinanter DNA-Verfahren hergestellt  werden (U.S.-Patent Nr. 4 816 567). 



   In der Hybridom-Methode wird eine Maus oder ein anderes geeignetes  Wirtstier, wie z.B. Hamster, wie hierin oben beschrieben, immunisiert,  um Lymphozyten hervorzurufen, die Antikörper produzieren oder dazu  fähig sind, die spezifisch an das für die Immunisierung verwendete  Protein binden. Alternativ dazu können Lymphozyten in vitro immunisiert  werden. Lymphozyten werden unter Verwendung eines geeigneten Fusionsmittels,  wie z.B. Polyethylenglykol, mit Myelom-Zellen fusioniert, um die  Hybridom-Zelle zu bilden (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles  and Practice, Seiten 59-103, Academic Press (1986)). 



   Die so hergestellten Hybridomzellen werden in eine geeignetes Kulturmedium,  das vorzugsweise eine oder mehrere Substanzen enthält, die das Wachstum  oder Überleben von nicht-fusionierten Myelom-Elternzellen inhibieren,  inokuliert und gezüchtet. Beispielsweise wird das Medium für die  Hybridoma, wenn der parentalen Myelomzelle das Enzym Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase  (HGPRT oder HPRT) fehlt, typischerweise Hypoxanthin, Aminopterin  und Thymidin (HAT-Medium) enthalten. Diese Substanzen verhindern  das Wachstum von HGPRT-defizienten Zellen. 



     Bevorzugte Myelomzellen sind jene, die effizient fusionieren,  stabile High-Level-Produktion von Antikörper durch selektierte Antikörper-produzierende  Zellen unterstützen und für ein Medium wie z.B. HAT-Medium sensitiv  sind. Unter diesen bevorzugten Myelom-Zelllinien sind murine Myelom-Linien,  wie z.B. jene die von MOPC-21- und MPC-11-Maustumoren hergeleitet  sind und vom Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego,  California USA, erhältlich sind, und SP-2- oder X63-Ag8-653-Zellen,  die von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland  USA, erhältlich sind. Human-Myelom- und Maus-Human-Heteromyelom-Zelllinien  sind ebenfalls für die Produktion humaner monoklonaler Antikörper  beschrieben worden (Kozbor, J.

   Immunol. 133, 3001 (1984); und Brodeur  et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,  Seiten 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York (1987)). 



   Das Kulturmedium, in dem die Hybridomzellen wachsen, wird auf die  Produktion monoklonaler Antikörper gegen das Antigen getestet. Vorzugsweise  wird die Bindungsspezifität der durch Hybridomzellen produzierten  monoklonalen Antikörper mittels Immunpräzipitation oder einem in  vitro Bindungstest, wie z.B. Radioimmunassay (RIA) oder Enzym-gebundenen  Immunosorptions-Assay (ELISA), bestimmt. 



   Die Bindungsaffinität monoklonaler Antikörper kann beispielsweise  mittels der Scatchard-Analyse von Munson et al., Anal. Biochem. 107,  220 (1980), bestimmt werden. 



   Nach der Identifizierung von Hybridomzellen, die Antikörper der gewünschten  Spezifität, Affinität und/oder Aktivität produzieren, können die  Klone mittels Grenzverdünnungs-Verfahren subkloniert und mittels  Standardmethoden gezüchtet werden (Goding, "Monoclonal Antibodies:  Principles and Practice", Seiten 59-103, Academic Press (1986)).  Geeignete Kulturmedien zu diesem Zweck umfassen z.B. D-MEM- oder  RPMI-1640-Medium. Zusätzlich können die Hybridomzellen in vivo als  Ascites-Tumore in einem Tier gezüchtet werden. 



     Die von den Subklonen sekretierten monoklonalen Antikörper werden  in geeigneter Wiese von Kulturmedium, Ascites-Flüssigkeit oder Serum  getrennt, und zwar mittels konventioneller Antikörper-Reinigungsprozeduren,  wie z.B. Protein-A-Sepharose, Hydroxylapatit-Chromatographie, Gelelektrophorese,  Dialyse oder Affinitätschromatographie. 



   DNA, die für monoklonale Antikörper kodiert, kann mittels konventioneller  Verfahren (z.B. unter Verwendung von Oligonukleotid-Sonden, die in  der Lage sind, spezifisch an Gene zu binden, die für leichte und  schwere Ketten von murinen Antikörpern kodieren) leicht isoliert  und sequenziert werden. Die Hybridomzellen dienen als bevorzugte  Quelle solcher DNA. Einmal isoliert, kann die DNA in Expressionsvektoren  gesetzt werden, die dann in Wirtszellen, wie z.B. E. coli-Zellen,  Simian-COS-Zellen, Chinahamster-Eierstock-(CHO-)Zellen oder Myelomzellen,  die keine Antikörperproteine produzieren, transfiziert werden, um  die Synthese monoklonaler Antikörper in der rekombinanten Wirtszelle  zu erhalten. Übersichtsartikel über rekombinante Expression von DNA,  die für den Antikörper kodiert, in Bakterien umfassen Skerra et al.,  Curr.

   Opinion in Immunol. 5, 256-262 (1993) und Plückthun, Immunol.  Revs 130, 151-188 (1992). 



   In einer weiteren Ausführungsform können monoklonale Antikörper oder  Antikörper-Fragmente unter Verwendung der in McCafferty et al., Nature  348, 552-554 (1990), beschriebenen Techniken aus Antikörper-Phagen-Bibliotheken  isoliert werden. Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991) und  Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991), beschreiben die  Isolierung von murinen bzw. humanen Antikörpern unter Verwendung  von Phagen-Bibliotheken. Nachfolgende Publikationen beschreiben die  Produktion humaner Antikörper hoher Affinität (nM-Bereich) mittels  Ketten-Shuffling (Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992)),  wie auch kombinatorische Infektion und in vivo-Rekombination als  Strategie zur Konstruktion grosser Phagen-Bibliotheken (Waterhouse  et al., Nuc. Acids. Res. 21, 2265-2266 (1993)).

   Folglich sind diese  Techniken    entwicklungsfähige Alternativen zu traditionellen Hybridom-Techniken  monoklonaler Antikörper zur Isolierung von monokonalen Antikörpern.                                                            



   Die DNA kann auch modifiziert werden, beispielsweise durch Substitution  der kodierenden Sequenz humaner Schwerketten- und Leichtketten-Konstantdomänen  anstelle der homologen murinen Sequenzen (U.S.-Patent Nr. 4 816 567  und Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851 (1994)),  oder durch kovalente Verbindung der gesamten oder eines Teils der  für ein Nicht-Immunglobulin-Polypeptid kodierenden Sequenz mit der  für Immunglobulin kodierenden Sequenz. 



   Typischerweise werden die konstanten Domänen eines Antikörpers durch  solche Nicht-Immunglobulin-Peptide substituiert, oder sie substituieren  die variabel Domäne einer Antigen-bindenden Stelle eines Antikörpers,  um einen chimären, bivalenten Antikörper zu erzeugen, der eine antigenbindende  Stelle mit Spezifität für ein Antigen und eine andere antigenbindende  Stelle mit Spezifität für eine anderes Antigen beinhaltet.  (iii)  Humanisierte Antikörper  



   Verfahren für humanisierte Antikörper sind im Fach beschrieben worden.  Bevorzugt besitzt ein humanisierter Antikörper eine oder mehrere  eingeführte Aminosäurereste, die von einer nicht-humanen Quelle herrühren.  Diese nicht-humanen Aminosäurereste werden oft als "Import"-Reste  bezeichnet, die typischerweise von einer "Import"-variablen-Domäne  genommen sind. Humanisierung kann im Wesentlichen nach der Methode  von Winter und Mitarbeiter (Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986);  Riechmann et al., Nature 332, 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science  239, 1534-1536 (1988)) durchgeführt werden, und zwar durch Substitution  der hypervariablen Sequenzen mit den entsprechenden Sequenzen eines  humanen Antikörpers.

   Demgemäss sind solche "humanisierten" Antikörper  chimäre Antikörper (U.S.-Patent Nr. 4 816 567), worin wesentlich  weniger als eine intakte humane variable Domäne durch die entsprechende  Sequenz aus einer nicht-humanen Spezies substituiert worden ist.  In der    Praxis sind humanisierte Antikörper typischerweise humane  Antikörper mit einigen Resten in der hypervariablen Region und möglicherweise  sind einige FR-Reste durch Reste analoger Stellen von Nager-Antikörpern  substituiert. 



   Die Auswahl der für die Herstellung humanisierter Antikörper zu verwendenden  humanen variablen Domänen ist sehr wichtig, um die Antigenität zu  vermindern. Gemäss der so genannten "Best-Fit"-Methode, wird die  Sequenz der variablen Domäne eines Nager-Antikörpers gegen die gesamte  Bibliothek bekannter Sequenzen humaner variabler Domänen gescreent.  Die humane Sequenz, die der des Nagers am ähnlichsten ist, wird dann  als die humane Gerüstregion (FR) für den humanisierten Antikörper  akzeptiert (Sims et al., J. Immunol. 151, 2296 (1993); Chothia et  al., J. Mol. Biol. 196, 901 (1987)). Ein weiteres Verfahren verwendet  eine bestimmte Gerüstregion, hergeleitet von der Konsensus-Sequenz  aller humaner Antikörper oder einer bestimmten Untergruppe leichter  und schwerer Ketten.

   Dasselbe Gerüst kann für mehrere verschiedene  humanisierte Antikörper verwendet werden (Carter et al., Proc. Natl.  Acad. Sci. USA 89, 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151, 2623  (1993)). 



   Weiters ist wichtig, dass die Antikörper unter Beibehaltung hoher  Affinität für das Antigen und anderer günstiger biologischer Eigenschaften  humanisiert werden. Um dieses Ziel zu erreichen, werden humanisierte  Antikörper gemäss einer bevorzugten Methode durch einen Prozess von  Analyse parentaler Sequenzen und verschiedener konzeptueller, humanisierter  Produkte, unter Verwendung dreidimensionaler Modelle der parentalen  und humanisierten Sequenzen, hergestellt. Dreidimensionale Immunglobulin-Modelle  sind allgemein erhältlich und dem Fachkundigen geläufig. Computerprogramme  sind erhältlich, die wahrscheinliche dreidimensionale Konformationen  ausgesuchter Immunglobulin-Kandidatsequenzen veranschaulichen und  darstellen.

   Die Prüfung dieser Darstellungen erlaubt die Analyse  der wahrscheinlichen Rolle von Resten, die die Fähigkeit des Immunglobulin-Kandidaten  beeinflussen, an sein Antigen zu binden. Auf diese Weise können FR-Reste  aus den Rezipienten- und Import-Sequenzen ausgewählt und kombiniert  werden, so dass das gewünschte Antikörper-   Charakteristikum, wie  z.B. erhöhte Affinität für das/die Zielantigen(e), erzielt werden  kann. Im Allgemeinen seien die Reste der hypervariablen Regionen  direkt und höchst signifikant an der Beeinflussung der Antigenbindung  beteiligt. 



   Unten angeführtes Beispiel 3 beschreibt die Produktion von exemplarischen  humanisierten Anti-ErbB2-Antikörpern, die ErbB2 binden und Liganden-Aktivierung  eines ErbB-Rezeptors blockieren. Der humanisierte Antikörper von  besonderem Interesse hierin blockiert EGF-, TGF- alpha - und/oder  HRG-vermittelte Aktivierung von MAPK genauso effektiv wie muriner  monoklonaler Antikörper 2C4 (oder ein Fab-Fragment davon) und/oder  bindet ErbB2 im Wesentlichen genauso effektiv wie muriner monoklonaler  Antikörper 2C4 (oder ein Fab-Fragment davon).

   Der humanisierte Antikörper  hierin kann beispielsweise Reste der nicht-humanen hypervariablen  Region, eingebaut in eine humane variable schwere Domäne, enthalten,  und kann weiters eine Gerüstregion-(FR-)Substitution an einer Position  enthalten, ausgesucht aus einer Gruppe bestehend aus 69H, 71H und  73H, unter Verwendung des Nummerierungs-Systems variabler Domänen  von Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest",  5. Auflage, Public Health Service, National Institutes of Health,  Bethesda, MD, USA (1991). In einer Ausführungsform beinhaltet der  humanisierte Antikörper FR-Substitutionen an zwei oder allen der  Positionen 69H, 71H und 73H. 



   Ein exemplarischer humanisierter Antikörper hierin von Interesse  beinhaltet die Komplementaritäts-bestimmenden Reste GFTFTDYTMX der  variablen schweren Domäne, wobei X bevorzugt D oder S (Seq.-ID Nr.  7) ist; DVNPNSGGSIYNQRFKG (Seq.-ID Nr. 8) und/oder NLGPSFYFDY (Seq.-ID  Nr. 9), optional beinhaltend Aminosäuremodifikationen dieser CDR-Reste,  z.B. wo die Modifikationen im Wesentlichen die Affinität des Antikörpers  erhalten oder verbessern. Beispielsweise besitzt die Antikörper-Variante  von Interesse ungefähr eine bis ungefähr sieben oder ungefähr fünf  Aminosäuresubstitutionen in den obigen variablen schweren CDR-Sequenzen.  Solche Antikörper-Varianten können durch Affinitäts-Reifung, z.B.  wie unten beschrieben, her   gestellt werden.

   Der insbesondere bevorzugte  humanisierte Antikörper beinhaltet die variable Schwerketten-Domänen-Aminosäuresequenz  der Seq.-ID Nr. 4. 



   Der humanisierte Antikörper kann die Komplementaritäts-bestimmenden  Reste KASQDVSIGVA (Seq.-ID Nr. 10) der variablen leichten Domäne  beinhalten; weiters SASYX<1>X<2>X<3>, wobei X<1> bevorzugt R oder  L ist, X<2> bevorzugt Y oder E ist und X<3> bevorzugt T oder S ist  (Seq.-ID Nr. 11); und/oder QQYYIYPYT (Seq.-ID Nr. 12), z.B. zusätzlich  zu jenen CDR-Resten der variablen schweren Domäne im vorangegangenen  Absatz. Solche humanisierte Antikörper können optional Aminosäuremodifikationen  der obigen CDR-Reste beinhalten, z.B. wo die Modifikationen im Wesentlichen  die Affinität des Antikörpers erhalten oder verbessern. Beispielsweise  kann die Antikörper-Variante von Interesse ungefähr eine bis ungefähr  sieben oder ungefähr fünf Aminosäuresubstitutionen in den obigen  variablen leichten CDR-Sequenzen besitzen.

   Solche Antikörper-Varianten  können durch Affinitäts-Reifung, z.B. wie unten beschrieben, hergestellt  werden. Der insbesondere bevorzugte humanisierte Antikörper beinhaltet  die variable Leichtketten-Domänen-Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr.  3. 



   Die vorliegende Anmeldung erwägt auch affinitätsgereifte Antikörper,  die ErbB2 binden und Liganden-Aktivierung eines ErbB-Rezeptors blockieren.  Der parentale Antikörper kann ein humaner Antikörper oder ein humanisierter  Antikörper sein, z.B. einer, der die variablen leichten und/oder  schweren Sequenzen der Seq.-ID Nr. 3 bzw. 4 umfasst (d.h. Variante  574). Der affinitätsgereifte Antikörper bindet bevorzugt an den ErbB2-Rezeptor  mit einer Affinität, die jene von murinem 2C4 oder Variante 574 übertrifft  (z.B. von ungefähr zwei- bis ungefähr fünffach, bis ungefähr 100fach  oder ungefähr 1000fach verbesserter Affinität, wie z.B. bewertet  mittels einem ErbB2-Extrazellulär-Domänen-(ECD-)ELISA).

   Beispielhafte  variable schwere CDR-Reste für Substitution umfassen H28, H30, H34,  H35, H64, H96, H99 oder Kombinationen von zwei oder mehreren davon  (z.B. zwei, drei, vier, fünf, sechs oder sieben dieser Reste). Beispiele  von variablen leichten CDR-Resten für Veränderung umfassen L28, L50,  L53, L56, L91, L92, L93, L94, L96,    L97 oder Kombinationen von  zwei oder mehreren davon (z.B. zwei, drei, vier, fünf, oder bis zu  ungefähr zehn dieser Reste). 



   Verschiedene Formen des humanisierten Antikörpers oder affinitätsgereiften  Antikörpers werden erwogen. Beispielsweise kann der humanisierte  Antikörper oder affinitätsgereifte Antikörper ein Antikörperfragment  sein, wie z.B. Fab, das optional mit einem oder mehreren zytotoxischen  Mittel konjugiert ist, um ein Immunkonjugat zu generieren. Alternativ  dazu kann der humanisierte Antikörper oder affinitätsgereifte Antikörper  ein intakter Antikörper sein, wie z.B. ein intakter IgG1-Antikörper.  (iv) Humane Antikörper  



   Als Alternative zur Humanisierung können humane Antikörper generiert  werden. Beispielsweise ist es nun möglich, transgene Tiere (z.B.  Mäuse) zu produzieren, die in der Lage sind, bei Immunisierung ein  volles Repertoire humaner Antikörper in Abwesenheit von endogener  Immunglobulin-Produktion zu produzieren. Beispielsweise ist beschrieben  worden, dass die homozygote Deletion der Schwerketten-verbindenden  Region (J tt ) von Antikörpern in chimären und Keimbahn-Mutantenmäusen  zur vollständigen Inhibierung endogener Antikörper-Produktion führt.  Transfer der humanen Keimbahn-lmmunglobulin-Genreihe in solche Keimbahn-Mutanten-Mäuse  wird bei Antigen-Exposition zur Produktion von humanen Antikörpern  führen. Siehe z.B. Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

   USA  90, 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362, 255-258 (1993); Bruggermann  et al., Year in Immuno. 7, 33 (1993); und die U.S.-Patente Nr. 5  591 669, 5 589 369 und 5 545 807. 



   Alternativ dazu kann Phagen-Display-Technologie (McCafferty et al.,  Nature 348, 552-553 (1990)) verwendet werden, um humane Antikörper  und Antikörper-Fragmente aus dem Repertoire von Genen der variablen  (V) Immunglobulin-Domänen nicht-immunisierter Spender in vitro herzustellen.  Gemäss dieser Technik, werden Antikörper V-Domänen-Gene im Raster  kloniert, und zwar entweder in ein bedeutendes oder in ein    untergeordnetes  Hüllprotein-Gen eines filamentösen Bakteriophagen, wie z.B. M13 oder  fd, und zeigen sich als funktionelle Antikörper-Fragmente an der  Oberfläche des Phagen-Partikels. Da das filamentöse Phagen-Partikel  eine Einzelstrang-DNA-Kopie des Phagen-Genoms enthält, führen die  auf den funktionellen Eigenschaften des Antikörpers basierenden Selektionen  auch zur Selektion des Gens, das für den Antikörper kodiert, der  diese Eigenschaften aufweist.

   Folglich ahmt der Phage einige der  Eigenschaften der B-Zelle nach. Phagen-Display kann in verschiedensten  Formaten durchgeführt werden; für einen Überblick siehe z.B. Kevin  S. Johnson und David J. Chriswell, Current Opinion in Structural  Biology 3, 564-571 (1993). Mehrere Quellen von V-Gen-Segmenten können  für Phagen-Display verwendet werden. Clackson et al., Nature 352,  624-628 (1991), isolierten mannigfaltige Reihen von Anti-Oxyzolon-Antikörper  aus einer kleinen Zufalls-kombinatorischen Bibliothek von V-Genen,  hergeleitet von der Milz immunisierter Mäuse. Ein Repertoire von  V-Genen kann aus nicht-immunisierten humanen Spendern konstruiert  werden und es können Antikörper gegen eine mannigfaltige Reihe von  Antigenen isoliert werden, im Wesentlichen unter Befolgung der von  Marks et al., J. Mol.

   Biol. 222, 581-597 (1991), oder Griffith et  al., EMBO J. 12, 725-734 (1993), beschriebenen Techniken. Siehe auch  die U.S.-Patente Nr. 5 565 332 und 5 573 905. 



   Wie oben diskutiert können humane Antikörper auch durch in vitro  Aktivierte B-Zellen generiert werden (siehe die U.S.-Patente Nr.  5 567 610 und 5 229 275). 



   Humane Anti-ErbB2-Antikörper werden beschrieben in U.S.-Patent Nr.  5 772 997, erteilt am 30. Juni 1998, und in der WO97/00271, publiziert  am 3. Jänner 1997.  (v) Antikörper-Fragmente  



   Verschiedenste Techniken sind zur Produktion von Antikörper-Fragmenten  entwickelt worden. Traditionell sind diese Fragmente vom proteolytischen  Verdau intakter Antikörper hergeleitet (siehe z.B. Morimoto et al.,  Journal of Biochemical and Biophysical Me   thods 24, 107-117 (1992)  und Brennan et al., Science 229, 81 (1985)). Diese Fragmente können  jedoch heute direkt durch rekombinante Wirtszellen produziert werden.  Beispielsweise können die Antikörper-Fragmente aus den oben diskutierten  Phagen-Bibliotheken isoliert werden. Alternativ dazu können Fab'-SH-Fragmente  direkt aus E. coli gewonnen und chemisch gekoppelt werden, um F(ab')  2 -Fragmente zu liefern (Carter et al., Bio/Technology 10, 163-167  (1992)). Gemäss einem anderen Ansatz können F(ab') 2 -Fragemente  direkt aus rekombinanten Wirtszellenkulturen isoliert werden.

   Andere  Techniken für die Produktion von Antikörper-Fragmenten werden dem  fachkundigen Praktiker offensichtlich sein. In anderen Ausführungsformen  ist der Antikörper der Wahl ein Einzelketten-Fv-Fragment (scFv).  Siehe WO93/16185; U.S.-Patent Nr. 5 571 894 und U.S.-Patent Nr. 5  587 458. Das Antikörper-Fragment kann auch ein "linearer Antikörper"  sein, z.B. wie beispielsweise beschrieben in U.S.-Patent Nr. 5 641  870. Solche lineare Antikörper können monospezifisch oder bispezifisch  sein.  (vi) Bispezifische Antikörper  



   Bispezifische Antikörper sind Antikörper die Bindungsspezifitäten  für zumindest zwei verschiedene Epitope besitzen. Exemplarische bispezifische  Antikörper könnten an zwei verschiedene Epitope des ErbB2-Proteins  binden. In anderen solcher Antikörper kann eine ErbB2-Bindungsstelle  mit Bindungsstelle(n) für EGFR, ErbB3 und/oder ErbB4 kombiniert sein.  Alternativ dazu kann ein Anti-ErbB2-Arm kombiniert sein mit einem  Arm, der an ein auslösendes Molekül auf einem Leukozyten bindet,  wie z.B. ein T-Zellen-Rezeptormolekül (z.B. CD2 oder CD3), oder Fc-Rezeptoren  für IgG (Fc gamma R), wie z.B. Fc gamma RI (CD64), Fc gamma RII (CD32)  und Fc gamma RIII (CD16), um die zellulären Abwehrmechanismen auf  die ErbB2-exprimierende Zelle zu konzentrieren.

   Bispezifische Antikörper  können auch verwendet werden, um zytotoxische Mittel gegen ErbB2-exprimierende  Zellen zu lokalisieren. Diese Antikörper besitzen einen ErbB2-bindenden  Arm und einen Arm, der ein zytotoxisches Mittel bindet (z.B. Saporin,  Anti-Interferon- alpha , Vinca-Alkaloid, Ricin-A-Kette, Methotrexat  oder Radioisotop-Hapten). Bispezifische    Antikörper können als  Volllängen-Antikörper oder Antikörper-Fragmente (z.B. F(ab') 2 -bispezifischer  Antikörper) produziert werden. 



   WO96/16673 beschreibt einen bispezifischen Anti-ErbB2/anti-Fc gamma  RIII-Antikörper und U.S.-Patent Nr. 5 837 234 offenbart einen bispezifischen  Anti-ErbB2/anti-Fc gamma RI-Antikörper. Ein bispezifischer Anti-ErbB2/Fc  alpha -Antikörper wird in WO98/02463 gezeigt. U.S. Patent Nr. 5 821  337 unterrichtet von einem bispezifischen Anti-ErbB2/Anti-CD3-Antikörper.                                                      



   Verfahren zur Herstellung bispezifischer Antikörper sind fachbekannt.  Traditionelle Produktion von Volllängen-bispezifischen Antikörpern  basiert auf die Co-Expression von zwei Immunglobulin-Schwerketten/Leichtketten-Paaren,  wobei die beiden Ketten verschiedene Spezifitäten besitzen (Millstein  et al., Nature 305, 537-539 (1983)). Wegen der Zufallsverteilung  von schweren und leichten Immunglobulin-Ketten produzieren diese  Hybridome (Quadrome) eine mögliche Mischung von 10 verschiedenen  Antikörpermolekülen, von denen nur eine die korrekte bispezifische  Struktur besitzt. Die Reinigung des korrekten Moleküls, die gewöhnlich  mittels affinitätschromatographischen Schritten durchgeführt wird,  ist eher beschwerlich, und die Produktausbeuten sind niedrig. Ähnliche  Prozeduren werden offenbart in WO 93/08829 und in Traunecker et al.,  EMBO J. 10, 3655-3659 (1991). 



   Gemäss einem anderen Ansatz werden variable Antikörper-Domänen mit  den gewünschten Bindungsspezifitäten (Antikörper-Antigen-Bindungsstellen)  an Sequenzen der konstanten Immunglobulin-Domäne fusioniert. Die  Fusionierung erfolgt bevorzugt mit einer konstanten Schwerketten-Immunglobulin-Domäne,  die zumindest einen Teil der Hinge-, CH2- und CH3-Regionen beinhaltet.  Es wird bevorzugt, dass die erste konstante Schwerketten-Region (CH1),  enthaltend die für Leichtketten-Bindung notwendige Stelle, in zumindest  eine der Fusionen vorhanden ist. DNAs, die für die Immunglobulin-Schwerketten-Fusionen  und, falls erwünscht, für die Immunglobulin-Leichtkette kodieren,  werden in getrennte Expressionsvektoren insertiert und in einen geeigneten  Wirtsor   ganismus co-transfektiert.

   Dies führt zu hoher Flexibilität  der Einstellung der wechselseitigen Anteile der drei Polypeptidfragmente  in Ausführungsformen, wenn ungleiche Verhältnisse der drei zur Konstruktion  verwendeten Polypeptidketten zu den optimalen Ausbeuten führen. Es  ist jedoch möglich, die kodierenden Sequenzen für zwei oder alle  Polypeptidketten in einem Expressionsvektor zu insertieren, wenn  die Expression von zumindest zwei Polypeptidketten in gleichen Verhältnissen  zu hohen Ausbeuten führt oder wenn die Verhältnisse von keiner besonderen  Signifikanz sind. 



   In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Ansatzes sind die bispezifischen  Antikörper aus einer Hybrid-Immunglobulin-Schwerkette mit einer ersten  Bindungsspezifität in einem Arm und einem Hybrid-Immunglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paar  (eine zweite Bindungsspezifität bereitstellend) im anderen Arm zusammengesetzt.  Es wurde gefunden, dass diese asymmetrische Struktur die Trennung  der gewünschten bispezifischen Verbindung von unerwünschten Immunglobulin-Kettenkombinationen  erleichtert, da das Vorhandensein einer Immunglobulin-Leichtkette  in nur der Hälfte der bispezifischen Moleküle eine einfache Möglichkeit  zur Trennung bereitstellt. Dieser Ansatz ist in WO 94/04690 offenbart.  Für weitere Details zur Generierung bispezifischer Antikörper siehe  z.B. Suresh et al., Methods in En-zymology 121, 210 (1986). 



   Gemäss einem weiteren Ansatz, beschrieben im U.S.-Patent Nr. 5 731  168, kann die Schnittstelle zwischen einem Paar von Antikörpermolekülen  so konstruiert werden, dass der Prozentanteil von Heterodimeren,  die aus rekombinanter Zellkultur gewonnen wird, maximiert wird. Die  bevorzugte Schnittstelle beinhaltet zumindest einen Teil der C H  3-Domäne einer konstanten Antikörper-Domäne. In diesem Verfahren  werden eine oder mehrere kleine Aminosäure-Seitenketten der Schnittstelle  des ersten Antikörpers durch grössere Seitenketten ersetzt (z.B.  Tyrosin oder Tryptophan). Kompensierende "Zellen" mit einer den grösseren  Seitenkette(n) identischen oder ähnlichen Grösse, werden am Interface  des zweiten Antikörpers erzeugt, indem grosse Aminosäure-Seitenketten  durch kleinere (z.B. Alanin oder Threonin) ersetzt werden.

   Dies stellt  einen Mechanismus zur    Steigerung der Ausbeute von Heterodimer  gegenüber anderen, unerwünschten Endprodukten, wie z.B. Homodimeren,  bereit. 



   Bispezifische Antikörper umfassen vernetzte oder "Heterokonjugat"-Antikörper.  Beispielsweise kann einer der Antikörper im Heterokonjugat an Avidin,  der andere an Biotin gekoppelt werden. Solche Antikörper sind beispielsweise  vorgeschlagen worden, um Immunsystem-Zellen auf ungewünschte Zellen  zu zielen (U.S.-Patent Nr. 4 676 980) und zur Behandlung von HIV-Infektion  (WO 91/00360, WO 92/200373 und EP-A-03089). Heterokonjugat-Antikörper  können mit jeglicher passenden Vernetzungsmethode hergestellt werden.  Geeignete Vernetzer sind gut fachbekannt und in U.S.-Patent Nr. 4  676 980, gemeinsam mit einer Anzahl von Vernetzungstechniken, offenbart.                                                       



   Verfahren zur Generierung bispezifischer Antikörper aus Antikörper-Fragmenten  sind in der Literatur ebenfalls beschrieben worden. Beispielsweise  können bispezifische Antikörper mittels chemischer Verknüpfung hergestellt  werden. Brennan et al., Science 229, 81 (1985), beschreiben eine  Prozedur, worin intakte Antikörper proteolytisch gespalten werden,  um F(ab')2-Fragmente zu generieren. Diese Fragmente werden in Gegenwart  des Dithiol-komplexierenden Mittel Natriumarsenit reduziert, um benachbarte  Dithiole zu stabilisieren und intramolekulare Disulfid-Bildung zu  verhindern. Die generierten Fab'-Fragmente werden dann zu den Thionitrobenzoat-(TNB-)Derivaten  umgesetzt.

   Eines der Fab'-TNB-Fragmente wird dann mittels Reduktion  mit Mercaptoethylamin zum Fab'-Thiol rückgebildet und mit einer äquimolaren  Menge des anderen Fab'TNB-Derivats vermischt, um den bispezifischen  Antikörper zu erhalten. Die hergestellten bispezifischen Antikörper  können als Mittel zur selektiven Immobilisierung von Enzymen verwendet  werden. 



   Kürzliche Fortschritte haben die direkte Gewinnung von Fab'-SH-Fragmenten  aus E. coli vereinfacht, die zur Bildung bispezifischer Antikörper  chemisch gekoppelt werden können. Shylaby et al., J. Exp. Med. 175,  217-225 (1992), beschreiben die Produktion eines vollständig humanisierten,  bispezifischen Antikörper-Fab'-Moleküls. Jedes Fab'-Fragment    wurde  getrennt aus E. coli sekretiert und gerichteter chemischer in vitro-Koppung  unterworfen, um den bispezifischen Antikörper zu bilden. Der so gebildete  bispezifische Antikörper war in der Lage, an ErbB2-Rezeptor-überexprimierende  und normale Human-T-Zellen zu binden, sowie auch die lytische Aktivität  humaner, cytotoxischer Lymphozyten gegen humane Brusttumor-Targets  auszulösen. 



   Verschiedene Techniken zur Herstellung und Isolierung bispezifischer  Antikörper-Fragmente direkt aus rekombinanten Zellkulturen sind ebenfalls  beschrieben worden. Beispielsweise sind bispezifische Antikörper  mittels Verwendung von Leucin-Zippern hergestellt worden. Kostelny  et al., J. Immunol. 148(5), 1547-1553 (1992). Die Leucin-Zipper-Peptide  von Fos- und Jun-Proteinen wurden mittels Genfusion an die Fab'-Teile  von zwei verschiedenen Antikörpern gebunden. Die Antikörper-Homodimere  wurden an der Hinge-Region reduziert, um Monomere zu bilden, und  dann reoxidiert um die Antikörper-Heterodimere zu bilden. Dieses  Verfahren kann auch zur Produktion von Antikörper-Homodimeren genützt  werden. Die von Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

   USA 90,  6444-6448 (1992), beschriebene "Diakörper"-Technologie lieferte einen  alternativen Mechanismus zur Herstellung bispezifischer Antikörperfragmente.  Die Fragmente umfassen eine variable Schwerketten-Domäne (V H ),  verbunden mit einer variablen Leichtketten-Domäne (V L ) über einen  Linker, der zu kurz ist, um Paarung der beiden Domänen an derselben  Kette zu erlauben. Demgemäss sind die V H - und V L -Domänen eines  Fragments gezwungen, sich den komplementären V L - und V H -Domänen  des anderen Fragments zu paaren und so zwei Antigen-bindende Stellen  zu bilden. Eine weitere Strategie zur Herstellung bispezifischer  Antikörperfragmente mittels Einzelketten-Fv-(sFv-) Dimeren ist ebenfalls  berichtet worden. Siehe Gruber et al., J. Immunol. 152, 5368 (1994).                                                           



   Antikörper mit mehr als zwei Valenzen werden erwogen. Beispielsweise  können trispezifische Antikörper hergestellt werden. Tutt et al.,  J. Immunol. 147, 60 (1991).  (vii)  Andere Aminosäuresequenz-Modifikationen  



   Aminosäuresequenz-Modifikation(en) des hierin beschriebenen Anti-ErbB2-Antikörpers  wird/werden erwogen. Beispielsweise kann es wünschenswert sein, die  Bindungsaffinität und/oder andere biologische Eigenschaften des Antikörpers  zu verbessern. Aminosäuresequenz-Varianten des Anti-ErbB2-Antikörpers  werden durch Einführung geeigneter Nukleotid-Änderungen in die Nukleinsäure  des Anti-ErbB2-Antikörpers oder durch Peptidsynthese hergestellt.  Solch Modifikationen umfassen beispielsweise Deletionen aus und/oder  Insertionen in und/oder Substitutionen von Resten innerhalb der Aminosäuresequenzen  des Anti-ErbB2-Antikörpers. Jede Kombination von Deletion, Insertion  und Substitution wird durchgeführt, um zum endgültigen Konstrukt  zu gelangen, sofern das endgültige Konstrukt die gewünschten Charakteristika  besitzt.

   Die Aminosäure-Änderungen kann auch den post-translationellen  Prozess des Anti-ErbB2-Antikörpers verändern, wie z.B. die Änderung  der Anzahl oder Position von Glykosylierungsstellen. 



   Ein nützliches Verfahren zur Identifizierung gewisser Reste oder  Regionen des Anti-ErbB2-Antikörpers, die bevorzugte Stellen für Mutagenese  sind, wird "Alanin-Scanning-Mutagenese" genannt, wie beschrieben  von Cunningham und Wells, Science 244, 1081-1085 (1989). Hier wird  ein Rest oder eine Gruppe von Ziel-Resten identifiziert (z.B. geladene  Reste wie z.B. arg, asp, his, lys und glu) und durch neutrale oder  negativ geladene Aminosäuren (insbesondere bevorzugt Alanin und Polyalanin)  ersetzt, um die Interaktion der Aminosäuren mit ErbB2-Antigen zu  beeinflussen. Jene Aminosäure-Stellen, die funktionelle Sensibilität  auf Substitutionen zeigen, werden dann durch Einführung weiterer  oder anderer Varianten, an oder anstelle der Substitutionsstellen,  verfeinert.

   Folglich muss die Natur der Mutation per se nicht vorbestimmt  sein, während die Stelle für die Einführung einer Aminosäuresequenz-Variation  vorbestimmt ist. Beispielsweise wird am Target-Codon oder der Target-Region,  um die Leistung einer Mutation an einer gegebenen Stelle zu analysieren,  Ala-Scanning oder ZufalIsmutagenese durchgeführt und die exprimierten  Anti-ErbB2-Antikörper-Varianten auf die gewünschte Aktivität gescreent.                                                        



     Aminosäuresequenz-Insertionen umfassen amino- und/oder carboxyterminale  Fusionen im Längenbereich von einem Rest bis zu Polypeptiden mit  hundert oder mehr Resten, sowie auch Intrasequenz-Insertionen von  einzelnen oder multiplen Aminosäureresten. Beispiele terminaler Insertionen  umfassen -einen Anti-ErbB2-Antikörper mit einem N-terminalen Methionyl-Rest  oder den mit einem zytotoxischen Polypeptid fusionierten Antikörper.  Andere Insertions-Varianten des Anti-ErbB2-Antikörper-Moleküls umfassen  die Fusion des N- oder C-Terminus des Anti-ErbB2-Antikörpers an ein  Enzym (z.B. ADEPT) oder ein Polypeptid, das die Serum-Halbwertszeit  des Antikörpers erhöht. 



   Ein anderer Variantentyp ist eine Aminosäuresubstitutions-Variante.  Bei diesen Varianten ist zumindest ein Aminosäurerest im Anti-ErbB2-Antikörper-Molekül  durch einen unterschiedlichen Rest ersetzt. Die Stellen von grösstem  Interesse für substitutionelle Mutagenese umfassen die hypervariablen  Regionen, jedoch werden FR-Veränderungen auch erwogen. Konservative  Substitutionen sind in Tabelle 1 unter der Überschrift "bevorzugte  Substitutionen" gezeigt. Wenn solche Substitutionen zu einer Veränderung  der biologischen Aktivität führen, können substantiellere Änderungen,  in Tabelle 1 als "beispielhafte Substitutionen" bezeichnet, oder  wie weiter unten in Bezug auf Aminosäureklassen beschrieben, eingeführt  und die Produkte gescreent werden.  Tabelle 1  



     Ursprünglicher Rest Beispielhafte Substitutionen Bevorzugte Substitutionen                                                  



    <tb><TABLE> Columns = 3  <tb>Head Col 1: Ursprüngl. Rest <tb>Head  Col 2: Beispielhafte Substitutionen <tb>Head Col 3: Bevorzugte  Substitution <tb><SEP> Ala (A)<SEP> val; leu; ile<SEP> val <tb><SEP>  Arg (R)<SEP> lys; gln; asn<SEP> lys <tb><SEP> Asn (N)<SEP> gln;  his; asp, lys; arg<SEP> gln <tb><SEP> Asp (D)<SEP> glu; asn<SEP>  glu <tb><SEP> Cys (C)<SEP> ser; ala<SEP> ser <tb><SEP> Gin (Q)<SEP>  asn; glu<SEP> asn <tb><SEP> Glu (E)<SEP> asp; gln<SEP> asp <tb><SEP>  Gly (G)<SEP> ala<SEP> ala <tb><SEP> His (H)<SEP> asn; gln; lys;  arg<SEP> arg <tb><SEP> Ile (I)<SEP> leu; val; met; ala; phe; norleucin<SEP>  leu <tb><SEP> Leu (L)<SEP> norleucin; ile; val; met; ala; phe<SEP>  ile <tb><SEP> Lys (K)<SEP> arg; gln; asn<SEP> arg <tb><SEP> Met  (M)<SEP> leu; phe; ile<SEP> leu <tb><SEP> Phe (F)<SEP> leu; val;

    ile; ala; tyr<SEP> tyr <tb><SEP> Pro (P)<SEP> ala<SEP> ala <tb><SEP>  Ser (S)<SEP> thr<SEP> thr <tb><SEP> Thr (T)<SEP> ser<SEP> ser <tb><SEP>  Trp (W)<SEP> tyr; phe<SEP> tyr <tb><SEP> Tyr (Y)<SEP> trp; phe;  thr; ser<SEP> phe <tb><SEP> Val (V)<SEP> ile; leu; met; phe; ala;  norleucin-<SEP> leu  <tb></TABLE> 



   Wesentliche Modifikationen der biologischen Eigenschaften des Antikörpers  werden erzielt, indem Substitutionen ausgewählt werden, die sich  signifikant unterscheiden, und zwar in ihrer Wirkung auf die Erhaltung  (a) der Struktur des Polypeptid-Gerüsts im Bereich der Substitution,  z.B. als Faltblatt- oder Helix-Konformation, (b) der Ladung oder  Hydrophobie des Moleküls an der Zielstelle oder (c) des Hauptteils  der Seitenkette. Na   türlich auftretende Reste werden, basierend  auf gemeinsame Eigenschaften der Seitenketten, in Gruppen unterteilt:  (1) hydrophob: Norleucin, Met, Ala, Val, Leu, lle; (2) neutral  hydrophil: Cys, Ser, Thr; (3) sauer: Asp, Glu; (4) basisch: Asn,  Gln, His, Lys, Arg; (5) Kettenorientierung-beeinflussende Reste:  Gly, Pro; und (6) aromatisch: Trp, Tyr, Phe. 



   Nicht-konservative Substitutionen erfordern den Austausch eines Mitglieds  einer dieser Klassen gegen eine andere Klasse. 



   Jeglicher Cystein-Rest, der nicht an der Erhaltung der richtigen  Konformation des Anti-ErbB2-Antikörpers beteiligt ist, kann ebenfalls  substituiert werden, im Allgemeinen mit Serin, um die oxidative Stabilität  des Moleküls zu verbessern und abweichende Vernetzung zu verhindern.  Umgekehrt können/kann Cystein-Bindung(en) dem Antikörper beigefügt  werden, um seine Stabilität zu verbessern (besonders wenn der Antikörper  ein Antikörperfragment, wie z.B. ein Fv-Fragment, ist). 



   Eine besonders bevorzugter Typ von Substitutionsvarianten umfasst  die Substitution von einem oder mehreren Resten der hypervariablen  Region eines parentalen Antikörpers (z.B. ein humanisierter oder  humaner Antikörper). Im Allgemeinen werden die resultierenden, für  weitere Entwicklung selektierten Varianten im Vergleich mit dem parentalen  Antikörper, aus dem sie generiert wurden, verbesserte biologische  Eigenschaften aufweisen. Eine günstige Art und Weise für die Generierung  solcher substitutioneller Varianten involviert Reifung mittels Phagen-Display.  Kurz gefasst, werden mehrere Stellen der hypervariablen Region (z.B.  6-7 Stellen) mutiert, um alle möglichen Aminosubstitutionen an jeder  Stelle zu erzeugen.

   Die so generierten Antikörper-Varianten werden  in monovalenter Weise von filamentösen Phagenpartikeln präsentiert,  und zwar als Fusionen an    das Gen-III-Produkt von M13, eingeschlossen  innerhalb eines jeden Partikels. Die Phagen-Display-Varianten werden  dann, wie hierin offenbart, auf ihre biologische Aktivität gescreent  (z.B. Bindungsaffinität). Um die Kandidaten der Stellen hypervariabler  Regionen für die Modifizierung zu identifizieren, kann Alanin-Scanning-Mutagenese  durchgeführt werden, um Reste hypervariabler Regionen zu identifizieren,  die signifikant zur Antigenbindung beitragen. Alternativ dazu oder  zusätzlich kann es von Vorteil sein, die Kristallstruktur des Antigen-Antikörper-Komplexes  zu analysieren, um die Kontaktpunkte zwischen dem Antikörper und  humanem ErbB2 zu identifizieren.

   Solche Kontaktreste und benachbarte  Reste sind Kandidaten zur Substitution gemäss der hierin ausgearbeiteten  Techniken. Wenn solche Varianten einmal erzeugt sind, wird die Reihe  von Varianten, wie hierin beschrieben, einem Screening unterworfen,  und Antikörper mit überlegenen Eigenschaften in einem oder mehreren  der Tests können für die weitere Entwicklung selektiert werden. 



   Ein weiterer Typus der Aminosäure-Variante des Antikörpers verändert  das ursprüngliche Glykosylierungsmuster des Antikörpers. Mit Veränderung  ist gemeint, dass eine oder mehrere im Antikörper gefundenen Kohlenhydrat-Bestandteile  deletiert werden oder dass eine oder mehrere Glykosylierungsstellen,  die im Antikörper nicht vorhanden sind, angefügt werden. 



   Glykosylierung in Antikörpern ist typischerweise entweder N-verknüpft  oder O-verknüpft. N-verknüpft betrifft die Anbindung des Kohlenhydrat-Bestandteils  an die Seitenkette eines Asparaginrests. Die Tripeptidsequenzen Asparagin-X-Serin  und Asparagin-X-Threonin, worin X jegliche Aminosäure ausser Prolin  ist, sind die Erkennungssequenzen für die enzymatische Anbindung  des Kohlenhydrat-Bestandteils an die Aparagin-Seitenkette. Folglich  erzeugt die Anwesenheit irgendeiner dieser Tripeptid-Sequenzen in  einem Polypeptid eine potentielle Glykosylierungsstelle. O-verknüpfte  Glykosylierung betrifft die Anbindung einer der Zucker N-Acetylgalactosamin,  Galactose oder Xylose an eine Hydroxyaminosäure, am häufigsten Serin  oder Threonin, obwohl 5-Hydroxyprolin und 5-Hydroxylysin auch verwendet  werden können. 



     Die Anfügung von Glykosylierungsstellen an einen Antikörper wird  bequem erzielt, indem die Aminosäuresequenz so verändert wird, dass  sie eine oder mehrere der oben beschriebenen Tripeptidsequenzen (für  N-verknüpfte Glykosylierungsstellen) enthält. Die Veränderung kann  auch mittels Addition von, oder Substitution durch, einem oder mehreren  Serin- oder Threonin-Resten an die Sequenz des ursprünglichen Antikörpers  (für O-verknüpfte Glykosylierungsstellen) herbeigeführt werden. 



   Nukleinsäuremoleküle, die für Aminosäure-Varianten des Anti-ErbB2-Antikörpers  kodieren, werden mittels einer Vielzahl fachbekannter Verfahren hergestellt.  Diese Verfahren umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, die  Isolierung aus einer natürlichen Quelle (im Falle von natürlich auftretenden  Aminosäuresequenz-Varianten) oder die Herstellung mittels Oligonukleotid-vermittelter  (oder ortsspezifischer) Mutagenese, PCR-Mutagenese, und Kassetten-Mutagenese  einer vorher hergestellten Varianten- oder Nicht-Varianten-Version  des Anti-ErbB2-Antikörpers. 



   Es kann wünschenswert sein, den Antikörper der Erfindung bezüglich  der Effektorfunktion zu modifizieren, z.B. um die Antigen-abhängige,  zeilvermittelte Zytotoxizität (ADCC) und/oder die Komplement-abhängige  Zytotoxizität (CDC) des Antikörpers zu steigern. Dies kann erreicht  werden, indem eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen in die Fc-Region  des Antikörpers eingeführt werden. Alternativ dazu oder zusätzlich  können Cystein-Rest(e) in die Fc-Region eingeführt werden, um so  die Bildung von Interketten-Disulfidbindung in dieser Region zu ermöglichen.  Der so erzeugte homodimere Antikörper könnte verbesserte Internalisierungsfähigkeit  und/oder erhöhte Komplementvermittelte Zellabtötung und Antikörperabhängige  zelluläre Zytotoxizität (ADCC) besitzen. Siehe Caron et al., J. Exp.  Med. 176, 1191-1195 (1992); und B. Shopes, J.

   Immunol. 148, 2918-2922  (1992). Homodimere Antikörper mit verstärkter Anti-Tumor-Aktivität  können auch hergestellt werden, indem heterobifunktionelle Vernetzer  verwendet werden, wie beschrieben von Wolff et al., Cancer Research  53, 2560-2565 (1993). Alternativ dazu kann ein -Antikörper konstruiert  werden, der duale Fc-Regionen besitzt und    so verstärkte Komplement-Lyse-  und ADCC-Fähigkeiten aufweist. Siehe Stevenson et al., Anti-Cancer  Drug Design 3, 219-230 (1989). 



   Um die Serum-Halbwertszeit des Antikörpers zu steigern, kann man  ein Salvage-Rezeptor-bindendes Epitop in den Antikörper (besonders  in ein Antikörperfragment) einbauen, wie beispielsweise beschrieben  im U.S.-Patent Nr. 5 739 277. Wie hierin verwendet betrifft der Ausdruck  "Salvage-Rezeptor-bindendes Epitop" ein Epitop der Fc-Region eines  IgG-Moleküls (z.B. IgG 1 , IgG 2 , IgG 3  oder lgG 4 ), das für die  Erhöhung der in vivo-Halbwertszeit des IgG-Moleküls im Serum verantwortlich  ist.  (viii) Screening auf Antikörper mit den gewünschten Eigenschaften  



   Techniken zur Erzeugung von Antikörpern sind oben beschrieben worden.  Man kann Antikörper mit bestimmten biologischen Charakteristika wie  gewünscht weiter selektieren. 



   Um einen Antikörper zu identifizieren, der Liganden-Aktivierung eines  ErbB-Rezeptors blockiert, kann die Fähigkeit des Antikörpers, die  Bindung des ErbB-Liganden an ErbB-Rezeptor-exprimierende Zellen zu  blockieren (z.B. bei Konjugation mit einem anderen ErbB-Rezeptor  mit dem der ErbB-Rezeptor von Interesse ein ErbB-Hetero-Oligomer  bildet) bestimmt werden. Beispielsweise können Zellen, die ErbB-Rezeptoren  des ErbB-Hetero-Oligomers natürlich exprimieren oder nach Transfektion  exprimieren, mit dem Antikörper inkubiert und dann markiertem ErbB-Liganden  ausgesetzt werden. Die Fähigkeit des Anti-ErbB2-Antikörpers, die  Liganden-Bindung an den ErbB-Rezeptor im ErbB-Hetero-Oligomer zu  blockieren, kann dann bewertet werden. 



   Beispielsweise kann die Inhibierung der HRG-Bindung an MCF7-Brusttumor-Zelllinien  mittels Anti-ErbB2-Antikörper durchgeführt werden, indem Monolayer-MCF7-Kulturen  auf Eis im 24-Napf-Platten-Format verwendet werden, wie im Wesentlichen  unten in Beispiel 1 beschrieben wird. Monoklonale Anti-ErbB2-Antikörper  können zu jedem Napf    zugesetzt und für 30 Minuten inkubiert werden.  <125>I-markiertes rHRG beta 1  177 - 22 4  (25 pm) kann dann zugesetzt  und die Inkubation für 4 bis 16 Stunden fortgesetzt werden. Dosis-Antwort-Kurven  können erstellt und ein IC 50 -Wert für den Antikörper von Interesse  berechnet werden.

   In einer Ausführungsform wird der Antikörper, der  Liganden-Aktivierung eines ErbB-Rezeptors blockiert, für die Inhibierung  von HRG-Bindung an MCF7-Zellen in diesem Test einen IC 50  von ungefähr  50 nM oder weniger, stärker bevorzugt 10 nM oder weniger, aufweisen.  Wenn der Antikörper ein Antikörperfragment ist, wie z.B. ein Fab-Fragment,  kann der IC 50  für die Inhibierung von HRG-Bindung an MCF7-Zellen  in diesem Test z.B. ungefähr 100 nM oder weniger, stärker bevorzugt  50 nM oder weniger, sein. 



   Alternativ dazu oder zusätzlich kann die Fähigkeit des Anti-ErbB2-Antikörpers,  die ErbB-Liganden-stimulierte Tyrosin-Phosphorylierung eines im ErbB-Hetero-Oligomer  vorhandenen ErbB-Rezeptors zu blockieren, bestimmt werden. Beispielsweise  können Zellen, die ErbB-Rezeptoren endogen exprimieren oder nach  Transfektion exprimieren, mit dem Antikörper inkubiert und dann auf  ErbB-Liganden-abhängige Tyrosin-Phosphorylierungs-Aktivität, unter  Verwendung eines monoklonalen Anti-Phosphotyrosin-Antikörpers (der  optional mit einem detektierbaren Marker konjugiert ist), getestet  werden. Der Kinase-Rezeptor-Aktivierungstest, beschrieben in U.S  Patent Nr. 5 766 863, ist auch verfügbar für die Bestimmung von ErbB-Rezeptor-Aktivierung  und Blockierung dieser Aktivität durch einen Antikörper. 



   In einer Ausführungsform kann man auf einen Antikörper screenen,  der die HRG-Stimulation von p180-Tyrosin-Phosphorylierung in MCF7-Zellen  inhibiert und wird im Wesentlichen unten in Beispiel 1 beschrieben.  Beispielsweise können die MCF7-Zellen in 24-Napf-Platten ausplattiert  werden und mono-klonale Antikörper gegen ErbB2 können jedem Napf  zugesetzt und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert werden;  dann kann rHRG beta 1 177 _ 2  24  jedem Napf in einer Endkonzentration  von 0,2 nM zugesetzt und die Inkubation für weitere 8 Minuten fortgesetzt  werden. Das Medium kann aus jedem Napf abgesaugt werden und die Reaktion  kann durch Zusatz von 100  mu l SDS-Probenpuf   fer (5% SDS, 25 mM  DTT und 25 mM Tris-HCl, pH 6,8) gestoppt werden.

   Jede Probe (25   mu l) kann in einem 4-12%igen Gradientengel (Novex) elektrophoretisch  getrennt und dann elektrophoretisch auf eine Polyvinylidendifluorid-Membran  transferiert werden. Antiphosphotyrosin (1  mu g/ml) Immunblots können  entwickelt und die Intensität der reaktiven Hauptbande bei MW '180  000 reflexionsdensitometrisch quantifiziert werden. Der selektierte  Antikörper wird in diesem Test die HRG-Stimulation der p180-Tyrosin-Phosphorylierung  bevorzugt signifikant zu etwa 0-35% der Kontrolle inhibieren. Eine  Dosisantwort-Kurve für die Inhibierung der HRG-Stimulation der p180-Tyrosin-Phosphorylierung,  wie bestimmt mittels Reflexionsdensitometrie, kann angefertigt und  ein IC 50  für den Antikörper von Interesse berechnet werden.

   In  einer Ausführungsform wird der Antikörper, der Liganden-Aktivierung  eines ErbB-Rezeptors blockiert, für die Inhibierung der HRG-Stimulation  der p180-Tyrosin-Phosphorylierung in diesem Test einen IC 50  von  ungefähr 50 nM oder weniger, stärker bevorzugt 10 nM oder weniger,  aufweisen. Wenn der Antikörper ein Antikörperfragment ist, wie z.B.  ein Fab-Fragment, kann der IC 50  für die Inhibierung von HRG-Stimulation  der p180-Tyrosin-Phosphorylierung in diesem Test z.B. ungefähr 100  nM oder weniger, stärker bevorzugt 50 nM oder weniger, sein. 



  * Man kann auch die wachstumshemmenden Effekte des Antikörpers auf  MDA-MB-175-Zellen bestimmen, im Wesentlichen wie beschrieben von  Schaefer et al., Oncogene 15, 1385-1394 (1997). Gemäss diesem Test  können MDA-MB-175-Zellen mit einem monoklonalen Anti-ErbB2-Antikörper  (10  mu g/ml) für 4 Tage behandelt und mit Kristallviolett behandelt  werden. Inkubation mit einem Anti-ErbB2-Antikörper könnte einen wachstumshemmenden  Effekt auf diese Zelllinie zeigen, ähnlich wie er vom monoklonalen  Antikörper C24 gezeigt wird. In einer weiteren Ausführungsform wird  exogenes HRG diese Inhibierung nicht signifikant umkehren.

   Bevorzugt  wird der Antikörper auch die Zellproliferation von MDA-MB-175-Zellen  in einem grösseren Ausmass inhibieren als der monoklonale Antikörper  4D5 (und optional in einem grösseren Ausmass als monoklonaler Antikörper  7F3), und zwar sowohl in Anwesenheit als auch in Abwesenheit von  exogenem HRG. 



     In einer Ausführungsform kann der Anti-ErbB2-Antikörper von Interesse  die Heregulin-abhängige Assoziierung von ErbB2 mit ErbB3 sowohl in  MCF7- als auch in SK-BR-3-Zellen blockieren, wie bestimmt in einem  Co-Immunpräzipitations-Experiment, wie z.B. dem in Bespiel 2 beschrieben,  und zwar effektiver als monoklonaler Antikörper 4D5 und bevorzugt  wesentlich effektiver als monoklonaler Antikörper 7F3. 



   Um wachstumshemmende Anti-ErbB2-Antikörper zu identifizieren, kann  man auf Antikörper screenen, die das Wachstum von Krebszellen, die  ErbB2 exprimieren, inhibieren. In einer Ausführungsform ist der Antikörper  der Wahl fähig, das Wachstum von SK-BR-3-Zellen in Zellkultur zu  ungefähr 20-100% und bevorzugt zu 50-100% bei einer Antikörper-Konzentration  von ungefähr 0,5 bis 30  mu g/ml zu inhibieren. Um solche Antikörper  zu identifizieren, kann der im U.S.-Patent Nr. 5 677 171 beschriebene  SK-BR-3-Test durchgeführt werden. Gemäss diesem Test werden SK-BR-3-Zellen  in einer 1:1-Mischung von F12- und DMEM-Medium, ergänzt mit 10% Fetalem  Rinderserum, Glutamin und Penicillin-Streptomycin, gezüchtet. 20  000 SK-BR-3-Zellen werden in eine 35 mm-ZeIIkulturplatte (2 ml/35  mm-Platte) plattiert. 0,5 bis 30  mu g des Anti-ErbB2-Antikörpers  werden pro Platte zugesetzt.

   Nach sechs Tagen wird die Anzahl von  Zellen im Vergleich zu unbehandelten Zellen mittels eines elektronischen  COULTER< <TM> >-Zellzählers gezählt. Jene Antikörper, die das Wachstum  der SK-BR-3-Zellen zu ungefähr 20-100% oder zu 50-100% inhibieren,  können als wachstumshemmende Antikörper selektiert werden. 



   Zur Selektion von Antikörpern, die Zelltod, Verlust vom Membranintegrität,  wie z.B. angezeigt durch Pl, induzieren, kann Trypanblau- oder 7AAD-Aufnahme  relativ zur Kontrolle bestimmt werden. Der bevorzugte Test ist der  Pl-Aufnahme-Test unter Verwendung von BT474-Zellen. Gemäss diesem  Test werden BT474-Zellen (die von der American Type Culture Collection  (Rockville, MD) beziehbar sind) in Dubelco's Modified Eagle Medium  (D-MEM):Ham's F12 (50:50), ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem FBS  (Hyclone) und 2 mM L-Glutamin, kultiviert. (Folglich wird dieser  Test in Abwesenheit    von Komplement und Immuneffektor-Zellen durchgeführt.)  Die BT474-Zellen werden in einer Dichte von 3  x  10<6> pro Platte  in 100  x  20 mm Platten inokuliert und über Nacht anhaften gelassen.

    Das Medium wird dann entfernt und durch frisches Medium alleine oder  Medium, das 10  mu g/ml des geeigneten monoklonalen Antikörpers enthält,  ersetzt. Die Zellen werden für eine Zeitspanne von drei Tagen inkubiert.  Nach jeder Behandlung werden die Monolayers mit PBS gewaschen und  mittels Trypsinbehandlung abgelöst. Die Zellen werden bei 1200 U/min  für 5 Minuten bei 4 DEG C zentrifugiert, das Pellet in 3 ml eiskaltem  Ca<2+>-bindenden Puffer (10 mM Hepes, pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM  CaCl 2 ) resuspendiert und zur Entfernung von Zellklumpen in 35 mm,  filterbedeckten 12  x  75-mm-Röhrchen aliquotiert (1 ml pro Röhrchen,  3 Röhrchen pro Behandlungsgruppe). Die Röhrchen erhalten dann Pl  (10  mu g/ml). Die Proben können mittels FAC-SCAN< <TM> >-Durchflusszytometer  und FACCONVERT< <TM> >-CellQuest-Software (Becton Dickinson) analysiert  werden.

   Jene Antikörper, die statistisch signifikante Levels von  Zelltod, wie bestimmt mittels Pl-Aufnahme, induzieren, können als  Zelltod-induzierende Antikörper selektiert werden. 



   Zur Selektion von Antikörpern, die Apotopsie induzieren, ist ein  Annexin-Bindungstest unter Verwendung von BT474-Zellen erhältlich.  Die BT474-Zellen werden kultiviert und wie im vorangegangenen Absatz  diskutiert, in Platten inokuliert. Das Medium wird dann entfernt  und durch frisches Medium alleine oder Medium, das 10  mu g/ml des  monoklonalen Antikörpers enthält, ersetzt. Nach einer dreitägigen  Inkubationsperiode werden die Monolayers mit PBS gewaschen und durch  Trypsinbehandlung abgelöst. Die Zellen werden dann zentrifugiert,  in Ca<2+>-bindendem Puffer resuspendiert und wie oben diskutiert  für den Zelltod-Test in Röhrchen aliquotiert. Die Röhrchen erhalten  dann markiertes Annexin (z.B. Annexin-V-FITC). Die Proben können  mittels FAC-SCAN< <TM> >-Durchflusszytometer und FACCONVERT< <TM>  >-CellQuest-Software (Becton Dickinson) analysiert werden.

   Jene Antikörper,  die im Vergleich zu Kontrollen statistisch signifikante Levels von  Annexin-Bindung induzieren, können als Apoptose-induzierende Antikörper  selektiert werden. 



     Zusätzlich zum Annexin-Bindungstest ist ein DNA-Färbetest unter  Verwendung von BT474-Zellen verfügbar. Um diesen Test auszuführen,  werden BT474-Zellen, die mit den in den vorangegangenen zwei Absätzen  beschriebenen Antikörpern von Interesse behandelt worden sind, mit  9  mu g/ml HOECHST 33342< <TM> > für 2 Std. bei 37 DEG C inkubiert  und dann in einem EPICS ELITE< <TM> >-Durchflusszytometer (Coulter  Corporation) mittels MODFIT LT< <TM> >-Software (Verity Software  House) analysiert. Antikörper, die eine Änderung des Prozentanteils  apoptotischer Zellen induzieren, die um das 2fache oder höher (und  bevorzugt um das 3fache oder höher) ist als die von unbehandelten  Zellen (bis zu 100% apoptotische Zellen), können als pro-apoptotische  Antikörper unter Verwendung dieses Tests selektiert werden. 



   Um auf Antikörper zu screenen, die an ein Epitop von ErbB2, das an  einen Antikörper von Interesse gebundenen ist, binden, kann eine  Routine-Cross-Blocking-Test, wie er z.B. in "Antibodies, A Laboratory  Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow und David Lane  (1988), beschrieben ist, durchgeführt werden. Alternativ dazu oder  zusätzlich kann Epitop-Kartierung mittels fachbekannten Methoden  (siehe z.B. die Fig. 1A und 1B hierin) durchgeführt werden.   (ix) Immunkonjugate  



   Die Erfindung betrifft auch Immunkonjugate, umfassend einen Antikörper,  der an ein zytotoxisches Mittel, wie z.B. ein therapeutisches Mittel,  Toxin (z.B. ein kleinmolekulares Toxin oder ein enzymatisch aktives  Toxin bakterieller, pilzlicher oder tierischer Herkunft, einschliesslich  deren Fragmente und/oder Varianten) oder ein radioaktives Isotop  (z.B. ein Radiokonjugat) konjugiert ist. 



   Zur Erzeugung solcher Immunkonjugate zweckdienliche chemotherapeutische  Mittel sind oben beschrieben worden. Konjugate eines Antikörpers  mit einem oder mehreren kleinmolekularen Toxinen, wie z.B. ein Calicheamicin,  ein Maytansin (U.S.-Patent Nr. 5 208 020), ein Trichothen und CC1065,  werden hierin auch ins Auge gefasst. 



     In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, wird der Antikörper  an ein oder mehrere Maytansin-Moleküle konjugiert (z.B. ungefähr  1 bis ungefähr 10 Maytansin-Moleküle pro Antikörper-Molekül). Maytansin  kann beispielsweise zu May-SS-Me umgesetzt werden, das zu May-SH3  reduziert und mit modifiziertem Antikörper reagiert werden kann (Chari  et al., Cancer Research 52, 127-131 (1992)), um ein Maytansin-Antikörper-lmmunkonjugat  zu erzeugen. 



   Ein weiteres Immunkonjugat von Interesse umfasst einen Anti-ErbB2-Antikörper,  der an ein oder mehrere Calicheamicin-Moleküle konjugiert ist. Die  Calicheamicin-Familie von Antikörpern ist in der Lage, bei sub-picomolaren  Konzentrationen DoppeIstrang-DNA-Brüche zu produzieren. Struktur-Analoga  von Calicheamicin die verwendet werden können, umfassen, sind aber  nicht eingeschränkt auf  gamma  1 <I>,  alpha  2 I,  alpha  3 I,  N-Acetyl- gamma  1 I, PSAG und  theta I 1  (Hinman et al., Cancer  Research 53, 3336-3342 (1993); und Lode et al., Cancer Research 58,  2925-2928 (1998)). Siehe auch die U.S.-Patente Nr. 5 714 586; 5 712  374; 5 264 586 und 5 773 001, hierin ausdrücklich durch Verweis aufgenommen.                                                   



   Enzymatisch aktive Toxine und deren Fragmente, die verwendet werden  können, umfassen Diphtherie-A-Kette, nicht-bindende aktive Fragmente  von Diphtherie-Toxin, Exotoxin-A-Kette (von Pseudomonas aeruginosa),  Ricin-A-Kette, Abrin-A-Kette, Modeccin-A-Kette, Alpha-Sarcin, Aleurites  fordii-Proteine, Dianthin-Proteine, Phytolaca americana-Proteine  (PAPI, PAPII und PAP-S), Mormordica charantina-lnhibitor, Curcin,  Crotin, Sapaonaria officinalis-lnhibitor, Gelonin, Mitogellin, Restrictocin,  Phenomycin, Enomycin und die Tricothecene. Siehe z.B. WO 93/21232,  publiziert am 28. Oktober 1993. 



   Die vorliegende Erfindung erwägt weiters ein Immunkonjugat, das zwischen  einem Antikörper und -einer Verbindung mit nukleolytischer Aktivität  (z.B. eine Ribonuklease oder eine DNA-Endonuklease wie z.B. Desoxyribonuklease;  DNase) gebildet wird. 



     Eine Reihe von radioaktiven Isotopen sind für die Produktion von  radiokonjugierten Anti-ErbB2-Antikörpern verfügbar. Beispiele umfassen  At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>,  P<32> und radioaktive Lu-Isotope. 



   Konjugate des Antikörpers mit zytotoxischem Mittel können unter Verwendung  einer Vielzahl von bifunktionellen Kopplungs-Mittel hergestellt werden,  wie z.B. N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)-propionat (SPDP), Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexan-1-carboxylat,  Iminothiolan (IT), bifunktionelle Derivate von Imidoestern (wie z.B.  Dimethyladipimidat-HCI), aktive Ester (wie z.B. Disuccinimidylsuberat),  Aldehyde (wie. z.B. Glutaraldehyd), Bis-Azido-Verbindungen (wie z.B.  Bis-(p-azidobenzoyl)hexandiamin), Bis-Diazonium-Derivate (wie z.B.  Bis-(p-diazoniumbenzoyl)ethylendiamin), Di-isocyanate (wie z.B. Tolyen-2,6-diisocyanat)  und bis-aktive Fluorverbindungen (wie z.B. 1,5-Difluor-2,4-dinitrobenzol).  Beispielsweise kann ein Ricin-Immuntoxin wie in Vitetta et al., Science  238, 1098 (1987) beschrieben hergestellt werden.

   Kohlenstoff-14-markierte  I-lsothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylentriaminpentaessigsäure (MX-DTPA)  ist ein exemplarischer Chelatbildner für die Konjugation von Radionukleotid  an den Antikörper. Siehe WO94/11026. Der Linker kann ein "abspaltbarer  Linker" sein, um die Freisetzung des zytotoxischen Medikaments in  der Zelle zu erleichtern. Beispielsweise kann ein säurelabiler Linker,  Peptidase-sensitiver Linker, Dimethyl-Linker oder Disulfid-enthaltender  linker (Chari et al., Cancer Research 52, 127-131 (1992)) verwendet  werden. 



   Alternativ dazu kann ein Fusionsprotein, umfassend den Anti-ErbB2-Antikörper  und zytotoxisches Mittel, hergestellt werden, z.B. mittels rekombinaten  Techniken oder Peptidsynthese. 



   In noch einer weiteren Ausführungsform, kann der Antikörper zur Verwendung  in Tumor-Vor-Targeting an einen "Rezeptor" (wie z.B. Streptavidin)  konjugiert werden, worin das Antikörper-Rezeptor-Konjugat an den  Patienten verabreicht wird, gefolgt von der Entfernung nichtgebundenen  Konjugats aus dem Kreislauf mittels eines Clearing-Mittels    und  nachfolgender Verabreichung eines "Liganden" (z.B. Avidin), der an  ein zytotoxisches Mittel (z.B. ein Radionukleotid) konjugiert ist.  (x) Antikörper-abhängige, Enzym-vermittelte Prodrug-Therapie  (ADEPT)  



   Die Antikörper der vorliegenden Erfindung können auch für ADEPT verwendet  werden, indem der Antikörper an ein Prodrug-aktivierendes Enzym konjugiert  wird, das ein Prodrug (z.B. ein Peptidyl-Chemotherapeutikum, siehe  WO 81/01145) zu einem aktiven Anti-Krebs-Medikament umsetzt. Siehe  beispielsweise WO 88/07378 und U.S.-Patent Nr. 4 975 278. 



   Die Enzymkomponente in dem für ADEPT zweckmässigen Immunkonjugat  umfasst jegliches Enzym, das fähig ist, auf das Prodrug zu wirken  und es so zu der aktiveren, zytotoxischen Form umzusetzen. 



   Für das Verfahren dieser Erfindung zweckdienliche Enzyme umfassen,  sind aber nicht eingeschränkt auf, alkalische Phosphatase, zweckdienlich  für die Umsetzung Phosphatenthaltender Prodrugs zu freien Medikamenten;  Arylsulfatase, zweckdienlich für die Umsetzung Sulfatenthaltender  Prodrugs zu freien Medikamenten; Cytosin-Deaminase, zweckdienlich  für die Umsetzung von nicht-toxischem 5-Fluorocytosin zum Anti-Krebs-Medikament  5-Fluoruracil; Proteasen wie z.B. Serratia-Protease, Thermolysin,  Subtilisin, Carboxypeptidasen und Cathepsine ( wie z.B. Capthesine  B und L), zweckdienlich für die Umsetzung Peptidenthaltender Prodrugs  zu freien Medikamenten; D-Alanylcarboxypeptidasen, zweckdienlich  für die Umsetzung von Prodrugs, die D-Aminosäure-Substituenten enthalten;  Kohlenhydrat-spaltende Enzyme, wie z.B.

    beta -Galactosidase und  Neuraminidase, zweckdienlich für die Umsetzung glykosylierter Prodrugs  zu freien Medikamenten;  beta -Lactamase, zweckdienlich für die Umsetzung  beta -Lactam-derivatiserter Medikamente zu freien Medikamenten;  und Penicillinamidasen, wie z.B. Penicillin V-Amidase oder Penicillin  G-Amidase, zweckdienlich für die Umsetzung von Medikamenten, die  an ihren Amin-Stickstoffen mit Phenoxyacetyl- bzw. Phenylacetyl-Gruppen  derivati   siert sind, zu den freien Medikamenten. Alternativ dazu  können Antikörper mit enzymatischer Aktivität, auch als "Abzyme"  fachbekannt, verwendet werden, um die Prodrugs der Erfindung zu freien,  aktiven Medikamenten umzusetzen (siehe z.B. Massey, Nature 328, 457-458  (1987)). Antikörper-Abzym-Konjugate können wie hierin beschrieben  für die Zufuhr des Abzyms zu einer Tumorzellen-Population hergestellt  werden. 



   Die Enzyme dieser Erfindung können kovalent an die Anti-ErbB2-Antikörper  gebunden werden, und zwar durch gut fachbekannte Techniken, wie z.B.  die Verwendung der oben diskutierten, heterobifunktionellen Vernetzungsreagenzien.  Alternativ können Fusionsproteine, die zumindest die Antigen-bindende  Region eines Antikörpers der Erfindung, gebunden an zumindest einem  funktionell aktiven Teil eines Enzyms der Erfindung, umfassen, unter  Verwendung gut fachbekannter, rekombinater DNA-Techniken konstruiert  werden (siehe z.B. Neuberger et al., Nature 312, 604-608 (1984)).  (xi) Andere Antikörper-Modifikationen  



   Andere Modifikationen des Antikörpers werden hierin erwogen. Beispielsweise  kann der Antikörper an eines von vielen nicht-proteinartigen Polymeren  gebunden werden, z.B. Polyethylenglykol, Polypropylenglykol, Polyoxyalkylene  oder Co-Polymere von Polyethylenglykol und Polypropylenglykol. Der  Antikörper kann auch in Mikrokapseln eingeschlossen werden, z.B.  mittels Coazervations-Techniken und Grenzflächen-Polymerisation (zum  Beispiel Hydroxymethylcellulose oder Gelatine-Mikrokapseln bzw. Poly(methylmethacrylat)-Mikrokapseln),  und zwar in kolloidalen Medikament-Zufuhrsystemen (zum Beispiel Liposomen,  Albumin-Mikrokügelchen, Mikroemulsionen, Nano-Par-tikel und Nanokapseln)  oder in Makro-emulsionen. Solche Techniken sind in "Remington's Pharmaceutical  Sciences", 16. Auflage, A. Oslo (Hrsg.) (1980), offenbart. 



   Die hierin offenbarten Anti-ErbB2-Antikörper können auch in Immunliposomen  formuliert sein. Antikörper enthaltende Liposomen werden nach fachbekannten  Verfahren hergestellt, wie z.B. beschrieben in Epstein et al., Proc.  Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688    (1985); Hwang et al., Proc. Natl.  Acad. Sci. USA 77, 4030 (1980); U.S.-Patente Nr. 4 485 045 und 4  544 545; und WO 97/38731, publiziert am 23. Oktober 1997. Liposomen  mit erhöhter Zirkulationszeit sind in U.S.-Patent Nr. 5 013 556 offenbart.                                                     



   Insbesondere zweckdienliche Liposomen können mittels Umkehrphasen-Verdampfungs-Verfahren  erzeugt werden, und zwar mit einer Lipid-Zusammensetzung, die Phosphatidylcholin,  Cholesterin und PEG-derivatisierte Phosphatidylethanolamine (PEG-PE)  umfasst. Die Liposomen werden durch Filter definierter Porengrösse  extrudiert, um Liposomen mit gewünschtem Durchmesser zu erhalten.  Fab'-Fragmente des Antikörpers der vorliegenden Erfindung können  über eine Disulfid-Austauschreaktion, wie von Martin et al., J. Biol.  Chem. 257, 286-288 (1982), beschrieben, an die Liposomen konjugiert  werden. 



   Innerhalb des Liposoms befindet sich optional ein Chemotherapeutikum.  Siehe Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19), 1484 (1989).   III. Vektoren, Wirtszellen und Rekombinationsverfahren                                                               



   Die Erfindung führt auch zu isolierten Nukleinsäuren, die für den  humanisierten Anti-ErbB2-Antikörper kodieren, die Nukleinsäure enthaltende  Vektoren und Wirtszellen und Rekombinationsverfahren zur Produktion  des Antikörpers. 



   Zur rekombinanten Produktion des Antikörpers wird die kodierende  Nukleinsäure isoliert und für weitere Klonierung (Amplifikation der  DNA) oder für die Expression in einen replizierbaren Vektor insertiert.  DNA, die für den monoklonalen Antikörper kodiert, kann mittels konventioneller  Prozeduren (z.B. mittels Oligonukleotid-Sonden, die fähig sind, spezifisch  an Gene zu binden, die für die schweren und leichten Ketten der Antikörper  kodieren) leicht isoliert und sequenziert werden. Viele Vektoren  sind verfügbar. Die Vektoren umfassen im Allgemeinen, sind aber nicht  eingeschränkt auf, eine oder mehrere der folgenden Komponenten: Eine  Signalsequenz, einen Replikationsur   sprung, ein oder mehrere Markergene,  ein Enhancer-Element, einen Promotor und eine Transkriptions-Terminationssequenz.  (i) Signalsequenz-Komponente  



   Der Anti-ErbB2-Antikörper dieser Erfindung kann rekombinant nicht  nur direkt, sondern auch als Fusionspeptid mit einem heterologen  Polypeptid reproduziert werden, das bevorzugt eine Signalsequenz  oder ein anderes Polypeptid ist, das eine spezifische Spaltungsstelle  am N-Terminus des gereiften Proteins oder Polypeptids besitzt. Die  ausgewählte heterologe Signalsequenz ist bevorzugt eine, die von  der Wirtszelle erkannt oder prozessiert (d.h. durch eine Signalpeptidase  gespalten) wird. Für prokaryotische Wirtszellen, die die native Anti-ErbB2-Antikörper-Signalsequenz  nicht erkennen und prozessieren, wird die Signalsequenz durch eine  ausgewählte prokaryotische Signalsequenz, zum Beispiel aus der Gruppe  der alkalischen Phosphatase-, Penicillinase-, Ipp- oder hitzestabiles  Enterotoxin Il-Leader, substituiert.

   Für Hefe-Sekretion kann die  native Signalsequenz z.B. durch Hefe-Invertase-Leader,  alpha -Faktor-Leader  (einschliesslich Saccharomyces- und Kluyveromyces-  alpha -Faktor-Leader)  oder Phosphatase-Leader, den C. albicans Glucoamylase-Leader oder  dem in WO 90/13646 beschriebenen Signal substituiert werden. Für  Säugetierzellen-Expression sind Säugetier-Signalsequenzen, sowie  auch Virus-Sekretionsleader, zum Beispiel das Herpex Simplex gD-Signal,  verfügbar. 



   Die DNA für eine solche Vorläufer-Region wird ins Leseraster an DNA  ligiert, die für den Anti-ErbB2-Antikörper kodiert.  (ii)  Replikationsursprung-Komponente  



   Sowohl Expressions-, als auch Klonierungsvektoren enthalten eine  Nukleinsäuresequenz, die es dem Vektor erlaubt, in einer oder mehreren  Wirtszellen zu replizieren. Im Allgemeinen ist diese Sequenz in Klonierungsvektoren  eine, die es dem Vektor ermöglicht, unabhängig von der chromosomalen  Wirts-DNA zu replizieren, und enthält Repli   kationsursprunge oder  autonom replizierende Sequenzen. Solche Sequenzen sind für eine Vielzahl  von Bakterien, Hefen und Viren gut bekannt. Der Replikationsursprung  des Plasmids pBR322 ist für die meisten Gram-negativen Bakterien  geeignet, der 2 mu -Plasmid-Ursprung ist für Hefen geeignet und verschiedene  Virus-Ursprunge (SV40, Polyoma, Adenovirus, VSV oder BPV) sind für  die Klonierung von Vektoren in Säugetierzellen geeignet.

   Im Allgemeinen  wird die Replikationsursprung-Komponente für Säugetier-Expressionsvektoren  nicht benötigt (der SV40-Ursprung wird typischerweise nur deshalb  verwendet, weil er den frühen Promotor enthält).  (iii) Selektionsgen-Komponente  



   Expressions- und Klonierungsvektoren können ein Selektionsgen enthalten  und wird auch als Selektionsmarker bezeichnet. Typische Selektionsgene  kodieren für Proteine die (a) Resistenz gegen Antibiotika oder andere  Toxine übertragen, z.B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin,  (b) Auxotrophie-Defizienzen komplementieren oder (c) entscheidende  Nährstoffe bereitstellen, die in komplexen Nährmedien nicht enthalten  sind, z.B. das für D-Alanin-Racemase von Bazilli kodierende Gen. 



   Ein Beispiel eines Selektionsschemas verwendet ein Medikament, um  das Wachstum einer Wirtszelle zum Stillstand zu bringen. Jene Zellen,  die erfolgreich mit einem heterologen Gen transformiert sind, produzieren  ein Protein, das Medikamenten-Resistenz überträgt und überleben so  den Selektionsvorgang. Beispiele solch dominanter Selektion verwenden  die Medikamente Neomycin, Mycophenolsäure und Hygromycin. 



   Ein weiteres Beispiel geeigneter Selektionsmarker für Säugetierzellen  sind jene, die die Identifizierung von Zellen erlauben, die für die  Aufnahme der Anti-ErbB2-Antikörper-Nukleinsäure kompetent sind, wie  z.B. DHFR, Thymidin-Kinase, Metallothionein-I und -II, vorzugsweise  Primaten-Metallothionein-Gene, Adenosin-Deamidase, Orthinin-Decarboxylase,  usw. 



     Beispielsweise werden mit dem DHFR-Selektionsgen transformierte  Zellen zunächst identifiziert, indem alle Transformanten in einem  Kulturmedium, das Mothotrexat (Mtx), ein kompetitiver DHFR-Antagonist,  kultiviert werden. Wenn Wildtyp-DHFR angewendet wird, ist eine geeignete  Wirtszelle die DHFR-Aktivitäts-defiziente Chinahamster-Eierstock-(CHO-)Zelllinie.                                              



   Alternativ dazu können Wirtszellen (insbesondere Wildtyp-Wirte, die  endogenes DHFR-Protein enthalten), transformiert oder co-transformiert  mit DNA-Sequenzen, die für Anti-ErbB2-Antikörper kodieren, Wildtyp-DHFR-Protein  und einem anderen Selektionsmarker, wie z.B. Aminoglykosid-3'-phosphotransferase  (APH), selektiert werden, indem die Zellen in Medium gezüchtet werden,  das ein Selektionsmittel für den Selektionsmarker enthält, wie z.B.  ein aminoglykosidisches Antibiotikum, z.B. Kanamycin, Neomycin oder  G418. Siehe U.S.-Patent Nr. 4 965 199. 



   Ein geeignetes Gen für Verwendung in Hefe ist das im Hefeplasmid  YRp7 vorhandene trpl-Gen (Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979)).  Das trpl-Gen liefert einen Selektionsmarker für einen Mutantenstamm  von Hefe, dem die Fähigkeit zum Wachstum auf Tryptophan fehlt, z.B.  ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1. Jones, Genetics 85, 12 (1977). Das Vorhandensein  von trpl-Schädigung im Hefe-Wirtszellen-Genom liefert dann eine effektive  Umgebung zur Detektion von Transformation durch Wachstum in Abwesenheit  von Tryptophan. Auf ähnliche Weise werden Leu2-defiziente Hefestämme  (ATCC 20.622 oder 38.626) durch bekannte, das Leu2-Gen tragende Plasmide  komplementiert. 



   Zusätzlich können vom 1,6  mu m-ringförmigen Plasmid pKD1 herrührende  Vektoren zur Transformation von Kluyveromyces-Hefen verwendet werden.  Alternativ dazu wurde über ein Expressionssystem für die Produktion  von rekombinantem Kälber-Chymosin für K. lactis im Grossmassstab  berichtet. Van den Berg, Bio/Technology 8, 135 (1990). Stabile Multikopien-Expressionsvektoren  für die Sekretion von reifem, rekombinantem humanem Serumalbumin  durch industrielle Stämme von Kluyveromyces sind ebenfalls offenbart  worden. Fleer et al., Bio/Technology 9, 968-975 (1991).  (iv)  Promotor-Komponente  



   Expressions- und Klonierungsvektoren enthalten gewöhnlich einen Promotor,  der durch den Wirtsorganismus erkannt wird und operativ an die Anti-ErbB2-Antikörper-Nukleinsäure  gebunden ist. Geeignete Promotoren für die Verwendung in prokaryotischen  Wirten umfassen den phoA-Promotor,  beta -Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme,  alkalische Phosphatase, ein Tryptophan-(trp-)Promotorsystem und Hybridpromotoren  wie z.B. der tac-Promotor. Andere bekannte bakterielle Promotoren  sind jedoch ebenfalls geeignet. Promotoren zur Verwendung in bakteriellen  Systemen werden auch eine Shine-Dalgarno- (S.D.-)Sequenz enthalten,  die operativ an die Anti-ErbB2-Antikörper-kodierende DNA gebunden  ist. 



   Promotorsequenzen für Eukaryoten sind bekannt. So gut wie alle eukaryotischen  Gene besitzen eine AT-reiche Region, die ungefähr 25 bis 30 Basen  stromaufwärts der Stelle lokalisiert ist, wo die Transkription initiiert  wird. Eine weitere Sequenz, die 70 bis 80 Basen stromaufwärts vom  Start der Transkription vieler Gene gefunden wird, ist eine CNCAAT-Region,  worin N jedes Nukleotid sein kann. Am 3'-Ende der meisten eukaryotischen  Gene befindet sich eine AATAAA-Sequenz, die das Signal für die Addition  des Poly A-Schwanzes an das 3'-Ende der kodierenden Sequenz sein  könnte. Alle diese Sequenzen werden in geeigneter Weise in eukaryotische  Expressionsvektoren insertiert. 



   Beispiele geeigneter Promotorsequenzen zur Verwendung in Hefewirten  umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglycerat-Kinase oder glykolytische  Enzyme, wie z.B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase,  Hexokinase, Pyruvat-Decarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphat-lsomerase,  3-Phosphoglycerat-Mutase, Pyruvat-Kinase, Triosephosphat-Isomerase,  Phosphoglucose-Isomerase und Glucokinase. 



   Andere Hefepromotoren, die induzierbare Promotoren mit dem zusätzlichem  Vorteil der Transkriptionskontrolle über Wachstumsbedingungen sind,  sind die Promotorregio   nen für Alkohol-Dehydrogenase 2, Isocytochrom  C, saure Phosphatase, mit Stickstoff-Stoffwechsel assoziierte degradative  Enzyme, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase und  für Maltose- und Glucoseverwertung verantwortliche Enzyme. Geeignete  Vektoren und Promotoren für Verwendung in der Hefeexpression sind  in der EP-A-73 657 näher beschrieben. 



   Anti-ErbB2-Antikörper-Transkription von Vektoren in Säugetier-Wirtszellen  wird beispielsweise durch Promotoren gesteuert, die aus Genomen von  Viren erhalten werden, wie z.B. Polyomavirus, Geflügelpockenvirus,  Adenovirus (wie z.B. Adenovirus 2), Rinder-Papillomavirus, Vogelsarkomavirus,  Zytomegalievirus, ein Retrovirus, Hepatitis-B-Virus und insbesondere  bevorzugt Simian-Virus-40 (SV40), aus heterologen Säugetier-Promotoren,  z.B. den Actin-Promotor oder einem Immunglobulin-Promotor, aus Hitzeschock-Promotoren,  vorausgesetzt das solche Promotoren mit den Wirtszellensystemen kompatibel  sind. 



   Die frühen und späten Promotoren des SV40-Virus werden zweckdienlich  als ein SV40-Fragment erhalten, das auch den viralen SV40-Replikationsursprung  enthält. Der unmittelbar frühe Promotor des humanen Zytomegalievirus  wird zweckdienlich als Hindlll E-Restriktionsfragment erhalten. Ein  System zur Expression von DNA in Säugetier-Wirten unter Verwendung  des Rinder-Papillomavirus als Vektor wird offenbart im U.S.-Patent  Nr. 4 419 446. Eine Modifikation dieses Systems wird beschrieben  im U.S.-Patent Nr. 4 601 978. Siehe auch Reyes et al. Nature 297,  598-601 (1982) über die Expression von humaner  beta -Interferon-cDNA  in Mauszellen unter der Kontrolle eines Thymidin-Kinase-Promotors  aus Herpex Simplex-Virus. Alternativ dazu kann die lange terminale  Wiederholung von Rous-Sarkoma-Virus als Promotor verwendet werden.  (v) Enhancer-Element-Komponente  



   Die Transkription der DNA, die für den Anti-ErbB2-Antikörper dieser  Erfindung kodiert, durch höhere Eukaryoten wird oft durch die Insertion  einer Enhancer-Sequenz in den    Vektor verstärkt. Viele Enhancer-Sequenzen  aus Säugetier-Genen sind bekannt (Globin, Elastase, Albumin,  alpha  -Fetoprotein und Insulin). Typischerweise wird man jedoch einen Enhancer  aus einem Virus eukaryotischer Zellen verwenden. Beispiele umfassen  den SV40-Enhancer an der späten Seite des Replikationsursprungs (bp  100-270), den Zytomegalievirus-früher-Promotor-Enhancer, den Polyoma-Enhancer  an der späten Stelle des Replikationsursprungs, und Adenovirus-Enhancer.  Siehe auch Yaniv, Nature 297, 17-18 (1982) über Enhancer-Elemente  zur Aktivierung eukaryotischer Promotoren.

   Der Enhancer kann an einer  Position 5'- oder 3'- zur Anti-ErbB2-Antikörper-kodierenden Sequenz  in den Vektor gespleisst werden, ist aber bevorzugt an einer Stelle  5' vom Promotor lokalisiert.  (vi) Transkriptions-Terminations-Komponente  



   In eukaryotischen Zellen (Hefe, Pilze, Insekt, Pflanze, Tier, Mensch  oder kernhaltige Zellen anderer vielzelliger Organismen) verwendete  Expressionsvektoren werden auch Sequenzen enthalten, die für die  Termination der Transkription und zur Stabilisierung der mRNA notwendig  sind. Solche Sequenzen sind gewöhnlich aus den 5'- und gelegentlich  aus den 3'-untranslatierten Regionen eukaryotischer oder viraler  DNAs und cDNAs erhältlich. Diese Regionen enthalten Nukleotidsequenzen,  die im untranslatierten Teil der mRNA, die für den Anti-ErbB2-Antikörper  kodiert, als Polyadenylierte Fragmente transkribiert werden. Eine  zweckdienliche Transkriptions-Terminations-Komponente ist die Rinder-Wachstumshormon-Polyadenylierungsregion.  Siehe WO 94/11026 und den darin offenbarten Expressionsvektor.   (vii) Selektion und Transformation von Wirtszellen  



   Geeignete Wirtszellen zur Klonierung oder Expression der DNA in die  Vektoren hierin sind die oben beschriebenen Prokaryoten-, Hefe- oder  höheren Eukaryotenzellen. Für diesen Zweck geeignete Prokaryoten  umfassen Eubakterien, wie z.B. Gram-negative und Gram-positive Organismen,  zum Beispiel Enterobacteriaceae, wie z.B. Escherichia, z.B.    E.  coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, z.B.  Salmonella typhimurium, Serratia, z.B. Serratia marcescans und Shigella,  sowie auch Bacillen, wie z.B. B. subtilis und B. licheniformis (z.B.  B licheniformis 41P, offenbart in DD 266,710, publiziert am 12. April  1989), Pseudomonas, wie z.B. P. aeruginosa und Streptomyces. Ein  bevorzugter E. coli-Klonierungswirt ist E. coli 294 (ATCC 31 446),  obwohl andere Stämme, wie z.B. E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537)  und E. coli W3110 (ATCC 31 446) geeignet sind.

   Diese Beispiele sind  illustrativ und nicht einschränkend. 



   Zusätzlich zu Prokaryoten, sind eukaryotische Mikroorganismen, wie  z.B. filamentöse Pilze oder Hefen geeignete Expressionswirte für  Anti-ErbB2-Antikörper-kodierende Vektoren. Saccharomyces cerevisiae  oder gemeine Backhefe ist der am meisten gebräuchliche unter den  eukaryotischen Wirts-Mikroorganismen. Jedoch sind eine Anzahl anderer  Genera, Spezies und Stämme allgemein erhältlich und hierin geeignet,  wie z.B. Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces-Wirte, wie z.B.  K. lactis, K. fragilis (ATCC 12 424), K. bulgaricus (ATCC 16 045),  K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56 500), K. drosophilarum  (ATCC 36 906), K. thermotolerans und K. marxianus; Yarrowia (EP-A-402  226); Pichia pastoris (EP-A-183 070); Candida; Trichoderma reesia  (EP-A-244 234); Neurospora crassa; Schwanniomyces, wie z.B. Schwanniomyces  occidentalis und filamentöse Pilze, wie z.B.

   Neurospora-, Penicillium-,  Tolypocladium- und AspergiIIus-Wirte, wie z.B. A. nidulans und A.  niger. 



   Geeignete Wirtszellen zur Expression von glykosyliertem Anti-ErbB2-Antikörper  sind von vielzelligen Organismen abgeleitet. Beispiele für Invertebraten-Zellen  umfassen Pflanzen- und Insektenzellen. Eine Vielzahl von Baculovirus-Stämmen  und -Varianten und entsprechende permissive Insekten-Wirtszellen  aus Wirten, wie z.B. Spodoptera frugiperda (Raupe), Aedes aegypti  (Moskito), Aedes albopictus (Moskito), Drosophila melanogaster (Fruchtfliege)  und Bombyx mori sind identifiziert worden. Eine Vielzahl von Virus-Stämmen  für Transfektion sind öffentlich erhältlich, z.B. die L-1-Variante  von Autographa California NPV und der Bm-5-Stamm von Bombyx mori  NPV, und solche Vi   ren können verwendet werden als der Virus hierin  gemäss der vorliegenden Erfindung, insbesondere für die Transfektion  von Spodoptera frugiperda-Zellen. 



   Pflanzenzellkulturen von Baumwolle, Mais, Kartoffel, Sojabohne, Petunie,  Tomate und Tabak können auch als Wirte genützt werden. 



   Das grösste Interesse hat jedoch für Wirbeltierzellen bestanden,  und die Vermehrung von Wirbeltierzellen in Kultur (Gewebekultur)  ist zu einer Routineprozedur geworden. Beispiele zweckdienlicher  Säugetier-Wirtszelllinien sind Affen-Nieren-CV1-Linie, transformiert  durch SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); humane embryonale Nierenlinie  (293 oder 293-Zellen, subkloniert zum Wachstum in Suspensionskultur,  Graham et al., J. Gen. Vir. 36, 59 (1977)); Baby-Hamsternierenzellen  (BHK, ATCC CCL 10); Chinahamster-Eierstockzellen/-DHFR (CHO, Urlaub  et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)); Maus-Sertoli-Zellen  (TM4, Mather, Biol.

   Reprod. 23, 243-251 (1980)); Affen-Nierenzellen  (CV1 ATTC CCL 70); afrikanische Grünaffen-Nierenzellen (VERO-76,  ATCC CRL-1587); humane Kollumkarzinom-Zellen (HELA, ATCC CCL 2);  Hunde-Nierenzellen (MDCK, ATCC CCL 34); Büffelratten-Leberzellen  (BRL 3A, ATCC CRL 1442); humane Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75);  humane Leberzellen (Hep G2, HB 8065); Maus-Mammatumor (MMT 060562,  ATCC CCL51); TRI-Zellen (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383,  44-68 (1982)); MRC 5-Zellen; FS4-Zellen und humane Hepatomlinie (Hep  G2). 



   Wirtszellen werden mit den oben beschriebenen Expressions- und Klonierungsvektoren  zur Anti- ErbB2-Antikörper-Produktion transformiert und in konventionellen  Nährmedien kultiviert, die in geeigneter Weise für Promotor-Induktion,  Transformanten-Selektion oder Amplifizierung von Genen, die für die  gewünschten Sequenzen kodieren, modifiziert werden.  (viii) Kultivierung  der Wirtszellen  



   Die Wirtszellen, die zur Produktion des Anti-ErbB2-Antikörpers dieser  Erfindung verwendet werden, können in einer Vielzahl von Medien kultiviert  werden. Im Handel erhältliche Medien, wie z.B. Ham's F10 (Sigma),  Minimal Essential Medium (MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) und Dulbecco's  Modified Eagle's Medium (DMEM, Sigma) sind zur Kultivierung der Wirtszellen  geeignet. Zusätzlich kann jedes der in Ham et al., Meth. Enz. 58,  44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102, 255 (1980), den U.S.-Patenten  Nr. 4 767 704; 4 657 866; 4 927 762; 4 560 655 oder 5 122 469; den  WO 90/03430; WO 87/00195 oder U.S.-Patent Re. 30 985 als Kulturmedium  für die Wirtszellen verwendet werden. Jedes dieser Medien kann wie  benötigt ergänzt werden mit Hormonen und/oder anderen Wachstumsfaktoren  (wie z.B. Insulin, Transferrin oder Epidermis-Wachstumsfaktor), Salzen  (wie z.B.

   Natriumchlorid, Calcium, Magnesium und Phosphat), Puffer  (wie z.B. HEPES), Nukleotiden (wie z.B. Adenosin und Thymidin), Antibiotika  (wie z.B. GENTAMYCIN< <TM> >-Medikament), Spurenelementen (definiert  als anorganische Verbindungen, die gewöhnlich in Endkonzentrationen  im mikromolaren Bereich vorliegen) und Glucose oder äquivalente Energiequelle.  Jegliche weitere notwendige Zusätze können in geeigneten Konzentrationen,  die dem Fachkundigen bekannt wären, ebenso enthalten sein. Die Kulturbedingungen,  wie z.B. Temperatur, pH und ähnliches, sind jene, die bei der für  die Expression gewählten Wirtszelle früher verwendet wurden und werden  dem gewöhnlich qualifizierten Praktiker offensichtlich sein.   (ix) Reinigung des Anti-ErbB2-Antikörpers  



   Unter Anwendung von Rekombinationstechniken kann der Antikörper intrazellulär  oder im periplasmatischen Raum produziert oder direkt ins Medium  sekretiert werden. Wenn der Antikörper intrazellulär produziert wird,  werden im ersten Schritt die partikulären Reste, entweder Wirtszellen  oder lysierte Fragmente, z.B. durch Zentrifugation oder Ultrafiltration,  entfernt. Carter et al., Bio/Technology 10, 163-167 (1992), beschreiben  eine Prozedur zur Isolierung von Antikörpern, die in den periplasmatischen  Raum    von E. coli. sekretiert werden. Kurz gefasst wird Zellbrei  in Anwesenheit von Natriumacetat (pH 3,5), EDTA und Phenylmethylsulfonylfluorid  (PMSF) über ungefähr 30 min aufgetaut. Zellreste können durch Zentrifugation  entfernt werden.

   Wenn der Antikörper ins Medium sekretiert wird,  werden Überstände solcher Expressionssysteme im Allgemeinen zuerst  unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Protein-Konzentrationsfilter,  z.B. eine Amicon oder Millipore Ultrafiltrationseinheit, konzentriert.  Ein Protease-inhibitor, wie z.B. PMSF kann in jedem der vorangegangenen  Schritte zugegeben werden, um Proteolyse zu inhibieren, und Antibiotika  können zugegeben werden, um das Wachstum eingebrachter Kontaminanten  zu verhindern. 



   Die von den Zellen hergestellten Antikörper-Zusammensetzungen können  z.B. mittels Hydroxylapatit-Chromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse  und Affinitätschromatographie, mit der Affinitätschromatographie  als die bevorzugte Reinigungstechnik, gereinigt werden. Die Eignung  von Protein A als Affinitätsligand ist Abhängig von Spezies und Isotyp  jeglicher Immunglobulin-Fc-Domäne, die im Antikörper vorhanden ist.  Protein A kann zur Reinigung von Antikörpern verwendet werden, die  auf humanen  gamma 1-,  gamma 2-oder  gamma 4-Schwerketten basieren  (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62, 1-13 (1983)). Protein G wird  empfohlen für alle Maus-Isotypen und für humanes  gamma 3 (Guss et  al., EMBO J. 5, 1567-1575 (1986)). Die Matrix, an die der Affinitätsligand  gebunden wird, ist meistens Agarose, jedoch sind andere Matrices  erhältlich.

   Mechanisch stabile Matrices, wie z.B. Controlled-Pore-Glass  oder Poly(styroldivinyl)benzol erlauben höhere Durchflussraten und  kürzere Prozesszeiten, als mit Agarose erreicht werden kann. Wenn  der Antikörper eine C H 3-Domäne beinhaltet, ist das Bakerbond ABX  <TM> -Harz (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) zur Reinigung zweckdienlich.  Andere Techniken zur Proteinreinigung, wie z.B. Fraktionierung auf  -einer lonentauschersäule, Ethanolpräzipitation, RP-HPLC, Chromatographie  auf Kieselgel, Chromatographie auf Heparin-SEPHAROSE <TM> , Chromatographie  auf Anionentauscher- oder Kationentauscher-Harz (wie z.B. eine Polyasparaginsäure-Säule),  Chromatofokussierung, SDS-PAGE und Ammoniumsulfatpräzipitation sind  ebenfalls verfügbar und vom zu gewinnenden Antikörper abhängig. 



     Im Anschluss an beliebige vorhergehende Reinigungsschritt(e),  kann die den Antikörper von Interesse und Kontaminanten enthaltende  Mischung Hydrophob-Chromatographie bei niedrigem pH unterzogen werden,  und zwar unter Verwendung eines Elutionspuffers mit einem pH zwischen  ungefähr 2,5 und 4,5, vorzugsweise durchgeführt bei niedrigen Salzkonzentrationen  (z.B. von ungefähr 0-0,25 M Salz).   IV. Pharmazeutische Formulierungen  



   Therapeutische Formulierungen der gemäss der vorliegenden Erfindung  verwendeten Antikörper werden für die Lagerung hergestellt, indem  ein Antikörper mit dem gewünschten Reinheitsgrad mit optional pharmazeutisch  vertretbaren Trägern, Füllstoffen oder Stabilisatoren ("Remington's  Pharmaceutical Sciences", 16. Auflage, A. Osol (Hrsg.) (1980)), in  Form von lyophilisierten Formulierungen oder wässrigen Lösungen gemischt  werden. Vertretbare Träger, Füllstoffe oder Stabilisatoren sind für  den Empfänger bei den angewendeten Dosierungen und Konzentrationen  nicht toxisch und umfassen Puffer, wie z.B. Phosphat, Citrat und  andere organische Säuren; Antioxidantien, einschliesslich Ascorbinsäure  und Methionin; Konservierungsmittel (wie z.B.

   Octadecyldimethylbenzyl-Ammoniumchlorid;  Hexamethoniumchlorid; Benzalkoniumchlorid; Benzethoniumchlorid; Phenol,  Butyl- oder Benzylalkohol; Alkylparabene, wie z.B. Methyl- oder Propylparaben;  Brenzcatechin; Resorcin; Cyclohexanol; 3-Pentanol und m-Kresol);  niedermolekulare (weniger als 10 Reste) Polypeptide; Proteine, wie  z.B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere,  wie z.B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren, wie z.B. Glycin, Glutamin,  Asparagin, Histidin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide  und andere Kohlenhydrate, einschliesslich Glucose, Mannose oder Dextrine;  Chelatbildner, wie z.B. EDTA; Zucker, wie z.B. Sucrose, Mannit, Trehalose  und Sorbit; salzbildende Gegenionen, wie z.B. Natrium; Metallkomplexe  (z.B. Zn-Protein-Komplexe) und/oder nichtionische Tenside, wie z.B.  TWEEN <TM> , PLURONICS <TM>  oder Poly-ethylenglykol (PEG).

   Bevorzugte  Anti-ErbB2-Antikörper-Formulierungen werden in der WO 97/04801 beschrieben  und sind hierin ausdrücklich durch Verweis aufgenommen. 



     Die Formulierungen hierin können für die einzelne zu behandelnde  Indikationen auch mehr als eine aktive Verbindung enthalten, vorzugsweise  jene mit komplementären Aktivitäten, die sich nicht gegenseitig negativ  beeinflussen. Beispielsweise kann es wünschenswert sein, weitere  Antikörper, die an EGFR, ErbB2 (z.B. ein Antikörper, der ein anderes  Epitop von ErbB2 bindet), ErbB3, ErbB4 oder vaskulären Endothel-Wachstumsfaktor  (VEGF) binden, in dieser einen Formulierung vorzusehen. Alternativ  dazu oder zusätzlich kann die Zusammensetzung weiters ein Chemotherapeutikum,  ein zytotoxisches Mittel, Cytokin, einen Wachstumshemmer, ein anti-hormonelles  Mittel, auf ERFR gerichtetes Medikament, Anti-Angiogenese-Mittel  und/oder einen Kardioprotektor enthalten.

   Solche Moleküle sind in  geeigneter Weise in Kombination vorhanden und in Mengen, die für  den beabsichtigten Zweck effektiv sind. 



   Die aktiven Bestandteile können auch in hergestellte Mikrokapseln  eingeschlossen sein, z.B. mittels Coazervations-Techniken und Grenzglächen-Polymerisation,  zum Beispiel Hydroxymethylcellulose oder Gelatine-Mikrokapseln bzw.  Poly(methylmethacrylat)-Mikrokapseln, und zwar in kolloidalen Medikament-Zufuhrsystemen  (zum Beispiel Liposomen, Albumin-Mikrokügelchen, Mikroemulsionen,  Nano-Partikel und Nanokapseln) oder in Makroemulsionen. Solche Techniken  sind in "Remington's Pharmaceutical Sciences", 16. Auflage, A. Osol  (Hrsg.) (1980), offenbart. 



   Retard-Präparate können hergestellt werden. Geeignete Beispiele für  Retard-Präparate umfassen semipermeable Matrices von festen, hydrophoben,  den Antikörper enthaltenden Polymeren, wobei die Matrices als Formteile,  z.B. Filme oder Mikrokapseln, bestehen. Beispiele für Retard-Matrices  umfassen Polyester, Hydrogele (zum Beispiel Poly(2-hydroxyethylmethacrylat)  oder Poly(vinylalkohol)), Polylactide (U.S.-Patent Nr. 3.773.919),  Copolymere von L-Glutaminsäure und  gamma -Ethyl-L-glutamat, nicht-abbaubares  Ethylen-Vinylacetat, abbaubares Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer,  wie z.B. das LUPRON DEPOT <TM>  (injizierbare Mikrokügelchen, bestehend  aus Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer und Leuprolid-Acetat) und Poly-D-(-)-3-Hydroxybuttersäure.                                



     Die für in vivo-Verabreichung zu verwendenden Formulierungen müssen  steril sein. Dies kann leicht durch Filtration durch Sterilfiltrationsmembranen  erreicht werden.   V. Behandlung mit den Anti-ErbB2-Antikörpern  



   Es ist beabsichtigt, die Anti-ErbB2-Antikörper gemäss der vorliegenden  Erfindung zur Behandlung verschiedener Krankheiten und Störungen  zu verwenden. Beispielhafte Zustände oder Störungen umfassen gutartige  und bösartige Tumore; Leukämien und Lymphoid-Malignitäten; andere  Störungen, wie z.B. neuronale, gliale, astrocytale, hypothalamische,  glandulare, makrophagische, epitheliale, stromale, blastocoelische,  entzündliche, angiogenetische und immunologische Störungen. 



   Im Allgemeinen ist Krebs die zu behandelnde Krankheit oder Störung.  Nichteinschränkende Beispiele für hierin zu behandelnde Krebsformen  sind Karzinome, Lymphome, Blastome, Sarcome und Leukämie oder Lymphoid-Malignitäten.  Speziellere Beispiele solcher Krebsformen umfassen Plattenepithelkrebs,  Lungenkrebs, einschliesslich klein-zelliger Lungenkrebs, nicht-kleinzelliger  Lungenkrebs, Adenokarzinom der Lunge und Plattenepithelkrebs der  Lunge, Peritoneum-Krebs, Leberzellenkrebs, Magenkrebs einschliesslich  Magen-Darm-Krebs, Pankreaskrebs, Glioblastom, Zervikalkrebs, Eierstockkrebs,  Leberkrebs, Blasenkrebs, Hepatom, Brustkrebs, Dickdarmkrebs, Rektalkrebs,  Kolon-Rektum-Krebs, Endometrium- oder Uterus-Karzinom, Speicheldrüsenkrebs,  Nieren- oder Renalkrebs, Prostatakrebs, Vulvakrebs, Schilddrüsenkrebs,  Leberkarzinom, Analkrebs, Peniskrebs, sowie auch Kopf- und Halskrebs.

                                                            



   Der Krebs wird im Allgemeinen ErbB2-exprimierende Zellen umfassen,  sodass der Anti-ErbB2-Antikörper hierin an den Krebs binden kann.  Während der Krebs durch Überexpression des ErbB-Rezeptors charakterisiert  sein kann, liefert die vorliegende Anwendung weiters ein Verfahren  zur Behandlung von Krebs, der nicht als ErbB2-über-exprimierender  Krebs anzusehen ist. Zur Bestimmung der ErbB2-Expression im Krebs    steht eine Reihe von diagnostischen/prognostischen Tests zur Verfügung.  In einer Ausführungsform kann die ErbB2-Überexpression mittels IHC  analysiert werden, z.B. unter Verwendung des HERCEPTES<TR> (Dako).  Paraffineingebettete Gewebeschnitte aus einer Tumorbiopsie können  dem IHC-Test unterzogen und die ErbB2-Proteinfärbungsintensität gemäss  den folgenden Kriterien eingeordnet werden: 



   



   Bewertung 0 



   Keine Färbung wird beobachtet, oder Membranfärbung wird bei weniger  als 10% der Tumorzellen beobachtet. 



   



   Bewertung 1 + 



   Eine schwache/kaum merkliche Membranfärbung wird bei mehr als 10%  der Tumorzellen detektiert. Nur in ein Teil der Membranen der Zellen  ist gefärbt. 



   



   Bewertung 2 + 



   Eine schwache bis mässige vollständige Membranfärbung wird bei mehr  als 10% der Tumorzellen beobachtet. 



   



   Bewertung 3 + 



   Mässig bis starke vollständige Membranfärbung wird bei mehr als 10%  der Tumorzellen beobachtet. 



   



   Jene Tumoren mit den Bewertungen 0 und 1 + bei der Abschätzung der  ErbB2-Überexpression können als nicht ErbB2-überexprimierend charakterisiert  werden, während jene Tumoren mit Bewertungen 2+ oder 3+ als ErbB2-überexprimierend  charakterisiert werden können. 



   Alternativ dazu oder zusätzlich können FISH-Tests, wie z.B. dem INFORM  <TM>  (angeboten von Ventana, Arizona, USA), oder PATHVISION <TM>  (Vysis, Illinois, USA) an formalin   fixiertem, paraffineingebettetem  Tumorgewebe durchgeführt werden, um das Ausmass (falls überhaupt  vorhanden) von ErbB2-Überexpression im Tumor zu bestimmen. 



   In einer Ausführungsform ist der Krebs einer, der EGFR exprimiert  (oder überexprimiert). Beispiele für Krebsformen, die EGFR exprimieren/überexprimieren  umfassen Plattenepithelkrebs, Lungenkrebs, einschliesslich kleinzelliger  Lungenkrebs, nicht-kleinzelliger Lungenkrebs, Adenokarzinom der Lunge  und Plattenepithelkrebs der Lunge, Peritoneum-Krebs, Leberzellenkrebs,  Magenkrebs einschliesslich Magen-Darm-Krebs, Pankreaskrebs, Glioblastom,  Zervikalkrebs, Eierstockkrebs, Leberkrebs, Blasenkrebs, Hepatom,  Brustkrebs, Dickdarmkrebs, Rektalkrebs, Kolon-Rektum-Krebs, Endometrium-  oder Uterus-Karzinom, Speicheldrüsenkrebs, Nieren- oder Renalkrebs,  Prostatakrebs, Vulvakrebs, Schilddrüsenkrebs, Leberkarzinom, Analkrebs,  Peniskrebs, sowie auch Kopf- und Halskrebs. 



   Der hierin zu behandelnde Krebs kann einer sein, der durch übermässige  Aktivierung eines ErbB-Rezeptors, z.B. EGFR, charakterisiert ist.  Eine solch übermässige Aktivierung kann auf Überexpression oder gesteigerter  Produktion des ErbB-Rezeptors oder EGFR zurückgeführt werden. In  einer Ausführungsform der Erfindung wird ein diagnostischer oder  prognostischer Test durchgeführt, um zu bestimmen, ob der Krebs des  Patienten durch übermässige Aktivierung eines ErbB2-Rezeptors charakterisiert  ist. Beispielsweise kann ErbB2-Genamplifizierung und/oder Überexpression  eines ErbB-Rezeptors im Krebs bestimmt werden. Verschiedene Tests  zur Bestimmung einer solchen Amplifizierung/ Überexpression sind  im Fachgebiet verfügbar und umfassen die oben beschriebenen IHC-,  FISH- und Shed-Antigen-Tests.

   Alternativ dazu oder zusätzlich können  die Level eines ErbB-Liganden, wie z.B. TGF- alpha , im oder assoziiert  mit dem Tumor gemäss bekannter Verfahren bestimmt werden. Solche  Tests können Proteine oder Nukleinsäuren, die für diese kodieren,  in der zu testenden Probe detektieren. In einer Ausführungsform können  die ErbB-Liganden-Level im Tumor mittels Immunhistochemie (IHC) bestimmt  werden; siehe zum Beispiel Scher et al., Clin. Cancer Research 1,  545-550 (1995). Alternativ dazu oder zusätzlich kann man den Level  der ErbB-Liganden-kodierenden Nu   kleinsäure in der zu testenden  Probe evaluieren; z.B. mittels FISH, Southern-Blotting oder PCR-Techniken.                                                     



   Darüber hinaus kann ErbB-Rezeptor- oder ErbB-Liganden-Überexpression  oder -Amplifikation evaluiert werden, indem ein in vivo-diagnostischer  Test verwendet wird, z.B. durch Verabreichung eines Moleküls (wie  z.B. ein Antikörper), das an das zu detektierende Molekül bindet  und mit einem detektierbaren Marker (z.B. einem radioaktiven Isotop)  markiert ist und äusserlichem Scanning des Patienten zur Lokalisierung  des Markers. 



   Wenn der zu behandelnde Krebs ein hormonunabhängiger Krebs ist, kann  die Expression des Hormons (z.B. Androgen) und/oder dessen selbiges  erkennenden Rezeptors im Tumor mittels Verwendung jeglicher von verschiedenen  verfügbaren Tests, z.B. wie oben beschrieben, bestimmt werden. Alternativ  dazu oder zusätzlich kann der Patient mit hormonunabhängigem Krebs  diagnostiziert werden, wenn er nicht mehr auf Anti-Androgen-Therapie  anspricht. 



   In bestimmten Ausführungsformen wird dem Patienten ein Immunkonjugat,  umfassend den mit einem zytotoxischen Mittel konjugierten Anti-ErbB2-Antikörper,  verabreicht. Vorzugsweise werden das Immunkonjugat und/oder das ErbB2-Protein,  an das es gebunden ist, von der Zelle aufgenommen und führt zu erhöhter  therapeutischer Effizienz des Immunkonjugats bei der Abtötung der  Krebszelle, an die es bindet. In einer bevorzugten Ausführungsform  zielt das zytotoxische Mittel auf oder interferiert mit Nukleinsäure  in der Krebszelle. Beispiele für solche zytotoxische Mittel umfassen  Maytansinoide, Calicheamicine, Ribonukleasen und DNA-Endonukleasen.                                                            



   Die Anti-ErbB2-Antikörper oder Immunkonjugate werden gemäss bekannter  Verfahren an einen menschlichen Patienten verabreicht, wie z.B. durch  intravenöse Verabreichung, z.B. als Bolusinjektion oder durch kontinuierliche  Infusion über einen Zeitraum, durch intramuskuläre, intraperitoneale,  intracerebrospinale, subkutane, intra-artikuläre,    intrasynoviale,  intrathekale, orale, topische oder Inhalations-Wege. Intravenöse  oder subkutane Verabreichung des Antikörpers wird bevorzugt. 



   Andere therapeutische Vorgehensweisen können mit der Verabreichung  des Anti-ErbB2-Antikörpers kombiniert werden. Die kombinierte Verabreichung  umfasst Co-Verabreichung, unter Verwendung von getrennten Formulierungen  oder einer einzelnen pharmazeutischen Formulierung, und konsekutive  Verabreichung in jeder Reihenfolge, worin bevorzugt eine Zeitspanne  besteht, während der beide (oder alle) aktiven Mittel ihre biologischen  Aktivitäten gleichzeitig ausüben. 



   In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Patient mit zwei verschiedenen  Anti-ErbB2-Antikörpern behandelt. Beispielsweise kann der Patient  mit einem ersten Antikörper, der die Liganden-Aktivierung eines ErbB-Rezeptors  blockiert, oder einem Antikörper, der die biologische Charakteristik  von monoklonalem Antikörper 2C4 besitzt, wie auch mit einem zweiten  Anti-ErbB2-Antikörper, der wachstumshemmend ist (z.B. HERCEPTIN<  <TM> >), oder einem Antikörper, der Apoptose einer ErbB2- überexprimierenden  Zelle (z.B. 7C2, 7F3 oder deren humanisierte Varianten) induziert,  behandelt werden. Vorzugsweise führt eine solche kombinierte Behandlung  zu einem synergistischen therapeutischen Effekt. Man kann beispielsweise  den Patienten mit HERCEPTIN< <TM> > und anschliessend mit rhuMAb2C4,  z.B. wenn der Patient auf HERCEPTIN-Therapie nicht anspricht, behandeln.

    In einer weiteren Ausführungsform kann der Patient zuerst mit rhuMAb2C4  behandelt werden und dann HERCEPTIN <TM> -Therapie erhalten. In noch  einer weiteren Ausführungsform kann der Patient mit beidem, rhuMAb2C4  und HERCEPTIN< <TM> >, gleichzeitig behandelt werden. 



   Es kann auch wünschenswert sein, die Verabreichung des/der Anti-ErbB2-Antikörpers  oder -Antikörper mit der Verabreichung eines Antikörpers gegen ein  anderes tumorassoziiertes Antigen zu kombinieren. Der andere Antikörper  kann in diesem Fall zum Beispiel an EGFR, ErbB2, ErbB4 oder den vaskulären  Endothel-Wachstumsfaktor (VEGF) binden. 



     In einer Ausführungsform umfasst die Behandlung der vorliegenden  Erfindung die kombinierte Verabreichung eines oder mehrerer Anti-ErbB2-Antikörper  und eines oder mehrerer Chemotherapeutika oder Wachstumshemmer, einschliesslich  die Co-Verabreichung von Cocktails verschiedener Chemotherapeutika.  Bevorzugte Chemotherapeutika umfassen Texane (wie z.B. Paclitaxel  und Docetaxel) und/oder Anthracyclin-Antikörper. Präparation und  Dosisschemata für solche Chemotherapeutika können gemäss den Anweisungen  des Herstellers oder wie von einem qualifizierten Praktiker empirisch  bestimmt, verwendet werden. Präparation und Dosisschemata für solche  Chemotherapie werden auch beschrieben in "Chemotherapy Service",  M.C. Perry (Hrsg.), Williams & Wilkins, Baltimore, MD, USA (1992).                                                         



   Der Antikörper kann mit einer anti-hormonellen Verbindung kombiniert  werden; z.B. eine Anti-Östrogen-Verbindung, wie z.B. Tamoxifen; ein  Anti-Progesteron, wie z.B. Onapriston (siehe EP-A-616 812) oder ein  Anti-Androgen, wie z.B. Flutamid, in für solche Moleküle bekannten  Dosierungen. Wenn der zu behandelnde Krebs ein hormonunabhängiger  Krebs ist, kann der Patient vorher der Anti-Hormontherapie unterzogen  worden sein, und es kann, sobald der Krebs hormonunabhängig wird,  der Anti-ErbB2-Antikörper (oder optional andere hierin beschriebene  Mittel) an den Patienten verabreicht werden. 



   Manchmal kann auch die Co-Verabreichung eines Kardioprotektors (um  mit Therapie assoziierte Myokard-Fehlfunktion zu verhindern oder  zu vermindern) oder eines oder mehrerer Cytokine an den Patienten  von Vorteil sein. Man kann auch ein EGFR-Target-Medikament oder ein  Anti-Angiogenese-Mittel co-verabreichen. Zusätzlich zu den obigen  therapeutischen Massnahmen kann der Patient der operativen Entfernung  von Krebszellen und/oder Strahlentherapie unterzogen werden. 



   Die Anti-ErbB2-Antikörper hierin können auch mit einem auf EGFR abzielenden  Medikament, wie z.B. jene, die oben im Definitionsteil diskutiert  worden sind, kombiniert    werden, was zu einem komplementären und  potentiell synergistischen therapeutischen Effekt führt. 



   Geeignete Dosierungen für jedes der obigen co-verabreichten Mittel  sind jene, die zur Zeit verwendet werden und könnten aufgrund der  kombinierten Wirkung (Synergismus) des Mittels und dem Anti-ErbB2-Antikörper  verringert werden. 



   Die geeignete Dosierung von Antikörper zur Verhinderung und Behandlung  von Krankheit hängt von der Art der zu behandelnden Krankheit, wie  sie oben definiert wurden, ist, von der Schwere und dem Verlauf der  Krankheit, davon, ob der Antikörper für präventive oder therapeutische  Zwecke verabreicht wird, der vorangegangener Therapie, der Krankengeschichte  des Patienten und dem Ansprechen auf den Antikörper und dem Ermessen  des behandelnden Arztes ab. Der Antikörper wird passend zu einem  Zeitpunkt oder in einer Serie von Behandlungen verabreicht. In Abhängigkeit  von Art und Schweregrad der Krankheit, ist ungefähr 1  mu g/kg bis  15 mg/kg (z.B. 0,1-20 mg/kg) Antikörper eine mögliche Ausgangsdosis  für die Verabreichung an den Patienten, ob beispielsweise als eine  oder mehrere getrennte Verabreichungen oder als kontinuierliche Infusion.

    Eine typische Dosierung kann im Bereich von ungefähr 1  mu g/kg bis  100 mg/kg oder mehr liegen, abhängig von den oben erwähnten Faktoren.  Für wiederholte Verabreichung über mehrere Tage oder länger, in Abhängigkeit  vom Zustand, wird die Behandlung aufrechterhalten, bis eine gewünschte  Unterdrückung der Krankheitssymptome auftritt. Die bevorzugte Dosierung  des Antikörpers liegt im Bereich von ungefähr 0,05 mg/kg bis ungefähr  10 mg/kg. Folglich können eine oder mehrere Dosierungen von ungefähr  0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg oder 10 mg/kg (oder jede Kombination  davon) an den Patienten verabreicht werden. Solche Dosierungen können  periodisch unterbrochen, z.B. jede Woche oder alle drei Wochen (z.B.  so, dass der Patient von ungefähr zwei bis ungefähr zwanzig, z.B.  ungefähr sechs Dosierungen des Anti-ErbB2-Antikörpers erhält), verabreicht  werden.

   Eine anfänglich höhere Belastungsdosis, gefolgt von einer  oder mehreren niedrigeren Dosen kann verabreicht werden. Eine exemplarische  Dosisvorgabe umfasst die Verabreichung einer anfänglichen Belastungsdosis  von    ungefähr 4 mg/kg, gefolgt von einer wöchentlichen Erhaltungsdosis  von ungefähr 2 mg/kg des Anti-ErbB2-Antikörpers. Jedoch können auch  andere Dosisvorgaben zweckmässig sein. Der Fortschritt dieser Therapie  kann mittels konventioneller Techniken und Tests leicht überwacht  werden. 



   Abgesehen von der Verabreichung des Antikörperproteins an den Patienten,  erwägt die vorliegende Erfindung die Verabreichung des Antikörpers  durch Gentherapie. Eine solche Verabreichung von Antikörper-kodierender  Nukleinsäure ist umfasst durch den Ausdruck "Verabreichung einer  therapeutisch wirksamen Menge eines Antikörpers." Siehe z.B. WO 96/07321,  publiziert am 14. März 1996, betreffend die Anwendung von Gentherapie  zur Erzeugung intrazellulärer Antikörper. 



   Es bestehen zwei hauptsächliche Ansätze, die Nukleinsäure (optional  in einem Vektor enthalten) in die Zellen des Patienten zu bringen;  in vivo und ex vivo. Zur in vivo-Zufuhr wird die Nukleinsäure direkt  in den Patienten injiziert, gewöhnlich an der Stelle, wo der Antikörper  benötigt wird. Zur ex vivo-Behandlung werden die Zellen des Patienten  entfernt und die Nukleinsäure in diese isolierten Zellen eingeführt,  und die modifizierten Zellen werden dem Patienten entweder direkt  verabreicht oder beispielsweise innerhalb poröser Membranen eingeschlossen,  die in den Patienten implantiert werden (siehe z.B. die U.S.-Patente  Nr. 4 892 538 und 5 283 187). Es besteht eine Reihe von verfügbaren  Techniken zur Einführung von Nukleinsäuren in lebensfähige Zellen.

    Die Techniken variieren in Abhängigkeit davon, ob die Nukleinsäure  in vitro in kultivierte Zellen oder in vivo in die Zellen des bestimmten  Wirtes eingeführt wird. Geeignete Techniken für den in vitro-Transfer  von Nukleinsäuren in Säugetierzellen umfassen die Verwendung von  Liposomen, Elektroporation, Mikroinjektion, Zellfusion, DEAE-Dextran,  die Calciumphosphat-Präzipitationsmethode, usw. Ein gewöhnlich verwendeter  Vektor für in vivo-Zufuhr des Gens ist ein Retrovirus. 



   Die zur Zeit bevorzugten in vivo-Nukleinsäure-Transfertechniken umfassen  Transfektion mit Virusvektoren (wie z.B. Adenovirus, Herpes Simplex-I-Virus  oder Adeno-assoziierter    Virus) und Lipid-basierende Systeme (zweckmässige  Lipide für Lipid-vermittelten Transfer des Gens sind beispielsweise  DOTMA, DOPE und DC-Chol). In einigen Situationen ist es wünschenswert,  die Nukleinsäurequelle mit einem Mittel, das an eine Target-Zelle  adressiert ist, bereitzustellen, wie z.B. einem Antikörper, der für  ein Oberflächen-Membranprotein an der Target-Zelle spezifisch ist,  einem Liganden für einen Rezeptor an der Target-Zelle, usw.

   Wenn  Liposomen angewendet werden, können Proteine, die an ein Endozytose-assoziiertes  Zelloberflächen-Membranprotein binden, zur Adressierung und/oder  zur Erleichterung der Aufnahme verwendet werden, z.B. für einen bestimmten  Zelltyp typische Capsid-Proteine und deren Fragmente, Antikörper  gegen Proteine, die im Kreislauf Internalisierung erfahren, und Proteine,  die intrazelluläre Lokalisierung adressieren und intrazelluläre Halbwertszeit  erhöhen. Die Technik Rezeptor-vermittelter Endozytose wird z.B. beschrieben  von Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); und Wagner et  al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990). Für einen Überblick  gegenwärtig bekannter Genmarkierungs- und Gentherapie-Protokolle  siehe Anderson et al., Science 256, 808-813 (1992). Siehe auch WO  93/25673 und darin zitierte Literatur.   VI. Gefertigte Produkte  



   In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein gefertigtes  Produkt bereitgestellt, das für die Behandlung der oben beschriebenen  Störungen zweckmässige Materialien enthält. Das gefertigte Produkt  umfasst einen Behälter und ein Etikett oder eine Packungsbeilage  auf dem oder gebunden an den Behälter. Geeignete Behälter umfassen  beispielsweise Flaschen, Fläschchen, Spritzen, usw. Die Behälter  können aus einer Vielzahl von Materialien bestehen, wie z.B. Glas  oder Kunststoff. Der Behälter enthält eine Zusammensetzung, die zur  Behandlung des Zustands effektiv ist und kann eine sterile Zugangsöffnung  besitzen (z.B. kann der Behälter ein Infusionsbeutel oder ein Fläschchen  mit einem von einer Subkutankanüle durchstechbaren Stopfen sein).  Zumindest ein aktives Mittel in der Zusammensetzung ist ein Anti-ErbB2-Antikörper.

    Das Etikett oder die Packungsbeilage weist darauf hin, dass die Zusammensetzung  zur Behandlung    des Zustands der Wahl, wie z.B. Krebs, verwendet  wird. In einer Ausführungsform weist das Etikett oder die Packungsbeilage  darauf hin, dass die ErbB2-bindenden Antikörper enthaltende Zusammensetzung  zur Behandlung von Krebs verwendet werden kann, der einen ErbB-Rezeptor,  ausgewählt aus der aus Epidermis-Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR),  ErbB3 und ErbB4, vorzugsweise EGFR, umfassenden Gruppe, exprimiert.  Zusätzlich kann das Etikett oder die Packungsbeilage darauf hinweisen,  dass der zu behandelnde Patient einer mit einem Krebs ist, der durch  übermässige Aktivierung eines aus EGFR, ErbB3 oder ErbB4 ausgewählten  ErbB-Rezeptors charakterisiert ist.

   Beispielsweise kann der Krebs  einer sein, der einen dieser Rezeptoren überexprimiert und/oder einen  ErbB-Liganden (wie z.B. TGF- alpha ) überexprimiert. Das Etikett  oder die Packungsbeilage kann auch darauf hinweisen, dass die Zusammensetzung  zur Behandlung von Krebs verwendet werden kann, wobei der Krebs nicht  durch Überexpression des ErbB2-Rezeptors charakterisiert ist. Beispielsweise  kann die Packungsbeilage hierin darauf hinweisen, dass der Antikörper  oder die Zusammensetzung zur Behandlung von Krebs unabhängig vom  Ausmass der ErbB2-Überexpression verwendet wird, wogegen die jetzige  Packungsbeilage für HERCEPTIN< <TM> > darauf hinweist, dass der Antikörper  zur Behandlung von Patienten mit metastasierendem Brustkrebs verwendet  wird, deren Tumore das ErbB2-Protein überexprimieren.

   In anderen  Ausführungsformen kann die Packungsbeilage darauf hinweisen, dass  der Antikörper oder die Zusammensetzung zur Behandlung von Brustkrebs  (z.B. metastasierendem Brustkrebs); hormon-unabhängigem Krebs; Prostatakrebs,  (z.B. Androgen-unabhängigem Prostatakrebs); Lungenkrebs (z.B. nicht-kleinzelliger  Lungenkrebs); Dickdarm-, Rektum- oder Kolon-Rektum-Krebs; oder jede  andere hierin offenbarte Krankheit oder Störung verwendet werden  kann.

   Weiters kann das gefertigte Produkt umfassen: (a) einen ersten  Behälter mit einer darin enthaltenen Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung  einen ersten Antikörper umfasst, der ErbB2 bindet und das Wachstum  ErbB2-überexprimierender Krebszellen inhibiert und (b) einen zweiten  Behälter mit einer darin enthaltenen Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung  einen zweiten Antikörper umfasst, der ErbB2 bindet und die Liganden-Aktivierung  eines ErbB-Rezeptors blockiert. Das gefertigte Produkt in dieser  Ausführungsform der Erfindung kann weiters eine Packungsbeilage beinhalten,  die darauf hinweist, dass die Erst   - und Zweit-Antikörper-Zusammensetzungen  zur Behandlung von Krebs verwendet werden können.

   Ausserdem kann  die Packungsbeilage den Benutzer der Zusammensetzung (umfassend einen  Antikörper, der ErbB2 bindet und Liganden-Aktivierung eines ErbB-Rezeptors  blockiert anweisen, die Therapie mit dem Antikörper und jeder der  im vorangegangenen Abschnitt beschriebenen Zusatztherapien (z.B.  ein Chemotherapeutikum, ein EGFR-adressierendes Medikament, ein Anti-Angiogenese-Mittel,  eine anti-hormonelle Verbindung, ein Kardioprotektor und/oder ein  Cytokin) zu kombinieren. Alternativ dazu oder zusätzlich kann der  gefertigtes Produkt weiters einen zweiten (oder dritten) Behälter  umfassen, der einen pharmazeutisch vertretbaren Puffer enthält, wie  z.B. bakteriostatisches Wasser zur Injektion (BWFI), Phosphat-gepufferte  Kochsalzlösung, Ringer'sche Lösung und Dextrose-Lösung.

   Er kann weiters  andere Materialien enthalten, die vom geschäftlichen oder Anwenderstandpunkt  wünschenswert sind, einschliesslich von anderen Puffern, Verdünnern,  Filtern, Nadeln und Injektionsspritzen.   VII. Nicht-therapeutische  Anwendungen für den Anti-ErbB2-Antikörper  



   Die Antikörper (z.B. die humanisierten Anti-ErbB2-Antikörper) der  Erfindung haben weitere, nicht-therapeutische Anwendungen. 



   Zum Beispiel können die Antikörper als Affinitätsreinigungs-Mittel  verwendet werden. In diesem Prozess werden die Antikörper unter Verwendung  gut fachbekannter Verfahren auf einer Festphase, wie z.B. Sephadex-Harz  oder Filterpapier, immobilisiert. Der immobilisierte Antikörper wird  mit einer ErbB2-Protein (oder ein Fragment davon) enthaltenden, zu  reinigenden Probe kontaktiert, und danach wird der Träger mit einem  geeigneten Lösungsmittel gewaschen, das im Wesentlichen alles Material  entfernt, ausser ErbB2-Protein, das am immobilisierten Antikörper  gebunden ist. Zum Schluss wird der Träger mit einem anderen Lösungsmittel  gewaschen, wie z.B. mit Glycinpuffer, pH 5,0, das das ErbB2-Protein  vom Antikörper ablöst. 



     Anti-ErbB2-Antikörper für diagnostische Tests für ErbB2-Protein  nützlich sein, z.B. zu dessen Detektion in spezifischen Zellen, Geweben  oder Serum. 



   Für diagnostische Anwendungen wird der Antikörper typischerweise  mit einem detektierbaren Bestandteil markiert sein. Eine Vielzahl  von Markern ist erhältlich, die im Allgemeinen in folgende Kategorien  eingeteilt werden können: 



   



   (i) Radioisotope, wie z.B. <35>S, <14>C, <125>I, <3>H und <131>I.  Der Antikörper kann unter Verwendung der z.B. in "Current Protocols  in Immunology", Bd. 1 und 2, Coligen et al. (Hrsg.), Wiley-Interscience,  New York, New York Pubs (1992), beschriebenen Techniken mit den Radioisotopen  markiert und die Radioaktivität mittels Szintillationszählung gemessen  werden. 



   



   (ii) Fluoreszenz-Marker, wie z.B. Seltenerd-Chelate (Europium-Chelate)  oder Fluorescein und dessen Derivate, Rhodamin und dessen Derivate,  Dansyl, Lissamin, Phycoerythrin und Texasrot sind erhältlich. Die  Fluoreszenz-Marker können unter Verwendung der z.B. in "Current Protocols  in Immunology" (s.o.) offenbarten Techniken an den Antikörper konjugiert  und die Fluoreszenz mittels eines Fluorimeters quantifiziert werden.                                                           



   



   (iii) Verschiedene Enzym-Substrat-Marker sind erhältlich, und das  U.S.-Patent Nr. 4 275 149 liefert eine Übersicht einiger davon. Die  Enzyme katalysieren im Allgemeinen eine chemische Veränderung des  chromogenen Substrats, die mittels verschiedener Techniken gemessen  werden kann. Beispielsweise kann das Enzym eine Farbveränderung in  einem Substrat katalysieren, die spektral photometrisch gemessen  werden kann. Alternativ dazu kann das Enzym die Fluoreszenz oder  Chemolumineszenz des Substrats verändern. Techniken zur Quantifizierung  einer Fluoreszenz-Änderung sind oben beschrieben. Das chemolumineszierende  Substrat erfährt durch die chemische Reaktion eine Elektronenanregung  und kann dann Licht emittieren, das gemessen werden kann (z.B. mit  ei   nem Chemoluminometer), oder überträgt Energie an einen Fluoreszenz-Akzeptor.

    Beispiele für enzymatische Marker umfassen Luciferase (z.B. Leuchtkäfer-Luciferase  und bakterielle Luciferase; U.S.-Patent Nr. 4 737 456), Luciferin,  2,3-Di-hydrophthalazindione, Malat-Dehydrogenase, Urease, Peroxidase,  wie z.B. Meerrettich-Peroxidase (HRPO), alkalische Phosphatase,   beta -Galactosidase, Glucoamylase, Lysozym, Saccharid-Oxidase (z.B.  Glucose-Oxidase, Galactose-Oxidase und Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase),  heterozyklische Oxidasen (wie z.B. Uricase und Xanthin-Oxidase),  Lactoperoxidase, Microperoxidase und ähnliche. Techniken zur Konjugation  von Enzymen an Antikörper werden beschrieben in O'Sullivan et al.,  "Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use  in Enzyme Immunoassay", Methods in Enzym. 73, J. Langone & H.  Van Vunakis (Hrsg.), Academic Press, New York, S. 147-166 (1981).

    Beispiele für Enzym-Substrat-Kombinationen umfassen zum Beispiel:  



   (i) Meerrettich-Peroxidase (HRPO) mit Wasserstoffperoxid als Substrat,  worin die Wasserstoff-Peroxidase einen Farbstoffvorläufer (z.B. o-Phenylendiamin  (OPD) oder 3,3', 5,5'-Tetramethylbenzidin-hydrochlorid (TMB)) oxidiert;                                                        



   



   (ii) alkalische Phosphatase (AP) mit p-Nitrophenylphosphat als chromogenes  Substrat; und 



   



   (iii)  beta -D-Galactosidase ( beta -D-Gal) mit einem chromogenen  Substrat (z.B. p-Nitro-phenyl- beta -D-galactosidase) oder dem fluorogenen  Substrat 4-Methylumbelliferyl- beta -D-galactosidase. 



   Eine Vielzahl anderer Enzym-Substrat-Kombinationen ist dem Fachkundigen  bekannt. Für einen allgemeinen Überblick darüber siehe die U.S.-Patente  Nr. 4 275 149 und 4 318 980. 



     Manchmal ist der Marker indirekt mit dem Antikörper konjugiert.  Der qualifizierte Praktiker wird verschiedene Techniken kennen, um  dieses zu erzielen. Beispielsweise kann der Antikörper mit Biotin  konjugiert werden und alle drei weit gefassten, oben erwähnten Kategorien  von Markern können mit Avidin konjugiert werden, oder vice versa.  Biotin bindet selektiv an Avidin, und folglich kann der Marker auf  diese Weise indirekt mit dem Antikörper konjugiert werden. Alternativ  kann die indirekte Konjugation des Markers mit dem Antikörper erzielt  werden, indem der Antikörper mit einem kleinen Hapten (z.B. Digoxin)  konjugiert wird, und einer der verschiedenen, oben erwähnten Marker  wird mit einem Anti-Hapten-Antikörper (z.B. Anti-Digoxin-Antikörper)  konjugiert. Folglich kann so indirekte Konjugation des Markers mit  dem Antikörper erzielt werden. 



   In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung muss  der Anti-ErbB2-Antikörper nicht markiert werden, und sein Vorhandensein  kann unter Verwendung eines markierten Antikörpers, das an den ErbB2-Antikörper  bindet, detektiert werden. 



   Die Antikörper der vorliegenden Erfindung können für jedes bekannte  Testverfahren angewendet werden, wie z.B. kompetitive Bindungstests,  direkte und indirekte Sandwich-Tests und Immunpräzipitations-Tests.  Zola, "Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques", S. 147-158  (CRC Press, Inc. 1987). 



   Für Immunhistochemie kann die Tumorprobe frisch oder gefroren sein,  oder kann in Paraffin eingebettet und mit einem Konservierungsmittel,  wie z.B. Formalin, fixiert werden. 



   Die Antikörper können auch für in vivo-diagnostische Tests verwendet  werden. Im Allgemeinen ist der Antikörper mit einem Radionuklid markiert  (wie z.B. <111>ln, <99>Tc, <14>C, <131>1, <125>I, <3>H, <32>P oder  <35>S), sodass der Tumor mittels Immunszintiographie lokalisiert  werden kann. Der Einfachkeit halber können die Antikörper der vorliegenden  Erfindung als Set bereitgestellt werden, z.B. als verpackte Kombination  von Reagenzien in festgesetzten Mengen mit Anleitungen zur Ausführung  diagnostischer Tests. Wenn der Anti   körper mit einem Enzym markiert  ist, wird das Set für das Enzym benötigte Substrate und Co-Faktoren  enthalten (z.B. einen Substrat-Vorläufer, der das detektierbare Chromophor  oder Fluorophor liefert). Zusätzlich können andere Additive enthalten  sein, wie z.B. Stabilisatoren, Puffer (z.B. ein Blockpuffer oder  Lysepuffer) und ähnliches.

   Die relativen Mengen der verschiedenen  Reagenzien können breit variiert werden, um Konzentrationen der Reagenzien  in Lösung zu liefern, die die Empfindlichkeit des Tests im Wesentlichen  optimieren). Insbesondere können die Reagenzien als trockene Pulver  bereitgestellt werden, gewöhnlich in lyophilisierter Form, einschliesslich  Trägerstoffen, die bei Auflösung eine Reagenslösung mit der passenden  Konzentration liefern.   VIII. Hinterlegung von Materialien   



   Die folgenden Hybridom-Zelllinien sind bei der American Type Culture  Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209,  USA (ATCC), hinterlegt worden: 



    <tb><TABLE> Columns = 3  <tb><SEP> Antikörper-Bezeichnung<SEP>  ATCC Nr.<SEP> Hinterlegungsdatum <tb><SEP> 7C2<SEP> ATCC HB-12215<SEP>  17. Oktober 1996 <tb><SEP> 7F3<SEP> ATCC HB-12216<SEP> 17. Oktober  1996 <tb><SEP> 4D5<SEP> ATCC CRL 10463<SEP> 24. Mai 1990 <tb><SEP>  2C4<SEP> ATCC HB-12697<SEP> 8. April 1999  <tb></TABLE> 



   Weitere Details der Erfindung sind durch die folgenden, nichteinschränkenden  Beispiele veranschaulicht. Die Offenlegung aller Zitate in der Patentbeschreibung  sind hierin ausdrücklich durch Verweis aufgenommen.   Beispiel  I       Produktion und Charakterisierung des monoklonalen  Antikörpers 2C4  



   Die murinen monoklonalen Antikörper 2C4, 7F3 und 4D5, die spezifisch  an die extrazelluläre Domäne von ErbB2 binden, wurden wie in Fendly  et al., Cancer Research 50, 1550-1558 (1990), beschrieben produziert.  Kurz gefasst wurden NIH-3T3/HER2-3 400 -Zellen (ungefähr 1  x  10<5>  ErbB2-Moleküle/Zelle exprimierend), produziert wie in Hudziak et  al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84, 7158-7163 (1987), beschrieben,  mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), enthaltend 25 mM EDTA,  geerntet und zur Immunisierung von BALB/c-Mäusen verwendet. Den Mäusen  wurde i.p.-lnjektionen von 10<7> Zellen in 0,5 ml PBS verabreicht,  und zwar an den Wochen 0,2, 5 und 7. Den Mäusen mit Antisera, die  <32>P-markiertes ErbB2 immunpräzipitierten, wurden an Wochen 9 und  13 i.p.-lnjektionen eines Wheat-Germ-Agglutinin-Sepharose- (WGA-)  gereinigten ErbB2-Membran-Extrakts verabreicht.

   Dies war gefolgt  von einer i.v.-lnjektion von 0,1 ml des ErbB2-Präparats und die Splenozyten  wurden mit Maus-Myelom-Linie X63-Ag-8 653 fusioniert. 



   Hybridom-Überstände wurden mittels Radioimmunpräzipitation und ELISA  auf ErbB2-Bindung gescreent. 



   Die von den monoklonalen Antikörpern 4D5, 7F3 und 2C4 gebundenen  ErbB2-Epitope wurden mittels kompetitiver Bindungsanalyse bestimmt  (Fendly et al., Cancer Research 50, 1550-1558 (1990)). Cross-Blocking  Studien wurden an Antikörpern durch direkte Fluoreszenz an intakten  Zellen unter Verwendung der PANDEX <TM> -Screen-Machine zur Quantifizierung  der Fluoreszenz durchgeführt. Unter Verwendung etablierter Prozeduren  (Wofsy et al., "Selected Methods in Cellular Immunology", S. 287,  -Mishel und Schiigi (Hrsg.), San Francisco, W.J. Freeman Co. (1980))  jeder monoklonale Antikörper mit Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)  konjugiert. Konfluente Monoschichten von NIH-3T3/HER2-3 40  0 -Zellen  wurden mit Trypsin behandelt, einmal gewaschen und bei 1,75  x  10<6  >Zellen/ml in kaltem PBS, enthaltend 0,5% Rinderserumalbumin (BSA)  und 0,1% NaN 3 ,    resuspendiert.

   Eine Endkonzentration von 1% Latex-Partikeln  (IDC, Portland, OR, USA) wurde zugesetzt, um Verstopfung der PANDEX  <TM> -Platten-Membranen zu reduzieren. Zellen in Suspension, 20   mu l, und 20  mu l gereinigter Antikörper (100  mu g/ml bis 0,1   mu g/ml) wurden zu den PANDEX <TM> -Platten-Näpfen zugegeben und  für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Eine vorbestimmte Verdünnung FITC-markierter  monoklonaler Antikörper in 20  mu l wurden jedem Napf zugegeben,  für 30 Minuten inkubiert, gewaschen und die Fluoreszenz mit dem PANDEX  <TM>  quantifiziert. Monoklonale Antikörper wurden als ein Epitop  gemeinsames Epitop besitzend betrachtet, wenn jeder die Bindung des  anderen im Vergleich zu einer irrelevanten monoklonalen Antikörperkontrolle  zu 50% oder mehr blockierte. In diesem Test wurden den monoklonalen  Antikörpern 4D5, 7F3 und 2C4 die Epitope I, G/F bzw. F zugeordnet.

                                                               



   Die wachstumshemmenden Charakteristika der monoklonalen Antikörper  2C4, 7F3 und 4D5 wurden unter Verwendung der Brusttumor-Zelllinie  SK-BR-3 (siehe Hudziak et al., Molec. Cell Biol. 9(3), 1165-1172  (1989)) evaluiert. Kurz gefasst wurden SK-BR-3-Zellen mittels 0,25%  (Vol./Vol.) Trypsin abgelöst und in komplettem Medium mit einer Dichte  von 4  x  10<5> Zellen pro ml suspendiert. Aliquoten von 100  mu  l (4  x  10<4> Zellen) wurden in 96-Napf-Mikroverdünnungsplatten  plattiert, die Zellen wurden anhaften gelassen und dann mit 100   mu I Medium alleine oder monoklonalen Antikörper enthaltendes Medium  (Endkonzentration 5  mu g/ml) versetzt. Nach 72 Stunden wurden die  Platten zweimal mit PBS (pH 7,5) gewaschen, mit Kristallviolett (0,5%  in Methanol) gefärbt und auf relative Zellproliferation analysiert,  wie beschrieben in Sugarman et al., Science 230, 943-945 (1985).

    Monoklonale Antikörper 2C4 und 7F3 inhibierten die relative SK-BR-3-Zellen-proliferation  um ungefähr 20% bzw. ungefähr 38% im Vergleich zu ungefähr 56% Inhibierung  mit monoklonalem Antikörper 4D5. 



   Die monoklonalen Antikörper 2C4, 4D5 und 7F3 wurden auf ihre Fähigkeit  hin evaluiert, HRG-stimulierte Tyrosinphosphorylierung von Proteinen  im MG-Bereich 180 000 aus Ganz-Zellen-Lysaten von MCF7-Zellen zu  inhibieren (Lewis et al., Cancer Research 56, 1457-1465 (1996)).  Es wurde berichtet, dass MCF-Zellen alle bekannten ErbB-Re   zeptoren  exprimieren, jedoch in relativ niedrigen Mengen. Da ErbB2, ErbB3  und ErbB4 nahezu identische Molekülgrösse besitzen, ist es nicht  möglich festzustellen, welches Protein tyrosinphosphoryliert wird,  wenn Ganz-Zellen-Lysate mittels Western-Blot-Analyse evaluiert werden.                                                         



   Jedoch sind diese Zellen ideal für HRG-Tyrosinphosphorylierungs-Tests,  da sie unter den verwendeten Testbedingungen, in Abwesenheit von  exogen zugesetztem HRG, niedrige bis nicht nachweisbare Mengen von  tyrosinphosphorylierten Proteinen im MG-180 000-Bereich aufweisen.                                                             



   MCF7-Zellen wurden in 24-Napf-Platten ausplattiert und monoklonale  Antikörper gegen ErbB2 jedem Napf zugesetzt und für 30 Minuten bei  30 DEG C inkubiert; dann wurde jedem Napf rHRG beta 1  177  -  244  in einer Endkonzentration von 0,2 nM zugesetzt und die Inkubation  für 8 Minuten fortgesetzt. Medium wurde vorsichtig aus jedem Napf  abgesaugt und die Reaktion durch Zusatz von 100  mu l SDS-Probenpuffer  (5% SDS, 25 mM DTT und 25 mM Tris-HCI, pH 6,8) gestoppt. Jede Probe  (25  mu l) wurde in einem 4-12% Gradientengel (Novex) elektrophoretisch  getrennt und dann elektrophoretisch auf Polyvinylidendifluorid-Membran  transferiert.

   Antiphosphotyrosin- (4G10 von UBI, verwendet in 1   mu g/ml) Immunblots wurden entwickelt und die Intensität der vorwiegenden  reaktiven Bande bei MG < >180 000 mittels Reflexions-Densitometrie,  wie früher beschrieben (Holmes et al., Science 256, 1205-1210 (1992);  Sliwkowski et al., J. Biol. Chem. 269, 14661-14665), quantifiziert,                                                            



   Monoklonale Antikörper 2C4, 7F3 und 4D5 inhibierten signifikant die  Bildung eines HRG-induzierten Tyrosinphosphorylierungs-Signals im  MG 180 000-Bereich. Diese Antikörper kreuzreagierten auch nicht mit  EGFR (Fendly et al., Cancer Research 50, 1550-1558 (1990)), ErbB3  oder ErbB4. Antikörper 2C4 und 7F3 inhibierten signifikant die HRG-Stimulation  von p180-Tyrosinphosphorylierung um < >50%. Fig. 2A zeigt Dosis-Antwort-Kurven  für 2C4- oder 7F3-lnhibierung von HRG-Stimulation von p180-Tyrosinphosphorylierung,  wie bestimmt mittels Reflexions-Densitometrie. Evaluierung dieser  In   hibierungskurven mittels einer 4-Parameter-Anpassung ergab ein  IC 50 von 2,8 +/- 0,7 nM und 29,0 +/- 4,1 nM für 2C4 bzw. 7F3. 



   Inhibierung der HRG-Bindung an MCF7-Brusttumor-Zelllinien durch Anti-ErbB2-Antikörper  wurde im 24-Napf-Format mit Monoschicht-Kulturen auf Eis durchgeführt  (Lewis et al., Cancer Research 56, 1457-1465 (1996)). Monoklonale  Anti-ErbB2-Antikörper wurden jedem Napf zugesetzt und für 30 Minuten  inkubiert. <125>l-markiertes rHRG beta 1 177  -  22  4  (25 pm) wurde  zugesetzt und die Inkubation für 4 bis 16 Stunden fortgesetzt. Fig.  2B zeigt Dosis-Antwort-Kurven für 2C4- oder 7F3-lnhibierung von HRG-Bindung  an MCF7-Zellen. Variierende Konzentrationen von 2C4 oder 7F3 wurden  mit MCF-Zellen in Gegenwart von <125>l-markiertem rHRG beta i inkubiert  und die Inhibierungskurven sind in Fig. 2B gezeigt. Die Analyse dieser  Daten ergab ein IC 50  von 2,4 +/- 0,3 nM und 19,0 +/- 7,3 nM für  2C4 bzw. 7F3.

   Eine maximale Inhibierung von < >74% für 2C4 und 7F3  war in Übereinstimmung mit den Tyrosinphosphorylierungs-Daten. 



   Um zu bestimmen, ob der beobachtete Effekt der Anti-ErbB2-Antikörper  ein generelles Phänomen war, wurden humane Tumor-Zelllinien mit 2C4  oder 7F3 inkubiert und der Grad an spezifischer Bindung von <125>l-markiertem  rHRG beta i bestimmt (Lewis et al., Cancer Research 56, 1457-1465  (1996)). Die Ergebnisse dieser Studie sind in Fig. 3 gezeigt. Bindung  von <125>l-markiertem rHRG beta i konnte sowohl durch 2C4, als auch  7F3 in allen Zelllinien signifikant inhibiert werden, mit Ausnahme  der Brusttumor-Krebszelllinie MDA-MB-468, von der berichtet wurde,  dass sie wenig oder kein ErbB2 exprimiert. Von den verbleibenden  Zelllinien wurde berichtet, dass sie ErbB2 exprimieren, wobei der  Level von ErbB2-Expression unter diesen Zelllinien in einem weiten  Bereich variiert.

   Tatsächlich variiert der Bereich von ErbB2-Expression  in den getesteten Zelllinien um mehr als 2 Grössenordnungen. Beispielsweise  exprimieren BT-20, MCF7 und Caov-3 < >10<4> ErbB2-Rezeptoren/Zelle,  wogegen BT-474 und SK-BR-3 < >10<6> ErbB2-Rezeptoren/Zellen exprimieren.  Aus dem gegebenen, weiten Bereich der ErbB2-Expression in diesen  Zellen und den obigen Daten wurde geschlossen, dass die Wechselwirkung  zwi   schen ErbB2, ErbB3 und ErbB4 selbst eine hochaffine Wechselwirkung  war, die an der Oberfläche der Plasmamembran stattfindet. 



   Die wachstumshemmenden Effekte der monoklonalen Antikörper 2C4 und  4D5 auf MDA-MB-175- und SK-BR-3-Zellen in An- und Abwesenheit von  exogenem rHRG beta i wurden bestimmt (Schaefer et al., Oncogene 15,  1385-1394 (1997)). ErbB2-Level in MDA-MB-175-Zellen sind 4-6 Mal  höher als die in normalen Brust-Epithelzellen gefundenen Level, und  der ErbB2-ErbB4-Rezeptor ist in MDA-MB-175-Zellen konstitutiv tyrosinphosphoryliert.  MDA-MB-175-Zellen wurden mit den monoklonalen Anti-ErbB2-Antikörpern  2C4 und 4D5 (10  mu g/ml) für 4 Tage behandelt. In einem KristalIviolett-Färbungstest  zeigte die Inkubation mit 2C4 einen starken inhibierenden Effekt  auf diese Zelllinie (Fig. 4A). Exogenes HRG kehrt diese Inhibierung  nicht signifikant um. Andererseits zeigte 2C4 keinen inhibierenden  Effekt auf die ErbB2-überexprimierende Zelllinie SK-BR-3 (Fig. 4B).

    Der monoklonale Antikörper 2C4 war in der Lage, die Zellproliferation  von MDA-MB-175-Zellen in einem stärkeren Ausmass zu inhibieren als  der monoklonale Antikörper 4D5, sowohl in der Anwesenheit, als auch  in der Abwesenheit von exogenem HRG. Inhibierung von Zellproliferation  durch 4D5 ist abhängig vom ErbB2-Expressions-Level (Lewis et al.,  Cancer Immunol. Immunother. 37, 255-263 (1993)). Eine maximale Inhibierung  von 66% in SK-BR-3-Zellen konnte detektiert werden (Fig. 4B). Dieser  Effekt konnte jedoch durch exogenes HRG überwunden werden.    Beispiel 2     HRG-abhängige Assoziierung von ErbB2 mit ErbB2  wird durch den monoklonalen Antikörper 2C4 blockiert  



   Die Fähigkeit von ErbB3, mit ErbB2 zu assoziieren, wurde in einem  Co-Immunpräzipitations-Experiment getestet. 1,0  x  10<6> MCF7- oder  SK-BR-Zellen wurden in Sechs-Napf-Gewebekulturplatten in 50:50 DMEM/Ham's  F12-Medium, enthaltend 10% Fetal-Rinderserum (FBS) und 10 mM HEPES,  pH 7,2 (Wachstumsmedium), inokuliert und über    Nacht anhaften gelassen.  Die Zellen wurden vor Beginn des Experiments für zwei Stunden in  Wachstumsmedium ohne Serum ausgehungert. 



   Die Zellen wurden kurz mit phosphatgepuffertem Kochsalz (PBS) gewaschen  und dann entweder mit 100 nM des bezeichneten Antikörpers, verdünnt  in 0,2% (Gew./Vol.) Rinderserumalbumin (BSA), -RPMI-Medium, mit 10  mM HEPES, pH 7,2 (Bindungspuffer) oder mit Bindungspuffer alleine  (Kontrolle) inkubiert. Nach einer Stunde bei Raumtemperatur wurde  HRG auf eine Endkonzentration von 5 nM einer Hälfte der Näpfe (+)  zugesetzt. Ein ähnliches Volumen von Bindungspuffer wurde den anderen  Näpfen (-) zugesetzt. Die Inkubation wurde für ungefähr 10 Minuten  fortgesetzt. 



   Überstände wurden durch Absaugung entfernt und die Zellen in RPMI,  10 mM HEPES, pH 7,2, 1,0% (VoL/Vol.) Triton X-100 <TM> , 1,0% (Gew./Vol.)  CHAPS (Lysepuffer), enthaltend 0,2 mM PMSF, 10  mu g/ml Leupeptin  und 10 TU/ml Aprotinin lysiert. Die Lysate wurden durch Zentrifugation  von unlöslichem Material befreit. 



   ErbB2 wurde unter Verwendung eines an ein Affinitätsgel (Affi-Prep,  Bio-Rad) konjugierten monoklonalen Antikörpers Immunpräzipitiert.  Dieser Antikörper (Ab-3, Oncogene Sciences) erkennt ein Epitop der  zytoplasmatische Domäne. Immunpräzipitation wurde durch Zusatz von  10  mu l Gel-Brei, enthaltend ungefähr 8,5  mu g des immobilisierten  Antikörpers zu jedem Lysat durchgeführt, und die Proben wurden bei  Raumtemperatur für zwei Stunden mischen gelassen. Die Gele wurden  dann durch Zentrifugation gesammelt. Die Gele wurden Satzweise drei  Mal mit Lysepuffer gewaschen, um ungebundenes Material zu entfernen.  SDS-Probenpuffer wurde dann zugesetzt und die Proben in einem siedenden  Wasserbad kurz erhitzt. 



   Überstände wurden in 4-12% Gelen getrennt und auf Nitrocellulose-Membranen  elektrogeblottet. Die Anwesenheit von ErbB3 wurde bestimmt, indem  die Blots mit einem polyklonalen Antikörper gegen eines von dessen  Epitopen der Cytoplasma-Domäne (c-   17, Santa Cruz Biotech) sondiert  wurden. Die Blots wurden mit einem chemolumineszenten Substrat (ECL,  Amersham) Visualisiert. 



   Wie in den Kontroll-Spuren in den Fig. 5A und 5B für MCF7- bzw. SK-BR-3-Zellen  gezeigt, war ErbB3 in einem ErbB2-lmmunpräzipitat nur dann anwesend,  wenn die Zellen mit HRG stimuliert waren. Wenn die Zellen zuerst  mit monoklonalem Antikörper sC4 inkubiert wurden, war das ErbB3-Signal  in MCF7-Zellen abwesend (Fig. 5A, Spur 2C4 +) oder in SK-BR-3-Zellen  wesentlich reduziert (Fig. 5B, Spur 2C4 +). Wie in den Fig. 5A-B  gezeigt, blockiert monoklonaler Antikörper 2C4 die Heregulin-abhängige  Assoziierung von ErbB3 mit ErbB2 in sowohl MCF7-, als auch SK-BR-3-Zellen  wesentlich effektiver als HERCEPTIN< <TM> >. Vorinkubation mit HERCEPTIN<  <TM> > erniedrigte das ErbB3-Signal in MCF7-Lysaten, hatte jedoch  einen geringen oder keinen Effekt auf die aus SK-BR-3-Lysaten co-präzipitierte  ErbB3-Menge.

   Vorinkubation mit einem Antikörper gegen den EGF-Rezeptor  (Ab-1, Oncogene Sciences) hatte keinen Effekt auf die Fähigkeit von  ErbB3, mit ErbB2 der beiden Zelllinien zu co-immunpräzipitieren.  Beispiel 3   Humanisierte 2C4-Antikörper  



   Die variablen Domänen des murinen monoklonalen Antikörpers 2C4 wurden  zuerst in einen Vektor kloniert, der die Produktion eines Maus/Mensch-chimären  Fab-Fragments erlaubt. Gesamt-RNA wurde mittels eines Stratagene-RNA-Extraktionskits,  unter Befolgung der Vorschriften des Herstellers, aus Hybridomzellen  isoliert. Die variablen Domänen wurden durch RT-PCR amplifiziert,  Gel-gereinigt, und in ein Derivat eines pUC119-basierten Plasmids  insertiert, das eine humane Kappa-Konstantdomäne und humane C H 1-Domäne  enthält, und zwar wie früher beschrieben (Carter et al., PNAS (USA)  89, 4285 (1992); und U.S.-Patent Nr. 5 821 337). Das resultierende  Plasmid wurde zur Expression des Fab-Fragments in den E. coli-Stamm  16C9 transformiert. Wachstum der Kulturen, Induktion von Proteinexpression  und Reinigung von Fab-Fragment wurden    wie früher beschrieben (Werther  et al., J.

   Immunol. 157, 4986-4995 (1996); Presta et al., Cancer  Research 57, 4593-4599 (1997)) durchgeführt. 



   Das gereinigte chimäre 2C4-Fab-Fragment wurde mit dem parentalen,  murinen Antikörper 2C4 bezüglich dessen Fähigkeit verglichen, <125>l-HRG-Bindung  an MCF7-Zellen zu inhibieren und rHRG-Aktivierung von p180-Tyrosinphosphorylierung  in MCF7-Zellen zu inhibieren. Wie in Fig. 6A gezeigt ist das chimäre  2C4-Fab-Fragment sehr effektiv in der Störung der Bildung der hoch-affinen  ErbB2-ErbB3-Bindungsstelle an der humanen Brustkrebs-Zelllinie MCF7.  Der berechnete, relative IC 50 -Wert für intaktes, murines 2C4 beträgt  4,0 +/- 0,4 nM, wogegen der Wert für das Fab-Fragment 7,7 +/- 1,1  nM beträgt. Wie in Fig. 6B illustriert ist das monovalente, chimäre  2C4-Fragment sehr effektiv in der Störung HRG-abhängiger ErbB2-ErbB3-Aktivierung.

    Der berechnete IC 50 -Wert für intakten monoklonalen Antikörper 2C4  beträgt 6,0 +/- 2 nM, wogegen der Wert für das Fab-Fragment 15,0  +/- 2 nM beträgt. 



   Die DNA-Sequenzierung des chimären Klons erlaubte die Identifizierung  von CDR-Resten (Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological  Interest", 5. Auflage, Public Health Service, National Institutes  of Health, Bethesda, MD (1991)) (Fig. 7A und B). Unter Verwendung  von Oligonukleotid-ortsgerichteter Mutagenese wurden alle dieser  CDR-Regionen in ein vollständiges Human-Gerüst (V L -Kappa-Untergruppe  I und V H -Untergruppe III), enthalten auf Plasmid VX4, wie früher  beschrieben (Presta et al., Cancer Research 57, 4593-4599 (1997)),  eingeführt. Proteine des resultierenden "CDR-Tauschs" wurden wie  oben exprimiert und gereinigt. Bindungsstudien wurden durchgeführt,  um die beiden Versionen zu vergleichen.

   Kurz gefasst wurde eine NUNC  MAXISORP <TM> -Platte mit 1 Mikrogramm pro ml an ErbB2-extrazellulärer  Domäne (ECD; produziert wie beschrieben in WO 90/14357) in 50 mM  Karbonatpuffer, pH 9,6, über Nacht bei 4 DEG C beschichtet und dann  mit ELISA-Verdünner (0,5% BSA, 0,05% Polysorbat 20. PBS) bei Raumtemperatur  für 1 Stunde blockiert. Verdünnungsreihen in ELISA-Verdünner wurden  an den Platten für 2 Stunden inkubiert. Nach dem Waschen, wurde gebundenes  Fab-Fragment mit biotinyliertem, murinen Anti-Human-Kappa-Antikörper  (ICN 634771), ge   folgt von Streptavidin-konjugierter Meerrettich-Peroxidase  (Sigma) und mittels 3,3', 5,5'-Tetramethylbenzidin (Kirkegaard &  Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) als Substrat detektiert. Die  Absorption bei 450 nm wurde abgelesen.

   Wie in Fig. 8A gezeigt, ging  durch Konstruktion von CDR-Tausch-Human-Fab-Fragment die gesamte  Bindung verloren. 



   Um die Bindung des humanisierten Fab wieder herzustellen, wurden  unter Verwendung von DNA des CDR-Tauschs als Templat Mutanten hergestellt.  Unter Verwendung eines Computer-generierten Modells (Fig. 9), wurden  diese Mutationen so konstruiert, dass sie humane Gerüstregion-Reste  zu ihren murinen Gegenstücken veränderten, und zwar an Positionen,  wo die Veränderung CDR-Konformationen oder das Antikörper-Antigen-Interface  beeinflussen könnte. Mutanten sind in Tabelle 2 angeführt.    Tabelle 2     Bezeichnungen von humanisierten 2C4-FR-Mutationen  



    <tb><TABLE> Columns = 2  <tb>Head Col 1: Mutante Nr. <tb>Head  Col 2: Gerüstregion-(FR-)Substitutionen <tb><SEP> 560<SEP> ArgH71Val <tb><SEP>  561<SEP> AspH73Arg <tb><SEP> 562<SEP> ArgH71Val, AspH73Arg <tb><SEP>  568<SEP> ArgH71Val, AspH73Arg, AlaH49Gly <tb><SEP> 569<SEP> ArgH71Val,  AspH73Arg, PheH67Ala <tb><SEP> 570<SEP> ArgH71Val, AspH73Arg, AsnH76Arg <tb><SEP>  571<SEP> ArgH71Val, AspH73Arg, LeuH78Val <tb><SEP> 574<SEP> ArgH71Val,  AspH73Arg, IleH69Leu <tb><SEP> 56869<SEP> ArgH71Val, AspH73Arg,  AlaH49Gly, PheH67Ala  <tb></TABLE> 



     Bindungskurven für die verschiedenen Mutanten sind in den Fig.  8A-C gezeigt. Bei der humanisierten Fab-Version 574, mit den Veränderungen  ArgH71Val, AspH73Arg und IleH69Leu scheint die Bindung des ursprünglichen,  chimären Fab-Fragment wiederhergestellt zu sein. Zusätzliche FR-  und/oder CDR-Reste, wie z.B. L2, L54, L55, L56, H35 und/oder H48,  können modifiziert werden (z.B. modifiziert wie folgt - IleL2Thr;  Arg-L54Leu; TyrL55Glu; ThrL56Ser; AspH35Ser und ValH48Ile), um die  Bindung des humanisierten Antikörpers weiter zu verfeinern oder zu  verstärken. Alternativ dazu oder zusätzlich kann der humanisierte  Antikörper affinitätsgereift werden (siehe oben), um seine Affinität  und/oder andere biologische Aktivitäten zu verfeinern oder zu verbessern.                                                      



   Die humanisierte 2C4-Version 574 wurde mittels Phagen-Display-Verfahren  affinitätsgereift. Kurz gesagt wurde humanisiertes 2C4.574-Fragment  als Genlll-Fusion in einen Phagen-Display-Vektor kloniert. Wenn Phagen-Partikel  durch Infektion mit M13KO7-Helferphagen induziert werden, erlaubt  diese Fusion, dass das Fab am N-Terminus des Phagen-Schwanzfaser-Proteins  Genlll präsentiert wird (Baca et al., J. Biol. Chem. 272, 10678 (1997)).                                                       



   Individuelle Bibliotheken wurden für jedes der 6 oben identifizierten  CDRs konstruiert. In diesen Bibliotheken wurden die Aminosäuren in  den CDRs, die mit Hilfe eines Computer-generierten Modells (Fig.  9) als potentiell an ErbB2-bindend identifiziert wurden, unter Verwendung  von "NNS" als ihre Codons enthaltenden Oligomeren randomisiert. Die  Bibliotheken wurden dann gegen ErbB2-ECD, beschichtet auf NUNC MAXISORP  <TM> -Platten mit 3% Trockenmilch in PBS mit 0,2% TWEEN 20< <TM>  > (MPBST) anstelle aller Block-Lösungen, Panning unterzogen. Um auf  Phagen mit höheren Affinitäten als 2C4.574 zu selektieren, wurde  in den Panningzyklen 3, 4 und 5 in der Wachschritten lösliches Erb-B2-ECD  oder lösliches Fab-2C4.574 als Kompetitiv zugesetzt. Waschzeiten  wurden auf 1 Stunde bei Raumtemperatur ausgedehnt. 



   Nach 5 Panningzyklen wurden die einzelnen Klone wiederum mittels  Phagen-ELISA analysiert. Einzelne Klone wurden in U-Boden Costar-96-Napf-Gewebekulturplatten  ge   züchtet und die Phagen durch Zusatz von Helferphagen induziert.  Nach Züchtung über Nacht, wurden E. coli-Zellen pelletiert und die  Phagen-enthaltenden Überstände in 96-Napf-Platten transfiziert, worin  der Phage mit MPBST für 1 Stunde bei Raumtemperatur blockiert wurde.  Mit ErbB2-ECD beschichtete NUNC MAXISORP <TM> -Platten wurden ebenso  wie oben beschrieben mit MPBST blockiert. Blockierte Phagen wurden  an den Platten für 2 Stunden inkubiert. Nach dem Waschen wurden gebundene  Phagen mittels Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem, monoklonalen  Anti-M13-Antikörper (Amersham Pharmacia Biotech, Inc. 27-9421-01),  1:5000 in MPBST verdünnt, gefolgt von 3,3', 5,5'-Tetramethylbenzidin  als Substrat, detektiert.

   Die Absorption wurde bei 450 nm abgelesen.                                                           



   Diejenigen 48 Klone jeder Bibliothek, die die stärksten Signale lieferten,  wurden DNA-sequenziert. Jene Klone, deren Sequenzen am häufigsten  auftraten, wurden in den oben beschriebenen Vektor subkloniert, der  die Expression löslicher Fabs erlaubt. Diese Fabs wurden induziert,  die Proteine gereinigt und die gereinigten Fabs wurden mittels ELISA,  wie oben beschrieben, auf Bindung analysiert und die Bindung mit  der der ursprünglichen humanisierten 2C4.574-Version verglichen. 



   Nach Identifizierung interessanter Mutationen in einzelnen CDRs wurden  zusätzliche Mutationen, die verschiedene Kombinationen davon waren,  konstruiert und wie oben getestet. Mutanten, die relativ zu 574 verbesserte  Bindung ergaben, sind in Tabelle 3 beschrieben.   Tabelle 3       Bezeichnungen von durch Affinitätsreifung von 2C4.574  abgeleiteten Mutanten  



    <tb><TABLE> Columns = 3  <tb><SEP> Mutanten-Name<SEP> Veränderung  gegenüber 574<SEP> Mutante/574* <tb><SEP> H3.A1<SEP> serH99trp,  metH34leu<SEP> 0.380 <tb><SEP> L2.F5<SEP> serL50trp, tyrL53gly,  metH34leu<SEP> 0.087 <tb><SEP> H1.3.B3<SEP> thrH28gln,thrH30ser,  metH34leu<SEP> 0.572 <tb><SEP> L3.G6<SEP> tyrL92pro, ileL93lys,  metH34leu<SEP> 0.569 <tb><SEP> L3.G11<SEP> tyrL92ser, ileL93arg,  tyrL94gly, metH34leu<SEP> 0.561 <tb><SEP> L3.29<SEP> tyrL92phe,  tyrL96asn, metH34leu<SEP> 0.552 <tb><SEP> L3.36<SEP> tyrL92phe,  tyrL94leu, tyrL96pro, metH34leu<SEP> 0.215 <tb><SEP> 654<SEP> serL50trp,  metH34leu<SEP> 0.176 <tb><SEP> 655<SEP> metH34ser<SEP> 0.542 <tb><SEP>  659<SEP> serL50trp, metH34ser<SEP> 0.076 <tb><SEP> L2.F5.H3.A1<SEP>  serL50trp, tyrL53gly, metH34leu, serH99trp<SEP> 0.175 <tb><SEP>  L3G6.H3.A1<SEP> tyrL92pro, ileL93lys, metH34Ieu,

   serH99trp<SEP> 0.218 <tb><SEP>  H1.3.B3.H3.A1<SEP> thrH28gln, thrH30ser, metH34Ieu, serH99trp<SEP>  0.306 <tb><SEP> L3.G11.H3.A1<SEP> tyrL92ser, ileL93arg, tyrL94gly,  metH341eu, serH99trp<SEP> 0.248 <tb><SEP> 654.H3.A1<SEP> serL50trp,  metH34leu, serH99trp<SEP> 0.133 <tb><SEP> 654.L3.G6<SEP> serL50trp,  metH34leu, tyrL92pro, ileL93Iys<SEP> 0.213 <tb><SEP> 654.L3.29<SEP>  serL50trp, metH34leu, tyrL92phe, tyrL96asn<SEP> 0.236 <tb><SEP>  654.L3.36<SEP> serL50trp, metH35leu, tyrL92phe, tyrL94leu, tyrL96pro<SEP>  0.141  <tb></TABLE> 



   *Verhältnis zwischen der zur Erreichung der mittleren optischen Dichte  (OD) der Standardkurve benötigten Menge an Mutante und der zur Erreichung  der mittleren OD der Standardkurve in einem Erb2-ECD-ELISA benötigten  Menge an 574. Eine Zahl kleiner als 1,0 weist darauf hin, dass die  Mutante Erb2 besser bindet als 574.  Die folgenden Mutanten wurden  ebenfalls konstruiert und werden zurzeit evaluiert:  



    <tb><TABLE> Columns = 7  <tb><SEP> 659.L3.G6<SEP> serL50trp,  metH34ser, tyrL92pro, ileL93lys <tb><SEP> 659.L3.G11<SEP> serL50trp,  metH34ser, tyrL92ser, ileL93arg, tyrL94gly <tb><SEP> 659.L3.29<SEP>  serL50trp, metH34ser, tyrL92phe, tyrL96asn <tb><SEP> 659.L3.36<SEP>  serL50trp, metH34ser, tyrL92phe, tyrL94leu, tyrL96pro <tb><SEP>  L2F5.L3G6<SEP> serL50trp, tyrL53gly, metH34leu, tyrL92pro, ileL93lys <tb><SEP>  L2F5.L3G11<SEP> serL50trp, tyrL53gly, metH34leu, tyrL92ser, ileL93arg,  tyrL94gly <tb><SEP> L2F5.L29<SEP> serL50trp, tyrL53gly, metH34leu,  tyrL92phe, tyrL96asn <tb><SEP> L2F5.L36<SEP> serL50trp, tyrL53gly,  metH34leu, tyrL92phe, tyrL94leu, tyrL96pro <tb><SEP> L2F5.L3G6.655<SEP>  serL50trp, tyrL53gly, metH35ser, tyrL92pro, ileL93lys <tb><SEP>  L2F5.L3G11.655<SEP> serL50trp, tyrL53gly, metH34ser, tyrL92ser, ileL93arg,  tyrL94gly <tb><SEP>    L2F5.L29.655<SEP> serL50trp,

   tyrL53gly, metH34ser,  tyrL92phe, tyrL96asn <tb><SEP> L2F5.L36.655<SEP> serL50trp, tyrL53gly,  metH34ser, tyrL92phe, tyrL94leu, tyrL96pro  <tb></TABLE>   Die folgenden Mutanten, nahe gelegt durch einen Homologie-Scan, werden  zurzeit konstruiert:  



    <tb><TABLE> Columns = 2  <tb><SEP> 678<SEP> thrH30ala <tb><SEP>  679<SEP> thrH30ser <tb><SEP> 680<SEP> lysH64arg <tb><SEP> 681<SEP>  leuH96val <tb><SEP> 682<SEP> thrL97ala <tb><SEP> 683<SEP> thrL97ser <tb><SEP>  684<SEP> tyrL96phe <tb><SEP> 685<SEP> tyrL96ala <tb><SEP> 686<SEP>  tyrL91phe <tb><SEP> 687<SEP> thrL56ala <tb><SEP> 688<SEP> glnL28ala <tb><SEP>  689<SEP> gInL28glu  <tb></TABLE> 



   Die bevorzugte Aminosäure bei H34 wäre Methionin. Ein Wechsel zu  Leucin könnte vorgenommen werden, falls Oxidation an dieser Position  aufträte. 



   AsnH52 und asnH53 wurden als stark bevorzugt für die Bindung erkannt.  Änderung dieser Reste zu Alanin und Asparaginsäure setzte die Bindung  dramatisch herab. 



   Ein intakter Antikörper, umfassend die variablen leichten und schweren  Domänen der humanisierten Version 574 mit einer Schwerketten-Konstantregion  von Human-lgG1 ist hergestellt worden (siehe U.S.-Patent Nr. 5 821  337). Der intakte Antikörper wird durch Chinahamster-Eierstock-(CHO-)Zellen  produziert. Dieses Molekül wird hierin als rhu-MAb-2C4 bezeichnet.   Beispiel 4       Monoklonaler Antikörper 2C4 blockiert  die EGF-, TGF- alpha - oder HRG-vermittelte Aktivierung von MAPK  



   Viele Wachstumsfaktor-Rezeptoren signalisieren über den Mitogen-aktivierten  Proteinkinase-(MAPK-) Stoffwechselweg. Diese Doppelspezifitäts-Kinasen  sind eine der Schlüssel-Endpunkte in Signalübertragungs-Stoffwechselwegen,  die letztlich die Teilung der Krebszellen auslösen. Die Fähigkeit  von mono-klonalem Antikörper 2C4 oder HERCEPTIN< <TM> >, die EGF-,  TGF- alpha - oder HRG-Aktivierung zu inhibieren, wurde in der folgenden  Weise bestimmt. 



   MCF7-Zellen (10<5> Zellen/Napf) wurden in Serum-enthaltenden 12-Napf-Kulturplatten  ausplattiert. Am nächsten Tag wurden die Zellmedien entfernt und  jedem Napf frisches, 0,1% Serum enthaltendes Medium, zugesetzt. Dieser  Vorgang wurde dann am nächsten Tag wiederholt und vor dem Test wurde  das Medium durch serum-freien Bindungspuffer ersetzt (Gones et al.,  J. Biol. Chem. 273, 11667-74 (1998); und Schaefer et al., J. Biol.  Chem. 274, 859-66 (1999)). Zellen wurden bei Raumtemperatur äquilibriert  und dann für 30 Minuten mit 0,5 ml von 200 nM HERCEPTIN< <TM> > oder  monoklonalem Antikörper 2C4 inkubiert. Die Zellen wurden dann für  15 Minuten mit 1 nM EGF, 1nM TGF- alpha  oder 0,2 nM HRG behandelt.  Die Reaktion wurde gestoppt, indem das Medium abgesaugt und dann  0,2 ml 1% DTT enthaltender SDS-Probenpuffer zugesetzt wurde.

   MAPK-Aktivierung  wurde mittels Western-Blotting bestimmt, unter Verwendung eines Anti-Aktiv-MAPK-Antikörpers  (Promega), wie früher beschrieben (Jones et al.,    J. Biol. Chem.  273, 11667-74 (1998)). 



   Wie in Fig. 10 gezeigt ist, blockiert der monoklonale Antikörper  2C4 signifikant EGF-, TGF- alpha - und HRG-vermittelte Aktivierung  von MAPK in einem stärkeren Ausmass als HERCEPTIN< <TM> >. Diese  Daten weisen darauf hin, dass der monoklonale Antikörper 2C4 an eine  Oberfläche von ErbB2 bindet, die für dessen Assoziierung mit entweder  EGFR oder ErbB3 verwendet wird und so die Bildung des Signal-Rezeptor-Komplexes  verhindert. 



     Es wurde auch gezeigt, dass monoklonaler Antikörper 2C4 die Heregulin-(HRG-)abhängige  Akt-Aktivierung inhibiert. Die Aktivierung des PI3-Kinase-Signalübertragungs-Stoffwechselwegs  ist wichtig für das Zell-Überleben (Carraway et al., J. Biol. Chem.  270, 7111-6 (1995)). In Tumorzellen könnte PI13-Kinase-Aktivierung  eine Rolle im invasiven Phenotyp spielen (Tan et al., Cancer Research  59, 1620-1625 (1999)). Der Überlebens-Stoffwechselweg wird in erster  Linie durch die Serin/Threonin-Kinase AKT vermittelt (Bos et al.,  Trends Biochem. Sci. 20, 441-442 (1995)). Zwischen ErbB2 und entweder  ErbB3 oder EGFR gebildete Komplexe können diese Stoffwechselwege,  als Reaktion auf Heregulin bzw. EGF, initiieren (Olayioye et al.,  Mol. & Cell. Biol. 18, 5042-51 (1998); Karunagaran et al., EMBO  Journal 15, 254-264 (1996); und Krymskaya et al., Am. J. Physiol.

    276, L246-55 (1999)). Inkubation von MCF7-Brustkrebszellen mit 2C4  inhibiert Heregulin-vermittelte AKT-Aktivierung. Darüber hinaus wird  der in Abwesenheit von Heregulin vorhandene Basislevel der AKT-Aktivierung  durch Zusatz von 2C4 weiter herabgesetzt. Diese Daten weisen darauf  hin, dass 2C4 die ErbB-Liganden-Aktivierung von PI3-Kinase inhibiert  und dass diese Inhibierung zu Apoptose führen kann. Die gesteigerte  Empfindlichkeit für Apoptose könnte sich in einer höheren Empfindlichkeit  von Tumorzellen auf die toxischen Effekte von Chemotherapie manifestieren.                                                     



   Folglich inhibiert der monoklonale Antikörper 2C4 Liganden-initiierte  ErbB-Signalisierung über zwei hauptsächliche Übertragungswege - MAP-Kinase  (ein proliferativer Hauptweg) und PI3-Kinase (ein Überlebens/Anti-Apoptose-Hauptweg).   Beispiel 5     Kombination von monoklonalem Antikörper  2C4 und HERCEPTIN< <TM> > in vivo  



   Ein Xenograft-Modell unter Verwendung der Lungen-Adenokarzinom-Zelllinie  Calu 3 wurde verwendet, um die Effizienz von monoklonalen HER2-Antikörpern,  entweder alleine oder in Kombination, in der Unterdrückung von Tumorwachstum  zu bestimmen. Weibliche NCR-Nacktmäuse wurden mit 20  x  10<6> Zellen  in 0,1 ml subkutan inokuliert. 



     Tumormessungen wurden zweimal in der Woche vorgenommen, und wenn  die Tumorknötchen ein Volumen von 100 mm<3> erreichten, wurden die  Tiere in 7 Behandlungsgruppen randomisiert. Die Behandlungsgruppen  waren: 



   (a) monoklonaler Kontroll-Antikörper, MAb 1766; 



   (b) HERCEPTIN< <TM> >, 10 mg/kg; 



   (c) monoklonaler Antikörper 7C2, 10 mg/ml; 



   (d) monoklonaler Antikörper 2C4, 10 mg/ml; 



   (e) HERCEPTIN< <TM> > und 7C2, je 10 mg/kg; 



   (f) HERCEPTIN< <TM> > und 2C4, je 10 mg/kg; und 



   (g) monoklonale Antikörper 2C4 und 7C2, je 10 mg/ml. 



   Die Tiere wurden bis Tag 24 zweimal pro Woche behandelt. Tumorvolumina  wurde bis Tag 38 zweimal pro Woche gemessen. 



   Wie im Balkendiagramm in Fig. 11 gezeigt inhibierte die Behandlung  von tumortragenden Calu 3-Mäusen mit 2C4 oder HERCEPTIN< <TM> > signifikant  das Wachstum der Tumoren. Die Kombination von HERCEPTIN< <TM> > und  2C4 oder HERCEPTIN< <TM> > und 7C2 war der Verabreichung beider Antikörper  alleine überlegen.   Beispiel 6     Behandlung von Kolon-Rektum-Krebs  mit monoklonalem Antikörper 2C4  



   Humane Kolon-Rektum-Zelllinien, wie z.B. HCA-7, LSI74T oder CaCo-2,  werden in athymische Nacktmäuse subkutan implantiert, wie beschrieben  in Sheng et al., J. Clin. Invest. 99, 2254-2259 (1997). Sobald sich  Tumoren bis zu einem Volumen von ungefähr 100 mm<3> entwickelt hatten,  wurden Gruppen von Tieren mit 10-50 mg/kg des monoklonalen Antikörpers  2C4 behandelt, verabreicht zweimal die Woche durch Injektion in die  Peritonealhöhle. Monoklonaler Antikörper 2C4 unterdrückt das Wachstum  von Kolon-Rektum-Xenografts in vivo.   Beispiel 7       Behandlung von Brustkrebs mit humanisiertem 2C4  



   Der Effekt von rhuMAb 2C4 oder HERCEPTIN< <TM> > auf Human-Brustkrebszellen,  die ErbB2 nicht exprimieren, wurden in einem 3-Tage-Almarblau-Test  (S.A. Ahmed, J. Immunol. Methods 170, 211-224 (1994); und Page et  al., Int. J. Oncol. 3, 473-476 (1994)) bestimmt. Die in diesem Test  verwendeten Zellen waren MDA-175-Human-Brustkrebszellen, die ErbB2  bei einem 1+-Level exprimieren. Wie in Fig. 12 gezeigt wird das Wachstum  der Brustkrebs-Zelllinie MDA-175 durch Zusatz von rhuMAb-2C4 im Vergleich  mit HERCEPTIN< <TM> >-Behandlung in Dosis-abhängiger Weise signifikant  inhibiert. 



   Die Effizienz von rhuMAb-2C4 gegen MCF7-Xenografts, die Östrogen-Rezeptor-positiv  (ER+) sind und niedrige Level von ErbB2 exprimieren, wurde bestimmt.  Mit Östrogen ergänzte, weibliche Mäuse wurden verwendet. rhuMAb-2C4  wurde in einer Dosis von 30 mg/kg jede Woche verabreicht. Wie in  Fig. 13 gezeigt ist, war rhuMAb-2C4 effektiv in der Inhibierung von  Brustkrebs-Tumor-Wachstum in vivo, wo der Brustkrebs nicht durch  Überexpression von ErbB2 charakterisiert war.   Beispiel 8     Pharmakokinetik, Metabolismus und Toxikologie von 2C4                                                                



   rhuMAb-2C4 war in humanem Serum stabil. Keine Anzeichen von Aggregaten  von Komplexbildung in biologischen Grundsubstanzen wurden beobachtet.  Bei Mäusen wurde rhuMAb-2C4 schneller eliminiert als HERCEPTIN< <TM>  >. Pharmakokinetische Studien weisen darauf hin, dass wöchentliche  Verabreichung von ungefähr 2-6 mg/kg rhuMAb-2C4 zu einer Serumkonzentration  ähnlich der von HERCEPTIN< <TM> > bei derzeitiger Dosierung führen  sollte. Die resultierende Serum-2C4-Exposition sollte in vivo-bestimmte  IC 50 stark überschreiten. 



     Eine toxikologische Studie wurde an Cynomolgus-Affen (2 Männchen  und 2 Weibchen pro Gruppe) ausgeführt. rhuMAb-2C4 wurde zu 0, 10,  50 oder 100 mg/kg zweimal pro Woche für 4 Wochen intravenös verabreicht.  Die Messungen der toxikologischen Studie umfassten Körpergewicht  (-2, -1 Wochen und danach wöchentlich); Futterkonsum (qualitativ,  täglich); physikalische Untersuchungen mit Bestimmung von Blutdruck,  Elektrokardiogramm (ECG) und Körpertemperatur (-2, -1 Wochen und  Wochen 2 und 4, 4 Stunden nach Dosierung der zweiten Dosierung der  jeweiligen Woche); Echokardiographie-Untersuchungen (nach der ersten  Dosierung in Woche 1 und dem Ende der Studie, Woche 4); klinische  Pathologie (Grundlinie und Ende der Wochen 2 und 4); Urinanalyse  (Grundlinie und Ende der Wochen 2 und 4);

   Antikörperanalyse-Probennahmen  (Grundlinie und Ende der Wochen 2 und 4), sowie Nekropsie und histopathologische  Analyse. 



   Alle Tiere in allen Gruppen überlebten bis zum Ende der Studie. Keine  signifikanten klinischen Beobachtungen oder Unterschiede zwischen  den Gruppen wurden ausgemacht. Nekropsie-Ergebnisse zeigten keine  signifikanten Abnormalitäten der Organe in allen Tieren. Bei keinem  der Tiere wurden signifikante mikroskopische Abnormalitäten in Geweben  beobachtet. Keine signifikanten Veränderungen im ECG wurden von Beginn  bis zum Abschluss der Studie beobachtet. Zusätzlich wurden keine  signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen bemerkt.   Beispiel  9   Dosisanpassung  



   Krebspatienten wurde eine erste Dosis von rhuMAb-2C4 bei einem von  fünf Dosis-Niveaus (0,05, 0,5, 2,0, 4,0 oder 10 mg/kg; 6 Patienten  pro Dosis-Niveau) verabreicht, gefolgt von einem 4-wöchigen Auswaschen.  In Woche 5 wurde den Patienten dieselbe Dosis 4 Mal wöchentlich gegeben,  gefolgt von einem weiteren 4-wöchigen Auswaschen. Patienten mit vollständigem  Ansprechen, teilweisem Ansprechen und stabiler Krankheit kommen für  Erweiterungsstudien infrage.   Beispiel 10       Therapie  von rezidiv oder refraktär matastasischem Prostatakrebs  



   RhuMAb-2C4 ist ein humanisierter, monoklonaler Volllängen-Antikörper  (produziert in CHO-Zellen) gegen ErbB2. RhuMAb-2C4 blockiert die  Assoziierung von ErbB2 mit anderen Mitgliedern der ErbB-Familie und  inhibiert so die intrazelluläre Signalisierung über den ErbB-Stoffwechselweg.  Im Gegensatz zu HERCEPTIN< <TM> >, inhibiert rhuMAb-2C4 nicht nur  das Wachstum von ErbB2-überexprimierenden Tumoren, sondern blockiert  auch das Wachstum von Tumoren, die ErbB-Liganden-abhängige Signalisierung  erfordern. 



   RhuMAb-2C4 ist als ein einzelnes Mittel für die Behandlung von Hormon-refraktären  (Androgen-unabhängigen) Prostatakrebs-Patienten indiziert. Primäre  Endpunkte der Effizienz umfassen Gesamt-Überleben im Vergleich zur  bestmöglichen Behandlung (Mitoxanthron/Prednison), wenn als Einzelmittel  verwendet, und Sicherheit. Sekundäre Effizienz-Endpunkte umfassen:  Zeit zur Krankheitsfortschreitung, Ansprechrate, Lebensqualität,  Schmerz und/oder Dauer der Reaktion. RhuMAb-2C4 wird intravenös (IV)  wöchentlich oder alle drei Wochen mit 2 bzw. 4 mg/kg bis zur Krankheits-Progression  verabreicht. Der Antikörper wird als eine flüssige Multi-Dosis Formulierung  (20 ml-Füllung mit einer Endkonzentration von 20 mg/ml oder höherer  Konzentration) bereitgestellt. 



   RhuMAb-2C4 ist auch indiziert in Kombination mit Chemotherapie zur  Behandlung von Hormon-refraktären (Androgen-unabhängigen) Prostatakrebs-Patienten.  Primäre Endpunkte für Effizienz umfassen Gesamt-Überleben im Vergleich  mit Chemotherapie, und Sicherheit. Sekundäre Effizienz-Endpunkte  umfassen: Zeit bis zum Fortschreiten der Krankheit, Ansprechrate,  Lebensqualität, Schmerz und/oder Dauer der Reaktion. Rhu-MAb-2C4  wird intravenös (IV) wöchentlich oder alle drei Wochen mit 2 bzw.  4 mg/kg bis zur Krankheits-Progression verabreicht. Der Antikörper  wird als eine flüssige Multi-   Dosis Formulierung (20 ml-Füllung  mit einer Endkonzentration von 20 mg/ml oder höherer Konzentration)  bereitgestellt. 



   Beispiele für Medikamente, die mit dem Anti-ErbB2-Antikörper (der  die Liganden-Aktivierung des ErbB2-Rezeptors blockiert) kombiniert  werden können, um Prostatakrebs (z.B. Androgen-unabhängigen Prostatakrebs)  zu behandeln, umfassen einen Farnesyl-Transferase-Inhibitor; ein  Anti-Angiogenese-Mittel (z.B. ein Anti-VEGF-Antikörper); ein EGFR-Target-Medikament  (z.B. C225 oder ZDI1839); ein weiterer Anti-ErbB2-Antikörper (z.B.  ein wachstumshemmender Anti-ErbB2-Antikörper, wie z.B. HERCEPTIN<  <TM> > oder ein Anti-ErbB2-Antikörper, der Apoptose induziert, wie  z.B. 7C2 oder 7F3, einschliesslich humanisierte und/oder affinitätsgereifte  Varianten davon); ein Cytokin (z.B. IL-2, IL-12, G-CSF oder GM-CSF);  ein Anti-Androgen (wie z.B. Flutamid oder Cyproteron-Acetat); Leuprolid;  Suramin; ein chemotherapeutisches Mittel, wie z.B.

   Vinblastin, Estramustin,  Mitoxanthron, Liarozol (ein Retinolsäure-Metabolismus-blockierendes  Mittel), Cyclophosphamid, Anthracyclin-Antibiotika, wie z.B. Doxorubicin,  ein Taxan (z.B. Paclitaxel oder Docetaxel), oder Methotrexat oder  jede andere Kombination von obigem, wie z.B. Vinblastin/Estramustin  oder Cyclophosphamid/Doxorubicin/Methotrexat; Prednison; Hydrocortison  oder eine Kombination davon. Standard-Dosierungen für diese verschiedenen  Medikamente können verabreicht werden, z.B. 40 mg/m<2>/Woche Docetaxel  (TAXOTERE< <TM> >); 6(AUC)-Carboplatin und 200 mg m<2> Paclitaxel  (TAXOL< <TM> >).   Beispiel 11     Therapie vom metastasischem  Brustkrebs  



   RhuMAb-2C4 ist indiziert als Einzelmittel zur Behandlung von Patienten  mit metastasischem Brustkrebs, deren Tumoren kein ErbB2 überexprimieren.  Primäre Endpunkte für Effizienz umfassen Ansprechrate und Sicherheit.  Sekundäre Effizienz-Endpunkte umfassen: Gesamt-Überleben, Zeit zur  Krankheitsfortschreitung, Lebensqualität und/oder Dauer der Ansprechreaktion.  RhuMAb-2C4 wird intravenös (IV) wöchentlich oder alle drei Wochen  mit 2 bzw. 4 mg/kg bis zur Krankheits-Progression verabreicht. Der  Antikörper    wird als eine flüssige Multi-Dosis Formulierung (20  ml-Füllung mit einer Endkonzentration von 20 mg/ml oder höherer Konzentration)  bereitgestellt. 



   RhuMAb-2C4 ist auch indiziert in Kombination mit Chemotherapie zur  Behandlung von Patienten mit metastasischem Brustkrebs, deren Tumoren  ErbB2 nicht überexprimieren. Primäre Endpunkte für Effizienz umfassen  Gesamt-Überleben im Vergleich mit Chemotherapie alleine, und Sicherheit.  Sekundäre Effizienz-Endpunkte umfassen: Zeit bis zum Fortschreiten  der Krankheit, Ansprechrate, Lebensqualität und/oder Dauer der Ansprechreaktion.  RhuMAb-2C4 wird intravenös (IV) wöchentlich oder alle drei Wochen  mit 2 bzw. 4 mg/kg bis zur Krankheits-Progression verabreicht. Der  Antikörper wird als flüssige Multi-Dosis Formulierung (20 ml-Füllung  mit einer Endkonzentration von 20 mg/ml oder höherer Konzentration)  bereitgestellt. 



   Beispiele für Medikamente, die mit dem Anti-ErbB2-Antikörper (der  die Liganden-Aktivierung des ErbB2-Rezeptors blockiert) kombiniert  werden können, um Brustkrebs (z.B. metastasischen Brustkrebs, der  nicht durch ErbB2-Überexpression charakterisiert ist) zu behandeln,  umfassen chemotherapeutische Mittel, wie z.B. Anthracyclin-Antibiotika  (z.B. Doxorubicin), Cyclophosphamid, ein Taxan (z.B. Paclitaxel oder  Docetaxel), Navelbin, Xeloda, Mitomycin C, eine Platinverbindung,  Oxaliplatin, Gemcitabin oder Kombinationen von zwei oder mehreren  dieser, wie z.B. Doxorubicin/Cyclophosphamid; einen weiteren Anti-ErbB2-Antikörper  (z.B. ein wachstumshemmender Anti-ErbB2-Antikörper, wie z.B.

   HERCEPTIN<  <TM> > oder ein Anti-ErbB2-Antikörper, der Apoptose induziert, wie  z.B. 7C2 oder 7F3, einschliesslich humanisierte und/oder affinitätsgereifte  Varianten davon); ein Anti-Östrogen (z.B. Tamoxifen); einen Farnesyltransferase-Inhibitor;  ein Anti-Angiogenese-Mittel (z.B. einen Anti-VEGF-Antikörper); ein  EGFR-Target-Medikament (z.B. C225 oder ZDI1839); ein Cytokin (z.B.  IL-2, IL-12, G-CSF oder GM-CSF) oder Kombinationen von obigem. Standard-Dosierungen  können für solche Medikamente verwendet werden. 



     RhuMAb-2C4 ist zusätzlich indiziert in Kombination mit HERCEPTIN<  <TM> > zur Behandlung von Patienten mit metastasischem Brustkrebs,  deren Tumoren ErbB2 überexprimieren. Primäre Endpunkte für Effizienz  umfassen Ansprechrate und Sicherheit. Sekundäre Effizienz-Endpunkte  umfassen: Zeit bis zum Fortschreiten der Krankheit, Gesamt-Überleben  im Vergleich mit HERCEPTIN< <TM> > alleine, Lebensqualität und/oder  Dauer der Ansprechreaktion. RhuMAb-2C4 wird intravenös (IV) wöchentlich  oder alle drei Wochen mit 2 bzw. 4 mg/kg bis zur Krankheits-Progression  verabreicht. Der Antikörper wird als flüssige Multi-Dosis Formulierung  (20 ml-Füllung mit einer Endkonzentration von 20 mg/ml oder höherer  Konzentration) bereitgestellt. HERCEPTIN< <TM> > wird verabreicht  IV in einer Initial-Belastungsdosis von 4 mg/kg, gefolgt von einer  wöchentlichen Erhaltungsdosis von 2 mg/kg.

   HERCEPTIN< <TM> > wird  als lyophilisiertes Pulver bereitgestellt. Jedes HERCEPTIN< <TM>  >-Fläschchen enthält 440 mg HERCEPTIN< <TM> >, 9,9 mg L-Histidin-HCI,  6,4 mg L-Histidin, 400 mg  alpha - alpha -Trehalose-Dihydrat und  1,8 mg Polysorbat 20. Rekonstitution mit 20 ml bakteriostatischem  Wasser (BWFI), enthaltend 1,1% Benzylalkohol als Konservierungsmittel,  ergibt 21 ml einer Multi-Dosis-Lösung, enthaltend 21 mg/ml HERCEPTIN<  <TM> > bei ungefähr pH 6,0.   Beispiel 12     Therapie  von Lungenkrebs  



   RhuMAb-2C4 ist indiziert als Einzelmittel zur Behandlung von Stadium-Illb  oder -IV von nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC). Primäre Endpunkte  für Effizienz umfassen Ansprechrate und Sicherheit. Sekundäre Effizienz-Endpunkte  umfassen: Gesamt-Überleben, Zeit bis zum Fortschreiten der Krankheit,  Lebensqualität und/oder Dauer der Ansprechreaktion. RhuMAb-2C4 wird  intravenös (IV) wöchentlich oder alle drei Wochen mit 2 bzw. 4 mg/kg  bis zur Krankheits-Progression verabreicht. Der Antikörper wird als  flüssige Multi-Dosis Formulierung (20 ml-Füllung mit einer Endkonzentration  von 20 mg/ml oder höherer Konzentration) bereitgestellt. 



     RhuMAb-2C4 ist auch indiziert in Kombination mit Chemotherapie  zur Behandlung von Patienten mit metastasischem nicht-kleinzelligem  Lungenkrebs. Primäre Endpunkte für Effizienz umfassen Gesamt-Überleben  im Vergleich mit Standardtherapie und Sicherheit. Sekundäre Effizienz-Endpunkte  umfassen: Zeit bis zum Fortschreiten der Krankheit, Ansprechrate,  Lebensqualität und/oder Dauer der Ansprechreaktion. RhuMAb-2C4 wird  intravenös (IV) wöchentlich oder alle drei Wochen mit 2 bzw. 4 mg/kg  bis zur Krankheits-Progression verabreicht. Der Antikörper wird als  flüssige Multi-Dosis Formulierung (20 ml-Füllung mit einer Endkonzentration  von 20 mg/ml oder höherer Konzentration) bereitgestellt. 



  * Bespiele für zusätzliche Medikamente, die mit dem Antikörper (der  ErbB2 bindet und Liganden-Aktivierung eines ErbB-Rezeptors blockiert)  kombiniert werden können, um Lungenkrebs zu behandeln umfassen chemotherapeutische  Mittel, wie z.B. Carboplatin, ein Taxan (z.B. Paclitaxel oder Docetaxel),  Gemcitabin, Navelbin, Cisplatin, Oxaliplatin oder Kombinationen von  zwei oder mehreren dieser, wie z.B. Carboplatin/Docetaxel; einen  weiteren Anti-ErbB2-Antikörper (z.B. ein wachstumshemmender Anti-ErbB2-Antikörper,  wie z.B. HERCEPTIN< <TM> > oder ein Anti-ErbB2-Antikörper, der Apoptose  induziert, wie z.B. 7C2 oder 7F3, einschliesslich humanisierte und/oder  affinitätsgereifte Varianten davon); einen Farnesyl-Transferase-Inhibitor;  ein Anti-Angiogenese-Mittel (z.B. einen Anti-VEGF-Antikörper); ein  -EGFR-Target-Medikament (z.B. C225 oder ZDI1839); ein Cytokin (z.B.

    IL-2, IL-12, G-CSF oder GM-CSF) oder Kombinationen von obigem.   Beispiel 13   Therapie von Kolon-Rektum-Krebs  



   RhuMAb-2C4 ist indiziert als Einzelmittel zur Behandlung metastasischem  Kolon-Rektum-Krebs. Primäre Endpunkte für Effizienz umfassen Ansprechrate  und Sicherheit. Sekundäre Effizienz-Endpunkte umfassen: Gesamt-Überleben,  Zeit bis zum Fortschreiten der Krankheit, Lebensqualität und/oder  Dauer der Ansprechreaktion. RhuMAb-2C4 wird intravenös (IV) wöchentlich  oder alle drei Wochen mit 2 bzw. 4 mg/kg bis zur Krank   heits-Progression  verabreicht. Der Antikörper wird als flüssige Multi-Dosis-Formulierung  (20 ml-Füllung mit einer Endkonzentration von 20 mg/ml oder höherer  Konzentration) bereitgestellt. 



   RhuMAb-2C4 ist auch indiziert in Kombination mit Chemotherapie zur  Behandlung von Patienten mit metastasischem Kolon-Rektum-Krebs. Primäre  Endpunkte für Effizienz umfassen Gesamt-Überleben im Vergleich mit  Standardtherapie, und Sicherheit. Sekundäre Effizienz-Endpunkte umfassen:  Zeit bis zum Fortschreiten der Krankheit, Ansprechrate, Lebensqualität  und/oder Dauer der Ansprechreaktion. RhuMAb-2C4 wird intravenös (IV)  wöchentlich oder alle drei Wochen mit 2 bzw. 4 mg/kg bis zur Krankheits-Progression  verabreicht. Der Antikörper wird als flüssige Multi-Dosis Formulierung  (20 ml-Füllung mit einer Endkonzentration von 20 mg/ml oder höherer  Konzentration) bereitgestellt. 



   Bespiele für zur Behandlung von Kolon-Rektum-Krebs verwendeten Chemotherapeutika,  die mit dem Antikörper, der ErbB2 bindet und Liganden-Aktivierung  eines ErbB-Rezeptors blockiert, kombiniert werden können, umfassen  5-Fluoruracil (5-FU), Leucovorin (LV), CPT-11, Levamisol oder Kombinationen  von zwei oder mehreren dieser, wie z.B. 5-FU/LV/CPT-11. Standard-Dosierungen  solcher Chemotherapeutika können verabreicht werden. Andere Medikamente,  die mit dem Anti-ErbB2-Antikörper kombiniert werden können, um Kolon-Rektum-Krebs  zu behandeln, umfassen einen Famesyl-Transferase-Inhibitor; ein Anti-Angiogenese-Mittel  (z.B. einen Anti-VEGF-Antikörper); ein EGFR-Target-Medikament (z.B.  C225 oder ZDI1839); ein Cytokin (z.B. IL-2, IL-12, G-CSF oder GM-CSF);  einen weiteren Anti-ErbB2-Antikörper (z.B. ein wachstumshemmender  Anti-ErbB2-Antikörper, wie z.B.

   HERCEPTIN< <TM> > oder ein Anti-  ErbB2-Antikörper, der Apoptose induziert, wie z.B. 7C2 oder 7F3,  einschliesslich humanisierte und/oder äffinitätsgereifte Varianten  davon) oder Kombinationen von obigem.

Claims (68)

1. Humanisierter Antikörper, der ErbB2 bindet und die Ligandenaktivierung eines ErbB-Rezeptors blockiert.

2. Humanisierter Antikörper nach Anspruch 1, der ErbB2 im Wesentlichen so wirksam bindet wie monoklonaler Mäuse-Antikörper 2C4.

3. Humanisierter Antikörper nach Anspruch 1, umfassend eine variable schwere(V H -) Domäne, die Reste einer nicht-humanen hypervariablen Region umfasst, die in eine humane V H -Domäne aufgenommen sind, und weiters eine Rahmenregion (FR-) Substitution an einer Position umfasst, die aus der aus 69H, 71H und 73H gemäss dem von Kabat (1991) beschriebenen Nummerierungssystem, bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

4. Humanisierter Antikörper nach Anspruch 3, umfassend FR-Substitutionen an den Positionen 69H, 71H und 73H.

5.

Humanisierter Antikörper nach Anspruch 1, umfassend die Komplementaritäts-Bestimmungs-Region-(CDR-)Reste GFTFTDYTMX (Seq.-ID Nr. 7), DVNPNSGGSIYNQRFKG (Seq.-ID Nr. 8) und NLGPSFYFDY (Seq.-ID Nr. 9) der V H -Domäne.

6. Humanisierter Antikörper nach Anspruch 1, umfassend die V H -Domänen-Aminosäuresequenz mit Seq.-ID Nr. 4.

7. Humanisierter Antikörper nach Anspruch 1, umfassend die Komplementaritäts-Bestimmungs-Region-(CDR-)Reste KASQDVSIGVA (Seq.-ID Nr. 10); SASYXXX (Seq.-ID Nr. 11); und QQYYIYPYT (Seq.-ID Nr. 12) der variablen leichten (V L -) Domäne.

8. Humanisierter Antikörper nach Anspruch 46, umfassend die V L -Domänen-Aminosäuresequenz mit Seq.-ID Nr. 3.

9. Humanisierter Antikörper nach Anspruch 1, der ein intakter lgG1-Antikörper ist.

10. Humanisierter Antikörper nach Anspruch 1, der ein Antikörperfragment ist.

11.

Humanisierter Antikörper nach Anspruch 10, der ein Fab-Fragment ist.

12. Humanisierter Antikörper nach Anspruch 1, der affinitätsgereinigt ist.

13. Antikörper nach Anspruch 1 bis 12, der an ein nicht-proteinartiges Polymer gebunden ist.

14. Antikörper nach Anspruch 13, worin das nicht-proteinartige Polymer Polyethylenglykol ist.

15. Zusammensetzung, umfassend einen humanisierten Antikörper nach Anspruch 1, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.

16. Immunkonjugat, umfassend einen humanisierten Antikörper nach Anspruch 1, konjugiert mit -einem cytotoxischen Mittel.

17. Isolierte Nukleinsäure, die für einen humanisierten Antikörper nach Anspruch 1, kodiert.

18. Vektor, der eine Nukleinsäure nach Anspruch 17, umfasst.

19. Wirtszelle, die einen Vektor nach Anspruch 18, umfasst.

20.

Wirtszelle nach Anspruch 19, die eine Säugetierzelle ist.

21. Wirtszelle nach Anspruch 20, die eine China-Hamster-Eierstock-(CHO-)Zelle ist.

22. Wirtszelle nach Anspruch 20, die eine prokaryotische Zelle ist.

23. Wirtszelle nach Anspruch 22, die ein E.coli-Zelle ist.

24. Gefertigtes Produkt, umfassend einen Behälter und eine darin enthaltene Zusammensetzung, worin die Zusammensetzung einen Antikörper nach Anspruch 1 umfasst, und das weiters eine Packungsbeilage umfasst, die angibt, dass die Zusammensetzung zur Behandlung von Krebs verwendet werden kann, der Epidermis-Wachstumsfaktor (EGFR) exprimiert.

25.

Gefertigtes Produkt, umfassend einen Behälter und eine darin enthaltene Zusammensetzung, worin die Zusammensetzung einen Antikörper nach Anspruch 1, umfasst und das weiters eine Packungsbeilage umfasst, die angibt, dass die Zusammensetzung zur Behandlung von Krebs verwendet werden kann, worin der Krebs nicht durch die Überexpression des ErbB2-Rezeptors gekennzeichnet ist.

26. Gefertigtes Produkt, umfassend (a) einen ersten Behälter mit einer darin enthaltenen Zusammensetzung, worin die Zusammensetzung einen ersten Antikörper umfasst, der ErbB2 bindet und das Wachstum von Krebszellen hemmt, die ErbB2 überexprimieren; und (b) einen zweiten Behälter mit einer darin enthaltenen Zusammensetzung, worin die Zusammensetzung einen zweiten Antikörper nach Anspruch 1, umfasst.

27.

Gefertigtes Produkt nach Anspruch 26, weiters umfassend eine Packungsbeilage, die angibt, dass die erste und die zweite Antikörperzusammensetzung zur Behandlung von Krebs verwendet werden können.

28. Gefertigtes Produkt, umfassend einen Behälter und eine darin enthaltene Zusammensetzung, worin die Zusammensetzung einen Antikörper nach Anspruch 1 umfasst und weiters umfassend eine Packungsbeilage, die angibt, dass die Zusammensetzung zur Behandlung von Krebs verwendet werden kann, der aus der aus Kolon-, Rektal- und Kolorektalkrebs bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

29. Verfahren zur Herstellung eines humanisierten Antikörpers, umfassend das Kultivieren der Wirtszelle nach Anspruch 19, so dass die Nukleinsäure exprimiert wird.

30.

Verfahren nach Anspruch 29, weiters umfassend das Gewinnen des humanisierten Antikörpers aus der Wirtszellenkultur.

31. Verfahren nach Anspruche 30, worin der humanisierter Antikörper aus dem Wirtszellen-Kulturmedium gewonnen wird.

32. Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 1, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs bei einem Menschen, worin der Krebs Epidermis-Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) exprimiert.

33. Verwendung nach Anspruch 32, worin der Antikörper die Bindung von monoklonalem Antikörper 2C4 an ErbB2 blockiert.

34. Verwendung nach Anspruch 32, worin der Krebs durch übermässige Aktivierung von EGFR gekennzeichnet ist.

35. Verwendung nach Anspruch 34, worin der Krebs einen ErbB-Liganden überexprimiert.

36.

Verwendung nach Anspruch 35, worin der ErbB-Ligand transformierender Wachstumsfaktor Alpha (TGF- alpha ) ist.

37. Verwendung nach Anspruch 32, worin der Antikörper die TGF- alpha -Aktivierung von Mitogen-aktivierter Protein-Kinase (MAPK) blockiert.

38. Verwendung nach Anspruch 32, worin der Krebs nicht durch Überexpression von ErbB2-Rezeptor gekennzeichnet ist.

39. Verwendung nach Anspruch 32, worin der Krebs aus der aus Kolon-, Rektal- und Kolorektal-Krebs bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

40. Verwendung nach Anspruch 39, worin das Medikament zur Verabreichung mit einem Chemotherapeutikum bestimmt ist.

41. Verwendung nach Anspruch 40, worin das Chemotherapeutikum aus der aus 5-Fluoruracil (5-FU), Leucovorin (LV), CPT-11 und Levamisol bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

42. Verwendung nach Anspruch 32, worin der Krebs Lungenkrebs ist.

43. Verwendung nach Anspruch 42, worin der Krebs ein nicht-kleinzeiliger Lungenkrebs ist.

44. Verwendung nach Anspruch 42, worin das Medikament zur Verabreichung mit einem Chemotherapeutikum bestimmt ist.

45. Verwendung nach Anspruch 44, worin das Chemotherapeutikum aus der aus einem Taxan, Gemcitabin, Navelbin, Cisplatin, Oxaliplatin und Carboplatin bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

46. Verwendung nach Anspruch 32, worin der Antikörper ein biologisches Merkmal von monoklonalem Antikörper 2C4 aufweist.

47. Verwendung nach Anspruch 46, worin der Antikörper monoklonalen Antikörper 2C4 oder humanisierten 2C4 umfasst.

48. Verwendung nach Anspruch 32, worin der Antikörper ein Antikörperfragment ist.

49. Verwendung nach Anspruch 48, worin das Antikörperfragment ein Fab-Fragment ist.

50.

Verwendung nach Anspruch 39, worin der Antikörper nicht mit einem cytotoxischen Mittel konjugiert ist.

51. Verwendung nach Anspruch 48, worin das Antikörperfragment nicht mit einem cytotoxischen Mittel konjugiert ist.

52. Verwendung nach Anspruch 39, worin der Antikörper mit einem cytotoxischen Mittel konjugiert ist.

53. Verwendung nach Anspruch 32, worin das Medikament zur Verabreichung mit einer therapeutisch wirksamen Menge eines zweiten Therapeutikums an den Menschen bestimmt ist, das aus der aus einem zweiten, unterschiedlichen Antikörper, der ErbB2 bindet, einem Chemotherapeutikum, einem EGFR-Target-Arzneimittel, einem Anti-Angiogenese-Mittel, einer anti-hormonellen Verbindung, einem Cardioprotektanten und einem Cytokin bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

54.

Verwendung nach Anspruch 32, worin das Medikament zur Verabreichung zumindest einer Dosis des Antikörpers in einer Menge von etwa 0,5 mg/kg bis etwa 10 mg/kg an den Menschen bestimmt ist.

55. Verwendung nach Anspruch 54, worin das Medikament zur Verabreichung der Dosis etwa einmal pro Woche bestimmt ist.

56. Verwendung nach Anspruch 54, worin das Medikament zur Verabreichung der Dosis etwa alle drei Wochen bestimmt ist.

57. Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 1, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs bei einem Menschen, worin der Krebs nicht durch die Überexpression des ErbB2-Rezeptors gekennzeichnet ist.

58. Verwendung nach Anspruch 57, worin der Krebs Brustkrebs ist.

59. Verwendung nach Anspruch 58, worin der Krebs metastatischer Brustkrebs ist.

60.

Verwendung nach Anspruch 58, worin das Medikament zur Verabreichung mit einem Chemotherapeutikum an den Menschen bestimmt ist.

61. Verwendung nach Anspruch 60, worin das Chemotherapeutikum aus der aus einem Anthracyclin-Antibiotikum, Cyclophosphomid, einem Taxan, Navelbin, Xeloda, Mitomycin C, Oxaliplatin, Gemcitabin und einer Platinverbindüng bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

62. Verwendung (a) eines ersten Antikörpers, der ErbB2 bindet und das Wachstum von Krebszellen hemmt, die ErbB2 überexprimieren; und (b) eines zweiten Antikörper nach Anspruch 1, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs bei einem Menschen.

63. Verwendung nach Anspruch 62, worin der erste Antikörper monoklonalen Antikörper 4D5 oder humanisierten 4D5 umfasst und der zweite Antikörper monoklonalen Antikörper 2C4 oder humanisierten 2C4 umfasst.

64.

Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 1, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs bei einem Menschen, worin der Krebs aus der aus Kolon-, Rektal- und Kolorektalkrebs bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

65. Verwendung nach Anspruch 53, worin das zweite Therapeutikum ein EGFR-Target-Arzneimittel ist.

66. Verwendung nach Anspruch 65, worin das EGFR-Target-Arzneimittel ZD1839, CP-358774 oder AG1478 ist.

67. Verwendung nach Anspruch 65, worin das EGFR-Target-Arzneimittel ein Antikörper ist, der EGFR bindet.

68. Verwendung nach Anspruch 67, worin der Antikörper, der EGFR bindet, C225 oder H225 ist.