PT616812E

PT616812E - Combinacao de compostos anti-hormonais e moleculas de ligacao no tratamento do cancro

Info

Publication number: PT616812E
Application number: PT93250090T
Authority: PT
Inventors: Beatrice C Langton
Original assignee: Berlex Biosciences
Priority date: 1993-03-24
Filing date: 1993-03-24
Publication date: 2000-04-28
Also published as: GR3032511T3; DE69326937D1; ATE186219T1; ES2141128T3; EP0616812A1; DE69326937T2; EP0616812B1; DK0616812T3

Description

1 Λ tf

DESCRICÃO “COMBINAÇÃO DE COMPOSTOS ANTI-HORMONAIS E MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO NO TRATAMENTO DO CANCRO” A invenção diz respeito a compostos anti-hormonais que são usados em combinação com um outro composto, tipo anticorpos anti-c-erb B-2 (moléculas de ligação). Além disso, a invenção refere-se à utilização da combinação do composto anti-hormonal com um segundo composto na produção de um medicamento para o tratamento do cancro. A invenção também se refere ao processo de produção da combinação. A invenção também se refere ao processo de administração da combinação.

Dados anteriores

Caracterizaram-se vários tumores como tumores que respondem a terapias anti-hormonais, entre eles os da mama, ovário e próstata. A terapia anti-hormonal teve sucesso em muitos pacientes, no entanto como são citoestáticos (isto é, inibem o crescimento) em vez de citotóxicos têm de ser administrados aos pacientes durante longos períodos de tempo.

Os oncogéneos e os seus produtos parecem estar ligados à transformação das células em malignas. Múitos dos oncogéneos até hoje identificados têm propriedades de receptores da superfície das células do factor de crescimento. As cinases da tirosina como o receptor do factor de. crescimento epidérmico (EGFr) e c-erb B-2 são dois exemplos bem conhecidos.

Como muitos destas proteínas oncogénicas estão presentes na superfície de algumas células normais, a amplificação do oncogéneo ou a expressão em excesso do produto proteico estão correlacionadas com fenótipos tumorgénicos. De facto, a amplificação do oncogéneo c-erb B-2 indica um prognóstico clínico muito pobre, em especial no que diz respeito ao cancro da

mama e do ovário (Slamon et al. (1987) Science 235: 177; Slamon et al. (1989) Science 244: 707). Não se conhecem bem os papeis quer das hormonas quer dos factõres de crescimento no desenvolvimento e persistência do cancro. A literatura científica descreve teorias e resultados contraditórios. Vários estudos realizados sobre a relação entre as hormonas e o putativo receptor do factor de crescimento c-erb B-2 indicaram uma relação inversa entre a presença de receptores hormonais e expressão do c-erb B-2 nas células de tumores. (Ver por exemplo Beckmann et al. (1992) Europeàn Journal of Câncer 28:322-326; Berns et al. (1992) European Journal of Câncer 28:697-700). Mizukami et al. testaram o efeito das hormonas e dos antagonistas das hormonas na expressão da proteína c-erb B-2 nas células de tumor da linha MCF-7 (que expressam baixos níveis da proteína c-erb B-2) num ensaio in vivo em ratos. Um antagonista da progesterona (acetato de medroxiprogesterona) e um antagonista do estrogénio (tamoxifen) reduziram ambos os níveis da proteína c-erb B-2 e diminuíram a taxa de crescimento celular enquanto que o tratamento com estrogénio aumentou os níveis de c-erb B-2e estimulou o crescimento celular. (Mizukami et al (1991) Anticancer Research, 11: 1333-1338). Antoniotti et al., obteve os resultados contrários. O tratamento com estrogénio diminuiu o nível de proteína c-erb B-2 e aumentou a taxa de crescimento em células T47D e ZR-75-1, enquanto que o tamoxifen aumentou o nível de proteína expressa enquanto que diminuiu a taxa de crescimento das células. (Antoniotti et al. (1992) European Journal of câncer 28: 318-321).

Foram feitos vários estudos sobre o papel dos factõres de crescimento e dos receptores dos factõres de crescimento no desenvolvimento do crescimento de tumores independente de hormonas. Van Agthoven et al., por exemplo, transfectaram células de cancro da mama ZR-75-1 dependente do estrogénio com o receptor para o factor de crescimento epidérmico. O tratamento prolongado destas células com tamoxifen teve como resultado a perda do receptor do estrogénio e as células ficaram independentes do estrogénio para o seu crescimento (van Agthoven et al., (1992) Câncer Research 52: 5082-5088). Valverius et al., no entanto, não conseguiram tomar as células independentes da hormona usando a mesma técnica. (Valverius et al., (1990) International Journal of Câncer 46: 712-718).

Na prática clínica, muitos tumores tornam-se resistentes às acções de supressão do crescimento dos compostos anti- hormonais. Ver, por exemplo, Piak et al. (1986) Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 83: 5521; Benz et al. (1991) Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 32:211. A utilização de compostos anti- hormonais durantes grandes períodos de tempo também está associado a um aumento do risco d edesenvolvimento de um segundo tipo de tumor. Por exemplo, a utilização a longo prazo do anti- estrogénio tamoxifen está associado com um aumento do risco de desenvolvimento de carcinoma endométrico. (Gurpide, E. (1991) Journal of de National Câncer Institute 83: 405-416).

Objectivo da Invenção O objectivo desta invneção é providenciar uma combinação de um composto anti- hormonal e outros compostos dè modo a aumentar a eficácia do tratamento com os compostos anti- hormonais.

Solução do Problema O problema da invenção é resolvido por uma combinação que consiste em: a) pelo menos um composto anti- hormonal e. b) uma molécula de ligação ou moléculas de ligação que se liguem especificamente à proteína codificada pelo oncogéneo c-erb B-2, em que a molécula ou moléculas de ligação induzem a inibição da proliferação das células do tumor.

Vantagens da Invenção

Esta combinação é surpreendente. Manni et al. trataram células com tamoxifen ou com o factor de crescimento TGF-β. Ambos os compostos usados por si só 4

suprimiram o crescimento celular mas não usados em combinação. (Manni et aI. (1991) Breast Câncer Research and Treatment 20: 43-52). Arteaga et al., descreveram a utilização sequencial de um composto hormonal e de uma molécula de ligação. Em rpimeiro lugar pré-trataram três linhas de células tumorais diferents com um agente anti- hormonal (tamoxifen) e depois subsequentemente com estrogénio na presença ou ausência de anticorpo em ligação ao receptor EGF. (Arteaga et al. (1988) Molecular Endocrinology 2: 1064-1069). A adição do anticorpo depois do pré-tratamento com o tamoxifen não inibiu o crescimento das células tratadas. O tamoxifen é um anti-estrogénio trepeniletileno particularmente útil no tratamento do cancro da mama. Já se testou clinicamente a combinação do tamoxifen com agentes citotóxicos, como por exemplo, agentes de alquilação sem se obter quaisquer benefícios. (Ver por exemplo Fischer et al. (1986) Journal of Clinicai Oncology 4: 459-471). Obtiveram-se resultados semelhantes quando se combinou o tamoxifen com um agente redutor da prolactina, um estimulador natural do crescimento das células da mama (Bonneterre et al. (1990) Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 37:977-981). Alguns estudos realizados em ensaios em cultura de células in vitro sugerem que o tratamento com tamoxifem pode mesmo proteger as células de tumores dos efeitos do tratamento de outros agentes anti-neoplásticos (Ver por exemplo, Clarke et al. (1986) Câncer Research 46: 6116-6119). O uso combinado de uma molécula de ligação ao factor de crescimento e um composto citotóxico já foi descrito (Aboud-Pirak et al.. (1988) J. Nat: Can. Inst: 80: 1605-1611; W089/06692, publicada a 27-03-1989 porGenentech Inc.). Os compostos citotóxicos actuam envenenando as células que se reproduzem rapidamente, que é um mecanismo bastante diferente que o dos compostos anti-hormonais aqui apresentados. O efeito sinergético da combinação recém -descrita é de particular importância. 5

Definição de algumas expressões Grupo de compostos anti-hormonais:

Os compostosanti-hormonais compreendem os compostos anti-estrogénio, o grupo de compostos anti-progesterona ou composots anti-androgéneos. Estes composots são usados no tratamento de cancros dependentes de hormonas.

Definição de moléculas de ligação:

As moléculas de ligação são específicas para a proteína c-erb B-2. estes compostos são capazes de se ligar e afectar, de preferência suprimir o crescimento de células de tumores que expressam a proteína c-erb B-2 na sua superfície. Estes efeitos podem ser medidos por métodos descritos nos Exemplos. As moléculas de ligação podem ser, por exemplo, um anticorpo ou um seu fragmento, um petpideo (sintético, natural ou recombinante), um composto peptidomimético ou um peptideo que corresponda à região variável de uma cadeia leve ou pesada de um anticorpo ou de um peptideo correspondente á uma cadeia simples que compreende a região variável leve e pesada de um anticorpo ligada por um espaçador por exemplo glicina e serina. Um exemplo de um método para sintetizar peptideos encontra-se em Pike (1987) Methods in Enzimology, 146: 353.

Em qualquer caso podem-se usar antocorpos de ratos ou outros não humanos, humanos ou quiméricos. Os anticorpos podem ser preparados a partir de uma grande variedade de métodos conhecidos nesta técnica, dependendo se se desejam anticorpos monoclonais ou policlonais. Os métodos adequados para preparar anticorpos monoclonais encontram-se descritos no Handbook of Experimental Immunology (1978) 3d ed., Weir (ed.), Blackwell Scientific Publications. O processo para obter anticorpos monoclonais encontra-se descrito por Kõhler e Milstein, (1975) Nature, 256: 495-497.

As moléculas de ligação são particularmente úteis para dar especificidade à proteína c-erb B-2. Por exemplo, as moléculas de ligação preferidas são anticorpos monoclonais quiméricos BACh 250 que consitem em regiões ι ·.

variáveis de rato e regiões constantes humanas. A produção de tais anticorpos quiméricos está descrita na publicação da EP-Publication 0120 694 de Celltech · em 23 Março de 1984. O anticorpoBACh 250 é feito usando o método descrito por Beidler et al. (1988) Journal of Immunology 141: 4053. O anticorpo BACh 250 é feito retirando a região variável do anticorpo Tab 250 que é construído de um modo similar à técnica apresentada naaplicação internacional com a publicação n°: WO 91/02062. Em ensaios de ligação competitiva BACh 250 é capaz de competir com o Tab 250 e no entanto é bastante parecido com o Tab 250. além disso, o BACh 250 inibe a proliferação de células de tumores que expressam a proteína c-erb B-2.

Pode-se usar usar uma grande variedade de materiais antigénicos para gerar anticorpos apropriados, incluindo células transfectadas, proteínas purificadas ou fragmentos seus. O antigénio pode ser preparado por sintese de proteínas ou DNA recombinante, dependendo do comprimento da sequência de amoniácidos que se deseje para o antigénio. Também se podem usar células NIH3T3 ou células SKBR3 transfectadas ou outras células que expressem a proteína c-erb B-2 em excesso, a célula inteira ou as membranas das células, para produzir antigénios.

Existem várias técnicas bem definidas para identificar anticorpos com a especificidade desejada, como a sua capacidade para corar células de tumores por via histoquímica, para reagir com células de tumores identificadas por separador de células activado por fluorescência (FACS), ou para reagir com o produto do gene oncogéneo purificado quer em radioimunoprecipitação (RIP) ou em Western blot.

Também se pode usar uma mistura de moléculas de ligação a receptores espcíficos nesta combinação para potenciar o efeito da combinação da droga sinergética.

Definição da proteína c-erb B-2: A proteína c-erb B-2 (também referida como receptor da proteína c-erb B-2) é uma glicoproteína de 185 kDalton com actividade de cinase da tirosina e está relacionado, mas é diferente, com o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFr). A sequência de aminoácidos da proteína c-erb B-2, tal como a sequência de nucleótidos, foi descrita por Coussens et al. (1985) Science 230:1132. A detecção dá presença da proteína c-erb B-2 pode ser conseguida por métodos imunológicos bem conhecidos utilizando anticorpos específicos para a proteína c-erb B-2. Estes anticorpos estão comercialmente disponíveis na Chemicon International, Inc., Temecula, CA ou podem-se conseguir por técnicas de anticorpos padrão. Pretende-se aqui que a definição de proteína c-erb B-2 também inclua as proteínas que existem em outros sistemas hospedeiros e que estejam imunologicamente relacionadas com a proteína c-erb B-2 humana. Por exemplo, um gene de rato relacionado (desigado neu) foi noticiado em Schecter et al. (1985) Science 229: 976. No entanto, o anticorpo Tab 250 não tem reacção cruzada com o neu.

Definição de tumor:

Os tumores ou cancros a serem tratados com as combinaçãos desta invenção são quaisquer tumores que expressem, ou se suspeitem que expressam, o produto do gene oncogéneo c-erb B-2. Estes tumores incluem, por exemplo: mama, ovário, bexiga, próstata, e cancros gástricos. Os cancros da mama e do ovário são tratados eficazmente com as combinações aqui descritas. A proteína c-erb B-2 é expressa em: tumores sólidos por, por exemplo, Gutman et al. (1989) International Journal of Câncer 44: 802-805; em adenocarcionomas humanas por em adenocarcinomas humanos por Yokata et al. (1986) The Lancet, 5 de Abril, p. 765; nos carcinomas gástricos e esofágicos por Houldsworth et al. (1990) Câncer Research 50: 6417-6422; em cérvix, vulva e vagina neoplástico por Berchuck et al. (1990) Obstetrics and Gynecology Survey, 76: 381; em carcinoma de células renais por Weidner et r/ 8 al. (1990) Câncer Research 50: 4504; em adenocarcinomas do pulmão por Kem et al. (1990) Câncer Research 50: 5184-5191; Scheider et al. (1986) Molecular and Cellular Biology 6: 955-958 e Park et al. (1989) Câncer Research 49: 6605; em cancro da mama e do ovário por Slamon et al. (1989) Science 244: 707; Berchuck et al. (1990) Câncer Research 50: 4087; por Van de Vijver et al. (1987) Oncogene 1: 423-430 e Bacus et al. (1990) American Journal of Pathology 137:103.

Outras Formas de Realização

Preferem-se as combinações em que a molécula ou moléculas de ligação são anticorpos ou fragmentos de anticorpos. A forma de realização mais preferida é o anticorpo monoclonal quimérico BACh 250 que já foi descrito.

De preferência, o composto anti-hormonal da combinação da invenção é um composto anti-estrogénio, anti-progesterona ou anti-androgénio. Também são possíveis as misturas dos compostos anti-hormonais mencionados na ultima frase com as moléculas de ligação, porque sabe-se que nesta técnica os compostos anti-hormonais desta invenção têm um efeito aditivo ou sinergético quando são co-administrados na ausência de moléculas de ligação. Além disso, a invenção contém uma combinação de uma mistura de compostos anti-hormonais e moléculas anti-hormonais que liguem especificamente à proteína c-erb B-2 em que as moléculas de ligação inibem a proliferação das células do tumor.

Estes compostos estão descritos na publicação da EP-Publication 0 310 542 (publicada na 05.04.1989).

Compostos especiais são: (I) 11 β- [(4-N,N-dimetilamino)fenil]- 17p-hidroxi -17a-propinil-4,9(10)-estradieno-3-ona, (II) 11 β- [(4-N,N-dimetilamino)fenil]- 17p-hidroxi -18-metil- 17a-propinil-4,9(10)-estradieno-3-ona, 9 β /y\ 1 (III) 11 β- [(4-N,N-dimetilamino)fenil]- 17ap-hidroxi -17aa-propinil- D-homo-4,9(10)-16-estratrieno-3-ona, (IV) 11 β- p-metoxifenil- 17p-hidroxi -17a-etinil- -4,9(10)-estradieno-3-ona, (V) 11 β- (4-dimetilaminofenil)- 17a-hidroxi -17p-(3-hidroxipropil)- 13-metil -4,9-gonadieno-3-ona, (VI) (Z)-2-[p-(1,2-difenil-1- butenil) fenoxi]- N,N-dimetiletilamino =tamoxifen, (VII) Hidrocloreto de 1-[2-[4-(6-metoxi-2-fenil-3,4-dihidro-1-naftil) fenoxi] etil] pirrolidina =nafoxidina, (VIII) , 1-[p-(2-dietilaminoetoxi) fenil]-2-(p-metoxifenil)-1-feniletanol =Mer 25, (IX) 11a-metoxi-17a- etinil-1,3,5(10)- estratrieno-3,17p- diol, (X) 16p-etilestradiol, (XI) Ácido (N-butil-N-metil) amida 11-(3, 17p-dihidroxi-1,3,5(10)-estratrieno-7a-il) undecanoico

Outros anti-estrogénios estão descritos na European Publication EP 0 062 503 publicada em 13 Outubro 1982 e em M.M:GOTTARDIS et al. (1990) Câncer Research 50: 3189-3192.

Os compostos do grupo que tem actividade anti-androgénio são referidos na Patente US com o Número de Patente 5,053,405 do dis 1 de Outubro de 1991 na German Publication DE 31 21 152, publicada em 9 de Dezembro 1982.

Os compostos seleccionados do grupo de compostos anti-androgéneo referidos no DE-OS 31 21 152 são: (XII) 6-cloro- 17-hidroxi- 1a,2a-metilenepregna- 4,6-dieno-3,20-diona; (XIII) 6-cloro- 17-hidroxipregna- 4,6-dieno-3,20-diona; β fi ν'·. '

v10 v (XIV) 6-cloro- 17-hidroxipregna- 1,4,6-trieno-3,20-diona; (XV) 6-cloro- 3,17-dihidroxi-1a,2a-metilenepregna- 4,6-dieno-20-ona; (XVI) 6-cloro-3-metoxi- 17-dihidroxi- 1a,2a-metilenepregna- 4,6-dieno-20-ona; (XVII) 6-fluoro- 17-hidroxi- 1a,2a-metilenepregna- 4,6-dieno-3,20-diona; (XVIII) 17-hidroxi- 1a,2a-metilenepregna- 4,6-dieno-3,20-diona; (XIX) 4,6- dicloro- 17-hidroxi- 1a,2a-metilenepregna- 4,6-dieno-3,20-diona.

Os compostos preferidos são: acetato de 6-cloro- 17-hidroxi- 1a,2a-metilenepregna- 4,6-dieno-3,20-diona =acetato de ciproterona e acetato de 6-cloro- 17-hidroxipregna- 4,6-dieno-3,20-diona (acetato de clormadiona).

Os compostos seleccionados do grupo de compostos anti-androgéneo também referidos no DE-OS 31 21 152 são: (XX) 6-cloro -17ap-acetoxi- 17aa-metil- 1 a,2a-metilene- D-homo- 4,6-androstadieno-3,17-diona; (XX) 6-cloro -17a-acetoxi- 17p-metil- 1a,2a-metilene- D-homo- 4,6-androstadieno-3,17a-diona; (XXI) 2-metil-N- [4-nitro-3-(triflurometil) fenil]- propionamida flutamida; (XXII) 2-hidroxi- 2-metil-N- [4-nitro-3-(triflurometil) fenil]- propionamida e (XXIII) 2-metil-4- [4-nitro-3-(triflurometil) fenil]-5,6- dihidro-2H-1,2,4-oxadiazina-3-ona. O composto anti-estrogénio é o tamoxifen, e o anti-progesterona é a onapristona. i fi *t.p 11

Utilidade

As combinações da invenção apresentam actividade farmacológica epodem, por isso, serem usadas como farmacêuticos. Podem ser usados como agente terapêutico.

Em particular, as combinações da invenção apresentam actividade na terapia contra as linhas de células de tumores. As combinações são activas em ratos nús (nude) Balb/c nos quais se implantaram células de tumores. O método do teste e os resultados estão descritos nos exemplos 4,5 e,6. A combinação de Tab 250 e tamoxifen resulta numa inibição significativa do crescimento de tumores numa concentração de 0,1 a 10 mg de tamoxifen e 100 a 3000 pg de anticorpo monoclonal usando o método do teste em ratos nús Balb/c. Preferem-se as concentrações de 0,1 a 5 mg de tamoxifen e 100 a 1000 pg de anticorpo monoclonal. As combinações da invenção são, assim sendo, úteis no tratamento do cancro, em especial para suprimir ou inibir tumores que expressam em excesso o receptor do c-erb B-2.

Como os compostos da combinação podem ser administrados por diferentes vias, a invenção inclui uma combinação que compreende um composto ou compostos anti-hormonais e uma molécula ou moléculas de ligação na forma de uma preparação combinada para utilização simultânea, separada ou sequencial.

Assim a combinação da invenção que compreende um composto ou compostos anti-hormonais e uma molécula ou moléculas de ligação pode ser administrada como uma preparação combinada para utilização simultânea, separada ou sequencial, em que na combinação há um agente terapêutico contra tumores. A invenção fornece a) a utilização de uma combinação da invenção para a produção de um medicamento para aplicação terapêutica para o tratamento do cancro, em que o(s) composto(s) anti-hormonal e a(s) molécula(s) de ligação da invenção numa preparação combinada são utilizados simultaneamente, em separado ou sequencialmente; b) um método para o tratamento do cancro que compreende a administração de uma quantidade eficaz da combinação supressora da invenção a um paciente que necessite de tal tratamento, em que o(s) composto(s) anti-hormonal e a(s) molécula(s) de ligação da invenção numa preparação combinada são utilizados simultaneamente, em separado ou sequencialmente; c) uma combinação farmacêutica no tratamento do cancro que compreende uma combinação da invenção e um diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável.

Além disso a invenção inclui um kit que contém a combinação farmaceuticamente activa da invenção em que o o(s) composto(s) anti-hormonal e a(s) molécula(s) de ligação na forma de uma preparação combinada a serem usados simultaneamente, em separado ou sequencialmente. A dose apropriada irá, claro, variar dependendo, por exemplo, dos compostos da invenção, do hospedeiro, do modo de administração e da natureza e gravidade da condição a ser tratada. No entanto, em geral, obtêm-se resultados satisfactórios em animais ou seres humanos com doses diárias de cerca de (mAb) 0,01 a cerca de 50 mg/kg de peso corporal e (c. anti-hormonal) de cerca de 0,01 a cerca de 10 mg/kg de peso corporal.

Preferem-se as doses diárias de cerca de (mAb) 0,1 a cerca de 10 mg/kg de peso corporal e (composto anti-hormonal) de cerca de 0,1 a cerca de 10 mg/kg de peso corporal.

Os compostos da invenção podem ser administrados por qualquer via de administração convencional, em particular, por via entérica, oral, por exemplo, hi 13 $ ....... na forma de comprimidos ou cápsulas, ou por via parental, por exemplo, na forma de soluções ou suspensões injectáveis. A combinação de BACh 250 e tamoxifen é a preferida.

Processo de produção A invenção também inclui um processo para a produção de uma combinação em que o composto anti-hormonal é um composto quimicamente sintetizado e em que a molécula de ligação é produzida pela imunização de um animal com a proteína c-erb B-2, pelo isolamento de células B, pela fusão das células B com células de mieloma e selecção de células positivas, pelo isolamento do anticorpo do sobrenadante e caso seja necessário pela formação de fragmentos dos anticorpos. A invenção também inclui um processo de produção da combinação da invenção em que o composto anti-hormonal é um composto quimicamente sintetizado e em que a molécula de ligação, cuja estrutura é detectável pelos processos acima mencionados, é recombinante ou sinteticamente produzida.

Descrição das Figuras

Figura 1 mostra o efeito sinergético de um anticorpo c-erb B-2 (TAb 250) em combinação com o tamoxifen em células MDA-361 em ratos atímicos (nu/nu).

Figura 2 mostra o efeito sinergético de um anticorpo c-erb B-2 (TAb 250) em combinação com o tamoxifen em células ZR-75-1 em ratos atímicos (nu/nu).

Figura 3 mostra o efeito sinergético de um anticorpo c-erb B-2 (TAb 250) em combinação com o anti-progesterona onapristona em células MDA-361 em ratos atímicos (nu/nu). 14 <5,í

Exemplos Exemplo 1:

Preparação de anticorpos monoclonais c-erb B-2

Imunizam-se ratos Balb/c por via intraperitonal e subcutânea com 2x106 a 2x107 células NIH3T3 (linha de células de fibroblastos de ratos (murine) obtidas pelo Dr. S. Aaronson, National Institutes of Health) transfectadas com o oncogene humano c-erb B-2, NIH3T3t, (Aaronson S. et al. (1987) Science 237: 178-182) ou com um número equivalente de células SKBR3 emulsificadas 1:1 volume /volume em adjuvante Freud completo. Recolhe-se o soro de duas em duas semanas e testa-se quanto à reactividade contra a formalina fixada nas células NIH3T3 ou NIH3T3t usando a técnica ELISA (enzyme- linked immunosorbent assay). Os animais com títulos positivos são injectados intraperitonal ou intravenosa com células em PBS (tampão salina com fosfato) e sacrificam-se os animais 4 dias depois por fusão. Fundem-se células do baço com células de mieloma P-X63Ag8,653 num ratio de 1:1 a 7,5:1 com PEG 4000 como descrita pelo procedimento de Kõhler e Milstein ((1975) Nature, 256: 495-497). As células fundidas são cuidadosamente lavadas e colocadas em placas com 96 poços a 1 a 4x106 células/ml em meio RPMI 1640. Os poços são alimentados com meio HAT 24 horas depois da fusão e depois cada 3 dias durante 2 a 3 semanas. Quando a formação de colónias é visível, 10 a 14 dias depois, testam-se os sobrenadantes quanto à sua reactividade, pela técnica ELISA. Os clones prospectivos que demonstrem um bom crescimento são espalhados em placas com 24 poços e re-testados 7 a 10 dias depois. Os poços positivos são depois testados quanto à sua reactividade, no domínio externo, contra células NIH3T3 ou NIH3T3t usando análise de distribuição (sorting) de fluxo. (Para descrição dos métodos ver as Patentes U.S. n° 3,376,110; 4,016,043 e Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications N.Y. (1988)). Os clones positivos por ambos os métodos são reclonados quer pela limitação da diluição quer pela deposição de células simples usando um citómetro de fluxo. As células são diluidas e depositadas em placas de 96 poços na presença ou ausência de céluas alimentadoras do baço (spleen feeder). Os poços que demosntram 15 βι Η crescimento são re-testados por ELISA e reclonados mais três vezes. Os sobrenadantes dos clones de hibridoma são testados quanto ao isotipo e subisotipo, à reactividade à proteína gp 185 (c-erb B-2) expressa na superfície de células NIH3T3t usando análise de distribuição de fluxo, e imunoprecipitação de uma proteína gp 185 marcada de células transfectadas. Os hibridomas positivos desenvolvem-se em cultura de tecidos e injectadas em ratos Balb/c -(pristane-primed), ratos nús Balb/c ou ratos IRCFi para produção de ascite. Os anticorpos monoclonais purificados do fluido de ascites por HPLC usando uma coluna Bakerbond ABx. Os anticorpos monoclonais purificados (referidos como TAb número) são dialisados contra PBS e armazenados a -20°C. Todos os anticorpos purificados são testados isotipos, subisotipos, e isotipos de contaminação por imunodifusão radial. A coloração da celular das linhas de células que espressam gp 185 é detectada e quantificada por análise de distribuição de fluxo, reactividade ELISA contra o dominio extracelular purificado, ensaio ELISA contra células NIH3T3 transfectadas e não transfectadas, e radio-imunoprecipitação de p185 de linhas de células que expressam c-erb B-2 marcada. Os anticorpos não têm reacção cruzada com as proteínas receptoras EGF fortemente relacionados como se verifica pela falha na precipitação de uma proteína de 170 kDalton radiomarcada de células A-431 radiomarcadas, e foram analisados por SDS-Page e gel densiometria (todas as proteínas purificadas são >90% imunoglobulinas). Na TABELA 1 encontram-se sumarizados os anticorpos monoclonais e a reactividade destes anticorpos. TABELA 1

Caracterísitcas dos Anticorpos Monoclonais que reconhecem o Domínio externo do c-erb B-2 TAb1 FACS2 Ligação ELISA3 Título(ng/ml) Subisotipo p185 p170 Domínio Externo Western Blot4 250 + 20 igG, + - + - 251 + 1 igG, + - + - 252 + 20 igG, + - + - 16

I § tf f'? Ί

J 253 + 47 igG, + - + - 254 ' + 10 igG, + - + - 255 + 16 igG, + - +/- - 256 + 25 \gG, + - + - 257 + 11 igG, + - + - 258 + 4 igG, + - + - 259 + 20 igG, + - + - 260 + 10 igGza + - + - 261 + 10 igG2b + - +/- - 262 + 27 igG, + - + - 263 + 100 igG2b + - + - 264 + 41 igG, + - + - 265 + 51 igG, + - + - 1 Os ratos são imunizados com NIH3T3t excepto Tab 259 (células SKBR-2) 2 FACS- Fluorescence Activated Cell Sorter Analysis 3 ELISA- o título ELISA é calculadoa 30% do máximo de ligação a NIH3T3t 4 Western blot é levado a cabo sob condições redutoras ND Não determinado

Exemplo 2:

Inibição do Crescimento das Células de Tumores da Mama

Pode-se usar o ensaio MTT para determinar a proliferação celular em função da actividade mitoçondrial. (Ver MOSMANN, T (1983) J Immunòl Methods 65: 55-63). O ensaio é usado para determinar os efeitos dos anticorpos monoclonais c-erb B-2 e é levado a cabo da seguinte maneira:

Colocam-se células SKBR3 (linha de células de cancro da mama humano que expressam a proteína c-erb B-2, que originou uma efusão pleural metastática obtida de ATCC com o n° de catálogo #HTB30) em microplacas de 96 poços (1x104 células/placa), e 24 horas depois, adicionam-se diluições de TAb 250 ou um anticorpo controlo isotipo lgG1 não específico. Incubam-se as placas mais 72 horas. Adiciona-se MTT durante 4 horas e dissolvem-se os cristais com 17 isopropanol/0,04 Ν HCL/0,3% SDS. Verificou-se que a inibição do crescimento se restringe a células que expressam a proteína c-erb B-2. A TABELA 2 mostra a resposta das células SKBR3 em contraste com outras duas linhas celulares que não expressam a proteína c-erb B-2. Nem as HBL100 (linha de células de mama derivada de glândulas mamárias obtida de ATCC com o n° de catálogo HTB124) nem MDA468 (linha de células de mama que originou uma efusão pleural metastática e contém EGFr amplificado obtida de ATCC com o n° de catálogo HTB132, que expressam em excesso o receptor EGF) são inibidas pelos TAb 252. TABELA 2

Efeito Anti-Proliferativo dos Anticorpos Anti- c-erb B-2

Anticorpo Conc.(pg/ml) Tipo de células % do Controlo TAb 252 0,1 HBL100 88 !-° 96 10 95 100 108 TAb 252 0,1 MDA468 96 1,0 95 10 94 100 90 TAb 252 0,1 . SKBR3 74 1,0 66 10 64 100 57 TAb 250 0.1 SKBR3 100 1.0 92 10 .64 100 49 Controlo IgG 0,1 SKBR3 100 1.0 99 10 100 100 103

.-¾ ή 18 O efeito do TAb 250, outro anticorpo monoclonal anti- c-erb B-2, no crescimento das células SKBR3 também consta da TABELA . O TAb 250 inibiu a proliferação até 50% na concentração de 100pg/m|.

Também se testaram outros monoclonais contra o c-erb B-2 quanto à inibição dò crescimento (TABELA 3). Os TAb 250, 252, 253 e 256 inibiram todos a proliferação até aproximadamente 50% do controlo a 100 μς anticorpos monoclonais/ml e 75 a 90% do controlo a 3,1 μς anticorpos monoclonais/ml. TABELA 3

Efeitos dos Anticorpos Monoclonais c-erb B-2 na proliferação em células SKBR3 in vitro N° Anticorpo 100 pg/ml 3,1 pg/ml 1 Controlo lgG1 971 95 2 250 55 76 3 250,052 53 75 4 251 72 80 5 252 55 78 6 253 44 82 7 254 69 77 8 255 63 78 9 256 50 76 10 257 68 82 11 258 75 82 12 259 73 . 85 13 260 73 91 14 261 88 95 15 262 74 88 16 263 70 86 17 264 69 90 18 265 62 80

Exemplo 3:

Inibição do Crescimento de Células de Tumor do Ovário

Para determinar o efeito de vários anticorpos que reagem com a proteína c-erb B-2 na proliferação de células de tumores, colocam-se células SKOV3 (linha de células de cancro do ovário humano que expressam a proteína c-erb B-2, que originou uma efusão ascitica metastática obtida de ATCC com o ns de catálogo HTB77) em meio de crescimento em discos com 24 poços a 10000 células/poço. Após 24 horas a 37°C adicionam-se anticorpos monocionais (TAbs 250, 251, 257, 261 e 263) ou fragmentos purificados Fab ou F(ab’)2 de TAb 250 até uma concentração final de 10 ng/ml. Dez dias depois da adição dos anticorpos removem-se as células com tripsina e quantificadas com um Culture Counter. Além disso, coram-se amostras representativas de células com iodeto de propidio e foram analisados com um FCAs Scan (Becton-Dickinson, Mountain view, CA) para determinar a percentagem do número de células viáveis em comparação com poços controlo não tratados. Nem o número nem a viabilidade das células tratadas com TAbs 261 e 263 ou com o fragmentos de TAb 250 são diferentes dos controlos não tratados. No entanto, após 10 dias na presença de TAbs 250, 251 ou 257 a proliferação das células SKOV3 é suprimida a 69%, 64% ou 60% do número de células controlo. O tratamento com fragmentos F(ab’)2 de TAb 250 reduziu o crescimento celular a 76% do nível controlo. Enquanto que se estima que as células controlo sejam >98% viáveis, as células tratadas com estes anticorpos apresentam uma pequena mas significante perda de viabilidade (de 84 a 89%). 20 TABELA 4

Efeito dos Anticorpos anti- c-erb B-2 no Crescimento de Células de Tumor de Ovário

Anticorpo % do controlo TAb 250 69 TAb 251 64 TAb 257 60 TAb 261 89 TAb 263 88 TAb 250 Fab 101 TAb 250 F(ab’)2 77

Exemplo 4:

Efeito Anticorpo Monoclonal c-erb B-2 e Tamoxifen em Combinação em Xenoenxertos de Tumores humanos (células MDA 361)

Implantaram-se pellets de estrogénio (0,72 mg/pellet, Innovative Research, Inc.) ou pellets placebo (Innovative Research) de libertação lenta (60 dias) em 80 ratos Balb/c nús (nude). Um dia depois implantaram-se os ratos com células MDA-MB-361 (linha de células de cancro da mama humano que expressam a proteína c-erb B-2 que originou um tumor metastático no cérebro obtido do ATCC, com o n5 de catalogo HTB27). As células do tumor crescem em garrafas rolantes, recolhidas e diluídas com PBS a 1,1x107 células por 100 μΙ. No sétimo dia depois da implantação, os ratos foram divididos, aleatoriamente, em dez grupos de oito ratos cada. Os ratos foram implantados com pellets de libertação lenta contendo placebo ou tamoxifen (2,5 ou 5,0 mg). No mesmo dia os ratos são também tratados intraperitonalmente com TAb 250 (500 ou 1000 pg) ou anticorpo controlo isotipo lgG1 não especifico. O tratamento dos vários grupos foi o seguinte:

Grupo 1- implantes de pellet de placebo e 1000 pg lgG1 de controlo isotipo;

Grupo 2- sem tamoxifen e 500 pg TAb 250;

Grupo 3- sem tamoxifen e 1000 pg TAb 250;

Grupo 4- 2,5 mg tamoxifen e sem anticorpo;

Grupo 5- 5,0 mg tamoxifen e sem anticorpo;

Grupo 6-5,0 mg tamoxifen e 1000 μg igG1 de controlo isotipo;

Grupo 7- 2,5 mg tamoxifen e 500 μg TAb 250;

Grupo 8- 2,5 mg tamoxifen e 1000^g TAb 250;

Grupo 9- 5,0 mg tamoxifen e 500 μg TAb 250;

Grupo 10- 5,0 mg tamoxifen e 1000 pg TAb 250;

Fizeram-se tratamentos intraperitonais adicionais nos dias 9, 11, 14, 16, 18, 21,23 e 25 depois da implantação do tumor.

Os resultados desta experiência estão representados na Figura 1. Observa-se uma inibição significativa do crescimento do tumor nos ratos tratados com a combinação de TAb 250 e tamoxifen, em especial com as dosagens combinadas de 2,5 mg tamoxifen e 500 μg TAb 250. Quatro de entre oito ratos não tinham tumores mensuráveis no dia 50 e sete de oito ratos ou tinham tumores não mensuráveis ou tumores demasiado pequenos no dia 84.

Exemplo 5:

Efeito do Anticorpo JMonoclonal c-erb B-2 e Tamoxifen em Combinação em Xenoenxertos de Tumores humanos (células ZR-75-1)

Realizou-se uma segunda experiência basicamente igual à descrita usando células ZR-75-1 (linha de células de cancro da mama, ATCC #CRL 1500). Implantaram-se pellets de estrogénio ou pellets placebo de libertação lenta em 40 ratos Balb/c nús (nude). Um dia depois da implantação, os ratos implantados com estrogénio são injectados subcutaneamente com 100 μΙ de suspensão de célulasZR-75-1 preparada da seguinte forma. Excisam-se tumores ZR-75-1 de ratos de passagem não tratados a cerca de 3400 mm3, finamente cortados e suspensos em PBS. Seis dias depois da implantação das células de tumor, os ratos são subdivididos aleatoriamente em cinco grupos de oito ratos cada. Os ratos são implantados com pellets de libertação lenta contendo quer placebo quer 2,5 mg tamoxifen. No dia 12 depois da implantação de células de tumores os ratos são tratados intraperitonalmente 22 fí. quer com 500 ug de TAb 250 ou um volume equivalente de pBS. O tratamento dos vários grupos foi o seguinte:

Grupo 1- pellets de placebo e PBS;

Grupo 2- 2,5 mg tamoxifen e sem anticorpo;

Grupo 3- 500 μg TAb 250;

Grupo 4- 2,5 mg tamoxifen e PBS;

Grupo 5- 2,5 mg tamoxifen e 500 μg TAb 250;

Foram feitos tratamentos adicionais nos dias 14, 16, 19, 21, 23, 28 e 30 depois do implante de células de tumores. Os resultados desta experiência estão representados na Figura 2. Observa-se uma inibição clara do crescimento do tumor nos ratos tratados com a combinação do TAb 250 e tamoxifen em contraste com outros regimes de tratamentos.

Exemplo 6:

Efeito do Anticorpo Monoclonal c-erb B-2 e Ònapristona em Combinação em Xenoenxertos de Tumores humanos lmplantam-se pellets de estrogénio ou placebo de libertação lenta em 48 ratos Balb/c nús. Um dia depois os ratos são implantados suncutaneamente com 1,3x106 células em 100 μΙ de PBS preparados a partir de células crescidas em frascos de cultura de tecidos (Ver Exemplo 4). Os ratos são aleatoriamente divididos em seis grupos de 8 ratos cada. No quarto dia depois da implantação de células, os grupos foram tratados da seguinte maneira:

Grupo 1-10% de benzoato de benzilo em óleo de rícino (controlo);

Grupo 2 - 500 pg TAb 250;

Grupo 3- 20 pg onapristona;

Grupo 4-20 pg onapristona e 500 pg TAb 250; A onapristona é administrada subcutaneamente numa solução de 10% de banzoato de benzilo /90% óleo de rícino. O TAb 250 é administrada através de uma injecção intraperitonal. Os tratamentos (50 pl volume total) de onapristona são dados durante 5 dias consecutivos por injecção subcutânea. Os ratos descansam durante dois dias e depois começa-se um novo ciclo de 5 dias de injecções subcutâneas. Há 5,5 ciclos num total de 28 injecções por rato. Os 23 Sí

tratamentos de TAb 250 são dados 3 vezes por semana durante 5,5 semanas num total de 17 tratamentos. O resultado desta experiência estão representados na Figura 3. Observa-se uma inibição clara do crescimento do tumor nos ratos tratados com TAb 250 em onapristona em combinação.

Lisboa, 2 I, m 2000 O Agente Oficial da Propriedade Industrial

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Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Uma combinação que compreende a) pelo menos um composto anti-hormonal retirado do grupo que consiste em compostos anti-estrogénio, anti-progesterona e anti-androgénio e b) uma molécula ou moléculas de ligação que ligam especificamente à proteína codificada pelo oncogéneo c-erb B-2, em que a molécula ou moléculas de ligação induzem a inibição da proliferação das células dos tumores.
2. Uma combinação de acordo com a reivindicação 1 em que a molécula ou moléculas de ligação são anticorpos ou fragmentos de anticorpos.
3. Uma combinação de acordo com a reivindicação 1 em que o composto anti-hormonal é o tamoxifen ou seus derivados.
4. Uma combinação de acordo com a reivindicação 1 em que o composto anti-hormonal é a onapristona ou seus derivados.
5. Uma combinação de acordo com a reivindicação 1 em que o composto anti-hormonal é dihidropirorenona.
6. Uma combinação de acordo com a reivindicação 1 em que o composto anti-hormonal é uma mistura de dois ou três compostos retirados do grupo que consiste em compostos anti-estrogénio, anti-progesterona e anti-androgénio.
7. Uma combinação de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6 como agente terapêutico.
8. Uma combinação que contém um composto ou compostos anti-hormonais e uma molécula ou moléculas de ligação de acordo com qualquer

ml/ das reivindicações 1 a 6 na forma de uma preparação combinada para utilização simultânea, separada ou sequencial.
9. Uma combinação que contém um composto ou compostos anti-hormonais e uma molécula ou moléculas de ligação de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6 na forma de uma preparação combinada para utilização simultânea, separada ou sequencial, em que a combinação é um agente terapêutico activo contra tumores.
10. Utilização de uma composição de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6 na produção de um medicamento para aplicação terapêutica no tratamento do cancro, em o composto ou compostos anti-hormonais e uma molécula ou moléculas de ligação de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6 estão na forma de uma preparação combinada para utilização simultânea, separada ou sequencial.
11. Uma combinação farmacêutica que compreende a combinação de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6 com pelo menos um diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável.
12. Um kit que contém a combinação farmaceuticamente activa de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6 em que o o(s) composto(s) anti-hormonal e a(s) molécula(s) de ligação de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6 na forma de uma preparação combinada a serem usados simultaneamente, em separado ou sequencialmente.
13. Um processo para a produção de uma combinação de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6 em que o composto anti-hormonal é um composto quimicamente sintetizado e em que a molécula de ligação é produzida: pela imunização de um animal com a proteína c-erb B-2, pelo isolamento de células B, 3

I pela fusão das células B com células de mieloma e selecção de células positivas, pelo isolamento do anticorpo do sobrenadante e caso seja necessário pela formação de fragmentos dos anticorpos.
14. Um processo de produção da combinação de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6 em que o composto anti-hormonal é um composto quimicamente sintetizado e em que a molécula de ligação, cuja estrutura é detectável de acordo com o processo da reivindicação 13, é recombinante ou sinteticamente produzida. Lisboa, 2 VJAM. 2000 O Agente Oficial da Propriedade Industrial

Àsrérko ds Siks Csrvsl0 AgaR* *s R. Casiiíft), 25ϊ - ó.c £ - íD70 LÍS30A Teíefs. 3851333-035^)-3-